Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65428
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 1,2, 1,2
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Irving Medical Center, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center

Summary

Hydrogenperoxid (H2O2) er både en kilde til oxidativ skade og et signalmolekyle. Denne protokol beskriver, hvordan man måler mitokondriel H2 O2 ved hjælp af mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), en genetisk kodet ratiometrisk biosensor, i levende gær. Det beskriver, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene og udfører kvantitativ cellulær og subcellulær analyse ved hjælp af frit tilgængelig software.

Abstract

Mitokondriel dysfunktion eller funktionel ændring findes i mange sygdomme og tilstande, herunder neurodegenerative og muskuloskeletale lidelser, kræft og normal aldring. Her beskrives en tilgang til vurdering af mitokondriefunktion i levende gærceller ved cellulære og subcellulære opløsninger ved hjælp af en genetisk kodet, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensoren, mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), detekterer hydrogenperoxid (H2O2) i mitokondrier. Den består af en mitokondriesignalsekvens smeltet sammen med et cirkulært permuteret fluorescerende protein og H2O2-responsivt domæne af et bakterielt OxyR-protein. Biosensoren genereres og integreres i gærgenomet ved hjælp af et CRISPR-Cas9 markørfrit system for mere konsistent ekspression sammenlignet med plasmidbårne konstruktioner.

mtHyPer7 er kvantitativt målrettet mod mitokondrier, har ingen påviselig effekt på gærvæksthastighed eller mitokondriemorfologi og giver en kvantitativ aflæsning for mitokondrielH2O2under normale vækstbetingelser og ved udsættelse for oxidativt stress. Denne protokol forklarer, hvordan man optimerer billeddannelsesforholdene ved hjælp af et spindeskivekonfokalmikroskopsystem og udfører kvantitativ analyse ved hjælp af frit tilgængelig software. Disse værktøjer gør det muligt at indsamle rig rumlig tidsmæssig information om mitokondrier både inden for celler og blandt celler i en population. Desuden kan arbejdsgangen beskrevet her bruges til at validere andre biosensorer.

Introduction

Mitokondrier er essentielle eukaryote cellulære organeller, der er velkendte for deres funktion i at producere ATP gennem oxidativ phosphorylering og elektrontransport1. Derudover er mitokondrier steder til calciumopbevaring, syntese af lipider, aminosyrer, fedtsyre og jern-svovlklynger og signaltransduktion 2,3. Inden for celler danner mitokondrier et dynamisk netværk med karakteristisk morfologi og fordeling, som varierer alt efter celletype og metabolisk tilstand. Selvom mitokondrier kan smelte sammen og dele sig, er ikke alle mitokondrier i en celle ækvivalente. Talrige undersøgelser har dokumenteret mitokondriernes funktionelle heterogenitet i individuelle celler i attributter som membranpotentiale og oxidativ tilstand 4,5,6. Denne variation i mitokondriefunktionen skyldes dels beskadigelse af organellen fra mtDNA-mutationer (som forekommer med en højere hastighed end i nukleært DNA) og oxidativ skade forårsaget af reaktive oxygenarter (ROS), der genereres både inden for og uden for organellen 7,8,9. Skader på organellen afbødes af mitokondrie kvalitetskontrolmekanismer, der reparerer skaden eller eliminerer mitokondrier, der er beskadiget uden reparation10.

Hydrogenperoxid (H2O2) er en reaktiv oxygenart, der er en kilde til oxidativ skade på cellulære proteiner, nukleinsyrer og lipider. Imidlertid tjenerH2O2også som et signalmolekyle, der regulerer cellulære aktiviteter gennem reversibel oxidation af thioler i målproteiner11,12. H2O2 fremstilles af elektroner, der lækker fra mitokondrieelektrontransportkæden og af specifikke enzymer, såsom NADPH-oxidase og monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det er også inaktiveret af antioxidant systemer, herunder dem, der er baseret på thioredoxin og glutathion21,22,23. Således er analyse af mitokondrie H2O2-niveauer afgørende for at forstå denne metabolits rolle i normal mitokondriel og cellulær funktion og under betingelser med oxidativ stress.

Det overordnede mål med denne protokol er at detektere mitokondrie H2O2 ved hjælp af en genetisk kodet ratiometriskH2O2biosensor, HyPer7, der er målrettet mod organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 er en kimær bestående af mitokondriesignalsekvensen fra ATP9 (Su9-præsekvensen), en cirkulært permuteret form af grønt fluorescerende protein (GFP) og H2O2-bindingsdomænet for OxyR-proteinet fra Neisseria meningitidis24 (figur 1). I cirkulært permuteret GFP smeltes N- og C-termini af native GFP, og nye terminer dannes nær kromoforen, hvilket giver større mobilitet til proteinet og større labilitet af dets spektrale egenskaber sammenlignet med native GFP25. Interaktionen mellem mtHyPer7s OxyR-domæne og H2O2 er højaffinitet,H2O2-selektivog fører til reversibel oxidation af de konserverede cysteinrester og disulfidbrodannelse. Konformationsændringer forbundet med oxidationen af OxyR overføres til den cirkulært permuterede GFP i mtHyPer7, hvilket resulterer i et spektralskift i excitationsmaksimumet for mtHyPer7-kromoforen fra 405 nm i reduceret tilstand til 488 nm i H2O2-oxideret tilstand26. Således afspejler forholdet mellem fluorescens fra mtHyPer7 som reaktion på excitation ved 488 nm versus 405 nm oxidationen af sonden medH2O2.

Ideelt set bør en biosensor give en absolut, kvantitativ aflæsning i realtid af dets målmolekyle. Desværre er dette dog ikke altid muligt i målinger i den virkelige verden. I tilfælde af oxidationssensorer, såsom mtHyPer7, påvirkes realtidsaflæsningen af reduktionshastigheden for disulfidbroen. De reduktionssystemer, der anvendes af ROS-biosensorer, er forskellige, og disse kan dramatisk ændre sonderesponsdynamikken - som vist ved sammenligningen af HyPer7, reduceret med thioredoxinsystemet, og roGFP2-Tsa2ΔCR, reduceret med glutathion-in gærcytosol27. For at drage en konklusion om den relativeH2O2-koncentrationfra mtHyPer7-forhold må man således antage, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under eksperimentet. Uanset disse overvejelser er HyPer7 og relaterede sonder blevet brugt i forskellige sammenhænge til at indhente oplysninger om H2O2i levende celler25,28,29.

Figure 1
Figur 1: Design, molekylær mekanisme og excitations-/emissionsspektre af H2O2-biosensoren mtHyPer7. (A) mtHyPer7-sonden er afledt ved at indsætte cirkulært permuteret GFP i OxyR-RD-domænet fra Neisseria meningitidis. Den indeholder mitokondriemålretningssekvensen fra underenhed 9 af ATP-syntase fra Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration af H 2 O2-sensormekanismeni mtHyPer7. Oxidation af cysteiner i RD-domænet øger fluorescensemission ved excitation ved 488 nm og reducerer emission produceret ved excitation ved 405 nm. C) Excitations- og emissionsspektre for HyPer7 i oxideret og reduceret form. Denne figur er genoptrykt med tilladelse fra Pak et al.24. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; cpGFP = cirkulært permuteret GFP. Klik her for at se en større version af denne figur.

Denne ratiometriske billeddannelse af mtHyPer7 giver vigtige fordele for mitokondriel H2O2-kvantificering24,27; Det giver en intern kontrol for sondekoncentration. Desuden er skiftet i excitationstop produceret af H2O2-eksponering ikke fuldstændigt, selv i mættende koncentrationer afH2O2. Således kan forholdsbilleddannelse øge følsomheden ved at inkorporere to spektralpunkter i analysen.

Den mtHyPer7-sonde, der anvendes her, har en meget høj affinitet forH2O2og relativt lav følsomhed over for pH24 og er med succes blevet målrettet mod Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Dette protein er også blevet brugt i gær27,31. Tidligere undersøgelser var imidlertid afhængige af plasmidbåren ekspression af mtHyPer7, hvilket resulterer i celle-til-celle-variabilitet i sondeekspression27. Derudover blev konstruktionen beskrevet i denne protokol integreret i en bevaret, genfri region på kromosom X32 ved hjælp af en CRISPR-baseret tilgang til markørfri integration. Ekspressionen af det integrerede biosensorgen styres også af den stærke konstitutive TEF1-promotor (figur 2). Som et resultat er der mere stabil, konsistent ekspression af biosensoren i gærcellepopulationer sammenlignet med den, der observeres ved hjælp af plasmidbåren biosensorekspression, og celler, der bærer biosensoren, kan formeres uden behov for selektive medier.

Figure 2
Figur 2: Generering af mtHyPer7-ekspressive celler ved hjælp af CRISPR. Den Cas9- og sgRNA-holdige plasmid- (YN2_1_LT58_X2site) og PCR-amplificerede mtHyPer7-holdige biosensorkonstruktion indføres i spirende gærceller ved lithiumacetattransformation. Det genfrie indsættelsessted på kromosom X (X2) genkendes og skæres af Cas9-protein med sgRNA'et, og biosensoren integreres i genomet ved homolog rekombination. Efter identifikation af de vellykkede transformanter ved mikroskopisk screening, koloni-PCR og sekventering fjernes Cas9-plasmidet (helbredes) ved vækst i ikke-selektive medier. Forkortelser: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkriptionsforstærkerfaktor. Klik her for at se en større version af denne figur.

Endelig tilbyder mtHyPer7 fordele i forhold til andre ROS-biosensorer. For eksempel kan organiske farvestoffer, der anvendes til at detektere ROS (f.eks. Dihydroethidium [DHE]2 og MitoSOX3), producere ujævn eller uspecifik farvning og leveres ofte i opløsningsmidler såsom ethanol eller dimethylsulfoxid, som kræver yderligere kontrol for opløsningsmiddelvirkninger. En anden klasse af ROS-biosensorer er fluorescensresonansenergioverførselsbaserede (FRET) -baserede biosensorer (f.eks. Redoxfluor til cellulær redoxtilstand4 og peroxidsensorerne HSP-FRET5, OxyFRET 6 og PerFRET6). Disse sonder er genetisk kodede og meget følsomme i princippet og kan kvantitativt målrettes mod mitokondrier ved hjælp af velkarakteriserede mitokondriesignalsekvenser. Der er dog udfordringer i brugen af FRET-baserede sonder, herunder baggrund på grund af krydsexcitation og gennemblødning, og strenge krav til fluoroforernes nærhed og orientering for FRET for at forekomme33,34. Derudover består FRET-sonder af to fluorescerende proteiner, der kræver større konstruktioner til ekspression i celler af interesse sammenlignet med spektra-skiftende sonder. Protokollen beskrevet her blev udviklet for at drage fordel af styrkerne ved den HyPer7-baserede biosensor og for at bruge denne kompakte, ratiometriske, højaffinitet, genetisk kodede sonde til kvantitativ billeddannelse af peroxid i mitokondrier i levende gær.

Protocol

1. Generering af biosensorplasmidet, integration i gærgenomet og vurdering af målretningen af mtHyPer7 mod mitokondrier og virkninger på mitokondriemorfologi, cellulære væksthastigheder eller oxidativ stressfølsomhed

BEMÆRK: Se supplerende fil 1, supplerende tabel S1, supplerende tabel S2 og supplerende tabel S3 for henholdsvis biosensorplasmidkonstruktion, stammer, plasmider og primere, der anvendes til biosensorkonstruktion og karakterisering. Se materialefortegnelsen for detaljer vedrørende alle materialer, reagenser og instrumenter, der anvendes i denne protokol.

  1. Biosensorkonstruktionen forstærkes fra biosensorplasmidet ved hjælp af primerne Y290 og Y291 (figur 2) via polymerasekædereaktion (PCR).
  2. 500 ng Cas9/guide RNA-plasmidet (YN2_1_LT58_X2site32) blandes med 50 μL PCR-produkt fra trin 1.1 (biosensorkonstruktionen). Omdan blandingen til spirende gær ved hjælp af lithiumacetatmetoden35 og vælg transformanter på YPD-plader indeholdende 200 mg / ml G418.
  3. Screene kandidattransformanter ved PCR-amplifikation af genomisk DNA ved hjælp af primerne Y292 og Y293. For transformanter med et skær af den forventede størrelse (positiv: 3,5 kb; negativ: 0,3 kb) sekvenseres det indsatte område til yderligere validering.
  4. Evaluer biosensorens effekt på vækst og mitokondriefunktion (figur 3). Hvis biosensoren ser ud til at påvirke funktionen af celler eller mitokondrier, skal du prøve at minimere effekten ved at ændre promotoren, integrationsstedet eller forældrestammen.
    1. Bestem effekten af biosensorkonstruktionen på væksthastigheden i nærvær og fravær af en oxidativ stressor (f.eks. Paraquat), som beskrevet tidligere36.
      1. Midtlogfaseceller fortyndes til en 600 nm optisk densitet (OD 600) på 0,0035 i200 μL tilsvarende medier med og uden behandling i hvert hul i en 96-brønds fladbundet plade. Mål kulturens optiske tæthed hvert 20. minut i 72 timer ved hjælp af en pladelæser. Beregn den maksimale væksthastighed (hældning) som den maksimale ændring i OD over et interval på 240 minutter i løbet af 72 timers forløbet.
    2. Visualiser cellerne ved fluorescensmikroskopi og evaluer lysstyrken og mitokondriemorfologien som beskrevet tidligere37.
      1. Dyrk cellerne til midten af logfasen, pletter mitokondrierne med 250 nM MitoTracker Red i 30 minutter, og vask to gange før billeddannelse. Optag Z-stakke med 6 μm dybde med 0,3 μm intervaller på et vidvinkel- eller konfokal fluorescensmikroskop, og inspicer visuelt. Se efter mitokondrier, der danner aflange rørformede strukturer.

Figure 3
Figur 3: mtHyPer7 er målrettet mitokondrier og påvirker ikke mitokondriemorfologi, cellevækst eller følsomhed over for oxidativt stress. (A) Mitokondriemorfologi i levende gærceller, der udtrykker mtHyPer7. Venstre panel: mtHyPer7 visualiseret med 488 nm excitation. Midterste panel: mitokondrier mærket med 250 nM MitoTracker Red. Højre panel: flettede billeder. Fremskrivninger af maksimal intensitet vises. Cellekonturen vises med hvidt. Skalabjælke = 1 μm. (B,C) Vækstkurver og maksimal væksthastighed for vildtypeceller og celler, der udtrykker mtHyPer7 dyrket i nærvær (+PQ) eller fravær af 2,5 mM paraquat i YPD-medier. (D,E) Vækstkurver og maksimal væksthastighed for vildtype- og mtHyPer7-ekspressive celler, der er dyrket i nærvær (+PQ) eller fravær af 2,5 mM paraquat i SC-medier. Alle vækstkurver er middelværdien af tre uafhængige replikater. De maksimale vækstrater angives som middelværdien ± standardafvigelsen for middelværdien (SEM). Vækstkurveanalyse blev udført ved at fortynde midterste logfaseceller til en OD 600 på 0,0035 i200 μL tilsvarende medier i hver brønd i en 96-brønds fladbundet plade. Kulturens OD blev målt hvert 20. minut i 72 timer ved hjælp af en pladelæser. Hver stamme/tilstand blev belagt i tre eksemplarer, og den gennemsnitlige væksthastighed blev plottet. Den maksimale væksthastighed (hældning) blev beregnet ved hjælp af ændringerne i OD over et interval på 240 minutter i løbet af 72 timer. Forkortelser: WT = vildtype; PQ = paraquat. Klik her for at se en større version af denne figur.

2. Cellekultur og forberedelse til billeddannelse (figur 4)

  1. Formere cellerne i syntetisk medium til mid-log-fasen til billeddannelse. En 5 ml mid-log fase kultur giver nok celler til fire eller fem dias og i alt >100 spirende celler til analyse.
    1. Om morgenen dagen før forsøget fremstilles flydende forkulturer ved at inokulere 5 ml syntetisk komplet (SC) medium i et 50 ml konisk bundrør med en enkelt koloni af gærceller.
    2. Forkulturen inkuberes i en orbitalryster ved 200 omdr./min. og 30 °C i 6-8 timer. Mål OD 600 for forkulturen, som skal være i midterlogfasen: ~ 0,5-1 × 107 celler / ml, OD600 ~ 0,1-0,3.
    3. Forbered en mid-log fase kultur ved hjælp af forkulturen til billeddannelse den næste dag. Beregn mængden af prækultur, der er nødvendig for en mid-log fase kultur efter vækst natten over (8-16 timer). Når cellerne dyrkes i SC-medium, er fordoblingstiden ~ 2 timer. Derfor beregnes volumenet (V) af forkultur til podning af en 5 ml overnight kultur ved hjælp af ligning (1):
      Equation 1(1)
    4. Der podes 5 ml SC-substrat i et 50 ml konisk bundrør med mængden af forkultur beregnet i trin 2.1.3. Voks i en orbitalryster ved 200 o / min og 30 ° C i 8-16 timer.
  2. På billeddannelsesdagen skal du bekræfte, at den kultur, der genereres i trin 2.1.4, er i midtlogfasen (OD600 ~ 0,1-0,3). Koncentrer cellerne fra 1 ml af midterlogfasekulturen ved centrifugering ved 6.000 × g i 30 s. Supernatanten fjernes, og der efterlades 10-20 μL supernatant i tuben. Resuspender cellepillen ved forsigtigt at blande med restmedier ved hjælp af en mikropipette.
  3. Brug en luftblæser eller fnugfrit væv til at fjerne støv fra et glasmikroskopglas, og tilsæt 1,8 μL af cellesuspensionen til diaset. Dæk cellerne med en # 1.5 (170 μm tyk) glasdæksel, sænk dækslet langsomt i en vinkel for at undgå at indføre bobler.
  4. Billede med det samme, og kassér diaset efter 10 minutters billeddannelse.

Figure 4
Figur 4: Cellevækst og billeddannelse. Spirende gærceller, der udtrykker mtHyPer7, dyrkes til midten af logfasen. Billeder i Z-serien indsamles ved konfokalmikroskopi med roterende skiver og udsættes derefter for 3D-rekonstruktion og analyse. Se protokollens afsnit 2-3. Klik her for at se en større version af denne figur.

3. Optimering af billedbehandlingsforhold og billedindsamling (figur 5)

  1. Vælg en billedtilstand. Til optisk sektionering uden efterbehandling foretrækkes et spindeskivekonfokalinstrument. Men hvis signalet er lavt, eller dette instrument ikke er tilgængeligt, skal du bruge vidvinkelbilleddannelse og sikre, at vidvinkelbillederne deconvoleres for at fjerne sløring uden for fokus, som beskrevet tidligere38.
  2. Vælg optik. Brug et olienedsænkningsobjektiv med høj numerisk blænde, f.eks. 100x/1,45 Plan-Apochromat.
  3. Vælg excitations- og emissionsbølgelængder. Til spindeskivekonfokal billeddannelse skal du bruge en laserexcitation ved 405 nm og 488 nm og et standard GFP-emissionsfilter. Til vidvinkelbilleddannelse skal du bruge en lysdiode (LED) eller lampeexcitation, men sørg for, at filteropsætningen tillader variation af excitationen, mens du fører emission gennem standard GFP-filteret.
    BEMÆRK: Dette kan for eksempel opnås ved at fjerne excitationsfilteret fra en GFP-terning og bruge en LED eller et filterhjul til at vælge excitationen.
  4. Vælg eksponeringstid og belysningsintensitet.
    1. Fastlæg anskaffelsesbetingelser, der giver et let detekterbart signal og acceptabel opløsning i hver fluorescenskanal. For eksempel på et spindediskkonfokalmikroskop med et sCMOS-kamera skal du bruge 2 x 2 binning, 20-40 % lasereffekt og 200-600 ms eksponering.
    2. Undersøg billedhistogrammet. I et 12-bit billede (4.096 mulige gråtoner) skal du sørge for, at pixelværdiernes samlede dynamiske område er mindst flere hundrede gråtoner uden mætning (figur 5A). Sørg desuden for, at rækkevidden er en størrelsesorden højere end støjniveauet. Beregn støjniveauet som standardafvigelsen for pixelværdier i et cellefrit område af et billede, målt som beskrevet i trin 4.1.3.1.
    3. Test for fotoblegning eller billeddannelsesinduceret mitokondriestress under de valgte billeddannelsesbetingelser. Hvis der observeres overdreven fotoblegning eller en stigning i mitokondrielH2O2, skal du reducere lasereffekten og øge eksponeringen eller binning.
      1. Saml en time-lapse-serie af billeder uden forsinkelse mellem erhvervelser for at vurdere billeddannelsesforholdenes virkninger på signalstabilitet og oxidativ stress i mitokondrier. Brug mikroskopoptagelsessoftwaren eller ImageJ til at måle den gennemsnitlige pixelværdi i hver fluorescenskanal for at bekræfte signalstabilitet (<5% ændring; Figur 5B). Hvis eksperimentet ikke involverer time-lapse-billeddannelse, skal du sørge for, at fluorescensen er stabil over to eller tre gentagne Z-stakke (25-35 eksponeringer).
        BEMÆRK: Et fald i fluorescens af begge kanaler kan indikere fotoblegning; et fald i 405 nm-exciteret fluorescens ledsaget af en stigning i den 488 nm-exciterede kanal kan imidlertid indikere øget mitokondrielH2O2og billeddannelsesinduceret oxidativ stress i organellen.
  5. Hent billeder. Hvis du indsamler Z-stakke, skal du sørge for, at Z-intervallet er det samme for alle billeder i datasættet, og medtage hele cellen. For spirende gær, billede med et Z-interval på 0,5 μm og en samlet stakdybde på 6 μm. Hent billeder med transmitteret lys for at dokumentere cellegrænser.
  6. Analysér billeder manuelt eller halvautomatisk via de scripts, der er tilgængelige i supplerende fil 2 og i https://github.com/theresaswayne/biosensor, ved hjælp af Fiji-distributionen af ImageJ39 og statistiksoftwaren R (figur 6). I softwareinstruktionerne vises hierarkiske menukommandoer med fed skrift med "|", hvilket angiver en række menuvalg. Indstillinger og knapper vises med fed skrift.

Figure 5
Figur 5: Optimering af billeddannelse . (A) Evaluering af billeder og histogrammer for det korrekte intensitetsområde. Fremskrivninger af konfokale billeder med maksimal intensitet af roterende diskebilleder vises. Histogrammerne vises med både en lineær Y-akse (sort) og en Y-akse i logskala (grå) for at illustrere billedets dynamiske område. Venstre paneler: et støjende billede med lav intensitet og dynamisk rækkevidde. Centerpaneler: et billede med et acceptabelt dynamisk område (~1.000 gråtoner) og intensitet. Højre paneler: Et billede, der er forkert kontrastforstærket for at producere overdreven mætning. Skalabjælke = 1 μm. (B,C) Analyse af fotoblegning af mtHyPer7. Efterfølgende Z-stakke blev indsamlet uden forsinkelse, Z-stakke blev summeret, og den gennemsnitlige intensitet af mitokondrier blev målt og normaliseret til det første tidspunkt. Resultaterne fra de første tre tidspunkter (27 eksponeringer) vises. (B) Excitationsbølgelængde: 405 nm. (C) Excitationsbølgelængde: 488 nm. De viste værdier er gennemsnittet af tre celler fra hver af tre uafhængige forsøg. Klik her for at se en større version af denne figur.

4. Semiautomatiseret analyse med scripts

  1. Generer og mål forholdsbilleder ved hjælp af et biosensoranalysescript (f.eks. biosensor.ijm eller biosensor-image-subtraction.ijm).
    1. Vælg det script, du vil bruge. Protokollen til brug af hvert script er ens; Eventuelle forskelle vil blive specificeret i teksten.
      1. biosensor.ijm: I dette script korrigeres baggrund og støj ved hjælp af brugervalgte billedområder, faste værdier eller ingen subtraktion. Vælg metoder til baggrunds- og støjkorrektion uafhængigt.
      2. biosensor-image-subtraction.ijm: I dette script håndteres baggrund og støj begge af den samme brugervalgte metode, som kan være en af følgende: tomt billede, brugervalgt område i billedet, fast værdi eller ingen korrektion.
    2. I Fiji skal du åbne et Z-stakbillede med flere kanaler, der blev hentet i trin 3.5. Åbn den ønskede biosensoranalysescriptfil. Kør scriptet ved at klikke på Kør i vinduet Script Editor. Indtast de ønskede oplysninger i dialogvinduet, der vises.
      1. Vælg kanalnumrene på tælleren og nævneren til beregning af forhold. For mtHyPer7 er tælleren kanalen exciteret ved 488 nm, og nævneren er kanalen exciteret ved 405 nm. Vælg kanalnummeret på billedet med transmitteret lys, hvis det findes, eller 0 , hvis der ikke er nogen.
      2. Vælg den ønskede baggrundssubtraktionsmetode blandt følgende fire muligheder. Hvis baggrunden er relativt ensartet, skal du vælge Vælg et billedområde, som måler baggrundsniveauet i billedet direkte. Hvis baggrunden varierer betydeligt på tværs af feltet, skal du bruge scriptet biosensor-image-subtraction.ijm og vælge Tomt billede (for at indsamle et tomt billede til korrektion skal du optage en Z-stak med flere kanaler med identiske erhvervelsesbetingelser i et cellefrit synsfelt eller fra et dias lavet med cellefrit vækstmedium). Fast værdi tillader indtastning af en tidligere målt baggrundsværdi. Ingen efterlader baggrunden ukorrigeret, men kan reducere målingens præcision.
      3. Vælg den ønskede støjsubtraktionsmetode. Støjværdien bruges som en lavere tærskel på baggrundsfratrukne, maskerede kanalbilleder for at reducere effekten af tilfældig variation i detektorudlæsningen. Vælg Vælg et billedområde eller Fast værdi for at tillade indtastning af et tidligere målt støjniveau, som normalt fungerer godt, da støjniveauerne er konstante, hvis billeddannelsesforholdene holdes konstante. Du kan også vælge Ingen og bruge værdien 1 som den nedre tærskel, hvilket kan øge målingernes variabilitet.
      4. Vælg en tærskelalgoritme for at detektere mitokondrier nøjagtigt og konsekvent; Otsu eller MaxEntropy anbefales. Ideelt set skal du bruge den samme algoritme til alle billeder i et eksperiment, men sikre den nøjagtige genkendelse af mitokondrier. Brug en anden tærskelmetode, hvis der er ændringer i morfologien under et eksperiment.
      5. Vælg antallet af interesseområder pr. celle. Hvis du f.eks. måler forskelle mellem mor og knop, skal du vælge 2.
      6. Vælg outputmappen, hvor målinger og forholdsbilleder gemmes.
    3. Følg vejledningen til baggrunds- og støjkorrektion.
      1. Valg af område (hvis relevant): Hvis Vælg et billedområde blev valgt til baggrunds- eller støjmåling, skal du følge vejledningen for at tegne et baggrundsområde (uden for celler eller fluorescerende artefakter) ved hjælp af værktøjet til rektangel-ROI. Når du har tegnet området, skal du klikke på OK.
      2. Indtastning af fast værdi (hvis relevant): Hvis der blev valgt Fast værdi til baggrunds- eller støjmåling, skal du følge vejledningen for at indtaste baggrunds - og/eller støjværdier for hver fluorescenskanal.
      3. Tomt referencebillede (hvis relevant): Hvis Tomt billede blev valgt til baggrunds- eller støjkorrektion i scriptet biosensor-image-subtraction.ijm, skal du følge vejledningen for at vælge en tom billedfil.
    4. Markér ROI'er til måling. I kulturer midt i logfasen skal analysen begrænses til spirende celler.
      1. Tegn ROI'er svarende til individuelle celler eller subcellulære regioner baseret på lysfeltbilledet. ROI behøver ikke nøjagtigt at matche cellekonturen, da kun tærskelede mitokondrier inden for ROI måles. Du kan også åbne et tidligere gemt ROI-sæt: Klik på Mere i ROI Manager, og vælg derefter ROI-filen.
      2. Tryk på T , når du har oprettet hvert investeringsafkast for at føje det valgte investeringsafkast til ROI-styringen. I ROI-styringen skal du markere Vis alle for at dokumentere de celler, der blev markeret. Hvert tilføjet område vises som et nummereret element på listen ROI Manager. Hvis du analyserer mere end ét investeringsafkast pr. celle (f.eks. mor og knop), skal du markere investeringsafkastet i samme rækkefølge for hver analysebehandlet celle.
      3. Når alle de ønskede ROI'er er føjet til ROI Manager, skal du klikke på OK i dialogboksen Markér celler .
    5. Vælg måletabelformatet. I dialogboksen Multimåling, der vises, skal du markere Mål alle udsnit. Kontroller indstillingen En række pr. skive for at oprette en tabel med det ønskede format. Brug process_multiROI_tables. R-script til behandling af tabeller, der er oprettet med indstillingen Én række pr. udsnit; markér ikke Tilføj resultater. Gentag dette trin 3x (til måling af tælleren [488], nævneren [405] og forholdet [488/405] billeder).
    6. Scriptet gemmer outputfilerne i den mappe, der blev valgt i trin 4.1.2.6.
  2. Beregning af vægtede gennemsnitsforhold for hver region eller celle
    1. Ved hjælp af resultaterne opnået i det foregående trin beregnes de vægtede gennemsnitlige forhold for hver region eller celle ved hjælp af ligning (2). Beregn enten "pixelvis" eller "regionvis" forhold (se diskussionen for detaljer).
      Equation 2(2)
      BEMÆRK: Værdierne for areal og integreret tæthed (IntDen) omfatter kun pixel inden for de tærskelbaserede mitokondrier. Denne beregning kan automatiseres ved hjælp af process_multiROI_tables. R-script og R-statistisk software.
  3. Generer et billede med farvelagt forhold. Da ændringer i nuance (farve) er mere tydelige for det menneskelige øje end ændringer i intensitet, skal du konvertere forholdsværdien til en farveskala for lettere visuel fortolkning. Scriptet colorize_ratio_image.ijm farvelægger et billede med maskeforhold.
    1. I Fiji skal du åbne et forhold Z-stakbillede, der blev genereret i trin 4.1.6. Åbn scriptfilen colorize_ratio_image.ijm. Kør scriptet ved at klikke på Kør i vinduet Script Editor . Indtast de ønskede oplysninger i dialogvinduet, der vises.
      1. Farvelægningsmetode: I indstillingen Umoduleret vises alle mitokondriepixels med samme lysstyrke. Nogle billeder kan dog virke støjende, da både svage og lyse pixels bidrager til billedets forhold. For at reducere denne effekt skal du bruge indstillingen Intensitetsmoduleret .
      2. Mindste og maksimum viste værdi: Disse værdier styrer intervallet af forholdsværdier, der vil blive farvet. Vælg værdier nær de gennemsnitlige minimums- og maksimumsværdier, der er observeret i et eksperiment (baseret på de vægtede gennemsnitsforhold beregnet i trin 4.2.1). I et eksperiment skal du sørge for at erhverve alle billeder med identiske billeddannelsesbetingelser og vise alle billeder med identiske minimum- og maksimumværdier.
      3. Projektionstilstand: Z-stakke vises som projektioner for at vise hele mitokondriepopulationen. Fremspringet oprettes før farvning. Vælg Maks . for en maksimal intensitetsprojektion (bevarelse af maksimumforholdet og intensitetsværdierne) eller Gennemsnit for en fremskrivning af gennemsnitlig intensitet.
      4. Outputmappe: Vælg den mappe, hvor de farvelagte billeder skal gemmes.
    2. Hvis indstillingen Umoduleret blev valgt, skal du vælge et farveskema (opslagstabel; LUT) i det dialogvindue, der vises. Brug Fire - eller Rainbow RGB LUT'erne, der er indbygget i Fiji, eller en hvilken som helst ønsket LUT i ImageJ's .lut-format (Importer fra LUT-fil). Rainbow Smooth40 LUT anbefales (inkluderet i supplerende fil 2 og på GitHub).
    3. Scriptet gemmer outputfilerne i den mappe, der blev valgt i trin 4.3.1.4. Disse omfatter billedet med farvelagt forhold (Color_RGB.tif) og billedet med farvelagt forhold med en kalibreringslinje, der viser korrespondancen mellem forholdsværdier og billedfarve (Color_with_bar.tif).

5. Manuel analyse

BEMÆRK: Denne fremgangsmåde tager længere tid, men giver fleksibilitet i forbehandlingen og fastsættelsen af tærsklen.

  1. Korrekt til baggrund.
    1. Angiv indstillinger i Fiji.
      1. Klik på Analysér | Indstil målinger. I det dialogboksvindue, der vises, skal du markere afkrydsningsfelterne for Area, Mean, StdDev, IntDen og Display Label. Indstil decimalerne til 3.
      2. Klik på Rediger | Indstillinger | Indgang/udgang. I det dialogboksvindue, der vises, skal du markere afkrydsningsfelterne for Gem rækkenumre og Gem kolonneoverskrifter.
    2. For at øge følsomheden af forholdsberegningen skal du trække baggrunden fra hver fluorescenskanal. Hvis baggrunden er forholdsvis ensartet, måles gennemsnitsintensiteten af et cellefrit område i et billede, og denne værdi trækkes fra hele billedet (trin 5.1.2.1). Alternativt, hvis baggrunden varierer betydeligt på tværs af feltet, kan du bruge et tomt billede til korrektion (trin 5.1.2.2.).
      1. For at trække et brugervalgt område fra skal du klikke på Billede | Farve | Opdel kanaler, og hold alle kanalbillederne åbne, da de bliver nødvendige senere. For hver fluorescenskanal skal du tegne et investeringsafkast på baggrunden (uden for celler) og klikke på Analysér | Mål eller klik på Billede | Stakke | Mål stak. Overhold middelværdien af det investeringsafkast, der vises i tabellen Resultater . Klik på Rediger | Vælg Ingen og derefter Behandl | Matematik | Træk fra. I det dialogboksvindue, der vises, skal du indtaste den målte gennemsnitlige baggrundsværdi, afrundet til nærmeste heltal.
        BEMÆRK: Afrunding forhindrer fejl med binære operationer senere.
      2. Hvis du vil trække et tomt billede fra en datafil, skal du indsamle et tomt billede fra et helt cellefrit synsfelt eller fra et dias, der er forberedt med cellefrit vækstmedium. Klik på Behandl | Billedberegner. I det dialogvindue, der vises, skal du indstille handlingen til Subtraher og indstille Image1 og Image2 til henholdsvis cellebilledet og det tomme billede. Kontroller Opret nyt vindue og 32-bit resultat.
  2. For at begrænse analysen til mitokondrier skal du udføre segmentering. Da hver kanal kan ændre intensitet afhængigt af biosensorens tilstand, skal du bruge summen af de to kanaler til at definere mitokondrieområdet konsekvent.
    1. For at oprette et sumbillede skal du klikke på Behandl | Billedberegner. I det dialogboksvindue, der vises, skal du indstille handlingen til Tilføj og indstille Image1 og Image2 til de to baggrundssubtraherede fluorescerende kanaler i vilkårlig rækkefølge. Marker Opret nyt vindue og 32-bit resultat , og vent på, at et sumbillede vises.
    2. Indstil tærsklen for at definere mitokondrier på sumbilledet.
      1. Klik på Billede | Juster | Tærskelværdi. I vinduet Tærskel , der vises, skal du markere Mørk baggrund og Statakhistogram. Indstil metode til den ønskede algoritme (f.eks. Otsu eller MaxEntropy). Anvend automatisk tærskelværdi for reproducerbarhed, men hvis ingen automatisk metode er egnet, skal du justere tærsklen manuelt.
        BEMÆRK: Ideelt set bør den samme algoritme bruges til alle billeder i et eksperiment, men ændringer i morfologi under et eksperiment kan kræve en anden tærskelmetode under visse forhold.
      2. Når tærsklen er tilfredsstillende, skal du klikke på Anvend. I det dialogvindue, der vises, skal du vælge Konverter til maske. I dialogvinduet, der vises, skal du kontrollere Sort baggrund og lade de andre felter være umarkeret. Gem det resulterende maskebillede til evaluering af segmenteringsnøjagtigheden.
    3. Konverter maskeværdierne fra 0 og 255 til henholdsvis 0 og 1 ved at klikke på Proces | Matematik | Opdel. Indstil værdien til 255, og når du bliver bedt om det, skal du vælge muligheden for at behandle alle billeder.
    4. Anvend masken på de baggrundsindtrukne fluorescenskanaler ved at klikke på Proces | Billedberegner. I dialogvinduet, der vises, skal du indstille handlingen til Multiplicer. Indstil Billede1 og Billede2 til henholdsvis tællerkanalen og masken. tjek Opret nyt vindue og 32-bit resultat; Gentag maskemultiplikationen med nævnerens kanal.
    5. Forbered hver maskeret kanal til beregning af forhold ved at indstille baggrundspixlerne til NaN ("ikke et tal").
      1. Vælg den maskerede tællerkanal, og klik på Billede | Juster | Tærskelværdi. Klik på Indstil i vinduet Tærskelværdi, og i det dialogboksvindue, der vises, skal du indstille minimumet til det beregnede støjniveau eller til 1 og lade maksimumet være, som det er.
      2. I vinduet Tærskel skal du klikke på Anvend. I den næste dialogboks skal du vælge Indstil til NaN. Gentag for kanalen med maskeret nævner.
  3. Generer forholdsbilledet.
    1. Klik på Behandl | Billedberegner. I dialogvinduet, der vises, skal du indstille betjening til Opdel. Indstil Image1 og Image2 til henholdsvis de baggrundssubtraherede maskerede tæller- og nævnerkanaler. For mtHyPer7 er tælleren den oxiderede form exciteret ved 488 nm, og nævneren er den reducerede form exciteret ved 405 nm. Derfor indikerer højere forhold højereH2O2.
    2. Kontroller Opret nyt vindue og 32-bit resultat. Gem forholdsbilledet til analyse.
  4. Markér og kvantificer interesseområder. Hver celle eller subcellulært region vælges og gemmes som et investeringsafkast i ROI Manager. ROI'erne behøver ikke at matche cellekonturerne perfekt, da kun de maskerede mitokondrieregioner måles.
    1. Brug billedet af transmitteret lys til at forhindre bias ved at oprette ROI'er svarende til individuelle celler (eller subcellulære regioner). I mid-log fase kulturer, begrænse analysen til gærceller bærende knopper, som er aktivt involveret i celledeling. Tryk på T , når du har oprettet hvert investeringsafkast, for at føje det til ROI-styringen. Markér Vis alle for at dokumentere de celler, der blev markeret.
    2. Klik på forholdsbilledet oprettet ovenfor, og klik på Mere i ROI Manager ... | MultiMeasure. I det dialogboksvindue, der vises, skal du markere Mål alle udsnit. Kontroller ikke Tilføj resultater. Kontroller indstillingen En række pr. skive for at oprette en tabel med det ønskede format. Den process_multiROI_tables. R-scriptet behandler tabeller, der er oprettet med indstillingen Én række pr. udsnit i den statistiske software R.
    3. Gem resultaterne. Klik på vinduet Resultater og derefter på Filer | Gem og gem resultattabellen i .csv eller .xls format. Indstil filnavnet, så det svarer til billednavnet.
    4. Gem investeringsafkastene. I ROI-manager skal du først sørge for, at der ikke er valgt nogen ROI'er: Klik på Fravælg og derefter på Mere | Gem. Åbn de gemte ROI'er sammen med det originale billede i Fiji for at krydsreferere målingerne med billedet.
  5. De vægtede gennemsnitsforhold pr. celle eller region beregnes ved hjælp af de resultater, der er opnået i det foregående trin og ligning (3). Beregn enten "pixelvis" eller "regionvis" forhold (se diskussionen for detaljer).
    Equation 3(3)
    BEMÆRK: Areal- og integrerede tæthedsværdier omfatter kun pixel inden for de tærskelede mitokondrier. Denne beregning kan automatiseres ved hjælp af process_multiROI_tables. R-script i statistikprogrammet R.
  6. Generer et billede med farvelagt forhold.
    BEMÆRK: Farvelagte billeder kan være umodulerede, hvor alle mitokondriepixel vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmoduleret, hvor pixelintensiteten i det originale billede bruges til at indstille intensiteter i det farvelagte billede.
    1. Du fremstiller et umoduleret farvelagt billede på følgende måde:
      1. Åbn det forholdsbillede, der er genereret ovenfor. Klik på Billede | Dubler for at generere en kopi af billedet, og luk derefter det originale billede.
      2. Hvis billedet er en Z-stak, skal du enten markere et enkelt udsnit eller generere en Z-projektion for at få vist alle mitokondrier. Brug enten en maksimal intensitet (bibeholder det maksimale forhold og intensitetsværdierne ved hver XY-pixelkoordinat) eller en fremskrivning af gennemsnitsintensiteten.
      3. Klik på Billede | Slå tabeller op, og indstil LUT'en til det ønskede farveskema (f.eks. Rainbow RGB eller Fire [tilgængelig som standard i ImageJ]). Alternativt kan du klikke på Filer | Importer LUT, og vælg en ønsket LUT i ImageJ's .lut-format, f.eks. Rainbow Smooth40 (inkluderet i Supplemental File 2 og på GitHub). Sørg for, at LUT har en mørk farve tildelt 0-værdien.
      4. Indstil skærmkontrasten ved at klikke på Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast. Klik på Indstil i vinduet Lysstyrke/kontrast, og indtast de ønskede værdier for de viste værdier for Minimum og Maximum i det dialogvindue, der vises. For at maksimere de observerede farveforskelle skal du indstille disse til omtrent det minimum og maksimum, der opnås på tværs af alle billeder. Indstil alle billederne i et eksperiment til de samme kontrastniveauer.
        BEMÆRK: Klik ikke på Anvend, da dette vil ændre pixelværdierne og forhindre generering af en nøjagtig kalibreringslinje i næste trin.
      5. Tilføj en farvekalibreringslinje ved at klikke på Analysér | Værktøjer | Kalibreringsstang. I dialogvinduet, der vises, skal du kontrollere indstillingen Overlay for at fjerne bjælken, hvis det ønskes, ved at klikke på Billede | Overlejring | Fjern overlay.
      6. Tilføj eventuelt en skalalinje ved at klikke på Analysér | Værktøjer | Vægtbjælke. I dialogvinduet, der vises, skal du indstille den ønskede størrelse, placering og farve for bjælken. Kontroller indstillingen Overlay for at bevare farven på bjælken uanset den anvendte LUT.
      7. Generer et RGB-billede til offentliggørelse ved at klikke på Billede | Overlejring | Flad. Gem det resulterende billede.
        BEMÆRK: Dette billede er kun til præsentation eller offentliggørelse. Intensitetsværdierne ændres, så de ikke kan måles. Søjlerne brændes også permanent på billedet.
    2. Sådan opretter du et intensitetsmoduleret billede:
      1. Klik på Billede | Dubler for at generere en kopi af billedet, og luk derefter originalen.
      2. Hvis billedet er en Z-stak, skal du enten markere et enkelt udsnit eller generere en Z-projektion for at få vist alle mitokondrier.
      3. Indstil visningskontrasten for forholdsbilledet ved at klikke på Billede | Juster | Lysstyrke/kontrast, og klik på Indstil i vinduet Lysstyrke/kontrast. I dialogvinduet, der vises, skal du indtaste de ønskede værdier for de viste værdier for minimum og maksimum. For at maksimere de observerede farveforskelle skal du indstille disse til omtrent det minimum og maksimum, der opnås på tværs af alle billeder, og indstille alle billederne i et eksperiment til de samme kontrastniveauer. Klik på Anvend for at skalere pixelværdierne igen.
      4. Hvis du vil oprette en kalibreringslinje, skal du dublere dette forbedrede billede og generere en linje ved at gå til Analysér | Værktøjer | Kalibreringslinje. Konverter billedet og overlayet til RGB-format ved at klikke på Billede | Overlejring | Flad. Hvis du ønsker det, kan du indsætte denne bjælke på det intensitetsmodulerede RGB-billede, der er opnået i trin 5.6.2.12 til præsentation eller offentliggørelse.
      5. Opret et nyt billede med samme bredde og højde som billedet ved at klikke på Filer | Ny | Billede.... I dialogvinduet, der åbnes, skal du indstille parametrene som følger: Type: RGB; Fyld med: Sort; Bredde og højde: 9bredde og højde på billedet); Udsnit: 1.
      6. Konverter den nye stak til en HSB (nuance, mætning, lysstyrke) billedstak ved at klikke på Billede | Type | HSB stak.
      7. Klik på billedet med kontrastjusterede forhold ved at gå til Rediger | Vælg Alle og derefter Rediger | Kopiér. Klik derefter på HSB-stakken, vælg den første skive (nuance), og klik på Rediger | Indsæt for at overføre forholdsværdierne.
      8. Vælg udsnit 2 (Mætning) i HSB-stakken. Indstil forgrundsfarven til hvid ved at gå til Rediger | Indstillinger | Farver. Klik på Rediger | Vælg Alle og derefter Rediger | Fyld, og vælg Nej i det dialogboksvindue, der åbnes, for kun at udfylde det aktuelle udsnit med hvidt.
      9. Åbn rådatabilledet, og opdel kanalerne ved at klikke på Billede | Farve | Opdel kanaler.
      10. Generer gennemsnittet af de to forholdskanaler ved hjælp af billedberegneren og klik på Proces | Billedberegner. I det dialogboksvindue, der vises, skal du indstille handlingen til Gennemsnit og indstille Billede1 og Billede2 til henholdsvis tæller- og nævnerbillederne. Marker Opret nyt vindue.
      11. Klik på det gennemsnitlige billede, der er oprettet ovenfor, ved at navigere til Rediger | Vælg Alle og derefter Rediger | Kopiér. Klik derefter på HSB-stakken, vælg den tredje skive (værdi), og klik på Rediger | Sæt ind for at overføre intensitetsværdierne.
      12. Konverter HSB-stakken til RGB-farverummet ved at klikke på Billede | Type | RGB-farve. Gem det resulterende billede.

Figure 6
Figur 6: Skematisk oversigt over billedanalyse og præsentation. Konfokale billeder med roterende disk trækkes først fra i baggrunden. Mitokondrier segmenteres ved tærskelværdi og konverteres til masker for hver skive. Disse masker anvendes på begge kanaler, og de maskerede billeder bruges til at beregne forholdsbilledet. ROI'er trækkes for at måle mtHyPer7-forholdet i celler eller subcellulære regioner. Billeder med farvelagt forhold kan også genereres til datapræsentation. Skalabjælke = 1 μm. Forkortelse: ROI = region af interesse. Klik her for at se en større version af denne figur.

Representative Results

For at bekræfte, at mtHyPer7 er en egnet sonde til vurdering af mitokondrielH2O2, blev lokaliseringen af mtHyPer7 og dens virkning på gærmitokondrier og cellesundhed vurderet. For at vurdere målretningen af mtHyPer7 blev mitokondrier farvet med det vitale mitokondriespecifikke farvestof MitoTracker Red i kontrolgærceller og gær, der udtrykker mtHyPer7. Ved hjælp af MitoTracker Rødfarvning blev mitokondrier opløst som lange rørformede strukturer, der justerede langs moderknoppeaksen og akkumulerede i spidsen af knoppen og spidsen af modercellen distal til knoppen41. Mitokondriemorfologien var ens i kontrol- og mtHyPer7-ekspressive celler. Derudover er mtHyPer7 lokaliseret sammen med MitoTracker rødfarvede mitokondrier (figur 3A). Således blev mtHyPer7 effektivt og kvantitativt målrettet mod mitokondrier uden at påvirke normal mitokondriel morfologi eller distribution.

Dernæst blev der udført yderligere valideringseksperimenter for at vurdere effekten af mtHyPer7 på cellulær fitness og følsomhed over for oxidativt stress i mitokondrier. Væksthastighederne for mtHyPer7-ekspressive celler i rige eller syntetiske glukosebaserede medier (henholdsvis YPD eller SC) svarer til dem for utransformerede vildtypeceller (figur 3B, D). For at vurdere de mulige virkninger på oxidativt stress i mitokondrier blev kontrol- og mtHyPer7-ekspressionsgær behandlet med lave niveauer af paraquat, et redoxaktivt lille molekyle, der akkumuleres i mitokondrier og resulterer i forhøjede superoxidniveauer i organellen24,27. Hvis mtHyPer7-ekspression enten inducerer oxidativt stress i mitokondrier eller beskytter mitokondrier mod oxidativt stress, bør mtHyPer7-ekspressive celler udvise henholdsvis øget eller nedsat følsomhed over for paraquatbehandling. Behandling med lave niveauer af paraquat resulterede i et fald i gærvækstrater. Desuden var væksthastighederne for vildtype- og mtHyPer7-ekspressive celler i nærvær af paraquat ens (figur 3C, E). Derfor skabte ekspression af biosensoren ikke signifikante cellulære spændinger i spirende gærceller eller ændrede gærens følsomhed over for mitokondriel oxidativ stress.

I betragtning af beviserne for, at mtHyPer7 er egnet til at studere mitokondrie H2O2 i spirende gær, blev det testet, om mtHyPer7 kunne detektere mitokondriel H2O2 i vildtypegær i midten af logfasen og ændringer i mitokondriel H2O2 induceret af eksternt tilsatH2O2. Et H2O2-titreringseksperiment blev udført, og det gennemsnitlige oxiderede:reducerede (O/R) mtHyPer7-forhold blev målt i mitokondrier.

De automatiserede analysescripts producerede flere outputfiler.

Forholdsbilledet (forhold.tif): En Z-stak bestående af forholdet mellem de baggrundskorrigerede, tærskelstakke på 488 nm og 405 nm. Denne stak kan ses i Fiji uden yderligere behandling; Det anbefales dog at forbedre kontrasten og/eller farvelægge billedet som beskrevet i protokoltrin 4.3 eller 5.6 før visning.

Maskebilledet (maske.tif): En Z-stak, der består af de tærskelovertrukne mitokondrieområder, der bruges til analyse. Dette billede skal bruges til at evaluere nøjagtigheden af tærsklen.

De investeringsafkast, der bruges til analyse (ROI'er.zip): Når denne fil åbnes i Fiji sammen med kildebilledet, lægges ROI'erne oven på billedet for at krydshenvise resultattabellen og kildebilledet. Hvert investeringsafkast omdøbes med et cellenummer og et ROI-nummer.

Måletabeller (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv), der indeholder areal, gennemsnit og integreret tæthed af tærskelværdier mitokondrier for hvert udsnit i henholdsvis tæller-, nævner- og forholdsbillederne. I skiver, hvor mitokondrier var fraværende eller ude af fokus, registreres NaN.

En logfil (Log.txt), der dokumenterer de indstillinger, der bruges til baggrunds- og støjkorrektion, tærskelværdi og forholdsberegning.

O/R-forholdet mellem mtHyPer7 viste et dosisafhængigt respons på H2O2-koncentrationen, som nåede et plateau ved 1-2 mM eksternt tilsatH2O2(figur 7). Overraskende nok var HyPer7-forholdet lavere i cellerne udsat for 0,1 mMH2O2end i kontrolcellerne, selvom denne forskel ikke var statistisk signifikant. En forklaring på dette fænomen kan være et hormesisrespons, hvor eksponering for et lavt stressniveau kan fremkalde stressresponser, såsom antioxidantmekanismer, som igen sænker mængden af ROS, der kan påvises af sonden. Højere niveauer af stressorer kan derimod overvælde de interne stressresponser og resultere i en højere aflæsning fra HyPer7.

Figure 7
Figur 7: mtHyPer7's respons på eksternt tilsatteH2O2. (A) Maksimal projektion på 405 nm og 488 nm exciterede billeder og gennemsnitlig intensitetsprojektion af ratiometriske billeder af mtHyPer7 i midterste logfaseceller, der udsættes for forskellige koncentrationer afH2O2. Pseudocolor angiver det oxiderede:reduceret mtHyPer7-forhold (skala nederst). Skalabjælke = 1 μm. Cellekonturen vises med hvidt; n > 100 celler pr. tilstand. (B) Kvantificering af mtHyPer7 oxideret: reduceret forhold i spirende gærceller behandlet med forskellige koncentrationer af H 2 O2. Midlerne til fem uafhængige forsøg er vist, med forskelligt formede og farvede symboler for hvert forsøg. Gennemsnitlig ± SEM af forholdet mellem oxideret:reduceret mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (ingen behandling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (envejs ANOVA med Tukeys multiple sammenligningstest). P-værdier betegnes som: ****p < 0,0001. Klik her for at se en større version af denne figur.

Endelig viste tidligere undersøgelser, at montørmitokondrier, som er mere reducerede og indeholder mindre superoxid, fortrinsvis arves af gærdatterceller4, og at cytosoliske katalaser transporteres til og aktiveres i gærdatterceller42,43,44,45. Disse undersøgelser dokumenterer den asymmetriske arv af mitokondrier under gærcelledeling og en rolle for denne proces i dattercelleegnethed og levetid samt mor-datter aldersasymmetri. For at teste, om der er forskelle iH2O2mellem mødre og knopper, blev mtHyPer7 målt i knopper og moderceller. Forskelle i mitokondrie H2O2 blev observeret i gærceller, og et subtilt, men statistisk signifikant fald iH2O2-biosensoraflæsningblev påvist i mitokondrier i knoppen sammenlignet med dem i modercellen (figur 8). Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere resultater, at mitokondrier i knoppen er bedre beskyttet mod oxidativt stress. De giver også dokumentation for, at mtHyPer7 kan give en kvantitativ aflæsning for mitokondrieH2O2med cellulær og subcellulær opløsning i spirende gær.

Figure 8
Figur 8: MitokondrieH2O2-niveauer lavere i dattercellen. (A) Maksimal projektion af et ratiometrisk billede af mtHyPer7 i en repræsentativ celle. Pseudocolor angiver det oxiderede:reduceret mtHyPer7-forhold (skala nederst). Subcellulære forskelle i forholdet er tydelige (pilespidser). Skalabjælke = 1 μm. Cellekontur: hvid. (B) Forskel mellem mtHyPer7-forholdet i knoppe- og modercellen. For hver enkelt celle blev moderforholdsværdien trukket fra knoppeforholdsværdien og plottet som et punkt. n = 193 celler samlet fra fem uafhængige eksperimenter, vist med forskelligt farvede symboler for hvert eksperiment. Gennemsnitlig ± SEM af forskellen mellem mtHyPer7-forholdet i knoppe- og modercellerne: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (parret t-test) Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende tabel S1: Stammer anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte gærstammer. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S2: Plasmider anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte plasmider. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S3: Primere anvendt i denne undersøgelse. Liste over anvendte primere. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 1: Protokol til biosensorplasmidkonstruktion. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2: Scripts til automatiseret analyse. For hvert script leveres eksempelinputfiler og outputfiler. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

I denne protokol beskrives en metode til anvendelse af mtHyPer7 som biosensor til vurdering af mitokondrielH2O2i levende spirende gærceller. Biosensoren konstrueres ved hjælp af en CRISPR-baseret metode og indføres i en bevaret genfri region i gærgenomet uden brug af valgbare markører. Sammenlignet med plasmidbårne biosensorer udtrykkes integrerede sensorer i alle celler og på ensartede niveauer, hvilket giver mere pålidelige kvantificeringsresultater. Der anvendes ingen valgbare markører til at generere mtHyPer7-ekspressive celler, hvilket giver mulighed for anvendelse af en bredere vifte af stammebaggrunde og letter den genetiske modifikation af biosensorekspressive celler. mtHyPer7-proteinet er korrekt målrettet mod mitokondrier uden mærkbare virkninger på mitokondriemorfologi, funktion, distribution eller cellulære væksthastigheder. mtHyPer7 viser et dosisafhængigt respons på eksternt tilsatH2O2. Desuden er mtHyPer7 i stand til at rapportere om heterogeniteten af mitokondriekvalitet med subcellulær opløsning. Endelig forårsager brug af et spindediskkonfokalmikroskop i modsætning til vidvinkelmikroskopi til billeddannelse mitokondriemålrettede biosensorer mindre fotoblegning til fluoroforer og genererer billeder i høj opløsning til analyse af subcellulære forskelle.

Begrænsninger og alternative tilgange
Denne metode er ikke egnet til billeddannelse af celler i mere end 10 minutter, da cellerne tørrer ud under dæksedlen. For længerevarende billeddannelse er det bedre at bruge agarpudemetoden46 eller at immobilisere celler i en glasbundet kulturskål fyldt med SC-medium.

Valget af biosensor bør styres af koncentrationen af målet under eksperimentelle betingelser. Hvis følsomheden af HyPer7 er for høj, anbefales en anden HyPer-version, såsom HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det skal dog bemærkes, at andre HyPer-sonder er mere pH-følsomme. For højere følsomhed kan den peroxiredoxinbaserede roGFP være mere passende (roGFP2Tsa2ΔCR)27.

H2O2-sensorens oxidationssteady state er bundet til både oxidations- og reduktionshastigheder. Oxidationshastigheden af biosensorer skyldes hovedsageligtH2O2, men reduktionshastigheden afhænger af antioxidantreduktionssystemerne, der er aktive i cellen og organellen. Det har vist sig, at HyPer7 overvejende reduceres af thioredoxinsystemet i gærcytosol, og dets reduktion er hurtigere end for roGFP2Tsa2ΔCR27. Derfor bør sondens forskellige reduktionsmekanismer og responsdynamik tages i betragtning ved fortolkning af målinger af H2O2-biosensorer. For at udledeH2O2-niveauerfra biosensoraflæsningen må det antages, at reduktionssystemet opretholder en konstant kapacitet under forsøget. Som et alternativ til de scripts, der er beskrevet her, er en række andre software blevet stillet frit til rådighed til analyse af redoxsensorer49.

Kritiske trin
Med enhver biosensor er det afgørende at demonstrere, at biosensoren i sig selv ikke påvirker den proces, der måles. Derfor er det vigtigt at sammenligne vækst og mitokondriel morfologi af stammer under hver eksperimentel tilstand. Her vurderes mitokondriemorfologi ved hjælp af MitoTracker Red, som pletter mitokondrier på en membranpotentialeafhængig måde. Imidlertid kan sammenligning af mitokondrier i utransformerede og biosensortransformerede celler opnås ved farvning med tetramethylrhodaminmethylester (TMRM), et alternativt membranpotentialefølende mitokondrielt vitalt farvestof, eller MitoTracker Green, som pletter mitokondrier uafhængigt af membranpotentiale. Hvis der er mistanke om skadelige virkninger, kan det hjælpe at reducere udtryksniveauet eller ændre integrationswebstedet.

Validering af sondens dosis-respons-adfærd og signal-støj-forholdet i billeddannelsesteknikken er også afgørende for at indsamle robuste resultater. Hvis variabiliteten inden for en gruppe overstiger variabiliteten mellem grupper, bliver forskelle vanskelige at opdage. Variabilitet inden for gruppen kan skyldes ægte populationsvariation eller støj i detektionsprocessen. De vigtigste trin til at øge signal: støjforholdet er billedoptagelse (pixelværdiområde og støj), baggrundssubtraktion og tærskelværdi.

Støjeffekter kan også reduceres under beregningstrinnene. Den mest enkle fremgangsmåde er at beregne den vægtede middelintensitet ud fra forholdsbilledmålingerne (Resultater.csv), hvor hver pixel repræsenterer det lokale forhold mellem excitationseffektiviteten. Dette giver et "pixelwise" forhold. Men hvis billedsignal:støj-forholdet er lavt, kan der opnås mere robuste resultater ved at beregne den vægtede gennemsnitsintensitet for et investeringsafkast i både tæller- og nævnerens kanaler og derefter beregne forholdet mellem disse to vægtede gennemsnit ("regionvis" forhold).

Hvis du vil vælge en tærskelmetode, skal Fiji-kommandoen Billede | Juster | Auto Threshold kan bruges til automatisk at prøve alle indbyggede Fiji-metoder. For at evaluere segmentering (tærskelværdi) konverteres en gemt maske til en markering ved at klikke på Rediger | Udvælgelse | Opret markering, føjet til ROI Manager (ved at trykke på T) og derefter aktiveret på den rå billedfil. Hvis mitokondrier ikke påvises tilstrækkeligt, skal en anden segmenteringsmetode forsøges.

Når du sammenligner billeder, er det vigtigt at erhverve alle billeder med identiske billedbehandlingsforhold samt at vise alle billederne med identisk kontrastforbedring.

Mitokondriebevægelse skal overvejes ved optimering af billeddannelsesforhold. Hvis mitokondrierne bevæger sig markant mellem excitation ved 405 og 488 nm, vil forholdsbilledet ikke være nøjagtigt. Det anbefales at holde eksponeringstiden <500 ms og ændre excitation ved hjælp af den hurtigste tilgængelige metode (f.eks. en triggerpuls eller akustooptisk justerbart filter). Når du fanger en Z-stak, skal begge excitationer udføres for hvert Z-trin, før du går videre til næste Z-trin.

Til visning af resultaterne er ændringer i nuance (farve) mere indlysende for det menneskelige øje end ændringer i intensitet. Derfor konverteres forholdsværdien til en farveskala for lettere visuel fortolkning. Farvelagte billeder kan være umodulerede, hvor alle mitokondriepixels vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmoduleret, hvor pixelintensiteten i det originale billede bruges til at indstille intensiteter i det farvede billede.

Ændring og fejlfinding
Som et alternativ til at bekræfte mitokondriefunktionen ved udfordring med paraquat kan celler replikeres eller podes i fermenterbare og ikke-fermenterbare kulstofkilder.

For baggrundssubtraktion, rullende boldsubtraktion (ved at navigere til Proces | Træk baggrund fra...) kan også anvendes til at fjerne uensartethed i belysningen. Det skal sikres, at tilstedeværelsen af celler ikke ændrer baggrunden, der trækkes fra (ved at markere muligheden for at oprette baggrund og undersøge resultatet).

Sammenfattende giver mtHyPer7-sonden en konsistent, minimalt invasiv metode til at relatere den morfologiske og funktionelle status for gærmitokondrier i levende celler og tillader undersøgelse af en vigtig cellulær stressor og signalmolekyle i et genetisk medgørligt, let tilgængeligt modelsystem.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takker Katherine Filpo Lopez for ekspert teknisk assistance. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Institutes of Health (NIH) (GM122589 og AG051047) til LP.

Disse undersøgelser brugte den konfokale og specialiserede mikroskopi delte ressource fra Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, delvist finansieret gennem NIH / NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens Nikon MRD01905
Adenine sulfate Sigma-Aldrich A9126
Bacto Agar BD Difco DF0145170
Bacto Peptone BD Difco DF0118170
Bacto Tryptone BD Difco DF211705
Bacto Yeast Extract BD Difco DF0127179
BamHI New England Biolabs R0136S
BglII New England Biolabs R0144S
Carbenicilin Sigma-Aldrich C1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil Carl Zeiss 444960
Dextrose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
E. cloni 10G chemical competent cell Bioserch Technologies 60108
FIJI NIH Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin) Sigma-Aldrich A1720
GFP emission filter Chroma 525/50
Gibson assembly New England Biolabs E2611
Graphpad Prism 7 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H2O2 (stable) Sigma-Aldrich H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO Pon Lab JYE057/EP41 Liao et al 20201
Incubator Shaker New Brunswick Scientific E24
KAPA HiFi PCR kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK1006
L-arginine hydrochloride Sigma-Aldrich A8094
laser Agilent 405 and 488 nm
L-histidine hydrochloride Sigma-Aldrich H5659
L-leucine Sigma-Aldrich L8912
L-lysine hydrochloride Sigma-Aldrich L8662
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P5482
L-tryptophan Sigma-Aldrich T8941
L-tyrosine Sigma-Aldrich T8566
mHyPer7 plasmid This study JYE116
Microscope coverslips ThermoScientific 3406 #1.5 (170 µm thickness)
Microscope slides ThermoScientific 3050
MitoTracker Red CM-H2Xros ThermoFisherScientific M7513
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix New England Biolabs E2621
Nikon Elements Nikon Microscope acquisition software
Nikon Ti Eclipse inverted microscope Nikon
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) Sigma-Aldrich Cat. 856177 
RStudio Posit.co Free desktop version
Spectrophotometer Beckman BU530
Stagetop incubator Tokai Hit INU
Uracil Sigma-Aldrich U1128
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids BD Difco DF0919073
YN2_1_LT58_X2site Addgene 177705 Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS camera Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  2. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  3. Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
  4. McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  5. Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
  6. Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
  7. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
  8. Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
  9. Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
  10. Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
  11. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
  12. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  13. Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
  14. Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
  15. Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
  16. Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
  17. Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
  18. Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
  19. Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
  20. Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
  21. Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
  22. Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
  23. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  24. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  25. Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
  26. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
  27. Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
  28. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
  29. Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
  30. Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
  31. Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
  32. Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
  33. Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
  34. Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
  35. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  36. Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
  37. Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
  38. Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
  42. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
  43. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  44. Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
  45. Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
  46. Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
  47. Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
  48. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
  49. Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
  50. Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).

Tags

MtHyPer7 ratiometrisk biosensor mitokondrieperoxid levende gærceller mitokondriel dysfunktion neurodegenerative lidelser muskuloskeletale lidelser kræft aldring genetisk kodet biosensor minimalt invasiv hydrogenperoxid (H2O2) mitokondrier-målrettet HyPer7 (mtHyPer7) cirkulært permuteret fluorescerende protein OxyR-proteindomæne CRISPR-Cas9-system markørfrit system gærgenomintegration spindeskivekonfokalmikroskopsystem kvantitativ analyse oxidativ Stress rumlig tidsmæssig information
Billeddannelse af mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrieperoxid, i levende gærceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, E. J. N., Boldogh, I. R., Ji,… More

Yang, E. J. N., Boldogh, I. R., Ji, H., Pon, L., Swayne, T. C. Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (196), e65428, doi:10.3791/65428 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter