Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Høy gjennomstrømning av småmolekylær legemiddelscreening for aldersrelaterte søvnforstyrrelser ved bruk av Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Presentert er en protokoll for high-throughput drug screening for å forbedre søvn ved å overvåke søvnadferden til fruktfluer i en eldre Drosophila-modell .

Abstract

Søvn, en viktig del av helse og generell velvære, gir ofte utfordringer for eldre personer som ofte opplever søvnforstyrrelser preget av forkortet søvnvarighet og fragmenterte mønstre. Disse søvnforstyrrelsene korrelerer også med økt risiko for ulike sykdommer hos eldre, inkludert diabetes, kardiovaskulære sykdommer og psykiske lidelser. Dessverre er eksisterende medisiner for søvnforstyrrelser forbundet med betydelige bivirkninger som kognitiv svekkelse og avhengighet. Følgelig er det et presserende behov for utvikling av nye, sikrere og mer effektive medisiner for søvnforstyrrelser. Den høye kostnaden og lange eksperimentelle varigheten av dagens narkotikascreeningsmetoder forblir imidlertid begrensende faktorer.

Denne protokollen beskriver en kostnadseffektiv og høy gjennomstrømningsscreeningsmetode som bruker Drosophila melanogaster, en art med en svært konservert søvnreguleringsmekanisme sammenlignet med pattedyr, noe som gjør den til en ideell modell for å studere søvnforstyrrelser hos eldre. Ved å administrere ulike små forbindelser til eldre fluer, kan vi vurdere deres effekter på søvnforstyrrelser. Søvnatferden til disse fluene registreres ved hjelp av en infrarød overvåkingsenhet og analyseres med åpen kildekode-datapakken Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Denne protokollen tilbyr en rimelig, reproduserbar og effektiv screeningtilnærming for søvnregulering. Bananfluer, på grunn av deres korte livssyklus, lave oppdrettskostnader og enkle håndtering, tjener som gode emner for denne metoden. Som en illustrasjon demonstrerte Reserpine, et av de testede legemidlene, evnen til å fremme søvnvarighet hos eldre fluer, og fremhevet effektiviteten av denne protokollen.

Introduction

Søvn, en av de essensielle atferdene som er nødvendige for menneskelig overlevelse, er preget av to hovedtilstander: rask øyebevegelse (REM) søvn og ikke-rask øyebevegelse (NREM) søvn1. NREM-søvn består av tre stadier: N1 (overgangen mellom våkenhet og søvn), N2 (lett søvn) og N3 (dyp søvn, langsom bølgesøvn), som representerer progresjonen fra våkenhet til dyp søvn1. Søvn spiller en avgjørende rolle for både fysisk og psykisk helse2. Aldring reduserer imidlertid total søvnvarighet, søvneffektivitet, søvnprosent med langsomme bølger og REM-søvnprosent hos voksne3. Eldre individer har en tendens til å bruke mer tid i lett søvn sammenlignet med langsom bølgesøvn, noe som gjør dem mer følsomme for nattlige oppvåkninger. Etter hvert som antall oppvåkninger øker, reduseres gjennomsnittlig søvntid, noe som resulterer i et fragmentert søvnmønster hos eldre, noe som kan være forbundet med overdreven eksitering av Hcrt-nevroner hos mus4. I tillegg bidrar aldersrelaterte reduksjoner i sirkadiske mekanismer til et tidligere skifte i søvnvarighet 5,6. I kombinasjon med fysisk sykdom, psykisk stress, miljøfaktorer og medisinbruk, gjør disse faktorene eldre voksne mer utsatt for søvnforstyrrelser, som søvnløshet, REM-søvnadferdsforstyrrelse, narkolepsi, periodiske benbevegelser, rastløse bensyndrom og søvnforstyrret pust 7,8.

Epidemiologiske studier har vist at søvnforstyrrelser er nært knyttet til kroniske sykdommer hos eldre9, inkludert depresjon10, kardiovaskulær sykdom 11 og demens12. Å adressere søvnforstyrrelser spiller en avgjørende rolle i å forbedre og behandle kroniske sykdommer og forbedre livskvaliteten for eldre voksne. For tiden er pasienter primært avhengige av medisiner som benzodiazepiner, ikke-benzodiazepiner og melatoninreseptoragonister for å forbedre søvnkvaliteten13. Benzodiazepiner kan imidlertid føre til nedregulering av reseptorer og avhengighet etter langvarig bruk, og forårsake alvorlige abstinenssymptomer ved seponering14,15. Ikke-benzodiazepinmedikamenter bærer også risiko, inkludert demens 16, brudd17 og kreft18. Den vanlige melatoninreseptoragonisten, ramelteon, reduserer søvnforsinkelsen, men øker ikke søvnvarigheten og har leverfunksjonsrelaterte bekymringer på grunn av omfattende førstepassasjeeliminering19. Agomelatin, en melatoninreseptoragonist og serotoninreseptorantagonist, forbedrer depresjonsrelatert søvnløshet, men utgjør også en risiko for leverskade20. Følgelig er det et presserende behov for sikrere medisiner for å behandle eller lindre søvnforstyrrelser. Imidlertid er nåværende narkotikascreeningsstrategier, basert på molekylære og cellulære eksperimenter kombinert med automatiserte systemer og dataanalyse, dyre og tidkrevende21. Strukturbaserte legemiddeldesignstrategier, avhengig av reseptorstruktur og egenskaper, krever en klar forståelse av reseptorens tredimensjonale struktur og mangler prediktive evner for legemiddeleffekter22.

I 2000, basert på søvnkriteriene foreslått av Campbell og Tobler i 1984 23, etablerte forskere enkle dyremodeller for å studere søvn 24, inkludert Drosophila melanogaster, som viste søvnlignende tilstander25,26. Til tross for anatomiske forskjeller mellom Drosophila og mennesker, er mange nevrokjemiske komponenter og signalveier som regulerer søvn i Drosophila bevart i pattedyrs søvn, noe som letter studiet av menneskelige nevrologiske sykdommer27,28. Drosophila er også mye brukt i sirkadiske rytmestudier, til tross for forskjeller i kjerneoscillatorer mellom fluer og pattedyr 29,30,31. Derfor tjener Drosophila som en verdifull modellorganisme for å studere søvnadferd og gjennomføre søvnrelatert legemiddelscreening.

Denne studien foreslår en kostnadseffektiv og enkel fenotypebasert tilnærming for screening av småmolekylære legemidler for å behandle søvnforstyrrelser ved bruk av eldre fluer. Søvnregulering i Drosophila er svært bevart25, og nedgangen i søvn observert med alderen kan være reversibel gjennom legemiddeladministrasjon. Dermed kan denne søvnfenotypebaserte screeningsmetoden intuitivt gjenspeile legemiddeleffekten. Vi mater fluene med en blanding av stoffet som undersøkes og mat, overvåker og registrerer søvnadferd ved hjelp av Drosophila Activity Monitor (DAM) 32, og analyserer de oppkjøpte dataene ved hjelp av åpen kildekode-SCAMP2020 datapakke i MATLAB (figur 1). Statistisk analyse utføres ved hjelp av statistikk og grafisk programvare (se Materialfortegnelse). Som et eksempel demonstrerer vi effektiviteten av denne protokollen ved å presentere eksperimentelle data på Reserpine, en liten molekylinhibitor av vesikulær monoamintransportør rapportert å øke søvn33. Denne protokollen gir en verdifull tilnærming til å identifisere legemidler for behandling av aldersrelaterte søvnproblemer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Denne protokollen bruker den 30 dager gamle w1118 fluer fra Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, se tabell over materialer).

1. Forberedelse av de gamle fruktfluene

  1. Matlaging
    1. Forbered standard maisstivelseskulturmedium ved å blande 50 g / L cornflakes, 110 g / L sukker, 5 g / L agar og 25 g / L gjær. Varm cornflakes og gjær med vann for å gelatinisere, og oppløs deretter alle stoffene helt.
    2. Når mediet avkjøles til 50-60 °C, tilsett 6 ml/l propionsyre og pakk dem raskt inn i dyrkningsflasker.
  2. Flueoppdrett og tilberedning av gamle fluer
    1. Breed fluestammen w1118i flasker som inneholder et standard maisstivelseskulturmedium og legg flasker i en konstant temperaturinkubator ved 25 ° C, 68% relativ fuktighet, 500-1000 lux lysforhold og en 12 timer: 12 h lys: mørk syklus.
    2. Transfer flyr inn i en ny flaske hver 7. dag i henhold til vekstsyklusen til fluer, og holder alderen på individer i samme flaske konsistent.
    3. Samle den nye gruppen fluer som klekkes fra den opprinnelige flasken 3 dager etter overføring og legg dem i en ny flaske. Etter prinsippet om å bytte flaske hver 7. dag, vil de bli dyrket til de er rundt 30 dager gamle.

2. Tilberedning av medisinsk mat og glassrør for overvåking

MERK: Prosedyren for glassrørpreparasjon følger arbeidet til Jin et al. med modifikasjoner34.

  1. Rengjøring og tørking av glassrør
    1. Plasser glassrøret (5 mm i diameter x 65 mm i lengde, se materialfortegnelse) i et stort begerglass, bløtlegg det og kok det med dobbelt destillert vann i 20 minutter. Gjenta 3 ganger.
    2. Fjern og bunt glassrøret, skyll innsiden med dobbelt destillert vann 3-5 ganger, og sett det i en ovn for tørking.
  2. Fremstilling av enkelt dyrkningsmedium (100 ml)
    1. Løs opp 1,5 g agar og 5 g sukrose i dobbeltdestillert vann, varme og konsentrere til 100 ml.
    2. Tilsett 600 μL propionsyre når mediet avkjøles til ca. 70 °C, slik at det ikke stivner ved hjelp av et vannbad med konstant temperatur.
    3. Tilsett ca. 4 ml enkelt medium og reserpin (se materialfortegnelse) i et 10 ml lite beger til stoffet når 20 μM eller 50 μM. Tilsett dimetylsulfoksid (DMSO) til konsentrasjonen på 0,2% i den negative kontrollgruppen.
  3. Fremstilling av glassrørene som inneholder medisin
    1. For å lette strømmen av mediet, sett forsiktig inn en passende lengde av glassrør i et lite beger. Mediet vil naturlig komme inn i glassrøret på grunn av atmosfærisk trykk.
    2. Trekk ut glassrøret når kulturmediet er helt størknet og tørk av ytterveggen for å oppnå et overvåkingsglassrør med et kulturmedium som inneholder legemidler i den ene enden.
    3. Varm den faste parafinen i et beger til den smelter ved 70 °C, legg enden av glassrøret nær maten i parafinvæsken i ca. 5 mm, og fjern den raskt. Vent til parafinen stivner for å forsegle matenden av glassrøret.

3. Eksperimentell design og fluebehandling

  1. Utforme forsøket for fluebehandlingen etter tabell 1.

4. Drosophila-montering og søvnovervåking

MERK: Prosedyren for Drosophila-montering følger arbeidet til Jin et al.34 med modifikasjoner.

  1. Bedøv fluer med CO2 -gass, legg dem i parafinforseglede glassrør (en per rør), og blokker den ikke-matende enden med en absorberende bomullsboll for å forhindre at fluer rømmer og sikrer luftcirkulasjon.
  2. Last rør på den infrarøde skjermen for å overvåke dem.
    1. Monter glassrørene som inneholder fluer på en infrarød skjerm i samme retning, og registrer skjermnummeret og hullnummeret som tilsvarer hvert legemiddel.
    2. Juster justeringen av hvert rør, og la de infrarøde strålene passere vertikalt gjennom midten av flyets aktivitetsområde.
    3. Plasser skjermen inne i en 25 °C inkubator plassert i fluesøvnmørkerommet, og følg de angitte innstillingene: 25 °C temperatur, Zeitgeber 12 (ZT12) (tilsvarer lokal tid 20:00) og ZT24 (tilsvarer lokal tid 08:00). Dette oppsettet sikrer at fluene opplever vekslende perioder på 12 timer med lys og mørke.
      MERK: Prøv å ikke åpne døren før overvåkingsdatainnsamlingen er fullført for å opprettholde et stabilt miljø i inkubatoren under overvåking.
    4. Start overvåking ved hjelp av DAM2-systemet (se Materialfortegnelse).
    5. Når overvåkingen er fullført, laster du ned de innsamlede dataene i .txt format fra systemet.

5. Databehandling

MERK: Databehandlingen ved hjelp av DAM-systemet, DAMFileScan107 og SCAMP ble utført i henhold til instruksjonene på deres offisielle nettsider (se materialfortegnelse).

  1. Importer ovennevnte txt-fil til DAMFileScan107-programvaren for skanning og del den etter behov for å skaffe søvndata.
    1. Sett starttidspunktet for segmenteringsdata til 8:01 (1 min segmentering) eller 8:00 (30 min segmentering) den tredje morgenen etter at du har startet skjermene, og avslutningstiden er 08:00 tre dager etter starttidspunktet (figur 2A1).
      MERK: Fluer må tilpasse seg overvåkingsmiljøet i minst ett døgn. Så man kan sette starttiden for delte data til 8 på den tredje dagen etter at skjermen begynner.
    2. Del dataene med intervaller på 1 min og 30 min. Endre alternativet "Binlengde" til 1 minutt, endre alternativet "Output File Type" til Channel-filer, endre navn og utdata. Datasegmenteringsmetoden på 30 minutter er den samme som ovenfor (figur 2A2-5).
      MERK: Når du utfører datasegmentering med intervaller på 1 min og 30 minutter, bør den endelige omdøpingen av de to filene være konsistent; ellers kan det være uleselig under senere Matlab-behandling. Om nødvendig kan filnavnet endres etter utdata for å lette differensieringen.
  2. Databehandling ved hjelp av SCAMP2020
    1. Åpne programpakken SCAMP2020 i Matlab, og dobbeltklikk på Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (figur 2B).
    2. Legg til undermappen "Vecsey SCAMP Scripts" til banen, finn filen "scamp.m" i den mappen, og kjør den. I følgende popup-vindu velger du mappen 1 min og 30 minutter i rekkefølge (figur 2C,D).
    3. Velg en skjerm, klikk på Last inn individuelle Se plott for å forhåndsvise (figur 3A1), og sjekk bildet som vises. Fjern merket for den tilsvarende kanalen med døde fluer (figur 3A2, figur 3B).
    4. Gjenta trinnene ovenfor for å sjekke alle skjermer.
    5. Gi nytt navn til hver kanal i hver skjerm basert på det tilsvarende stoffet som skal testes (figur 3A3), velg alle skjermer, og klikk på ANALYSER utvalgte data for analyse (figur 3A4).
    6. Standard til det valgte alternativet, klikk på Analyser for valgt papirkurv, merk av for Eksporter data, og klikk til slutt på GRAPH 30 min Datatyper for alle dager for valgte grupper og EKSPORTER alle data for å sende resultatene (figur 3C).
  3. Velg filen med navnet s30 fra CSV-filen, finn den tilsvarende middelverdien og standard feildata for hver skjerm, sikkerhetskopier den til Excel for endring og justering, og lim den inn i GraphPad Prism (se Materialliste) for å tegne et søvnstatusdiagram (figur 4A, B).
  4. Finn filen som heter "stdur" og beregne gjennomsnittsverdiene for dagtid, nattetid og total søvn for hver fly innen tre dager (figur 4A, C). Lim inn dataene i Prism-programvaren for å fullføre forskjellstesten og tegne en graf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpin er en småmolekylær hemmer av vesikulær monoamintransportør (VMAT), som hemmer gjenopptaket av monoaminer i presynaptiske vesikler, noe som fører til økt søvn33. De søvnfremmende effektene av reserpin ble undersøkt hos 30 dager gamle fluer, med kontrollgruppen som utelukkende ble matet med løsningsmidlet dimetylsulfoksid (DMSO). I Reserpine-gruppen viste eldre fluer betydelig økt søvn både dag og natt sammenlignet med DMSO-gruppen. Figur 5A,E illustrerer søvnmønstrene til Reserpine og DMSO flyr over tre påfølgende dager, mens figur 5B-D og figur 5F-H viser resultatene av differensialtesten på søvndataene. For å eliminere muligheten for at stoffet virker utelukkende på ett kjønn, ble forsøkene gjentatt ved hjelp av mannlige fluer. Ulike konsentrasjoner av reserpin, 20 μM og 50 μM, ble administrert, noe som viser en positiv korrelasjon mellom reserpinkonsentrasjon og fremme av søvn.

Figure 1
Figur 1: Småmolekylær legemiddelscreening for aldersrelaterte søvnforstyrrelser eksperimentell prosess. Eldre fluer ble plassert i et lite glassrør med mat som inneholdt medisinene som skulle testes. Søvnmønstrene ble kontinuerlig overvåket i tre dager ved hjelp av DAM-systemet. De innhentede dataene ble importert til en datamaskin for behandling, visualisering og analyse, noe som førte til konklusjoner. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Skanning og deling av data . (A) Datavalg og skanning, etterfulgt av sekvensiell tidsmessig segmentering. (B) Plasseringen av mappen "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Tillegg av undermappen "Vecsey SCAMP Scripts" til banen. (D) Plasseringen av filen "scamp.m". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Seleksjon og behandling av søvndata . (A) Forhåndsvisning av fluesøvnforhold, avmerking av kanalen for døde fluer, og gruppering og analyse av utvalgte data. (B) Forhåndsvisning av Drosophila søvn, hvor et ensartet blått rektangel indikerer aktiv søvn, mens et bestemt øyeblikk av et ensartet blått rektangel antyder at fluen er død. Døde fluer er merket med røde rektangler. (C) Analyse og utgang av utvalgte data. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Resultater av søvndataanalyse . (A) Valg av s30 - og stdur-filer fra CSV-filen. (B) Gjennomsnittsverdien og standardfeilen for gjennomsnittet (SEM) av søvn for hver gruppe i "s30.csv". (C) Verdier av dagtid (Bin1, Bin3, Bin5), nattetid (Bin2, Bin4, Bin6) og total søvn for hver fly innen tre dager i "stdur.csv". Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 5
Figur 5: Søvnforhold hos eldre fluer behandlet med reserpin. (A) Skjematisk fremstilling av søvntid innen 3 dager hos eldre hunner fôret med 0,2 % DMSO, 20 μM reserpin og 50 μM reserpin. (VG Nett) Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig dagtid, nattetid og total søvntid innen 3 dager med eller uten medisiner. Resultatene viser en signifikant økning i søvntid hos eldre kvinner som får reserpin. N = 8 for hver gruppe, Enveis ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Skjematisk fremstilling av søvntid innen 3 dager hos eldre menn som fikk 0,2 % DMSO, 20 μM reserpin og 50 μM reserpin. (VG Nett) Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig dagtid, nattetid og total søvntid innen 3 dager med eller uten medisiner. Resultatene indikerer at søvntiden økte hos menn som fikk reserpin. n = 16 for hver gruppe, Enveis ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 6
Figur 6: Sammenligning av søvnvarighet mellom unge og gamle fluer. (A) Skjematisk diagram som illustrerer overvåking av søvnvarighet over 3 dager hos unge og gamle menn. (VG Nett) Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig dagtid, nattetid og total søvntid over 3 dager hos unge og gamle menn viste ingen signifikant forskjell. n = 32 for hver gruppe, uparet t-test, n.s., ikke signifikant. (E) Skjematisk overvåking av søvnvarighet over 3 dager hos unge og gamle kvinner. (VG Nett) Kvantitativ analyse av gjennomsnittlig dagtid, nattetid og total søvntid over 3 dager hos unge og gamle kvinner viste en signifikant nedgang i dagtid, nattetid og total søvntid hos gamle kvinner sammenlignet med unge kvinner. n = 32 for hver gruppe, uparet t-test, ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Gruppe Studiegruppe Behandling Fluenes alder og kjønn Antall fluer
Equation 1 Normale kontroller 4 ml enkelt kulturmedium med 0,2% DMSO i 4 dager 30 dager menn / kvinner 16 fluer per gruppe
Equation 2 Lavdose narkotikatestEquation 6 4 ml enkelt dyrkningsmedium med 20 μM reserpin i 4 dager 30 dager kvinner 16 fluer per gruppe
Equation 3 Høydose narkotikatestEquation 6 4 ml enkelt dyrkningsmedium med 50 μM reserpin i 4 dager 30 dager kvinner 16 fluer per gruppe
Equation 4 Lavdose narkotikatestEquation 7 4 ml enkelt dyrkningsmedium med 20 μM reserpin i 4 dager 30 dager menn 16 fluer per gruppe
Equation 5 Høydose narkotikatestEquation 7 4 ml enkelt dyrkningsmedium med 50 μM reserpin i 4 dager 30 dager menn 16 fluer per gruppe

Tabell 1: Eksperimentelt design for fluebehandlingen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrevne metoden er egnet for rask screening av små og mellomstore søvnmedisiner. For tiden er de fleste vanlige screeningsmetoder med høy gjennomstrømning basert på biokjemiske og cellulære nivåer. For eksempel undersøkes strukturen og egenskapene til reseptoren for å søke etter spesifikke ligander som kan binde seg til den22. En annen tilnærming innebærer å analysere bindingsmodus og styrke av molekylære fragmenter av utvalgte stoffer ved bruk av kjernemagnetisk resonans (NMR) med massespektrometri35. Imidlertid har disse metodene ofte en relativt høy screeningfeilrate, og legemidlene som velges gjennom dem, viser ofte ingen effekt i dyreforsøk eller kliniske eksperimenter. Effekten av legemidler i kroppen påvirkes av ulike faktorer, for eksempel legemiddelabsorpsjon, distribusjon, metabolisme og utskillelse, noe som fører til en høy grad av falsk screening. I kontrast, selv om vår foreslåtte metode har en mindre screeningskala sammenlignet med høykapasitetsmetoder, gir den en mer enkel og kostnadseffektiv tilnærming ved direkte å observere medikamenteffekter på fenotyper. Dette demonstrerer potensialet for å bruke Drosophila-modellen for effektiv narkotikascreening og identifisering av narkotikamål.

Drosophila har en konservert søvnreguleringsmekanisme og viser søvnforstyrrelser forbundet med aldring. Vi observerte at søvnvarigheten til 30 dager gamle hunnfluer var signifikant kortere enn hos 7 dager gamle fluer, mens søvnvarigheten til 30 dager gamle hannfluer ikke skilte seg vesentlig fra 7 dager gamle fluer (figur 6). Følgelig ble 30 dager gamle kvinnelige fluer valgt for de nåværende forsøkene. Screeningprosessen i flere runder ble gjennomført for å minimere utilsiktet faktorinterferens. Legemiddelkonsentrasjonen i første runde ble satt til 20 μM for å unngå giftige bivirkninger som kunne føre til fluedødelighet. I andre screeningrunde ble legemiddelkonsentrasjonen økt til 50 μM for å vurdere effekten av stoffet ved ulike konsentrasjoner. Legemidler valgt fra andre runde ble administrert til mannlige fluer ved både 20 μM og 50 μM for å evaluere kjønnsforskjeller i legemiddeleffekter. Dette tillot en å screene for stoffer som konsekvent viste søvnrelaterte effekter. For eksempel har reserpin tidligere vist seg å øke søvnen hos voksne fluer i alderen 4-6 dager31. Vi replikerte dette resultatet i vår modell ved hjelp av eldre fluer, hvor eldre kvinner viste en signifikant økning i søvn etter å ha blitt administrert reserpin (figur 5).

DMSO ble brukt til å oppløse legemidlene, men dets potensielle toksisitet bør vurderes. Tidligere studier har vist at konsentrasjoner på 0,1% til 0,25% DMSO i kulturmediet ikke skader rottehårceller innen 24 timer, mens konsentrasjoner på 0,5% til 6% øker celledøden betydelig36. Tilsvarende har det blitt funnet at DMSO-konsentrasjoner på 0,1% eller mindre ikke påvirker ekspresjonen av viktige legemiddelmetabolismerelaterte enzymer eller transportører i humane hepatocytter. Likevel kan høyere konsentrasjoner indusere endringer i uttrykk37. Det skal imidlertid bemerkes at 0,1% DMSO har vist seg å påvirke levetiden til kvinnelige fluer, men ikke menn38. I tillegg har intraperitoneal administrering av 15 % og 20 % DMSO vist seg å forstyrre søvnen hos rotter39. For å redusere den potensielle toksisiteten til DMSO, holdt vi konsentrasjonen under 0,2%.

For tiden er det to hovedmetoder som brukes til å karakterisere oppførselen til Drosophila. En metode er basert på videoanalyse, som gir et vell av atferdsparametere, inkludert fluestilling, hastighet og subtile bevegelser av kroppsdeler. Den andre metoden er basert på infrarøde strålebrudd, for eksempel DAM-systemet. 40. Det er imidlertid viktig å merke seg at visse videoanalyseverktøy som PySolo er designet for å studere flere enkeltstående fluer, og begrenser antall fluer som kan plasseres under et kamera41. Andre verktøy som C-trax42 og JAABA43 kan utføre populasjonssporing, men er beregningsmessig dyre og tidkrevende. For screening med høy gjennomstrømning er det vanligvis tilstrekkelig å fange den totale søvnvarigheten til fluer, og presise bevegelsesparametere er ikke nødvendige. Derfor foretrekkes den mye brukte og svært skalerbare metoden basert på infrarød strålefraktur. Denne metoden har imidlertid også sine begrensninger. For eksempel, hvis fluer bare beveger seg i den ene enden av røret uten å forstyrre den infrarøde strålen, kan systemet feilaktig registrere det som søvn, noe som fører til en overestimering av søvn44. I tillegg er det viktig å nøye teste motiliteten til fluestammen før du bruker den i screening for å unngå utilsiktede påvirkninger.

Her er noen nyttige tips for et vellykket oppsett: (1) For å forhindre at maten fester seg til glassrøret når du fjerner den fra det lille begeret etter størkning, kan man prøve å sette glassrøret vertikalt inn i bunnen av det lille begeret før maten stivner. Forsiktig å trekke glassrøret frem og tilbake, tappe bunnen av begeret for å la luft komme inn, sakte rotere begeret for å fjerne all maten og glassrøret, og tørk forsiktig av gjenværende mat på glassrørets ytre vegg kan være effektivt. (2) Når du forsegler matenden av glassrøret med parafinfilm, anbefales det å bruke et vannbad for sakte å varme opp filmen til parafinen smelter. Denne tilnærmingen bidrar til å unngå problemet med at den medisinske maten spruter voldsomt ved høye temperaturer og forurenser parafinfilmen. Alternativt kan man bruke små plastkorker til tetting, men sørge for at luft kan komme inn under tettingen, slik at maten blir presset opp totalt. (3) Det er verdt å vurdere at noen potente søvnfremmende stoffer i utgangspunktet kan føre til feil vurdering av testede fluer som døde. For å overvinne dette problemet anbefales det å sette en konsentrasjonsgradient, slik at man kan utforske den optimale legemiddelkonsentrasjonen og gjenta forsøket. 4) Ta hensyn til at lukten av stoffet kan påvirke mengden mat som fluene konsumerer og deres inntak av stoffet, noe som potensielt kan påvirke nøyaktigheten av eksperimentelle resultater. Derfor kan det være fordelaktig å forlenge varigheten av forsøket på riktig måte, slik at fluer har god tid til å konsumere så mye stoff som mulig og øke akkumuleringseffekten av stoffet. (5) For databehandling, mens mange universiteter og institutter har tilgang til Matlab for offentlig bruk, er det billigere alternativer tilgjengelig for enkeltpersoner eller forskningsinstitusjoner som ennå ikke har kjøpt programmet. Et anbefalt alternativ er ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

Avslutningsvis har vi utviklet en trinnvis prosedyre for screening av legemidler for å behandle søvnforstyrrelser. Ved å bruke en eldre fluemodell som viser en fenotype med kortere søvnvarighet, valideres effekten av reserpin ved å øke søvnvarigheten hos eldre hunnfluer. Denne metoden gir en ny tilnærming til narkotika screening med betydelig applikasjonspotensial og tjener som grunnlag for videre narkotikaforskning. Mens narkotikaeffekter vurderes basert på fenotyper, er den underliggende mekanismen for narkotikavirkning fortsatt ukjent. Videre studier vil bli gjennomført for å undersøke patologien til søvnforstyrrelser og molekylær regulering av søvn, og dermed kaste lys over de farmakologiske mekanismene som er involvert. Selv om sirkadianmaskineriet i Drosophila har likheter med menneskelige oscillatorer, bør forskjeller i søvnkontrollmekanismer mellom mennesker og fluer ikke overses. Denne protokollen gir et grunnleggende rammeverk for legemiddelscreening for søvnforstyrrelser. Imidlertid vil fremtidig forskning avgjøre om noen av de screenede legemidlene kan brukes til klinisk behandling, samt belyse deres virkningsmekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende interesser.

Acknowledgments

Vi takker professor Junhai Hans laboratoriemedlemmer for deres diskusjon og kommentarer. Dette arbeidet ble støttet av National Natural Science Foundation of China 32170970 til YT og "Cyanine Blue Project" av Jiangsu-provinsen til Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Høy gjennomstrømning småmolekylær legemiddelscreening aldersrelaterte søvnforstyrrelser Drosophila melanogaster søvnvarighet fragmenterte mønstre eldre sykdommer diabetes kardiovaskulære sykdommer psykiske lidelser eksisterende medisiner bivirkninger kognitiv svekkelse avhengighet sikrere medisiner effektive søvnforstyrrelsesmedisiner kostnadseffektiv screeningsmetode søvnreguleringsmekanisme modellorganisme infrarød overvåkingsenhet søvn- og sirkadisk analyse MATLAB-program 2020 (SCAMP2020) lavkost screeningprotokoll
Høy gjennomstrømning av småmolekylær legemiddelscreening for aldersrelaterte søvnforstyrrelser ved bruk av <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter