Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных препаратов на возрастные нарушения сна с использованием Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Представлен протокол высокопроизводительного скрининга лекарственных препаратов для улучшения сна путем мониторинга поведения плодовых мушек во сне на пожилой модели дрозофилы .

Abstract

Сон, важнейший компонент здоровья и общего благополучия, часто представляет проблемы для пожилых людей, которые часто сталкиваются с нарушениями сна, характеризующимися сокращением продолжительности сна и фрагментированными паттернами. Эти нарушения сна также коррелируют с повышенным риском различных заболеваний у пожилых людей, включая диабет, сердечно-сосудистые заболевания и психологические расстройства. К сожалению, существующие препараты для лечения расстройств сна связаны со значительными побочными эффектами, такими как когнитивные нарушения и зависимость. Следовательно, срочно необходима разработка новых, более безопасных и эффективных препаратов для лечения расстройств сна. Тем не менее, высокая стоимость и длительная продолжительность экспериментов существующих методов скрининга лекарственных средств остаются ограничивающими факторами.

Этот протокол описывает экономически эффективный и высокопроизводительный метод скрининга, в котором используется Drosophila melanogaster, вид с высококонсервативным механизмом регуляции сна по сравнению с млекопитающими, что делает его идеальной моделью для изучения нарушений сна у пожилых людей. Вводя различные мелкие соединения старым мухам, мы можем оценить их влияние на нарушения сна. Поведение этих мух во время сна записывается с помощью инфракрасного устройства мониторинга и анализируется с помощью пакета данных с открытым исходным кодом Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Этот протокол предлагает недорогой, воспроизводимый и эффективный подход к скринингу для регуляции сна. Плодовые мушки, благодаря своему короткому жизненному циклу, низкой стоимости содержания и простоте в обращении, служат отличными объектами для этого метода. В качестве иллюстрации можно привести Резерпин, один из протестированных препаратов, продемонстрировавший способность увеличивать продолжительность сна у пожилых мух, подчеркнув эффективность этого протокола.

Introduction

Сон, одно из основных форм поведения, необходимых для выживания человека, характеризуется двумя основными состояниями: сон с быстрыми движениями глаз (БДГ)и сон с небыстрыми движениями глаз (NREM). Фазы быстрого сна включают в себя три стадии: N1 (переход между бодрствованием и сном), N2 (легкий сон) и N3 (глубокий сон, медленный сон), представляющие собой прогрессию от бодрствования к глубокому сну1. Сон играет важнейшую роль как в физическом, так и в психическом здоровье2. Тем не менее, старение снижает общую продолжительность сна, эффективность сна, процент медленного сна и процент быстрого сна у взрослых3. Пожилые люди, как правило, проводят больше времени в легком сне по сравнению с медленным сном, что делает их более чувствительными к ночным пробуждениям. По мере увеличения числа пробуждений среднее время сна уменьшается, что приводит к фрагментированному режиму сна у пожилых людей, что может быть связано с чрезмерным возбуждением нейронов Hcrt у мышей4. Кроме того, возрастное снижение циркадных механизмов способствует более раннему сдвигу продолжительности сна 5,6. В сочетании с физическими заболеваниями, психологическим стрессом, факторами окружающей среды и приемом лекарств эти факторы делают пожилых людей более восприимчивыми к нарушениям сна, таким как бессонница, расстройство поведения во время быстрого сна, нарколепсия, периодические движения ног, синдром беспокойных ног и нарушение дыхания во сне 7,8.

Эпидемиологические исследования показали, что нарушения сна тесно связаны с хроническимизаболеваниями у пожилых людей9, включая депрессию 10, сердечно-сосудистые заболевания11 и деменцию12. Борьба с нарушениями сна играет решающую роль в улучшении и лечении хронических заболеваний и повышении качества жизни пожилых людей. В настоящее время пациенты в основном полагаются на такие препараты, как бензодиазепины, небензодиазепины и агонисты рецепторов мелатонина для улучшения качества сна13. Тем не менее, бензодиазепины могут приводить к подавлению регуляции рецепторов и зависимости после длительного использования, вызывая тяжелые симптомы отмены при прекращении приема14,15. Небензодиазепиновые препараты также несут риски, включая деменцию16, переломы17 и рак18. Широко используемый агонист рецепторов мелатонина, рамелтеон, уменьшает латентность сна, но не увеличивает продолжительность сна и вызывает проблемы, связанные с функцией печени, из-за обширной элиминации при первом прохождении19. Агомелатин, агонист рецепторов мелатонина и антагонист серотониновых рецепторов, улучшает бессонницу, связанную с депрессией, но также представляет риск повреждения печени20. Следовательно, существует острая потребность в более безопасных препаратах для лечения или облегчения нарушений сна. Однако современные стратегии скрининга лекарственных средств, основанные на молекулярных и клеточных экспериментах в сочетании с автоматизированными системами и компьютерным анализом, являются дорогостоящими и трудоемкими. Структурно-ориентированные стратегии разработки лекарственных средств, основанные на структуре и свойствах рецепторов, требуют четкого понимания трехмерной структуры рецептора и не имеют прогностических возможностей для эффектов лекарств22.

В 2000 году, основываясь на критериях сна, предложенных Кэмпбеллом и Тоблером в 1984 году, исследователи создали простые животные модели дляизучения сна, включая Drosophila melanogaster, которая демонстрировала состояния, похожие на сон25,26. Несмотря на анатомические различия между дрозофилой и человеком, многие нейрохимические компоненты и сигнальные пути, регулирующие сон у дрозофилы, сохраняются во сне млекопитающих, что облегчает изучение неврологических заболеваний человека 27,28. Дрозофила также широко используется в исследованиях циркадных ритмов, несмотря на различия в основных осцилляторах у мух и млекопитающих 29,30,31. Таким образом, дрозофила служит ценным модельным организмом для изучения поведения во сне и проведения скрининга лекарств, связанных со сном.

В этом исследовании предлагается экономически эффективный и простой фенотипический подход к скринингу низкомолекулярных препаратов для лечения нарушений сна с использованием старых мух. Регуляция сна у дрозофилы являетсявысококонсервативной, и снижение сна, наблюдаемое с возрастом, может быть обратимым при приеме лекарств. Таким образом, этот метод скрининга, основанный на фенотипе сна, может интуитивно отражать эффективность препарата. Мы кормим мух смесью исследуемого препарата и корма, отслеживаем и записываем поведение во сне с помощью монитора активности дрозофилы (DAM)32 и анализируем полученные данные с помощью пакета данных SCAMP2020 с открытым исходным кодом в MATLAB (рис. 1). Статистический анализ выполняется с помощью программ для статистики и построения графиков (см. Таблицу материалов). В качестве примера мы демонстрируем эффективность этого протокола, представляя экспериментальные данные по резерпину, низкомолекулярному ингибитору везикулярного переносчика моноаминов, который, как сообщается, увеличивает сон33. Этот протокол обеспечивает ценный подход к определению препаратов для лечения возрастных проблем со сном.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

В этом протоколе используются 30-дневные мухи w1118 из Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, см. Таблицу материалов).

1. Приготовление выдержанных плодовых мушек

  1. Приготовление пищи
    1. Приготовьте стандартную питательную среду для кукурузного крахмала, смешав кукурузные хлопья 50 г/л, сахар 110 г/л, агар 5 г/л и дрожжи 25 г/л. Нагрейте кукурузные хлопья и дрожжи с водой до желатинизации, а затем полностью растворите все вещества.
    2. Когда среда остынет до 50-60 °C, добавьте 6 мл/л пропионовой кислоты и немедленно расфасуйте их во флаконы для культур.
  2. Разведение мух и подготовка старых мух
    1. Разводят штамм мух w1118в бутылках, содержащих стандартную питательную среду для кукурузного крахмала, и помещают бутылки в инкубатор с постоянной температурой при температуре 25 ° C, относительной влажности 68%, условиях освещения 500-1000 люкс и цикле 12 ч: 12 ч свет: темнота.
    2. Пересаживайте мух в новую бутылку каждые 7 дней в соответствии с циклом роста мух, сохраняя возраст особей в одной и той же бутылке постоянным.
    3. Соберите новую партию мух, которые вылупились из оригинальной бутылки через 3 дня после их переноса, и поместите их в новую бутылку. Следуя принципу замены бутылочки каждые 7 дней, они будут культивироваться примерно до 30-дневного возраста.

2. Подготовка лекарственных продуктов питания и стеклянных пробирок к мониторингу

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура подготовки стеклянных пробирок повторяет работу Jin et al. с изменениями34.

  1. Очистка и сушка стеклянных трубок
    1. Поместите стеклянную трубку (5 мм в диаметр и 65 мм в длину, см. Таблицу материалов) в большой стакан, замочите ее и прокипятите в двойной дистиллированной воде в течение 20 минут. Повторить 3 раза.
    2. Снимите и свяжите стеклянную трубку, промойте внутреннюю часть двойной дистиллированной водой 3-5 раз и поставьте в духовку для просушки.
  2. Приготовление простой питательной среды (100 мл)
    1. Растворите 1,5 г агара и 5 г сахарозы в воде двойной дистилляции, нагрейте и концентрируйте до 100 мл.
    2. Добавьте 600 мкл пропионовой кислоты, когда среда остынет примерно до 70 °C, предотвратив ее затвердевание с помощью водяной бани постоянной температуры.
    3. Добавьте примерно 4 мл простой среды и резерпина (см. таблицу материалов) в маленький стакан объемом 10 мл до тех пор, пока препарат не достигнет 20 мкМ или 50 мкМ. Добавьте диметилсульфоксид (ДМСО) до концентрации 0,2% в отрицательной контрольной группе.
  3. Приготовление стеклянных пробирок с лекарственным средством
    1. Чтобы облегчить поток среды, осторожно вставьте стеклянную трубку подходящей длины в небольшой стакан. Среда будет естественным образом попадать в стеклянную трубку из-за атмосферного давления.
    2. Вытащите стеклянную пробирку, когда питательная среда полностью затвердеет, и протрите внешнюю стенку, чтобы получить контрольную стеклянную пробирку с питательной средой, содержащей лекарственные препараты на одном конце.
    3. Нагрейте твердый парафин в стакане до тех пор, пока он не расплавится при температуре 70 °C, поместите конец стеклянной трубки близко к пище в парафиновую жидкость примерно на 5 мм и быстро извлеките ее. Подождите, пока парафин затвердеет, чтобы запечатать пищевой конец стеклянной трубки.

3. Экспериментальный дизайн и лечение мух

  1. Спланируйте эксперимент по обработке мух в соответствии с таблицей 1.

4. Сборка дрозофилы и мониторинг сна

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура сборки дрозофилы повторяет работу Jin et al.34 с изменениями.

  1. Обезболивайте мух газомСО2 , помещайте их в стеклянные пробирки с парафином (по одной в каждой пробирке) и закройте непищевой конец абсорбирующим ватным тампоном, чтобы мухи не убегали и обеспечивали циркуляцию воздуха.
  2. Загрузите трубки на инфракрасный монитор для их мониторинга.
    1. Соберите стеклянные трубки с мухами на инфракрасный монитор в том же направлении и запишите номер монитора и номер отверстия, соответствующие каждому препарату.
    2. Отрегулируйте выравнивание каждой трубки и сделайте так, чтобы инфракрасные лучи проходили вертикально через центр диапазона активности мушки.
    3. Поместите монитор в инкубатор с температурой 25 °C, расположенный в темной комнате для сна мух, следуя указанным настройкам: температура 25 °C, Zeitgeber 12 (ZT12) (эквивалент местного времени 08:00 вечера) и ZT24 (эквивалент местного времени 08:00 утра). Эта настройка гарантирует, что мухи будут испытывать чередующиеся периоды света и темноты в течение 12 часов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь не открывать дверцу до завершения сбора данных мониторинга, чтобы поддерживать стабильную среду в инкубаторе во время мониторинга.
    4. Начните мониторинг с помощью системы DAM2 (см. Таблицу материалов).
    5. После завершения мониторинга загрузите собранные данные в формате .txt из системы.

5. Обработка данных

ПРИМЕЧАНИЕ: Обработка данных с помощью системы DAM, DAMFileScan107 и SCAMP проводилась в соответствии с инструкциями на их официальных сайтах (см. Таблицу материалов).

  1. Импортируйте приведенный выше txt-файл в программное обеспечение DAMFileScan107 для сканирования и разделите его по мере необходимости для получения данных о сне.
    1. Установите время начала данных сегментации на 8:01 (сегментация 1 минута) или 8:00 (сегментация на 30 минут) на третье утро после запуска мониторов, а время завершения — 8:00 утра через три дня после времени запуска (рис. 2A1).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Мухи должны адаптироваться к среде мониторинга в течение как минимум одного дня. Таким образом, можно установить время начала работы с разделенными данными на 8 утра на третий день после запуска монитора.
    2. Разделите данные с интервалами 1 минута и 30 минут. Измените параметр «Длина ячейки» на 1 минуту, измените параметр «Тип выходного файла» на «Файлы канала», переименуйте и выведите. Метод сегментации данных за 30 минут аналогичен описанному выше (рис. 2A2-5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении сегментации данных с интервалами 1 минута и 30 минут окончательное переименование двух файлов должно быть согласованным; в противном случае он может быть нечитаемым при последующей обработке Matlab. При необходимости имя файла может быть изменено после вывода, чтобы облегчить дифференциацию.
  2. Обработка данных с помощью SCAMP2020
    1. Откройте пакет программ SCAMP2020 в Matlab и дважды щелкните Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (рисунок 2B).
    2. Добавьте его подпапку "Vecsey SCAMP Scripts" в путь, найдите файл "scamp.m" в этой папке и запустите его. В следующем всплывающем окне последовательно выберите папки процесса 1 мин и 30 мин (рис. 2C,D).
    3. Выберите монитор, нажмите кнопку Load individual See Plots to preview (рисунок 3A1) и проверьте появившееся изображение. Снимите галочку с соответствующего канала мертвых мух (рисунок 3A2, рисунок 3B).
    4. Повторите описанные выше шаги, чтобы проверить все мониторы.
    5. Переименуйте каждый канал в каждом мониторе в зависимости от соответствующего тестируемого препарата (Рисунок 3A3), выберите все мониторы и нажмите кнопку ANALYZE Selected Data for analysis (Рисунок 3A4).
    6. По умолчанию выберите выбранную опцию, нажмите Analyze for Selected Bin, отметьте Export Data и, наконец, нажмите GRAPH 30 min Data Types for All Days for Selected Groups и EXPORT All Data для вывода результатов (рисунок 3C).
  3. Выберите файл с именем s30 из CSV-файла, найдите соответствующее среднее значение и данные о стандартных ошибках для каждого монитора, создайте резервную копию в Excel для изменения и настройки и вставьте его в GraphPad Prism (см. таблицу материалов), чтобы нарисовать диаграмму состояния сна (рис. 4A,B).
  4. Найдите файл с именем «stdur» и вычислите средние значения дневного, ночного и общего сна для каждой мухи в течение трех дней (рис. 4A,C). Вставьте данные в программное обеспечение Prism, чтобы выполнить разностный тест и нарисовать график.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Резерпин является низкомолекулярным ингибитором везикулярного транспортера моноаминов (VMAT), который ингибирует обратный захват моноаминов в пресинаптические везикулы, что приводит к увеличению продолжительности сна33. Снотворное действие Резерпина было изучено на 30-дневных мухах, при этом контрольную группу кормили исключительно растворителем диметилсульфоксидом (ДМСО). В группе, принимавшей резерпин, пожилые мухи демонстрировали значительно более высокий уровень сна как днем, так и ночью по сравнению с группой ДМСО. На рисунках 5A, E показаны паттерны сна мух Reserpine и DMSO в течение трех дней подряд, в то время как на рисунках 5B-D и 5F-H показаны результаты дифференциального теста на данных о сне. Чтобы исключить возможность воздействия препарата исключительно на одного пола, эксперименты повторяли на самцах мух. Были введены различные концентрации резерпина, 20 мкМ и 50 мкМ, что продемонстрировало положительную корреляцию между концентрацией резерпина и улучшением сна.

Figure 1
Рисунок 1: Экспериментальный процесс скрининга низкомолекулярных препаратов на возрастные расстройства сна. Пожилых мух помещали в маленькую стеклянную пробирку с пищей, содержащей тестируемые препараты. Режим сна непрерывно контролировался в течение трех дней с помощью системы DAM. Полученные данные были импортированы в компьютер для обработки, визуализации и анализа, что привело к выводам. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Сканирование и разделение данных. (A) Отбор и сканирование данных с последующей последовательной временной сегментацией. (B) Местонахождение папки «Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)». (C) Добавление подпапки "Vecsey SCAMP Scripts" в путь. (D) Местонахождение файла "scamp.m". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Отбор и обработка данных о сне . (A) Предварительный просмотр условий сна мух, снятие флажка с канала для мертвых мух, а также группировка и анализ выбранных данных. (B) Предварительный просмотр сна дрозофилы, где однородный синий прямоугольник указывает на активный сон, в то время как определенный момент равномерного синего прямоугольника указывает на то, что муха мертва. Мертвые мухи помечены красными прямоугольниками. (C) Анализ и вывод выбранных данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Результаты анализа данных о сне . (A) Выбор файлов s30 и stdur из CSV-файла. (B) Среднее значение и стандартная ошибка среднего значения (SEM) сна для каждой группы в "s30.csv". (C) Значения дневного времени (Bin1, Bin3, Bin5), ночного времени (Bin2, Bin4, Bin6) и общего сна для каждой мухи в течение трех дней в "stdur.csv". Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Условия сна у пожилых мух, получавших Резерпин. (А) Схематическое изображение времени сна в течение 3 дней у пожилых самок, получавших 0,2% ДМСО, 20 мкМ резерпина и 50 мкМ резерпина. (Б-Д) Количественный анализ среднего дневного, ночного и общего времени сна в течение 3 дней с препаратами или без них. Результаты демонстрируют значительное увеличение времени сна у пожилых самок, получавших Резерпин. N = 8 для каждой группы, односторонняя ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Схематическое изображение времени сна в течение 3 дней у пожилых мужчин, получавших 0,2% ДМСО, 20 мкМ резерпина и 50 мкМ резерпина. (Ф-Х) Количественный анализ среднего дневного, ночного и общего времени сна в течение 3 дней с препаратами или без них. Результаты показывают, что время сна увеличилось у самцов, получавших Резерпин. n = 16 для каждой группы, Односторонняя ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Сравнение продолжительности сна между молодыми и старыми мухами. (A) Принципиальная диаграмма, иллюстрирующая мониторинг продолжительности сна в течение 3 дней у молодых и старых самцов. (Б-Д) Количественный анализ среднего времени дневного, ночного и общего времени сна за 3 дня у молодых и старых мужчин не выявил существенных различий. n = 32 для каждой группы, непарный t-критерий, n.s., не значимый. (E) Схематический мониторинг продолжительности сна в течение 3 дней у молодых и старых самок. (Ф-Х) Количественный анализ среднего времени дневного, ночного и общего сна за 3 дня у молодых и старых самок показал достоверное снижение дневного, ночного и общего времени сна у старых самок по сравнению с молодыми самками. n = 32 для каждой группы, непарный t-критерий, ****p < 0,0001. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Группа Исследовательская комиссия Лечение Возраст и пол мух Количество мух
Equation 1 Обычное управление 4 мл простой питательной среды с 0,2% ДМСО в течение 4 дней 30 дней кобели/суки 16 мух в группе
Equation 2 Тест на наркотики в низких дозахEquation 6 4 мл простой питательной среды с резерпином 20 мкМ в течение 4 дней 30 дней суки 16 мух в группе
Equation 3 Тест на наркотики в высоких дозахEquation 6 4 мл простой питательной среды с резерпином 50 мкМ в течение 4 дней 30 дней суки 16 мух в группе
Equation 4 Тест на наркотики в низких дозахEquation 7 4 мл простой питательной среды с резерпином 20 мкМ в течение 4 дней 30 дней кобелей 16 мух в группе
Equation 5 Тест на наркотики в высоких дозахEquation 7 4 мл простой питательной среды с резерпином 50 мкМ в течение 4 дней 30 дней кобелей 16 мух в группе

Таблица 1: Схема эксперимента по лечению мух.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Описанный метод подходит для быстрого скрининга снотворных препаратов малого и среднего размера. В настоящее время большинство основных высокопроизводительных методов скрининга лекарственных средств основаны на биохимическом и клеточном уровнях. Например, исследуется структура и свойства рецептора для поиска специфических лигандов, способных связываться с ним22. Другой подход заключается в анализе режима связывания и прочности молекулярных фрагментов выбранных лекарств с помощью ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с масс-спектрометрией35. Тем не менее, эти методы часто имеют относительно высокую частоту ошибок скрининга, и препараты, подобранные с их помощью, часто не показывают никакого эффекта в клинических экспериментах на животных. На эффективность лекарств в организме влияют различные факторы, такие как всасывание, распределение, метаболизм и выведение лекарств, что приводит к высокому уровню ложного скрининга. В отличие от этого, несмотря на то, что предлагаемый нами метод имеет меньшую шкалу скрининга по сравнению с высокопроизводительными методами, он предлагает более простой и экономичный подход путем непосредственного наблюдения за влиянием лекарств на фенотипы. Это демонстрирует потенциал использования модели дрозофилы для эффективного скрининга лекарств и идентификации мишеней для лекарств.

Дрозофила обладает консервативным механизмом регуляции сна и проявляет нарушения сна, связанные со старением. Мы заметили, что продолжительность сна 30-дневных самок мух была значительно короче, чем у 7-дневных, в то время как продолжительность сна 30-дневных самцов мух существенно не отличалась от продолжительности сна 7-дневных мух (рис. 6). Следовательно, для текущих экспериментов были отобраны 30-дневные самки мух. Процесс скрининга в несколько раундов проводился для минимизации случайных факторных помех. Концентрация препарата в первом раунде была установлена на уровне 20 мкМ, чтобы избежать токсических побочных эффектов, которые могли бы привести к гибели мух. Во втором раунде скрининга концентрацию препарата увеличивали до 50 мкМ для оценки эффектов препарата в различных концентрациях. Препараты, отобранные во втором раунде, вводили самцам мух в дозах 20 мкМ и 50 мкМ для оценки половых различий в эффектах препарата. Это позволило выявить препараты, которые постоянно демонстрировали эффекты, связанные со сном. Например, ранее было показано, что Резерпин улучшает сон у взрослых мух в возрасте 4-6 дней31 года. Мы успешно воспроизвели этот результат в нашей модели на старых мухах, где пожилые самки показали значительное увеличение сна после введения Резерпина (рис. 5).

Для растворения препаратов использовался ДМСО, но следует учитывать его потенциальную токсичность. Предыдущие исследования показали, что концентрации от 0,1% до 0,25% ДМСО в питательной среде не повреждают волосковые клетки крыс в течение 24 ч, в то время как концентрации от 0,5% до 6% значительно увеличиваютгибель клеток. Аналогичным образом, было обнаружено, что концентрация ДМСО 0,1% или менее не влияет на экспрессию ключевых ферментов или транспортеров, связанных с метаболизмом лекарств, в гепатоцитах человека. Тем не менее, более высокие концентрации могут индуцировать изменения экспрессии37. Тем не менее, следует отметить, что 0,1% ДМСО значительно влияет на продолжительность жизни самок мух, но не самцов38. Кроме того, было показано, что внутрибрюшинное введение 15% и 20% ДМСО нарушает сон у крыс39. Чтобы снизить потенциальную токсичность ДМСО, мы сохранили его концентрацию ниже 0,2%.

В настоящее время существует два основных метода, используемых для характеристики поведения дрозофилы. Один из методов основан на видеоанализе, который предоставляет множество поведенческих параметров, включая положение мухи, скорость и едва уловимые движения частей тела. Другой метод основан на разрушении инфракрасным лучом, например, система DAM. 40. Тем не менее, важно отметить, что некоторые инструменты видеоанализа, такие как PySolo, предназначены для изучения нескольких мух, живущих в одном месте, что ограничивает количество мух, которые могут быть размещены под камерой41. Другие инструменты, такие как C-trax42 и JAABA43 , могут выполнять отслеживание популяции, но требуют больших вычислительных ресурсов и времени. Для высокопроизводительного скрининга обычно достаточно фиксировать общую продолжительность сна мух, и точные параметры движения не требуются. Поэтому предпочтение отдается широко используемому и высокомасштабируемому методу, основанному на разрушении инфракрасным лучом. Однако и у этого метода есть свои ограничения. Например, если мухи двигаются только на одном конце трубки, не прерывая инфракрасный луч, система может ошибочно записать это как сон, что приведет к завышению сна44. Кроме того, важно тщательно проверить подвижность штамма мухи перед использованием его в скрининге, чтобы избежать непреднамеренных воздействий.

Вот несколько полезных советов для успешной установки: (1) Чтобы предотвратить прилипание пищи к стеклянной трубке при извлечении ее из маленького стакана после затвердевания, можно попробовать вставить стеклянную трубку вертикально в дно маленького стакана до того, как пища затвердеет. Осторожно тяните стеклянную трубку вперед и назад, постукивайте по дну стакана, чтобы позволить воздуху поступить, медленно вращайте стакан, чтобы удалить всю пищу и стеклянную трубку, а затем осторожно вытирайте остатки пищи о внешнюю стенку стеклянной трубки. (2) При герметизации пищевого конца стеклянной трубки парафиновой пленкой рекомендуется использовать водяную баню, чтобы медленно нагревать пленку до тех пор, пока парафин не расплавится. Такой подход позволяет избежать проблемы сильного разбрызгивания лекарственной пищи при высоких температурах и загрязнения парафиновой пленки. В качестве альтернативы можно использовать небольшие пластиковые крышки для запечатывания, но убедитесь, что во время запайки воздух может проникнуть, что приведет к тому, что пища в целом выталкивается вверх. (3) Стоит учитывать, что некоторые сильнодействующие снотворные препараты могут изначально привести к неправильному выводу о том, что испытуемые мухи мертвы. Чтобы решить эту проблему, рекомендуется установить градиент концентрации, позволяющий исследовать оптимальную концентрацию препарата и повторить эксперимент. (4) Примите во внимание, что запах препарата может влиять на количество пищи, потребляемой мухами, и потребление ими препарата, что потенциально влияет на точность результатов эксперимента. Таким образом, может быть полезно соответствующим образом увеличить продолжительность эксперимента, гарантируя, что у мух будет достаточно времени, чтобы потребить как можно больше препарата, и усилив эффект накопления препарата. (5) Для обработки данных, в то время как многие университеты и институты имеют доступ к Matlab для публичного использования, существуют более дешевые альтернативы, доступные для частных лиц или исследовательских учреждений, которые еще не приобрели программу. Одним из рекомендуемых вариантов является ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

В заключение мы разработали пошаговую процедуру скрининга препаратов для лечения нарушений сна. Используя более старую модель мухи, демонстрирующую фенотип более короткой продолжительности сна, была подтверждена эффективность Резерпина в увеличении продолжительности сна у старых самок мух. Этот метод предлагает новый подход к скринингу лекарственных средств со значительным потенциалом применения и служит основой для дальнейших исследований лекарственных средств. В то время как эффекты лекарств оцениваются на основе фенотипов, основной механизм действия лекарств остается неизвестным. Дальнейшие исследования будут проводиться для изучения патологии нарушений сна и молекулярной регуляции сна, тем самым проливая свет на задействованные фармакологические механизмы. Несмотря на то, что циркадный аппарат дрозофилы имеет сходство с человеческими осцилляторами, не следует упускать из виду различия в механизмах контроля сна между людьми и мухами. Этот протокол обеспечивает базовую основу для медикаментозного скрининга нарушений сна. Тем не менее, будущие исследования определят, можно ли использовать какой-либо из проверенных препаратов для клинического лечения, а также прояснят механизмы их действия.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Мы благодарим сотрудников лаборатории профессора Джунхай Хана за их обсуждение и комментарии. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая 32170970 Y.T и «Cyanine Blue Project» провинции Цзянсу для Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Высокая пропускная способность скрининг низкомолекулярных препаратов возрастные расстройства сна меланогастер дрозофилы продолжительность сна фрагментированные паттерны пожилые люди болезни диабет сердечно-сосудистые заболевания психологические расстройства существующие лекарства побочные эффекты когнитивные нарушения зависимость более безопасные лекарства эффективные лекарства от расстройств сна экономически эффективный метод скрининга механизм регуляции сна модельный организм устройство инфракрасного мониторинга анализ сна и циркадных ритмов Программа MATLAB 2020 (SCAMP2020) Протокол недорогого скрининга
Высокопроизводительный скрининг низкомолекулярных препаратов на возрастные нарушения сна с использованием <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter