Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Behavior
Click here for the English version

Behavior

Storskalig småmolekylär läkemedelsscreening för åldersrelaterade sömnstörningar med hjälp av Drosophila melanogaster

Published: October 20, 2023 doi: 10.3791/65787
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1, 1
1School of Life Science and Technology, Key Laboratory of Developmental Genes and Human Disease, Southeast University

Summary

Här presenteras ett protokoll för läkemedelsscreening med hög genomströmning för att förbättra sömnen genom att övervaka bananflugornas sömnbeteende i en äldre Drosophila-modell .

Abstract

Sömn, en viktig del av hälsa och allmänt välbefinnande, innebär ofta utmaningar för äldre individer som ofta upplever sömnstörningar som kännetecknas av förkortad sömntid och fragmenterade mönster. Dessa sömnstörningar korrelerar också med en ökad risk för olika sjukdomar hos äldre, inklusive diabetes, hjärt- och kärlsjukdomar och psykiska störningar. Tyvärr är befintliga läkemedel för sömnstörningar förknippade med betydande biverkningar som kognitiv försämring och beroende. Följaktligen finns det ett akut behov av att utveckla nya, säkrare och effektivare läkemedel mot sömnstörningar. De nuvarande metoderna för läkemedelsscreening är dock fortfarande begränsande faktorer eftersom de nuvarande metoderna för läkemedelsscreening är höga kostnader och långa försöksperioder.

Detta protokoll beskriver en kostnadseffektiv screeningmetod med hög genomströmning som använder Drosophila melanogaster, en art med en mycket bevarad sömnregleringsmekanism jämfört med däggdjur, vilket gör den till en idealisk modell för att studera sömnstörningar hos äldre. Genom att administrera olika små föreningar till åldrade flugor kan vi bedöma deras effekter på sömnstörningar. Dessa flugors sömnbeteenden registreras med hjälp av en infraröd övervakningsenhet och analyseras med datapaketet Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program 2020 (SCAMP2020). Detta protokoll erbjuder en billig, reproducerbar och effektiv screeningmetod för sömnreglering. Bananflugor, på grund av sin korta livscykel, låga djurhållningskostnader och enkla hantering, fungerar som utmärkta ämnen för denna metod. Som en illustration visade Reserpine, ett av de testade läkemedlen, förmågan att främja sömnlängden hos äldre flugor, vilket belyser effektiviteten av detta protokoll.

Introduction

Sömn, ett av de väsentliga beteenden som är nödvändiga för människans överlevnad, kännetecknas av två huvudtillstånd: REM-sömn (rapid eye movement) och NREM-sömn (non-rapid eye movement)1. NREM-sömn består av tre stadier: N1 (övergången mellan vakenhet och sömn), N2 (lätt sömn) och N3 (djup sömn, långsam vågsömn), som representerar utvecklingen från vakenhet till djup sömn1. Sömn spelar en avgörande roll för både fysisk och psykisk hälsa2. Åldrande minskar dock den totala sömnlängden, sömneffektiviteten, sömnprocenten för långsamma vågor och REM-sömnprocenten hos vuxna3. Äldre individer tenderar att tillbringa mer tid i lätt sömn jämfört med sömn med långsamma vågor, vilket gör dem mer känsliga för nattliga uppvaknanden. När antalet uppvaknanden ökar minskar den genomsnittliga sömntiden, vilket resulterar i ett fragmenterat sömnmönster hos äldre, vilket kan vara förknippat med överdriven excitation av Hcrt-neuroner hos möss4. Dessutom bidrar åldersrelaterade nedgångar i cirkadiska mekanismer till en tidigare förskjutning av sömnlängden 5,6. I kombination med fysisk sjukdom, psykisk stress, miljöfaktorer och läkemedelsanvändning gör dessa faktorer äldre vuxna mer mottagliga för sömnstörningar, såsom sömnlöshet, REM-sömnbeteendestörning, narkolepsi, periodiska benrörelser, restless legs syndrome och sömnrelaterade andningsstörningar 7,8.

Epidemiologiska studier har visat att sömnstörningar är nära kopplade till kroniska sjukdomar hos äldre9, inklusive depression 10, hjärt- och kärlsjukdomar11 och demens12. Att ta itu med sömnstörningar spelar en avgörande roll för att förbättra och behandla kroniska sjukdomar och förbättra livskvaliteten för äldre vuxna. För närvarande förlitar sig patienter främst på läkemedel som bensodiazepiner, icke-bensodiazepiner och melatoninreceptoragonister för att förbättra sömnkvaliteten13. Bensodiazepiner kan dock leda till nedreglering av receptorer och beroende efter långvarig användning, vilket orsakar allvarliga abstinenssymtom vid utsättning14,15. Icke-bensodiazepiner medför också risker, inklusive demens 16, frakturer17 och cancer18. Den vanliga melatoninreceptoragonisten, ramelteon, minskar sömnlatensen men ökar inte sömnlängden och har leverfunktionsrelaterade problem på grund av omfattande förstapassageeliminering19. Agomelatin, en melatoninreceptoragonist och serotoninreceptorantagonist, förbättrar depressionsrelaterad sömnlöshet men utgör också en risk förleverskador. Följaktligen finns det ett akut behov av säkrare läkemedel för att behandla eller lindra sömnstörningar. Nuvarande strategier för läkemedelsscreening, baserade på molekylära och cellulära experiment i kombination med automatiserade system och datoranalys, är dock dyra och tidskrävande. Strukturbaserade strategier för läkemedelsdesign, som förlitar sig på receptorstruktur och egenskaper, kräver en tydlig förståelse av receptorns tredimensionella struktur och saknar prediktiva möjligheter för läkemedelseffekter22.

År 2000, baserat på de sömnkriterier som föreslogs av Campbell och Tobler 1984 23, etablerade forskare enkla djurmodeller för att studera sömn24, inklusive Drosophila melanogaster, som uppvisade sömnliknande tillstånd25,26. Trots anatomiska skillnader mellan Drosophila och människor bevaras många neurokemiska komponenter och signalvägar som reglerar sömnen hos Drosophila i däggdjurs sömn, vilket underlättar studier av mänskliga neurologiska sjukdomar 27,28. Drosophila används också i stor utsträckning i studier av dygnsrytm, trots skillnader i kärnoscillatorer mellan flugor och däggdjur 29,30,31. Därför fungerar Drosophila som en värdefull modellorganism för att studera sömnbeteende och genomföra sömnrelaterad läkemedelsscreening.

Denna studie föreslår ett kostnadseffektivt och enkelt fenotypbaserat tillvägagångssätt för screening av småmolekylära läkemedel för att behandla sömnstörningar med hjälp av åldrade flugor. Sömnregleringen hos Drosophila är mycket bevarad25, och den nedgång i sömn som observeras med åldern kan vara reversibel genom läkemedelsadministrering. Således kan denna sömnfenotypbaserade screeningmetod intuitivt återspegla läkemedelseffekten. Vi matar flugorna med en blandning av läkemedlet som undersöks och mat, övervakar och registrerar sömnbeteende med hjälp av Drosophila Activity Monitor (DAM)32 och analyserar insamlade data med hjälp av SCAMP2020 datapaket med öppen källkod i MATLAB (figur 1). Statistisk analys utförs med hjälp av statistik- och grafprogram (se Materialförteckning). Som ett exempel demonstrerar vi effektiviteten av detta protokoll genom att presentera experimentella data om Reserpine, en småmolekylär hämmare av den vesikulära monoamintransportören som rapporteras öka sömnen33. Detta protokoll ger ett värdefullt tillvägagångssätt för att identifiera läkemedel för behandling av åldersrelaterade sömnproblem.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Detta protokoll använder de 30 dagar gamla w1118-flugorna från Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC_3605, se materialtabell).

1. Beredning av de åldrade bananflugorna

  1. Matlagning
    1. Förbered ett vanligt odlingsmedium för majsstärkelse genom att blanda 50 g/L cornflakes, 110 g/L socker, 5 g/L agar och 25 g/L jäst. Värm cornflakes och jäst med gelatinvatten och lös sedan upp alla ämnen helt.
    2. När mediet svalnar till 50-60 °C, tillsätt 6 ml/l propionsyra och packa dem omedelbart i odlingsflaskor.
  2. Fluguppfödning och preparering av åldrade flugor
    1. Odla flugstammen w1118i flaskor som innehåller ett vanligt majsstärkelseodlingsmedium och lägg flaskorna i en inkubator med konstant temperatur vid 25 ° C, 68 % relativ luftfuktighet, 500-1000 lux ljusförhållanden och en 12 h:12 h ljus: mörk cykel.
    2. Överför flugor till en ny flaska var 7:e dag enligt flugornas tillväxtcykel, och håll åldern på individerna i samma flaska konsekvent.
    3. Samla in den nya omgången flugor som kläcks från originalflaskan 3 dagar efter att du överfört dem och lägg dem i en ny flaska. Enligt principen att byta flaska var 7:e dag kommer de att odlas tills de är cirka 30 dagar gamla.

2. Beredning av medicinska livsmedel och glasrör för övervakning

OBS: Proceduren för beredning av glasrör följer arbetet av Jin et al. med modifieringar34.

  1. Rengöring och torkning av glasrör
    1. Lägg glasröret (5 mm i diameter x 65 mm långt, se Materialförteckning) i en stor bägare, blötlägg det och koka det med dubbelt destillerat vatten i 20 minuter. Upprepa 3 gånger.
    2. Ta bort och bunta ihop glasröret, skölj insidan med dubbelt destillerat vatten 3-5 gånger och placera det i en ugn för torkning.
  2. Beredning av enkelt odlingsmedium (100 ml)
    1. Lös upp 1,5 g agar och 5 g sackaros i dubbeldestillerat vatten, värm och koncentrera till 100 ml.
    2. Tillsätt 600 μl propionsyra när mediet svalnar till cirka 70 °C, så att det inte stelnar med hjälp av ett vattenbad med konstant temperatur.
    3. Tillsätt cirka 4 ml enkelt medium och Reserpine (se materialtabell) i en 10 ml liten bägare tills läkemedlet når 20 μM eller 50 μM. Tillsätt dimetylsulfoxid (DMSO) till koncentrationen av 0,2 % i den negativa kontrollgruppen.
  3. Beredning av glasrör som innehåller läkemedel
    1. För att underlätta flödet av mediet, sätt försiktigt in en lämplig längd av glasrör i en liten bägare. Mediet kommer naturligt in i glasröret på grund av atmosfärstrycket.
    2. Dra ut glasröret när odlingsmediet är helt stelnat och torka av ytterväggen för att få ett övervakningsglasrör med ett odlingsmedium som innehåller läkemedel i ena änden.
    3. Värm det fasta paraffinet i en bägare tills det smälter vid 70 °C, lägg änden av glasröret nära maten i paraffinvätskan i ca 5 mm och ta snabbt bort det. Vänta tills paraffinet stelnar för att försegla matänden av glasröret.

3. Experimentell design och flugbehandling

  1. Utforma experimentet för flugbehandling enligt tabell 1.

4. Montering av Drosophila och sömnövervakning

OBS: Proceduren för montering av Drosophila följer arbetet av Jin et al.34 med modifieringar.

  1. Bedöva flugor med CO2 gas, lägg dem i paraffinförseglade glasrör (en per rör) och blockera den icke-matära änden med en absorberande bomullstuss för att förhindra att flugor flyr och säkerställa luftcirkulation.
  2. Ladda rör på den infraröda monitorn för att övervaka dem.
    1. Montera glasrören som innehåller flugor på en infraröd monitor i samma riktning och registrera monitornumret och hålnumret som motsvarar varje läkemedel.
    2. Justera inriktningen av varje rör och få de infraröda strålarna att passera vertikalt genom mitten av flugans aktivitetsområde.
    3. Placera monitorn i en 25 °C inkubator placerad i flugsömnmörkrummet, enligt de angivna inställningarna: 25 °C temperatur, Zeitgeber 12 (ZT12) (motsvarande lokal tid 20:00) och ZT24 (motsvarande lokal tid 08:00). Denna inställning säkerställer att flugorna upplever omväxlande perioder av 12 timmar av ljus och mörker.
      OBS: Försök att inte öppna dörren förrän insamlingen av övervakningsdata är klar för att upprätthålla en stabil miljö i inkubatorn under övervakningen.
    4. Börja övervaka med DAM2-systemet (se Materialförteckning).
    5. När övervakningen är klar laddar du ner insamlade data i .txt -format från systemet.

5. Behandling av uppgifter

OBS: Databehandlingen med hjälp av DAM-systemet, DAMFileScan107 och SCAMP utfördes enligt instruktionerna på deras officiella webwebbplatser (se materialförteckning).

  1. Importera ovanstående txt-fil till programvaran DAMFileScan107 för skanning och dela upp den efter behov för att få sömndata.
    1. Ställ in starttiden för segmenteringsdata till 8:01 (1 min segmentering) eller 8:00 (30 min segmentering) den tredje morgonen efter start av monitorerna, och sluttiden är 8:00 tre dagar efter starttiden (Figur 2A1).
      OBS: Flugor måste anpassa sig till övervakningsmiljön i minst ett dygn. Så man kan ställa in starttiden för delade data till 8 på morgonen den tredje dagen efter att monitorn börjar.
    2. Dela upp data i intervaller på 1 min och 30 min. Ändra alternativet "Papperskorgslängd" till 1 minut, ändra alternativet "Utdatafiltyp" till Kanalfiler, byt namn och mata ut. Metoden för 30 minuters datasegmentering är densamma som ovan (figur 2A2-5).
      OBS: När du utför datasegmentering med 1 min och 30 minuters intervall bör det slutliga namnet på de två filerna vara konsekvent; annars kan den vara oläslig under efterföljande Matlab-bearbetning. Vid behov kan filnamnet ändras efter utmatning för att underlätta differentiering.
  2. Databehandling med hjälp av SCAMP2020
    1. Öppna programpaketet SCAMP2020 i Matlab och dubbelklicka på Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP) (Figur 2B).
    2. Lägg till dess undermapp "Vecsey SCAMP Scripts" till sökvägen, hitta filen "scamp.m" i den mappen och kör den. I följande popup-fönster väljer du mapparna process 1 min och 30 min i följd (Figur 2C,D).
    3. Välj en bildskärm, klicka på Ladda enskilda Se diagram för förhandsgranskning (Figur 3A1) och kontrollera bilden som visas. Avmarkera motsvarande kanal för döda flugor (Figur 3A2, Figur 3B).
    4. Upprepa stegen ovan för att kontrollera alla bildskärmar.
    5. Byt namn på varje kanal i varje monitor baserat på motsvarande läkemedel som ska testas (Figur 3A3), välj alla monitorer och klicka på ANALYZE Selected Data for analysis (Figur 3A4).
    6. Standard för det valda alternativet, klicka på Analysera för vald lagerplats, markera Exportera data och klicka slutligen på GRAPH 30 min Datatyper för alla dagar för valda grupper och EXPORTERA alla data för att mata ut resultaten (Figur 3C).
  3. Välj filen med namnet s30 från CSV-filen, hitta motsvarande medelvärde och standardfeldata för varje bildskärm, säkerhetskopiera den till Excel för modifiering och justering och klistra in den i GraphPad Prism (se materialförteckning) för att rita ett sömnstatusdiagram (Figur 4A,B).
  4. Hitta filen med namnet "stdur" och beräkna medelvärdena för dagtid, nattetid och total sömn för varje fluga inom tre dagar (Figur 4A,C). Klistra in data i Prism-programvaran för att slutföra differenstestet och rita en graf.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Reserpine är en småmolekylär hämmare av den vesikulära monoamintransportören (VMAT), som hämmar återupptaget av monoaminer i presynaptiska vesiklar, vilket leder till ökad sömn33. De sömnfrämjande effekterna av Reserpine undersöktes hos 30 dagar gamla flugor, där kontrollgruppen enbart matades med lösningsmedlet dimetylsulfoxid (DMSO). I Reserpine-gruppen uppvisade äldre flugor signifikant ökad sömn under både dag och natt jämfört med DMSO-gruppen. Figur 5A,E illustrerar sömnmönstren hos Reserpine- och DMSO-flugorna under tre på varandra följande dagar, medan figur 5B-D och figur 5F-H visar resultaten av differentialtestet på sömndata. För att eliminera möjligheten att läkemedlet verkar uteslutande på det ena könet upprepades experimenten med hanflugor. Olika koncentrationer av Reserpine, 20 μM och 50 μM, administrerades, vilket visade en positiv korrelation mellan koncentrationen av Reserpine och främjandet av sömn.

Figure 1
Figur 1: Experimentell process för screening av små molekylära läkemedel för åldersrelaterade sömnstörningar. Äldre flugor placerades i ett litet glasrör med mat som innehöll de läkemedel som skulle testas. Sömnmönstren övervakades kontinuerligt under tre dagar med hjälp av DAM-systemet. Den insamlade datan importerades till en dator för bearbetning, visualisering och analys, vilket ledde till slutsatser. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Skanning och uppdelning av data. (A) Urval och genomsökning av data, följt av sekventiell tidssegmentering. (B) Plats för mappen "Vecsey Sleep and Circadian Analysis MATLAB Program (SCAMP)". (C) Tillägg av undermappen "Vecsey SCAMP Scripts" till sökvägen. (D) Plats för filen "scamp.m". Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Urval och bearbetning av sömndata . (A) Förhandsgranskning av flugans sömnförhållanden, avmarkering av kanalen för döda flugor samt gruppering och analys av utvalda data. (B) Förhandsvisning av Drosophila-sömn, där en enhetlig blå rektangel indikerar aktiv sömn, medan ett visst ögonblick av en enhetlig blå rektangel tyder på att flugan är död. Döda flugor är markerade med röda rektanglar. (C) Analys och utmatning av utvalda data. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Resultat av analys av sömndata . (A) Val av s30 - och stdur-filer från CSV-filen. (B) Medelvärdet och medelfelet (SEM) för sömn för varje grupp i "s30.csv". (C) Värden för dagtid (Bin1, Bin3, Bin5), nattetid (Bin2, Bin4, Bin6) och total sömn för varje fluga inom tre dagar i "stdur.csv". Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: Sömnförhållanden hos åldrade flugor som behandlats med Reserpine. (A) Schematisk representation av sömntid inom 3 dagar hos åldrade honor som matats med 0,2 % DMSO, 20 μM Reserpine och 50 μM Reserpine. (B-D) Kvantitativ analys av den genomsnittliga dag-, natt- och totala sömntiden inom 3 dagar med eller utan läkemedel. Resultaten visar en signifikant ökning av sömntiden hos äldre kvinnor som matas med Reserpine. N = 8 för varje grupp, Enkelriktad ANOVA, **p < 0,01, ***p < 0,001. (E) Schematisk representation av sömntid inom 3 dagar hos äldre män som matats med 0,2 % DMSO, 20 μM Reserpine och 50 μM Reserpine. (F-H) Kvantitativ analys av den genomsnittliga dag-, natt- och totala sömntiden inom 3 dagar med eller utan läkemedel. Resultaten tyder på att sömntiden ökade hos män som matades med Reserpine. n = 16 för varje grupp, Enkelriktad ANOVA, *p < 0,05, **p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Jämförelse av sömnlängd mellan unga och gamla flugor. (A) Schematiskt diagram som illustrerar övervakningen av sömnlängd under 3 dagar hos unga och gamla hanar. (B-D) Kvantitativ analys av den genomsnittliga dag-, natt- och totala sömntiden under 3 dagar hos unga och gamla män visade ingen signifikant skillnad. n = 32 för varje grupp, oparat t-test, n.s., ej signifikant. (E) Schematisk övervakning av sömnlängd under 3 dagar hos unga och gamla kvinnor. (F-H) Kvantitativ analys av den genomsnittliga dagtid, nattetid och totala sömntiden under 3 dagar hos unga och gamla honor visade en signifikant minskning av dagtid, nattetid och total sömntid hos gamla honor jämfört med unga honor. n = 32 för varje grupp, oparat t-test, ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Grupp Studiegrupp Behandling Flugornas ålder och kön Antal flugor
Equation 1 Normala kontroller 4 ml enkelt odlingsmedium med 0,2 % DMSO i 4 dagar 30 dagar hanar/kvinnor 16 flugor per grupp
Equation 2 Lågdos drogtestEquation 6 4 ml enkelt odlingsmedium med 20 μM reserpine i 4 dagar 30 dagar kvinnor 16 flugor per grupp
Equation 3 Drogtest med hög dosEquation 6 4 ml enkelt odlingsmedium med 50 μM reserpine i 4 dagar 30 dagar kvinnor 16 flugor per grupp
Equation 4 Lågdos drogtestEquation 7 4 ml enkelt odlingsmedium med 20 μM reserpine i 4 dagar 30 dagar hanar 16 flugor per grupp
Equation 5 Drogtest med hög dosEquation 7 4 ml enkelt odlingsmedium med 50 μM reserpine i 4 dagar 30 dagar hanar 16 flugor per grupp

Tabell 1: Försöksplanering för flugbehandling.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den beskrivna metoden är lämplig för snabb screening av små och medelstora sömnläkemedel. För närvarande är de flesta vanliga metoder för läkemedelsscreening med hög kapacitet baserade på biokemiska och cellulära nivåer. Till exempel undersöks receptorns struktur och egenskaper för att söka efter specifika ligander som kan binda till den22. Ett annat tillvägagångssätt innebär att man analyserar bindningssätt och styrka hos molekylära fragment av utvalda läkemedel med hjälp av kärnmagnetisk resonans (NMR) med masspektrometri35. Dessa metoder har dock ofta en relativt hög felprocent vid screening, och de läkemedel som väljs genom dem visar ofta ingen effekt i djurförsök eller kliniska försök. Effekten av läkemedel i kroppen påverkas av olika faktorer, såsom läkemedelsabsorption, distribution, metabolism och utsöndring, vilket leder till en hög grad av falsk screening. Däremot, även om vår föreslagna metod har en mindre screeningskala jämfört med metoder med hög genomströmning, erbjuder den ett mer enkelt och kostnadseffektivt tillvägagångssätt genom att direkt observera läkemedelseffekter på fenotyper. Detta visar på potentialen i att använda Drosophila-modellen för effektiv läkemedelsscreening och identifiering av läkemedelsmål.

Drosophila har en bevarad sömnregleringsmekanism och uppvisar sömnstörningar i samband med åldrande. Vi observerade att sömnlängden för 30 dagar gamla honflugor var signifikant kortare än för 7 dagar gamla flugor, medan sömnlängden för 30 dagar gamla hanflugor inte skilde sig signifikant från den för 7 dagar gamla flugor (Figur 6). Följaktligen valdes 30 dagar gamla flughonor ut för de aktuella experimenten. Screeningprocessen i flera omgångar genomfördes för att minimera oavsiktlig faktorinterferens. Läkemedelskoncentrationen i den första omgången sattes till 20 μM för att undvika toxiska biverkningar som kan leda till flygdödlighet. I den andra screeningomgången höjdes läkemedelskoncentrationen till 50 μM för att bedöma läkemedlets effekter vid olika koncentrationer. Läkemedel som valdes ut från den andra omgången administrerades till hanflugor vid både 20 μM och 50 μM för att utvärdera könsskillnader i läkemedelseffekter. Detta gjorde det möjligt att screena för läkemedel som konsekvent visade sömnrelaterade effekter. Till exempel har Reserpine tidigare visat sig öka sömnen hos vuxna flugor i åldern 4-6 dagar31. Vi lyckades replikera detta resultat i vår modell med äldre flugor, där äldre honor visade en signifikant ökning av sömnen efter att ha fått Reserpine (Figur 5).

DMSO användes för att lösa upp läkemedlen, men dess potentiella toxicitet bör beaktas. Tidigare studier har visat att koncentrationer på 0,1 % till 0,25 % DMSO i odlingsmediet inte skadar råtthårceller inom 24 timmar, medan koncentrationer på 0,5 % till 6 % signifikant ökar celldöden36. På samma sätt har det visat sig att DMSO-koncentrationer på 0,1 % eller mindre inte påverkar uttrycket av viktiga läkemedelsmetabolismrelaterade enzymer eller transportörer i humana hepatocyter. Ändå kan högre koncentrationer framkalla förändringar i uttrycket37. Det bör dock noteras att 0,1 % DMSO har visat sig påverka livslängden avsevärt för honflugor men inte hanar38. Dessutom har intraperitoneal administrering av 15 % och 20 % DMSO visat sig störa sömnen hos råttor39. För att mildra den potentiella toxiciteten hos DMSO höll vi dess koncentration under 0,2 %.

För närvarande finns det två huvudsakliga metoder som används för att karakterisera beteendet hos Drosophila. En metod är baserad på videoanalys, som ger en mängd beteendeparametrar, inklusive flugposition, hastighet och subtila rörelser av kroppsdelar. Den andra metoden är baserad på infraröd strålfraktur, till exempel DAM-systemet. 40. Det är emellertid viktigt att notera att vissa videoanalysverktyg, såsom PySolo, är utformade för att studera flera flugor som är bosatta i en enda stad, vilket begränsar antalet flugor som kan placeras under enkamera41. Andra verktyg som C-trax42 och JAABA43 kan utföra populationsspårning men är beräkningsmässigt dyra och tidskrävande. För screening med hög genomströmning räcker det vanligtvis med att fånga flugornas totala sömnlängd, och exakta rörelseparametrar är inte nödvändiga. Därför är den allmänt använda och mycket skalbara metoden baserad på infraröd strålfraktur att föredra. Men denna metod har också sina begränsningar. Till exempel, om flugor bara rör sig i ena änden av röret utan att avbryta den infraröda strålen, kan systemet av misstag registrera det som sömn, vilket leder till en överskattning av sömn44. Dessutom är det viktigt att noggrant testa flugstammens rörlighet innan den används i screening för att undvika oavsiktlig påverkan.

Här är några användbara tips för en lyckad installation: (1) För att förhindra att maten fastnar på glasröret när man tar bort det från den lilla bägaren efter stelning, kan man prova att föra in glasröret vertikalt i botten av den lilla bägaren innan maten stelnar. Att försiktigt dra glasröret fram och tillbaka, knacka på botten av bägaren så att luft kan komma in, långsamt rotera bägaren för att ta bort all mat och glasröret och sedan försiktigt torka bort eventuell kvarvarande mat på glasrörets yttervägg kan vara effektivt. (2) När du förseglar matänden av glasröret med paraffinfilm, rekommenderas att använda ett vattenbad för att långsamt värma filmen tills paraffinet smälter. Detta tillvägagångssätt hjälper till att undvika problemet med att den medicinska maten stänker våldsamt vid höga temperaturer och förorenar paraffinfilmen. Alternativt kan man använda små plastlock för försegling, men se till att luft kan komma in under förseglingen, vilket gör att maten trycks upp överlag. (3) Det är värt att tänka på att vissa potenta sömnfrämjande läkemedel till en början kan leda till en felaktig bedömning av testade flugor som döda. För att lösa detta problem rekommenderas det att ställa in en koncentrationsgradient, vilket gör det möjligt att utforska den optimala läkemedelskoncentrationen och upprepa experimentet. (4) Ta hänsyn till att läkemedlets lukt kan påverka mängden mat som äts av flugorna och deras intag av läkemedlet, vilket kan påverka noggrannheten i de experimentella resultaten. Därför kan det vara fördelaktigt att förlänga experimentets varaktighet på lämpligt sätt, se till att flugorna har gott om tid att konsumera så mycket läkemedel som möjligt och öka läkemedlets ackumuleringseffekt. (5) För databehandling har många universitet och institut tillgång till Matlab för allmänt bruk, men det finns billigare alternativ tillgängliga för individer eller forskningsinstitutioner som ännu inte har köpt programmet. Ett rekommenderat alternativ är ShinyR-DAM v3.1 «Refresh»45.

Sammanfattningsvis har vi utvecklat en steg-för-steg-procedur för screening av läkemedel för att behandla sömnstörningar. Med hjälp av en äldre flugmodell som uppvisar en fenotyp av kortare sömnlängd, valideras effekten av Reserpine för att öka sömnlängden hos äldre honflugor. Denna metod erbjuder ett nytt tillvägagångssätt för läkemedelsscreening med betydande tillämpningspotential och fungerar som en grund för ytterligare läkemedelsforskning. Läkemedelseffekter bedöms utifrån fenotyper, men den underliggande verkningsmekanismen är fortfarande okänd. Ytterligare studier kommer att genomföras för att undersöka patologin för sömnstörningar och den molekylära regleringen av sömn, och därigenom belysa de farmakologiska mekanismer som är involverade. Även om det cirkadiska maskineriet hos Drosophila har likheter med mänskliga oscillatorer, bör man inte förbise skillnader i sömnkontrollmekanismer mellan människor och flugor. Detta protokoll ger ett grundläggande ramverk för läkemedelsscreening för sömnstörningar. Framtida forskning kommer dock att avgöra om något av de screenade läkemedlen kan användas för klinisk behandling, samt belysa deras verkningsmekanismer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna redovisar inga motstridiga intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Prof. Junhai Hans labbmedlemmar för deras diskussion och kommentarer. Detta arbete stöddes av National Natural Science Foundation of China 32170970 till Y.T och "Cyanine Blue Project" i Jiangsu-provinsen till Z.C.Z.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Ager BIOFROXX 8211KG001
Artificial Climate Box PRANDT PRX-1000A official website:https://www.nbplt17.com/PLTXBS-Products-20643427/
DAM2 Drosophila Activity Monitor TriKineics DAM2 official website:https://www.trikinetics.com/
DAM2system TriKineics version:v3.03 official website:https://www.trikinetics.com/
DAMFileScan TriKineics version:1.0.7.0 official website:https://www.trikinetics.com/
Dimethyl Sulfoxide SIGMA 276855
Drosophila Activity Monitoring Incubator Tritech Research DT2-CIRC-TK official website:https://www.tritechresearch.com/DT2-CIRC-TK.html
Drosophila Bottles Biologix 51-17720 official website:http://biologixgroup.com/goods.php?id=48
Drosophila: w1118 Bloomington Drosophila Stock Center  BDSC_3605
Excel Microsoft version:Excel 2016 official website:https://www.microsoftstore.com.cn/software/office/excel
Glass tubes TriKinetics PPT5x65 official website:https://www.trikinetics.com/
MATLABR2022b MathWorks version:9.13.0.2049777 official website:https://ww2.mathworks.cn/products/matlab.html
Prism GraphPad Version:Prism 8.0.1 official website:https://www.graphpad.com/features
Reserpine MACKLIN R817202-1g
Saccharose SIGMA 1245GR500
SCAMP Vecsey Lab N/A official website:https://academics.skidmore.edu/blogs/cvecsey/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Le Bon, O. Relationships between REM and NREM in the NREM-REM sleep cycle: a review on competing concepts. Sleep Medicine. 70, 6-16 (2020).
  2. Krueger, J. M., Frank, M. G., Wisor, J. P., Roy, S. Sleep function: Toward elucidating an enigma. Sleep Medicine Reviews. 28, 46-54 (2016).
  3. Ohayon, M. M., Carskadon, M. A., Guilleminault, C., Vitiello, M. V. Meta-analysis of quantitative sleep parameters from childhood to old age in healthy individuals: developing normative sleep values across the human lifespan. Sleep. 27 (7), 1255-1273 (2004).
  4. Li, S. B., et al. Hyperexcitable arousal circuits drive sleep instability during aging. Science. 375 (6583), eabh3021 (2022).
  5. Rodriguez, J. C., Dzierzewski, J. M., Alessi, C. A. Sleep problems in the elderly. Medical Clinics of North America. 99 (2), 431-439 (2015).
  6. Gulia, K. K., Kumar, V. M. Sleep disorders in the elderly: a growing challenge. Psychogeriatrics. 18 (3), 155-165 (2018).
  7. Wolkove, N., Elkholy, O., Baltzan, M., Palayew, M. Sleep and aging: 1. Sleep disorders commonly found in older people. Canadian Medical Association Journal. 176 (9), 1299-1304 (2007).
  8. Suzuki, K., Miyamoto, M., Hirata, K. Sleep disorders in the elderly: Diagnosis and management. Journal of General and Family Medicine. 18 (2), 61-71 (2017).
  9. Foley, D. J., et al. Sleep complaints among elderly persons - an epidemiologic-study of 3 communities. Sleep. 18 (6), 425-432 (1995).
  10. Yu, D. S. Insomnia Severity Index: psychometric properties with Chinese community-dwelling older people. Journal of Advanced Nursing. 66 (10), 2350-2359 (2010).
  11. Hoevenaar-Blom, M. P., Spijkerman, A. M., Kromhout, D., van den Berg, J. F., Verschuren, W. M. Sleep duration and sleep quality in relation to 12-year cardiovascular disease incidence: the MORGEN study. Sleep. 34 (11), 1487-1492 (2011).
  12. Rebok, G. W., Rovner, B. W., Folstein, M. F. Sleep disturbance and Alzheimer's disease: relationship to behavioral problems. Aging (Milano). 3 (2), 193-196 (1991).
  13. Schroeck, J. L., et al. Review of safety and efficacy of sleep medicines in older adults. Clinical Therapeutics. 38 (11), 2340-2372 (2016).
  14. Pericic, D., Strac, D. S., Jembrek, M. J., Vlainic, J. Allosteric uncoupling and up-regulation of benzodiazepine and GABA recognition sites following chronic diazepam treatment of HEK 293 cells stably transfected with alpha1beta2gamma2S subunits of GABA (A) receptors. Naunyn-Schmiedeberg's Archives of Pharmacology. 375 (3), 177-187 (2007).
  15. Lader, M. History of benzodiazepine dependence. Journal of Substance Abuse Treatment. 8 (1-2), 53-59 (1991).
  16. Chen, P. L., Lee, W. J., Sun, W. Z., Oyang, Y. J., Fuh, J. L. Risk of dementia in patients with insomnia and long-term use of hypnotics: a population-based retrospective cohort study. Plos One. 7 (11), e49113 (2012).
  17. Kang, D. Y., et al. Zolpidem use and risk of fracture in elderly insomnia patients. Journal of Preventive Medicine and Public Health. 45 (4), 219-226 (2012).
  18. Kao, C. H., et al. Relationship of zolpidem and cancer risk: a Taiwanese population-based cohort study. Mayo Clinic Protocols. 87 (5), 430-436 (2012).
  19. Sateia, M. J., Kirby-Long, P., Taylor, J. L. Efficacy and clinical safety of ramelteon: an evidence-based review. Sleep Medicine Reviews. 12 (4), 319-332 (2008).
  20. Friedrich, M. E., et al. Drug-induced liver injury during antidepressant treatment: results of amsp, a drug surveillance program. The International Journal of Neuropsychopharmacology. 19 (4), pyv126 (2016).
  21. Entzeroth, M., Flotow, H., Condron, P. Overview of high-throughput screening. Current Protocols in Pharmacology. Chapter 9, (2009).
  22. Ferreira, L. G., Dos Santos, R. N., Oliva, G., Andricopulo, A. D. Molecular docking and structure-based drug design strategies. Molecules. 20 (7), 13384-13421 (2015).
  23. Campbell, S. S., Tobler, I. Animal sleep - a review of sleep duration across phylogeny. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 8 (3), 269-300 (1984).
  24. Hendricks, J. C., Sehgal, A., Pack, A. I. The need for a simple animal model to understand sleep. Progress in Neurobiology. 61 (4), 339-351 (2000).
  25. Hendricks, J. C., et al. Rest in Drosophila is a sleep-like state. Neuron. 25 (1), 129-138 (2000).
  26. Shaw, P. J., Cirelli, C., Greenspan, R. J., Tononi, G. Correlates of sleep and waking in Drosophila melanogaster. Science. 287 (5459), 1834-1837 (2000).
  27. Ly, S., Pack, A. I., Naidoo, N. The neurobiological basis of sleep: Insights from Drosophila. Neuroscience & Biobehavioral Reviews. 87, 67-86 (2018).
  28. Jeibmann, A., Paulus, W. Drosophila melanogaster as a model organism of brain diseases. International Journal of Molecular Sciences. 10 (2), 407-440 (2009).
  29. Morse, D., Sassone-Corsi, P. Time after time: inputs to and outputs from the mammalian circadian oscillators. Trends in Neuroscience. 25 (12), 632-637 (2002).
  30. De Nobrega, A. K., Lyons, L. C. Drosophila: an emergent model for delineating interactions between the circadian clock and drugs of abuse. Neural Plasticity. 2017, 4723836 (2017).
  31. Reppert, S. M., Weaver, D. R. Coordination of circadian timing in mammals. Nature. 418 (6901), 935-941 (2002).
  32. Koudounas, S., Green, E. W., Clancy, D. Reliability and variability of sleep and activity as biomarkers of ageing in Drosophila. Biogerontology. 13 (5), 489-499 (2012).
  33. Nall, A. H., Sehgal, A. Small-molecule screen in adult Drosophila identifies VMAT as a regulator of sleep. Journal of Neuroscience. 33 (19), 8534-8464 (2013).
  34. Jin, X., Gu, P., Han, J. Protocol for Drosophila sleep deprivation using single-chip board. STAR Protocols. 2 (4), 100827 (2021).
  35. Kashyap, A., Singh, P. K., Silakari, O. Counting on fragment based drug design approach for drug discovery. Current Topics in Medicinal Chemistry. 18 (27), 2284-2293 (2018).
  36. Qi, W., Ding, D., Salvi, R. J. Cytotoxic effects of dimethyl sulphoxide (DMSO) on cochlear organotypic cultures. Hearing Research. 236 (1-2), 52-60 (2008).
  37. Nishimura, M., Ueda, N., Naito, S. Effects of dimethyl sulfoxide on the gene induction of cytochrome P450 isoforms, UGT-dependent glucuronosyl transferase isoforms, and ABCB1 in primary culture of human hepatocytes. Biological and Pharmaceutical Bulletin. 26 (7), 1052-1056 (2003).
  38. Solovev, I. A., Shaposhnikov, M. V., Moskalev, A. A. Chronobiotics KL001 and KS15 extend lifespan and modify circadian rhythms of Drosophila melanogaster. Clocks Sleep. 3 (3), 429-441 (2021).
  39. Cavas, M., Beltran, D., Navarro, J. F. Behavioural effects of dimethyl sulfoxide (DMSO): changes in sleep architecture in rats. Toxicology Letters. 157 (3), 221-232 (2005).
  40. Pfeiffenberger, C., Lear, B. C., Keegan, K. P., Allada, R. Locomotor activity level monitoring using the Drosophila Activity Monitoring (DAM) System. Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (11), 5518 (2010).
  41. Gilestro, G. F. Video tracking and analysis of sleep in Drosophila melanogaster. Nature Protocols. 7 (5), 995-1007 (2012).
  42. Branson, K., Robie, A. A., Bender, J., Perona, P., Dickinson, M. H. High-throughput ethomics in large groups of Drosophila. Nature Methods. 6 (6), 451-457 (2009).
  43. Kabra, M., Robie, A. A., Rivera-Alba, M., Branson, S., Branson, K. JAABA: interactive machine learning for automatic annotation of animal behavior. Nature Methods. 10 (1), 64-67 (2013).
  44. Donelson, N. C., et al. High-resolution positional tracking for long-term analysis of Drosophila sleep and locomotion using the "tracker" program. Plos One. 7 (5), e37250 (2012).
  45. Cichewicz, K., Hirsh, J. ShinyR-DAM: a program analyzing Drosophila activity, sleep and circadian rhythms. Communications Biology. 1, 25 (2018).

Tags

Hög genomströmning Screening av småmolekylära läkemedel Åldersrelaterade sömnstörningar Drosophila melanogaster Sömnlängd Fragmenterade mönster Äldre Sjukdomar Diabetes Hjärt-kärlsjukdomar Psykiska störningar Befintliga läkemedel Biverkningar Kognitiv försämring Missbruk Säkrare mediciner Effektiva sömnstörningsmediciner Kostnadseffektiv screeningmetod Sömnregleringsmekanism Modellorganism Infraröd övervakningsanordning Sömn och dygnsrytmanalys MATLAB-programmet 2020 (SCAMP2020) protokoll för lågkostnadskontroll
Storskalig småmolekylär läkemedelsscreening för åldersrelaterade sömnstörningar med hjälp av <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han,… More

Zhang, Z., Wang, Y., Zhao, J., Han, S., Zhang, Z. C., Tian, Y. High-Throughput Small Molecule Drug Screening For Age-Related Sleep Disorders Using Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (200), e65787, doi:10.3791/65787 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter