Summary
Väteperoxid (H2O2) är både en källa till oxidativ skada och en signalmolekyl. Detta protokoll beskriver hur man mäter mitokondriellH2O2med hjälp av mitokondrieriktad HyPer7 (mtHyPer7), en genetiskt kodad ratiometrisk biosensor, i levande jäst. Den beskriver hur man optimerar avbildningsförhållanden och utför kvantitativ cellulär och subcellulär analys med hjälp av fritt tillgänglig programvara.
Abstract
Mitokondriell dysfunktion, eller funktionell förändring, finns i många sjukdomar och tillstånd, inklusive neurodegenerativa och muskuloskeletala störningar, cancer och normalt åldrande. Här beskrivs ett tillvägagångssätt för att bedöma mitokondriell funktion i levande jästceller vid cellulär och subcellulär upplösning med hjälp av en genetiskt kodad, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensorn, mitokondrier riktade HyPer7 (mtHyPer7), detekterar väteperoxid (H 2 O2) i mitokondrier. Den består av en mitokondriell signalsekvens sammansmält med ett cirkulärt permuterat fluorescerande protein och den H2O-2-responsiva domänen av ett bakteriellt OxyR-protein. Biosensorn genereras och integreras i jästgenomet med hjälp av ett CRISPR-Cas9-markörfritt system, för mer konsekvent uttryck jämfört med plasmidburna konstruktioner.
mtHyPer7 är kvantitativt inriktad på mitokondrier, har ingen detekterbar effekt på jästtillväxthastighet eller mitokondriell morfologi och ger en kvantitativ avläsning för mitokondriellH2O2under normala tillväxtförhållanden och vid exponering för oxidativ stress. Detta protokoll förklarar hur man optimerar avbildningsförhållandena med hjälp av ett konfokalmikroskopsystem med snurrande skivor och utför kvantitativ analys med hjälp av fritt tillgänglig programvara. Dessa verktyg gör det möjligt att samla in rik spatiotemporal information om mitokondrier både inom celler och mellan celler i en population. Dessutom kan arbetsflödet som beskrivs här användas för att validera andra biosensorer.
Introduction
Mitokondrier är essentiella eukaryota cellulära organeller som är välkända för sin funktion att producera ATP genom oxidativ fosforylering och elektrontransport1. Dessutom är mitokondrier platser för kalciumlagring, syntes av lipider, aminosyror, fettsyra- och järn-svavelkluster och signaltransduktion 2,3. Inom celler bildar mitokondrier ett dynamiskt nätverk med karakteristisk morfologi och distribution, som varierar beroende på celltyp och metaboliskt tillstånd. Dessutom, även om mitokondrier kan smälta samman och dela sig, är inte alla mitokondrier i en cell likvärdiga. Många studier har dokumenterat den funktionella heterogeniteten hos mitokondrier inom enskilda celler i attribut som membranpotential och oxidativt tillstånd 4,5,6. Denna variation i mitokondriell funktion beror delvis på skador på organellen från mtDNA-mutationer (som förekommer i högre takt än i kärn-DNA) och på oxidativ skada av reaktiva syrearter (ROS) som genereras både i och utanför organellen 7,8,9. Skador på organellen mildras av mitokondriella kvalitetskontrollmekanismer som reparerar skadan eller eliminerar mitokondrier som är skadade bortom reparation10.
Väteperoxid (H2O2) är en reaktiv syreart som är en källa till oxidativ skada på cellulära proteiner, nukleinsyror och lipider. MenH2O2fungerar också som en signalmolekyl som reglerar cellulära aktiviteter genom reversibel oxidation av tioler i målproteiner11,12. H2O2 framställs av elektroner som läcker från mitokondrieelektrontransportkedjan och av specifika enzymer, såsom NADPH-oxidas och monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det inaktiveras också av antioxidantsystem, inklusive de som är baserade på thioredoxin och glutation21,22,23. Således är analys av mitokondriella H2O2-nivåer avgörande för att förstå denna metabolits roll i normal mitokondriell och cellulär funktion och under förhållanden med oxidativ stress.
Det övergripande målet med detta protokoll är att detektera mitokondriellH2O2med hjälp av en genetiskt kodad ratiometrisk H 2 O 2 biosensor, HyPer7, som är riktad mot organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 är en chimär som består av den mitokondriella signalsekvensen från ATP9 (Su9-presekvensen), en cirkulärt permuterad form av grönt fluorescerande protein (GFP) och den H2O-2-bindande domänen av OxyR-proteinet från Neisseria meningitidis24 (Figur 1). I cirkulärt permuterad GFP smälter N- och C-terminerna för naturlig GFP samman och nya terminer bildas nära kromoforen, vilket ger större rörlighet till proteinet och större labilitet av dess spektrala egenskaper jämfört med naturlig GFP25. Interaktionen mellan mtHyPer7:s OxyR-domän och H2O2är högaffinitet,H2O2-selektiv,och leder till reversibel oxidation av de konserverade cysteinresterna och disulfidbryggbildning. Konformationsförändringar associerade med oxidationen av OxyR överförs till den cirkulärt permuterade GFP i mtHyPer7, vilket resulterar i en spektral förskjutning i excitationsmaximum för mtHyPer7-kromoforen från 405 nm i reducerat tillstånd till 488 nm i H 2 O2-oxiderattillstånd26. Således återspeglar förhållandet mellan fluorescens från mtHyPer7 som svar på excitation vid 488 nm jämfört med 405 nm oxidationen av sonden med H 2 O2.
Helst bör en biosensor ge en absolut, kvantitativ avläsning i realtid av sin målmolekyl. Tyvärr är detta dock inte alltid möjligt i verkliga mätningar. När det gäller oxidationssensorer, såsom mtHyPer7, påverkas realtidsavläsningen av disulfidbryggans reduktionshastighet. Reduktionssystemen som används av ROS-biosensorer skiljer sig åt, och dessa kan dramatiskt förändra sondresponsdynamiken - vilket visas av jämförelsen mellan HyPer7, reducerad av thioredoxin-systemet, och roGFP2-Tsa2ΔCR, reducerad av glutation-i-jästcytosol27. Således, för att dra en slutsats om den relativa H2O2-koncentrationen från mtHyPer7-förhållandena, måste man anta att reduktionssystemet bibehåller en konstant kapacitet under experimentet. Trots dessa överväganden har HyPer7 och relaterade prober använts i olika sammanhang för att få information om H2O2i levande celler25,28,29.
Figur 1: Design, molekylär mekanism och excitations-/emissionsspektra för H2 O2 biosensorn mtHyPer7. (A) MtHyPer7-sonden erhålls genom att föra in cirkulärt permuterad GFP i OxyR-RD-domänen från Neisseria meningitidis. Den innehåller den mitokondriella målsökningssekvensen från subenhet 9 av ATP-syntaset från Neurospora crassa (Su9). (B) Illustration av H 2 O2-avkänningsmekanismenför mtHyPer7. Oxidation av cysteiner i RD-domänen ökar fluorescensemissionen vid excitation vid 488 nm och minskar emissionen som produceras av excitation vid 405 nm. (C) Excitations- och emissionsspektra av HyPer7 i oxiderade och reducerade former. Denna figur återges med tillstånd från Pak et al.24. Förkortningar: GFP = grönt fluorescerande protein; cpGFP = cirkulärt permuterad GFP. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Denna ratiometriska avbildning av mtHyPer7 erbjuder viktiga fördelar för mitokondriell H2O2-kvantifiering24,27; Den ger en intern kontroll för sondkoncentrationen. Dessutom är förskjutningen i excitationstoppen som produceras av H2O2-exponering inte fullständig, inte ens vid mättnadskoncentrationer avH2O2. Således kan ratio imaging öka känsligheten genom att införliva två spektralpunkter i analysen.
MtHyPer7-sonden som används här har en mycket hög affinitet förH2O2och relativt låg känslighet för pH24, och har framgångsrikt riktats mot Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Detta protein har också använts i jäst27,31. Tidigare studier har dock förlitat sig på plasmidburet uttryck av mtHyPer7, vilket resulterar i cell-till-cell-variabilitet i sonduttryck27. Dessutom integrerades konstruktionen som beskrivs i detta protokoll i en bevarad, genfri region på kromosom X32 med hjälp av en CRISPR-baserad metod för markörfri integration. Uttrycket av den integrerade biosensorgenen styrs också av den starka konstitutiva TEF1-promotorn (Figur 2). Som ett resultat finns det mer stabilt, konsekvent uttryck av biosensorn i jästcellpopulationer jämfört med det som observeras med plasmidburet biosensoruttryck, och celler som bär biosensorn kan förökas utan behov av selektiva medier.
Figur 2: Generering av mtHyPer7-uttryckande celler med CRISPR. Den Cas9- och sgRNA-innehållande plasmiden (YN2_1_LT58_X2site) och PCR-amplifierade mtHyPer7-innehållande biosensorkonstruktionen introduceras i spirande jästceller genom litiumacetattransformation. Det genfria insättningsstället på kromosom X (X2) känns igen och klipps av Cas9-proteinet med sgRNA, och biosensorn integreras i genomet genom homolog rekombination. Efter identifiering av de framgångsrika transformanterna genom mikroskopisk screening, koloni-PCR och sekvensering, avlägsnas Cas9-plasmiden (botas) genom tillväxt i icke-selektiva medier. Förkortningar: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkriptionsförstärkare. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen erbjuder mtHyPer7 fördelar jämfört med andra ROS-biosensorer. Till exempel kan organiska färgämnen som används för att detektera ROS (t.ex. dihydroetidium [DHE]2 och MitoSOX3) ge ojämn eller ospecifik färgning och levereras ofta i lösningsmedel som etanol eller dimetylsulfoxid, som kräver ytterligare kontroller för lösningsmedelseffekter. En annan klass av ROS-biosensorer är fluorescensresonansenergiöverföring (FRET)-baserade biosensorer (t.ex. Redoxfluor för cellulärt redoxtillstånd4 och peroxidsensorerna HSP-FRET5, OxyFRET 6 och PerFRET6). Dessa prober är genetiskt kodade och i princip mycket känsliga och kan kvantitativt riktas mot mitokondrier med hjälp av väl karakteriserade mitokondriella signalsekvenser. Det finns dock utmaningar vid användning av FRET-baserade prober, inklusive bakgrund på grund av korsexcitation och genomblödning, och stränga krav på att fluoroforernas närhet och orientering för att FRET ska inträffa33,34. Dessutom består FRET-sonder av två fluorescerande proteiner som kräver större konstruktioner för uttryck i celler av intresse jämfört med spektraskiftande sonder. Protokollet som beskrivs här utvecklades för att dra nytta av styrkorna hos den HyPer7-baserade biosensorn och för att använda denna kompakta, ratiometriska, genetiskt kodade sond med hög affinitet för kvantitativ avbildning av peroxid i mitokondrier i levande jäst.
Protocol
1. Generering av biosensorplasmiden, integration i jästgenomet och bedömning av inriktningen av mtHyPer7 till mitokondrier och effekter på mitokondriell morfologi, cellulär tillväxthastighet eller oxidativ stresskänslighet
OBS: Se kompletterande File 1, Kompletterande tabell S1, Kompletterande tabell S2 och kompletterande tabell S3 för biosensorplasmidkonstruktion, stammar, plasmider respektive primers som används för biosensorkonstruktion och karakterisering. Se materialtabellen för detaljer relaterade till alla material, reagenser och instrument som används i detta protokoll.
- Förstärk biosensorkonstruktionen från biosensorplasmiden med hjälp av primrarna Y290 och Y291 (figur 2) via polymeraskedjereaktion (PCR).
- Blanda 500 ng Cas9/guide-RNA-plasmiden (YN2_1_LT58_X2site32) med 50 μL av PCR-produkten från steg 1.1 (biosensorkonstruktionen). Omvandla blandningen till spirande jäst med litiumacetatmetod35 och välj transformanter på YPD-plattor som innehåller 200 mg/ml G418.
- Screena kandidattransformanter genom PCR-amplifiering av genomiskt DNA med hjälp av primrarna Y292 och Y293. För transformanter med en insats av förväntad storlek (positiv: 3,5 kb; negativ: 0,3 kb), sekvensera det infogade området för ytterligare validering.
- Utvärdera biosensorns effekt på tillväxt och mitokondriell funktion (Figur 3). Om biosensorn verkar påverka cellernas eller mitokondriernas funktion, försök att minimera effekten genom att ändra promotorn, integrationsstället eller föräldrastammen.
- Bestäm effekten av biosensorkonstruktionen på tillväxthastigheten i närvaro och frånvaro av en oxidativ stressfaktor (t.ex. parakvat), som beskrivits tidigare36.
- Späd celler i mitten av logfasen till en optisk densitet på 600 nm (OD 600) på 0,0035 i200 μl motsvarande medier med och utan behandling i varje brunn på en 96-håls plattbottenplatta. Mät kulturens optiska densitet var 20:e minut i 72 timmar med hjälp av en plattläsare. Beräkna den maximala tillväxthastigheten (lutningen) som den maximala förändringen i OD under ett 240 minuters intervall under 72 timmars banan.
- Visualisera cellerna med fluorescensmikroskopi och utvärdera ljusstyrkan och mitokondriernas morfologi som beskrivits tidigare37.
- Odla cellerna till mitten av log-fasen, färga mitokondrierna med 250 nM MitoTracker Red i 30 minuter och tvätta två gånger före avbildning. Fånga Z-stackar med 6 μm djup med 0,3 μm intervall med ett vidfältsmikroskop eller konfokalfluorescensmikroskop och inspektera visuellt. Leta efter mitokondrier som bildar långsträckta rörformiga strukturer.
- Bestäm effekten av biosensorkonstruktionen på tillväxthastigheten i närvaro och frånvaro av en oxidativ stressfaktor (t.ex. parakvat), som beskrivits tidigare36.
Figur 3: mtHyPer7 är riktad mot mitokondrier och påverkar inte mitokondriernas morfologi, celltillväxt eller känslighet för oxidativ stress. (A) Mitokondriell morfologi i levande jästceller som uttrycker mtHyPer7. Vänster panel: mtHyPer7 visualiserad med 488 nm excitation. Mittpanel: mitokondrier märkta med 250 nM MitoTracker Red. Höger panel: sammanfogade bilder. Prognoser för maximal intensitet visas. Cellkonturen visas i vitt. Skalstapel = 1 μm. (B,C) Tillväxtkurvor och maximal tillväxthastighet för vildtypsceller och celler som uttrycker mtHyPer7 som odlats i närvaro (+PQ) eller frånvaro av 2,5 mM parakvat i YPD-media. (D,E) Tillväxtkurvor och maximal tillväxthastighet för vildtyps- och mtHyPer7-uttryckande celler som odlats i närvaro (+PQ) eller frånvaro av 2,5 mM parakvat i SC-media. Alla tillväxtkurvor är medelvärdet av tre oberoende replikat. Maximala tillväxthastigheter representeras som medelvärdet ± medelfelet för medelvärdet (SEM). Analys av tillväxtkurvan gjordes genom att späda ut celler i mitten av logfasen till en OD 600 på 0,0035 i200 μL motsvarande media i varje brunn på en 96-håls plattbottenplatta. Kulturens OD mättes var 20:e minut i 72 timmar med hjälp av en plattläsare. Varje stam/tillstånd pläterades i tre exemplar och den genomsnittliga tillväxthastigheten plottades. Den maximala tillväxthastigheten (lutningen) beräknades med hjälp av förändringarna i OD under ett 240 minuters intervall under loppet av 72 timmar. Förkortningar: WT = vildtyp; PQ = parakvat. Klicka här för att se en större version av denna figur.
2. Cellodling och förberedelse för avbildning (figur 4)
- Sprid cellerna i syntetiskt medium till mitten av log-fasen för avbildning. En 5 ml mellanfasodling ger tillräckligt med celler för fyra eller fem objektglas och totalt > 100 knoppade celler för analys.
- På morgonen dagen före experimentet bereds flytande förkulturer genom inokulering av 5 ml syntetiskt komplett medium (SC) i ett 50 ml rör med konisk botten med en enda koloni av jästceller.
- Inkubera förkulturen i en orbital shaker vid 200 rpm och 30 °C i 6-8 timmar. Mät OD 600 för förkulturen, som bör vara i mitten av logfasen: ~0,5-1 × 107 celler/ml, OD600 ~0,1-0,3.
- Förbered en odling i mitten av logfasen med hjälp av förkulturen för avbildning nästa dag. Beräkna mängden förkultur som behövs för en odling i mitten av logfasen efter tillväxt över natten (8-16 timmar). När cellerna odlas i SC-medium är fördubblingstiden ~2 timmar. Därför beräknas volymen (V) av förkulturen för inokulering av en 5 ml nattodling med hjälp av ekvation (1):
Nej (1) - Inokulera 5 ml substrat substrat i ett 50 ml rör med konisk botten med den mängd förkultur som beräknades i steg 2.1.3. Odla i orbital shaker vid 200 rpm och 30 °C i 8-16 timmar.
- På dagen för avbildningen, bekräfta att kulturen som genererades i steg 2.1.4 befinner sig i mitten av logfasen (OD600 ~0,1-0,3). Koncentrera cellerna från 1 ml av odlingen i mitten av logfasen genom centrifugering vid 6 000 × g i 30 s. Ta bort supernatanten och lämna kvar 10-20 μL av supernatanten i röret. Återsuspendera cellpelleten genom att försiktigt blanda med restmedia med hjälp av en mikropipett.
- Använd en luftfläkt eller luddfri vävnad för att avlägsna damm från ett glasmikroskopglas och tillsätt 1.8 μL av cellsuspensionen till objektglaset. Täck cellerna med ett #1.5 (170 μm tjockt) glastäcke, sänk täckglaset långsamt i en vinkel för att undvika att införa bubblor.
- Bilden omedelbart och kassera bilden efter 10 minuters avbildning.
Nej (1)
Figur 4: Celltillväxt och avbildning. Spirande jästceller som uttrycker mtHyPer7 odlas till mitten av log-fasen. Bilderna i Z-serien samlas in med konfokalmikroskopi och utsätts sedan för 3D-rekonstruktion och analys. Se protokollets avsnitt 2-3. Klicka här för att se en större version av denna figur.
3. Optimering av bildbetingelser och bildinsamling (figur 5)
- Välj ett bildläge. För optisk snittning utan efterbehandling är ett konfokalt instrument med snurrskiva att föredra. Men om signalen är låg, eller om det här instrumentet inte är tillgängligt, använd vidvinkelavbildning, se till att vidvinkelbilderna dekonvolveras för att ta bort oskärpa ur fokus, som beskrivits tidigare38.
- Välj optik. Använd ett oljenedsänkningsobjektiv med hög numerisk bländare, till exempel 100x/1,45 Plan-Apochromat.
- Välj excitations- och emissionsvåglängder. För konfokal avbildning med roterande skiva, använd en laserexcitation vid 405 nm och 488 nm och ett standard GFP-emissionsfilter. För vidvinkelavbildning, använd en lysdiod (LED) eller lamp excitation, men se till att filterinställningen tillåter variation av excitationen samtidigt som den passerar emission genom standard GFP-filtret.
OBS: Detta kan åstadkommas till exempel genom att ta bort excitationsfiltret från en GFP-kub och använda en lysdiod eller filterhjul för att välja excitation. - Välj exponeringstid och belysningsintensitet.
- Etablera insamlingsförhållanden som ger en lätt detekterbar signal och acceptabel upplösning i varje fluorescenskanal. Till exempelample, på ett konfokalmikroskop med snurrande skiva med en sCMOS-kamera, använd 2 x 2 binning, 20-40 % lasereffekt och 200-600 ms exponering.
- Undersök bildhistogrammet. I en 12-bitarsbild (4 096 möjliga grånivåer) kontrollerar du att det totala dynamiska omfånget för pixelvärdena är minst flera hundra grånivåer, utan mättnad (figur 5A). Se dessutom till att räckvidden är en storleksordning högre än ljudnivån. Beräkna brusnivån som standardavvikelsen för pixelvärden i ett cellfritt område i en bild, mätt enligt beskrivningen i steg 4.1.3.1.
- Testa för fotoblekning eller bildinducerad mitokondriell stress under de valda avbildningsförhållandena. Om överdriven fotoblekning eller en ökning av mitokondriellH2O2observeras, minska lasereffekten och öka exponeringen eller binning.
- Samla in en time-lapse-serie bilder, utan fördröjning mellan tagningarna, för att bedöma effekterna av avbildningsförhållandena på signalstabilitet och oxidativ stress i mitokondrier. Använd programvaran för insamling av mikroskop eller ImageJ, mät det genomsnittliga pixelvärdet i varje fluorescenskanal för att bekräfta signalstabiliteten (<5 % förändring; Figur 5B). Om experimentet inte involverar time-lapse-avbildning, se till att fluorescensen är stabil över två eller tre upprepade Z-stackar (25-35 exponeringar).
OBS: En minskning av fluorescensen i båda kanalerna kan tyda på fotoblekning; En minskning av 405 nm-exciterad fluorescens åtföljd av en ökning av den 488 nm-exciterade kanalen kan dock indikera ökad mitokondriellH2O2och bildinducerad oxidativ stress i organellen.
- Samla in en time-lapse-serie bilder, utan fördröjning mellan tagningarna, för att bedöma effekterna av avbildningsförhållandena på signalstabilitet och oxidativ stress i mitokondrier. Använd programvaran för insamling av mikroskop eller ImageJ, mät det genomsnittliga pixelvärdet i varje fluorescenskanal för att bekräfta signalstabiliteten (<5 % förändring; Figur 5B). Om experimentet inte involverar time-lapse-avbildning, se till att fluorescensen är stabil över två eller tre upprepade Z-stackar (25-35 exponeringar).
- Skaffa bilder. Om du samlar in Z-staplar kontrollerar du att Z-intervallet är detsamma för alla bilder i datauppsättningen och inkluderar hela cellen. För spirande jäst, bild med ett Z-intervall på 0,5 μm och ett totalt stackdjup på 6 μm. Hämta bilder med överfört ljus för att dokumentera cellgränser.
- Analysera bilder manuellt eller halvautomatiskt via skripten som finns tillgängliga i Supplemental File 2 och på https://github.com/theresaswayne/biosensor, med hjälp av Fiji-fördelningen av ImageJ39 och statistikprogramvaran R (figur 6). I programvaruinstruktionerna visas hierarkiska menykommandon i fetstil med "|", vilket indikerar en sekvens av menyval. Alternativ och knappar visas i fetstil.
Figur 5: Optimering av avbildning . (A) Utvärdering av bilder och histogram för rätt intensitetsområde. Projektioner med maximal intensitet av konfokala bilder med snurrande skiva visas. Histogrammen visas med både en linjär Y-axel (svart) och en logaritmisk Y-axel (grå) för att illustrera bildens dynamiska omfång. Vänster paneler: en brusig bild med låg intensitet och dynamiskt omfång. Mittpaneler: en bild med ett acceptabelt dynamiskt omfång (~1 000 grånivåer) och intensitet. Högerpaneler: en bild som är felaktigt kontrastförstärkt för att ge överdriven mättnad. Skalstapel = 1 μm. (B,C) Analys av fotoblekning av mtHyPer7. Successiva Z-stackar samlades in utan fördröjning, Z-stackar summerades och den genomsnittliga intensiteten av mitokondrier mättes och normaliserades till den första tidpunkten. Resultat från de tre första tidpunkterna (27 exponeringar) visas. (B) Excitationsvåglängd: 405 nm. (C) Excitationsvåglängd: 488 nm. Värdena som visas är medelvärdet av tre celler från var och en av tre oberoende försök. Klicka här för att se en större version av denna figur.
4. Halvautomatisk analys med skript
- Generera och mät förhållandebilder med hjälp av ett skript för biosensoranalys (t.ex. biosensor.ijm eller biosensor-image-subtraction.ijm).
- Välj det skript som ska användas. Protokollet för att använda varje skript är liknande. Eventuella skillnader kommer att specificeras i texten.
- biosensor.ijm: I det här skriptet korrigeras bakgrund och brus med hjälp av användarvalda bildområden, fasta värden eller ingen subtraktion. Välj metoder för bakgrunds- och bruskorrigering oberoende av varandra.
- biosensor-image-subtraction.ijm: I det här skriptet hanteras både bakgrund och brus av samma användarvalda metod, som kan vara något av följande: tom bild, användarmarkerat område i bilden, fast värde eller ingen korrigering.
- I Fiji öppnar du en Z-stackavbildning med flera kanaler som hämtades i steg 3.5. Öppna önskad skriptfil för biosensoranalys. Kör skriptet genom att klicka på Kör i fönstret Skriptredigerare . I dialogrutan som visas anger du den information som efterfrågas.
- Välj kanalnummer för täljaren och nämnaren för beräkning av förhållandet. För mtHyPer7 är täljaren kanalen som är exciterad vid 488 nm, och nämnaren är kanalen som är exciterad vid 405 nm. Välj kanalnumret för bilden med överfört ljus, om det finns, eller 0 om det inte finns något.
- Välj önskad bakgrundssubtraktionsmetod bland följande fyra alternativ. Om bakgrunden är relativt enhetlig väljer du Välj ett bildområde som direkt mäter bakgrundsnivån i bilden. Om bakgrunden varierar avsevärt över fältet, använd skriptet biosensor-image-subtraction.ijm och välj Tom bild (för att samla in en tom bild för korrigering, fånga en flerkanalig Z-stack med identiska insamlingsförhållanden i ett cellfritt synfält eller från en bild gjord med cellfritt tillväxtmedium). Fast värde gör det möjligt att mata in ett tidigare uppmätt bakgrundsvärde. Ingen lämnar bakgrunden okorrigerad, men kan minska mätningens precision.
- Välj önskad brussubtraktionsmetod. Brusvärdet används som en lägre tröskel på de bakgrundssubtraherade, maskerade kanalbilderna för att minska effekten av slumpmässig variation i detektoravläsningen. Välj Välj ett bildområde eller ett fast värde för att tillåta inmatning av en tidigare uppmätt brusnivå, vilket vanligtvis fungerar bra eftersom brusnivåerna är konstanta om bildförhållandena hålls konstanta. Du kan också välja Ingen och använda värdet 1 som det nedre tröskelvärdet, vilket kan öka variationen i mätningarna.
- Välj en tröskelalgoritm för att upptäcka mitokondrier exakt och konsekvent; Otsu eller MaxEntropy rekommenderas. Vi rekommenderar att du använder samma algoritm för alla bilder i ett experiment, men säkerställer korrekt igenkänning av mitokondrier. Använd en annan tröskelmetod om morfologin ändras under ett experiment.
- Välj antalet intressanta regioner (ROI) per cell. Om du till exempel mäter skillnader mellan mamma och knopp väljer du 2.
- Välj den utdatamapp där mätningar och förhållandebilder ska sparas.
- Följ anvisningarna för bakgrunds- och bruskorrigering.
- Områdesval (om tillämpligt): Om Välj ett bildområde har valts för bakgrunds- eller brusmätning följer du anvisningarna för att rita ett bakgrundsområde (utanför celler eller fluorescerande artefakter) med hjälp av ROI-verktyget för rektangel. När du har ritat området klickar du på OK.
- Inmatning av fast värde (om tillämpligt): Om Fast värde valdes för bakgrunds- eller brusmätning, följ anvisningarna för att ange bakgrunds - och/eller brusvärden för varje fluorescenskanal.
- Tom referensbild (om tillämpligt): Om Tom bild har valts för bakgrunds- eller bruskorrigering i skriptet biosensor-image-subtraction.ijm följer du anvisningarna för att välja en tom bildfil.
- Markera ROI för mätning. I odlingar i mitten av logfasen ska analysen begränsas till knoppade celler.
- Rita ROI som motsvarar enskilda celler eller subcellulära regioner baserat på ljusfältsbilden. ROI behöver inte exakt matcha cellkonturen, eftersom endast tröskelvärdesmitokondrier inom ROI kommer att mätas. Alternativt kan du öppna en tidigare sparad ROI-uppsättning: i ROI-hanteraren klickar du på Mer och väljer sedan ROI-filen.
- Tryck på T efter att du har skapat varje ROI för att lägga till den valda ROI i ROI Manager. I ROI-hanteraren markerar du Visa alla för att dokumentera cellerna som har markerats. Varje tillagd region visas som ett numrerat objekt i listan ROI Manager. Om du analyserar mer än en ROI per cell (t.ex. mamma och knopp), markera ROI i samma ordning för varje cell som analyseras.
- När alla önskade ROI:er har lagts till i ROI-hanteraren klickar du på OK i dialogrutan Markera celler .
- Välj måtttabellformat. I dialogrutan MultiMeasure som visas markerar du Mät alla sektorer. Markera alternativet En rad per sektor för att skapa en tabell med önskat format. Använd process_multiROI_tables. R-skript för att bearbeta tabeller som skapats med alternativet En rad per sektor. Markera inte Lägg till resultat. Upprepa detta steg 3x (för mätning av täljaren [488], nämnaren [405] och förhållandet [488/405] bilder).
- Skriptet sparar utdatafilerna i den mapp som valdes i steg 4.1.2.6.
- Välj det skript som ska användas. Protokollet för att använda varje skript är liknande. Eventuella skillnader kommer att specificeras i texten.
- Beräkning av viktade medelvärden för varje region eller cell
- Med hjälp av resultaten från föregående steg beräknas de viktade medelvärdesförhållandena för varje region eller cell med hjälp av ekvation (2). Beräkna antingen "pixelvisa" eller "regionvisa" förhållanden (se diskussionen för detaljer).
Nej (2)
Värdena för area och integrerad densitet (IntDen) inkluderar endast pixlarna inom de tröskelförsedda mitokondrierna. Denna beräkning kan automatiseras med hjälp av process_multiROI_tables. R-skript och R-statistisk programvara.
- Med hjälp av resultaten från föregående steg beräknas de viktade medelvärdesförhållandena för varje region eller cell med hjälp av ekvation (2). Beräkna antingen "pixelvisa" eller "regionvisa" förhållanden (se diskussionen för detaljer).
- Generera en bild med färgat förhållande. Eftersom förändringar i nyans (färg) är mer uppenbara för det mänskliga ögat än förändringar i intensitet, konvertera kvotvärdet till en färgskala för enklare visuell tolkning. Skriptet colorize_ratio_image.ijm färglägger en bild med maskerat förhållande.
- I Fiji öppnar du en Z-stackbild med proportioner som genererades i steg 4.1.6. Öppna skriptfilen colorize_ratio_image.ijm. Kör skriptet genom att klicka på Kör i fönstret Skriptredigerare . I dialogrutan som visas anger du den information som efterfrågas.
- Färgläggningsmetod: I alternativet Omodulerad visas alla mitokondriella pixlar med samma ljusstyrka. Vissa bilder kan dock verka bullriga eftersom både svaga och ljusa pixlar bidrar till bildförhållandet. För att minska denna effekt, använd alternativet Intensitetsmodulerad .
- Lägsta och högsta visade värde: Dessa värden styr intervallet av kvotvärden som kommer att färgläggas. Välj värden nära de genomsnittliga minimi- och maximivärden som observerats i ett experiment (baserat på de viktade medelvärdeskvoterna som beräknats i steg 4.2.1). I ett experiment måste du hämta alla bilder med identiska bildförhållanden och visa alla bilder med identiska minimi- och maximivärden.
- Projektionsläge: Z-staplar visas som projektioner för att visa hela mitokondriepopulationen. Projektionen skapas före färgläggningen. Välj Max för en projektion med maximal intensitet (med bibehållande av värdena för maximalt förhållande och intensitet) eller Genomsnitt för en projektion med medelintensitet.
- Utdatamapp: Välj den mapp där du vill spara de färglagda bilderna.
- Om alternativet Omodulerad har valts väljer du ett färgschema (uppslagstabell; LUT) i dialogrutan som visas. Använd Fire - eller Rainbow RGB LUT:er som är inbyggda i Fiji, eller valfri LUT i ImageJ:s .lut-format (Importera från LUT-fil). Rainbow Smooth40 LUT rekommenderas (ingår i Supplemental File 2 och på GitHub).
- Skriptet sparar utdatafilerna i den mapp som valdes i steg 4.3.1.4. Dessa inkluderar den färgade förhållandebilden (Color_RGB.tif) och den färgade förhållandebilden med ett kalibreringsfält som visar överensstämmelsen mellan förhållandevärden och bildfärg (Color_with_bar.tif).
- I Fiji öppnar du en Z-stackbild med proportioner som genererades i steg 4.1.6. Öppna skriptfilen colorize_ratio_image.ijm. Kör skriptet genom att klicka på Kör i fönstret Skriptredigerare . I dialogrutan som visas anger du den information som efterfrågas.
Nej (2)5. Manuell analys
Den här metoden tar längre tid men ger flexibilitet vid förbearbetning och inställning av tröskelvärdet.
- Korrigera för bakgrund.
- Ange alternativ i Fiji.
- Klicka på Analysera | Ställ in mått. I dialogrutan som visas markerar du rutorna för Area, Mean, StdDev, Intden och Display Label. Ange decimalerna till 3.
- Klicka på Redigera | Tillval | Ingång/utgång. I dialogrutan som visas markerar du rutorna för Spara radnummer och Spara kolumnrubriker.
- För att öka känsligheten för kvotberäkningen, subtrahera bakgrunden från varje fluorescenskanal. Om bakgrunden är relativt enhetlig mäter du medelintensiteten för ett cellfritt område i en bild och subtraherar detta värde från hela bilden (steg 5.1.2.1). Alternativt, om bakgrunden varierar kraftigt över fältet, använd en tom bild för korrigering (steg 5.1.2.2.).
- Om du vill subtrahera ett användarmarkerat område klickar du på Bild | Färg | Dela kanaler och håll alla kanalbilder öppna, eftersom de kommer att behövas senare. För varje fluorescenskanal ritar du en ROI i bakgrunden (utanför alla celler) och klickar på Analysera | Mät eller klicka på Bild | Travar | Mät stack. Observera medelvärdet för ROI som visas i resultattabellen . Klicka på Redigera | Välj Ingen och sedan Process | Matematik | Subtrahera. I dialogrutan som visas anger du det uppmätta medelvärdet för bakgrunden, avrundat till närmaste heltal.
Avrundning förhindrar fel med binära åtgärder senare. - Om du vill subtrahera en tom bild från en datafil samlar du in en tom bild från ett helt cellfritt synfält eller från en bild som preparerats med cellfritt odlingsmedium. Klicka på Process | Kalkylator för bilder. I dialogrutan som visas ställer du in åtgärden på Subtrahera och anger Image1 och Image2 till cellbilden respektive den tomma bilden. Markera Skapa nytt fönster och 32-bitarsresultat.
- Om du vill subtrahera ett användarmarkerat område klickar du på Bild | Färg | Dela kanaler och håll alla kanalbilder öppna, eftersom de kommer att behövas senare. För varje fluorescenskanal ritar du en ROI i bakgrunden (utanför alla celler) och klickar på Analysera | Mät eller klicka på Bild | Travar | Mät stack. Observera medelvärdet för ROI som visas i resultattabellen . Klicka på Redigera | Välj Ingen och sedan Process | Matematik | Subtrahera. I dialogrutan som visas anger du det uppmätta medelvärdet för bakgrunden, avrundat till närmaste heltal.
- Ange alternativ i Fiji.
- Om du vill begränsa analysen till mitokondrier utför du segmentering. Eftersom varje kanal kan ändra intensitet beroende på biosensorns tillstånd, använd summan av de två kanalerna för att definiera mitokondriernas area konsekvent.
- För att skapa en summabild, klicka på Process | Kalkylator för bilder. I dialogrutan som visas ställer du in åtgärden på Lägg till och ställer in Bild1 och Bild2 på de två bakgrundssubtraherade fluorescerande kanalerna i valfri ordning. Markera Skapa nytt fönster och 32-bitarsresultat och vänta tills en summabild visas.
- Ange tröskelvärdet för att definiera mitokondrier på summabilden.
- Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde. I fönstret Tröskelvärde som visas markerar du Mörk bakgrund och Stapla histogram. Ställ in Method på önskad algoritm (t.ex. Otsu eller MaxEntropy). Använd automatisk tröskel för reproducerbarhet, men om ingen automatisk metod är lämplig justerar du tröskelvärdet manuellt.
Helst bör samma algoritm användas för alla bilder i ett experiment, men förändringar i morfologi under ett experiment kan kräva en annan tröskelmetod under vissa förhållanden. - När tröskelvärdet är tillfredsställande klickar du på Använd. I dialogrutan som visas väljer du Konvertera till mask. I dialogrutan som visas markerar du Svart bakgrund och lämnar de andra rutorna omarkerade. Spara den resulterande maskbilden för utvärdering av segmenteringsnoggrannheten.
- Klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde. I fönstret Tröskelvärde som visas markerar du Mörk bakgrund och Stapla histogram. Ställ in Method på önskad algoritm (t.ex. Otsu eller MaxEntropy). Använd automatisk tröskel för reproducerbarhet, men om ingen automatisk metod är lämplig justerar du tröskelvärdet manuellt.
- Konvertera maskvärdena från 0 och 255 till 0 respektive 1 genom att klicka på Process | Matematik | Dela upp. Ange värdet till 255 och välj alternativet för att bearbeta alla bilder när du uppmanas att göra det.
- Applicera masken på de bakgrundssubtraherade fluorescenskanalerna genom att klicka på Process | Kalkylator för bilder. I dialogrutan som visas ställer du in åtgärden på Multiplicera. Ställ in Image1 och Image2 på täljarkanalen respektive masken. Kontrollera Skapa nytt fönster och 32-bitars resultat; Upprepa maskmultiplikationen med nämnarkanalen.
- Förbered varje maskerad kanal för beräkning av proportioner genom att ställa in bakgrundspixlarna på NaN ("inte ett tal").
- Välj den maskerade täljarkanalen och klicka på Bild | Justera | Tröskelvärde. I fönstret Tröskelvärde klickar du på Ställ in och i dialogrutan som visas anger du miniminivån till den beräknade brusnivån eller till 1 och lämnar maxvärdet som det är.
- I fönstret Tröskelvärde klickar du på Använd. I nästa dialogruta väljer du Ange till NaN. Upprepa för den maskerade nämnarkanalen.
- Generera bildförhållandet.
- Klicka på Process | Kalkylator för bilder. I dialogrutan som visas ställer du in åtgärden på Dela upp. Ange Image1 och Image2 till de bakgrundssubtraherade maskerade täljar- respektive nämnarkanalerna. För mtHyPer7 är täljaren den oxiderade formen exciterad vid 488 nm, och nämnaren är den reducerade formen exciterad vid 405 nm. Därför indikerar högre förhållanden högre H 2 O2.
- Markera Skapa nytt fönster och 32-bitarsresultat. Spara bilden av förhållandet för analys.
- Markera och kvantifiera intresseområden. Varje cell eller subcellulär region väljs och lagras som en ROI i ROI-hanteraren. ROI:erna behöver inte matcha cellkonturerna perfekt, eftersom endast de maskerade mitokondrieregionerna kommer att mätas.
- Använd bilden med genomfört ljus för att förhindra bias och skapa ROI som motsvarar enskilda celler (eller subcellulära regioner). I odlingar i mellanlogsfasen begränsas analysen till jästceller med knoppar som är aktivt engagerade i celldelningen. Tryck på T när du har skapat varje ROI för att lägga till den i ROI-hanteraren. Markera Visa alla om du vill dokumentera de markerade cellerna.
- Klicka på förhållandebilden som skapades ovan och i ROI Manager klickar du på Mer ... | MultiMeasure. I dialogrutan som visas markerar du Mät alla sektorer. Kontrollera inte Lägg till resultat. Markera alternativet En rad per sektor för att skapa en tabell med önskat format. Den process_multiROI_tables. R-skriptet bearbetar tabeller som skapats med alternativet En rad per sektor i den statistiska programvaran R.
- Spara resultaten. Klicka på resultatfönstret och sedan på Arkiv | Spara och spara resultattabellen i .csv eller .xls format. Ställ in filnamnet så att det matchar bildnamnet.
- Spara ROI:erna. I ROI-hanteraren kontrollerar du först att inga ROI:er är markerade: klicka på Avmarkera och sedan på Mer | Spara. Öppna de sparade ROI:erna tillsammans med originalbilden i Fiji för att korsreferera måtten med bilden.
- Beräkna de viktade medelvärdena per cell eller region med hjälp av resultaten från föregående steg och ekvation (3). Beräkna antingen "pixelvisa" eller "regionvisa" förhållanden (se diskussionen för detaljer).
Nej (3)
OBS: Area- och integrerade densitetsvärden inkluderar endast pixlarna inom de tröskelförsedda mitokondrierna. Denna beräkning kan automatiseras med hjälp av process_multiROI_tables. R-skript i statistikprogrammet R. - Generera en bild med färgat förhållande.
OBS: Färglagda bilder kan vara omodulerade, där alla mitokondriella pixlar visas med samma ljusstyrka, eller intensitetsmodulerade, där pixelintensiteten i originalbilden används för att ställa in intensiteter i den färgade bilden.- Så här skapar du en omodulerad färglagd bild:
- Öppna bildförhållandet som genererades ovan. Klicka på Bild | Duplicera för att generera en kopia av bilden och stäng sedan originalbilden.
- Om bilden är en Z-stack väljer du antingen ett enda segment eller genererar en Z-projektion för att visa alla mitokondrier. Använd antingen en projektion med maximal intensitet (med bibehållande av det maximala förhållandet och intensitetsvärdena vid varje XY-pixelkoordinat) eller en projektion med medelintensitet.
- Klicka på Bild | Slå upp tabeller och ställ in LUT till önskat färgschema (t.ex. Rainbow RGB eller Fire [tillgängligt som standard i ImageJ]). Alternativt kan du klicka på Arkiv | Importera LUT och välj önskad LUT i ImageJ:s .lut-format, till exempel Rainbow Smooth40 (ingår i Supplemental File 2 och på GitHub). Se till att LUT har en mörk färg tilldelad 0-värdet.
- Ställ in displayens kontrast genom att klicka på Bild | Justera | Ljusstyrka/kontrast. I fönstret Ljusstyrka/kontrast klickar du på Ställ in och i dialogrutan som visas anger du önskade värden för de lägsta och högsta värden som visas. Om du vill maximera de färgskillnader som observeras ställer du in dem på ungefär det lägsta och högsta som erhålls för alla bilder. Ställ in alla bilder i ett experiment på samma kontrastnivåer.
Klicka inte på Verkställ, eftersom det ändrar pixelvärdena och förhindrar generering av ett korrekt kalibreringsfält i nästa steg. - Lägg till ett färgkalibreringsfält genom att klicka på Analysera | Verktyg | Kalibrering bar. I dialogrutan som visas markerar du alternativet Överlägg för att ta bort fältet, om så önskas, genom att klicka på Bild | Överlägg | Ta bort överlägget.
- Om du vill kan du lägga till en skalstapel genom att klicka på Analysera | Verktyg | Skala stapel. I dialogrutan som visas anger du önskad storlek, plats och färg för fältet. Markera alternativet Överlägg för att behålla färgen på stapeln oavsett vilken LUT som används.
- Generera en RGB-bild för publicering genom att klicka på Bild | Överlägg | Platta till. Spara den resulterande bilden.
OBS: Denna bild är endast för presentation eller publicering. Intensitetsvärdena ändras, så det kan inte mätas. Staplarna bränns också permanent på bilden.
- Så här skapar du en intensitetsmodulerad bild:
- Klicka på Bild | Duplicera för att skapa en kopia av bilden och stäng sedan originalet.
- Om bilden är en Z-stack väljer du antingen ett enda segment eller genererar en Z-projektion för att visa alla mitokondrier.
- Ställ in visningskontrasten för bildförhållandet genom att klicka på Bild | Justera | Intensitet/kontrast och klicka på Ställ in i fönstret Intensitet/kontrast. I dialogrutan som visas anger du önskade värden för de lägsta och högsta värden som visas. Om du vill maximera de färgskillnader som observeras ställer du in dem på ungefär det lägsta och högsta som erhålls för alla bilder och ställer in alla bilder i ett experiment på samma kontrastnivåer. Klicka på Använd för att skala om pixelvärdena.
- Om du vill skapa ett kalibreringsfält duplicerar du den förbättrade bilden och genererar ett fält genom att gå till Analysera | Verktyg | Kalibrering Bar. Konvertera bilden och överlägget till RGB-format genom att klicka på Bild | Överlägg | Platta till. Om så önskas klistrar du in denna stapel på den intensitetsmodulerade RGB-bilden som erhölls i steg 5.6.2.12 för presentation eller publicering.
- Skapa en ny bild med samma bredd och höjd som bilden genom att klicka på Arkiv | Nyhet | Bild.... I dialogrutan som öppnas ställer du in parametrarna enligt följande: Typ: RGB; Fyll med: Svart; Bredd och höjd: 9Bildens bredd och höjd); Skivor: 1.
- Konvertera den nya stapeln till en HSB-bildstapel (nyans, mättnad, ljusstyrka) genom att klicka på Bild | Typ | HSB-stack.
- Klicka på bilden med kontrastjusterat förhållande genom att gå till Redigera | Välj Alla och sedan Redigera | Kopiera. Klicka sedan på HSB-stapeln, välj den första sektorn (nyans) och klicka på Redigera | Klistra in för att överföra förhållandevärdena.
- Välj sektor 2 (Mättnad) i HSB-stapeln. Ställ in förgrundsfärgen till vit genom att navigera till Redigera | Tillval | Färger. Klicka på Redigera | Välj Alla och sedan Redigera | Fyll och välj Nej i dialogrutan som öppnas om du bara vill fylla det aktuella segmentet med vitt.
- Öppna rådatabilden och dela kanalerna genom att klicka på Bild | Färg | Dela kanaler.
- Generera medelvärdet av de två kanalerna med hjälp av bildkalkylatorn och klicka på Process | Kalkylator för bilder. I dialogrutan som visas anger du åtgärden till Genomsnitt och anger Image1 och Image2 till täljar- respektive nämnarbilderna. Markera Skapa nytt fönster.
- Klicka på den genomsnittliga bilden som skapades ovan genom att navigera till Redigera | Välj Alla och sedan Redigera | Kopiera. Klicka sedan på HSB-stacken, markera den tredje sektorn (Value) och klicka på Redigera | Klistra in för att överföra intensitetsvärdena.
- Konvertera HSB-stapeln till RGB-färgrymden genom att klicka på Bild | Typ | RGB-färg. Spara den resulterande bilden.
- Så här skapar du en omodulerad färglagd bild:
Nej (3)
Figur 6: Schematisk bild av bildanalys och presentation. Konfokala bilder med snurrande skiva subtraheras först. Mitokondrier segmenteras efter tröskelvärden och konverteras till masker för varje segment. Dessa masker används på båda kanalerna och de maskerade bilderna används för att beräkna bildförhållandet. ROI ritas för att mäta mtHyPer7-förhållandet i celler eller subcellulära regioner. Bilder med färgat förhållande kan också genereras för datapresentation. Skalstapel = 1 μm. Förkortning: ROI = intresseområde. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Representative Results
För att bekräfta att mtHyPer7 är en lämplig sond för att bedöma mitokondriellH2O2utvärderades lokaliseringen av mtHyPer7 och dess effekt på jästmitokondrier och cellhälsa. För att bedöma målinriktningen av mtHyPer7 färgades mitokondrierna med det vitala mitokondriespecifika färgämnet MitoTracker Red i kontrolljästceller och jäst som uttrycker mtHyPer7. Med hjälp av MitoTracker Red-färgning upplöstes mitokondrier som långa rörformiga strukturer som låg i linje längs moderknoppsaxeln och ackumulerades i spetsen av knoppen och spetsen av modercellen distalt om knoppen41. Mitokondriell morfologi var likartad i kontrollcellerna och mtHyPer7-uttryckande cellerna. Dessutom samlokaliserades mtHyPer7 med MitoTracker rödfärgade mitokondrier (Figur 3A). Således riktades mtHyPer7 effektivt och kvantitativt mot mitokondrier utan att påverka normal mitokondriell morfologi eller distribution.
Därefter utfördes ytterligare valideringsexperiment för att bedöma effekten av mtHyPer7 på cellulär kondition och känslighet för oxidativ stress i mitokondrier. Tillväxthastigheten för mtHyPer7-uttryckande celler i rika eller syntetiska glukosbaserade medier (YPD respektive SC) liknar den för otransformerade vildtypsceller (figur 3B,D). För att bedöma de möjliga effekterna på oxidativ stress i mitokondrier behandlades kontroll- och mtHyPer7-uttryckande jäst med låga nivåer av parakvat, en redoxaktiv liten molekyl som ackumuleras i mitokondrier och resulterar i förhöjda superoxidnivåer i organellen24,27. Om mtHyPer7-uttryck antingen inducerar oxidativ stress i mitokondrier eller skyddar mitokondrier från oxidativ stress, bör mtHyPer7-uttryckande celler uppvisa en ökad respektive minskad känslighet för parakvatbehandling. Behandling med låga nivåer av parakvat resulterade i en minskning av jästtillväxten. Dessutom var tillväxthastigheten för vildtypsceller och mtHyPer7-uttryckande celler i närvaro av parakvat likartad (Figur 3C,E). Därför skapade inte uttrycket av biosensorn signifikanta cellulära spänningar i spirande jästceller eller förändrade jästens känslighet för mitokondriell oxidativ stress.
Med tanke på bevisen för att mtHyPer7 är lämplig för att studera mitokondriell H2O2 i spirande jäst, testades det om mtHyPer7 kunde detektera mitokondriell H2O2 i vildtypsjäst i mitten av logfasen och förändringar i mitokondriell H2O2 inducerad av externt tillsattH2O2. Ett H2O2-titreringsexperiment utfördes och medelvärdet av oxiderad:reducerad (O/R) mtHyPer7-kvot mättes i mitokondrier.
De automatiserade analysskripten producerade flera utdatafiler.
Förhållandebilden (ratio.tif): En Z-stack som består av förhållandet mellan de bakgrundskorrigerade, tröskelförsedda 488 nm- och 405 nm-stackarna. Den här stacken kan visas i Fiji utan ytterligare bearbetning. Vi rekommenderar dock att du förbättrar kontrasten och/eller färglägger bilden enligt beskrivningen i protokollsteg 4.3 eller 5.6 innan du tittar på den.
Maskbilden (mask.tif): En Z-stack som består av de tröskelförsedda mitokondriella områdena som används för analys. Den här bilden måste användas för att utvärdera tröskelvärdets noggrannhet.
ROIs som används för analys (ROIs.zip): När den här filen öppnas i Fiji, tillsammans med källbilden, läggs ROI ovanpå bilden för att korsreferera resultattabellen och källbilden. Varje ROI döps om med ett cellnummer och ROI-nummer.
Måtttabeller (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) som innehåller area, medelvärde och integrerad densitet för tröskelförsedda mitokondrier för varje sektor i täljar-, nämnar- respektive förhållandebilderna. I skivor där mitokondrier var frånvarande eller ur fokus registreras NaN.
En loggfil (Log.txt) som dokumenterar de alternativ som används för bakgrunds- och bruskorrigering, tröskelvärde och förhållandeberäkning.
O/R-kvoten för mtHyPer7 visade ett dosberoende svar på H2O2-koncentrationen, som nådde en platå vid 1-2 mM externt tillsattH2O2(figur 7). Överraskande nog var HyPer7-kvoten lägre i cellerna som exponerades för 0,1 mM H2O2än i kontrollcellerna, även om denna skillnad inte var statistiskt signifikant. En förklaring till detta fenomen kan vara en hormesisrespons, där exponering för en låg stressnivå kan inducera stressreaktioner, såsom antioxidantmekanismer, som i sin tur minskar mängden ROS som kan detekteras av sonden. Högre nivåer av stressorer kan däremot överväldiga de interna stressreaktionerna och resultera i en högre avläsning från HyPer7.
Figur 7: Respons av mtHyPer7 på externt tillsatt H 2 O 2. (A) Maximal projektion av 405 nm och 488 nm exciterade bilder och genomsnittlig intensitetsprojektion av ratiometriska bilder av mtHyPer7 i celler i mitten av logfasen som exponerats för olika koncentrationer av H 2 O 2. Pseudocolor indikerar förhållandet oxiderat: reducerat mtHyPer7 (skala längst ner). Skalstapel = 1 μm. Cellkonturen visas i vitt. n > 100 celler per villkor. (B) Kvantifiering av mtHyPer7 oxiderad:reducerad kvot i spirande jästceller behandlade med olika koncentrationer avH2O2. Medelvärdet för fem oberoende försök visas, med olikformade och färgade symboler för varje försök. Medelvärde ± SEM för förhållandet mellan oxiderad:reducerad mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (ingen behandling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (envägs ANOVA med Tukeys test för multipla jämförelser). p-värden betecknas som: ****p < 0,0001. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Slutligen har tidigare studier visat att piggare mitokondrier, som är mer reducerade och innehåller mindre superoxid, företrädesvis nedärvs av jästdotterceller4, och att cytosoliska katalaser transporteras till och aktiveras i jästdotterceller42,43,44,45. Dessa studier dokumenterar den asymmetriska nedärvningen av mitokondrier under jästcelldelning och en roll för denna process i dottercellernas kondition och livslängd, såväl som mor-dotter-åldersasymmetri. För att testa om det finns skillnader iH2O2mellan mödrar och knoppar mättes mtHyPer7 i knoppar och moderceller. Skillnader i mitokondriellH2O2observerades inom jästceller, och en subtil men statistiskt signifikant minskning av H 2 O2biosensoravläsning detekterades i mitokondrier i knoppen jämfört med de i modercellen (Figur 8). Dessa fynd överensstämmer med tidigare fynd om att mitokondrier i knoppen är bättre skyddade mot oxidativ stress. De tillhandahåller också dokumentation om att mtHyPer7 kan ge en kvantitativ avläsning för mitokondriellH2O2med cellulär och subcellulär upplösning i spirande jäst.
Figur 8: MitokondriellH2O2-nivåär lägre i dottercellen. (A) Maximal projektion av en ratiometrisk bild av mtHyPer7 i en representativ cell. Pseudocolor indikerar förhållandet oxiderat: reducerat mtHyPer7 (skala längst ner). Subcellulära skillnader i förhållandet är uppenbara (pilspetsar). Skalstapel = 1 μm. Cellkontur: vit. (B) Skillnaden mellan mtHyPer7-kvoten i knoppen och modercellen. För varje enskild cell subtraherades moderkvotvärdet från knoppkvotvärdet och plottades som en punkt. n = 193 celler sammanslagna från fem oberoende experiment, visade med olikfärgade symboler för varje experiment. Medelvärde ± SEM för skillnaden mellan mtHyPer7-kvoten i knopp- och modercellerna: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (parvis t-test) Klicka här för att se en större version av denna figur.
Tilläggstabell S1: Stammar som används i denna studie. Förteckning över använda jäststammar. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande tabell S2: Plasmider som används i denna studie. Lista över plasmider som används. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggstabell S3: Primers som används i denna studie. Förteckning över använda primers. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tilläggsfil 1: Protokoll för konstruktion av plasmider för biosensorer. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande fil 2: Skript för automatiserad analys. För varje skript tillhandahålls exempelindatafiler och utdatafiler. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Discussion
I detta protokoll beskrivs en metod för att använda mtHyPer7 som biosensor för att bedöma mitokondriellH2O2i levande spirande jästceller. Biosensorn konstrueras med hjälp av en CRISPR-baserad metod och förs in i en bevarad genfri region i jästgenomet utan användning av selekterbara markörer. Jämfört med plasmidburna biosensorer uttrycks integrerade sådana i alla celler och på konsekventa nivåer, vilket ger mer tillförlitliga kvantifieringsresultat. Inga selekterbara markörer används för att generera mtHyPer7-uttryckande celler, vilket möjliggör användning av ett bredare spektrum av stambakgrunder och underlättar genetisk modifiering av biosensoruttryckande celler. Proteinet mtHyPer7 är korrekt riktat mot mitokondrier utan märkbara effekter på mitokondriell morfologi, funktion, distribution eller cellulär tillväxthastighet. mtHyPer7 visar ett dosberoende svar på externt tillsattH2O2. Dessutom kan mtHyPer7 rapportera om heterogeniteten i mitokondriell kvalitet med subcellulär upplösning. Slutligen, att använda ett konfokalmikroskop med snurrande skiva i motsats till vidvinkelmikroskopi för att avbilda mitokondriellt riktade biosensorer orsakar mindre fotoblekning till fluoroforer och genererar högupplösta bilder för att analysera subcellulära skillnader.
Begränsningar och alternativa tillvägagångssätt
Denna metod är inte lämplig för avbildning av celler i mer än 10 minuter, eftersom cellerna kommer att torka ut under täckglaset. För långtidsavbildning är det bättre att använda agardynmetoden46 eller att immobilisera celler i en odlingsskål med glasbotten fylld med SC-medium.
Valet av biosensor bör styras av målkoncentrationen under experimentella förhållanden. Om känsligheten för HyPer7 är för hög rekommenderas en annan HyPer-version, till exempel HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det bör dock noteras att andra HyPer-sonder är mer pH-känsliga. För högre känslighet kan peroxiredoxinbaserad roGFP vara lämpligare (roGFP2Tsa2ΔCR)27.
Oxidationskonstanttillståndet för H 2 O2-sensornär knuten till både oxidations- och reduktionshastigheter. Oxidationshastigheten för biosensorer orsakas huvudsakligen avH2O2, men reduktionshastigheten beror på de antioxidantreduktionssystem som är aktiva i cellen och organellen. Det har visats att HyPer7 huvudsakligen reduceras av thioredoxinsystemet i jästcytosol, och dess reduktion är snabbare än för roGFP2Tsa2ΔCR27. Därför bör probens olika reduktionsmekanismer och responsdynamik beaktas vid tolkning av mätningar av H2O2-biosensorer. I synnerhet, för att härleda H2O2-nivåerfrån biosensoravläsningen, måste det antas att reduktionssystemet bibehåller en konstant kapacitet under experimentet. Som ett alternativ till de skript som beskrivs här har en mängd annan programvara gjorts fritt tillgänglig för analys av redoxsensorer49.
Kritiska steg
Med alla biosensorer är det viktigt att visa att biosensorn i sig inte påverkar processen som mäts. Därför är det viktigt att jämföra tillväxten och mitokondriell morfologi hos stammar under varje experimentellt tillstånd. Här bedöms mitokondriernas morfologi med hjälp av MitoTracker Red, som färgar mitokondrier på ett membranpotentialberoende sätt. Jämförelse av mitokondrierna i otransformerade och biosensortransformerade celler kan dock åstadkommas genom färgning med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM), ett alternativt membranpotentialavkännande mitokondriellt vitalfärgämne, eller MitoTracker Green, som färgar mitokondrier oberoende av membranpotential. Om du misstänker skadliga effekter kan det hjälpa att minska uttrycksnivån eller ändra integreringsplatsen.
Validering av probens dos-responsbeteende och signal-brusförhållandet för avbildningstekniken är också viktigt för att samla in robusta resultat. Om variationen inom en grupp överstiger variationen mellan grupperna blir skillnaderna svåra att upptäcka. Variabilitet inom gruppen kan bero på verklig populationsvariation eller på brus i detektionsprocessen. De viktigaste stegen för att öka signal:brus-förhållandet är bildförvärv (pixelvärdesintervall och brus), bakgrundssubtraktion och trösklar.
Bullereffekter kan också reduceras under beräkningsstegen. Det enklaste tillvägagångssättet är att beräkna den viktade medelintensiteten från bildmätningarna (Results.csv), där varje pixel representerar det lokala förhållandet mellan excitationseffektiviteten. Detta ger ett "pixelvist" förhållande. Men om förhållandet mellan bildsignal och brus är lågt kan mer robusta resultat erhållas genom att beräkna den viktade medelintensiteten för en ROI i både täljar- och nämnarkanalerna och sedan beräkna förhållandet mellan dessa två viktade medelvärden ("regionvist" förhållande).
Om du vill välja en tröskelmetod använder du Fiji-kommandot Bild | Justera | Auto Threshold kan användas för att automatiskt prova alla inbyggda Fiji-metoder. För att utvärdera segmentering (trösklar) konverteras en sparad mask till en markering genom att klicka på Redigera | Urval | Skapa markering, läggs till i ROI-hanteraren (genom att trycka på T) och aktiveras sedan på råbildsfilen. Om mitokondrier inte detekteras på ett tillfredsställande sätt bör en annan segmenteringsmetod försökas.
När du jämför bilder är det viktigt att få alla bilder med identiska bildförhållanden, samt att visa alla bilder med identisk kontrastförbättring.
Mitokondriella rörelser måste beaktas vid optimering av avbildningsförhållandena. Om mitokondrierna rör sig signifikant mellan excitation vid 405 och 488 nm kommer förhållandebilden inte att vara korrekt. Det rekommenderas att hålla exponeringstiden <500 ms och att ändra excitationen med den snabbaste tillgängliga metoden (t.ex. en triggerpuls eller akustooptiskt avstämbart filter). När du samlar in en Z-stack bör båda excitationerna utföras för varje Z-steg innan du går vidare till nästa Z-steg.
För visning av resultaten är förändringar i nyans (färg) mer uppenbara för det mänskliga ögat än förändringar i intensitet. Därför konverteras kvotvärdet till en färgskala för enklare visuell tolkning. Färglagda bilder kan vara omodulerade, där alla mitokondriella pixlar visas med samma ljusstyrka, eller intensitetsmodulerade, där pixelintensiteten i originalbilden används för att ställa in intensiteter i den färglagda bilden.
Modifiering och felsökning
Som ett alternativ till att bekräfta mitokondriell funktion genom provokation med parakvat kan celler kopieras eller inokuleras till fermenterbara och icke-fermenterbara kolkällor.
För bakgrundssubtraktion, subtraktion av rullande boll (genom att navigera till Process | Subtrahera bakgrund...) Kan också användas för att ta bort ojämn belysning. Det bör säkerställas att närvaron av celler inte ändrar bakgrunden som subtraheras (genom att markera alternativet Skapa bakgrund och undersöka resultatet).
Sammanfattningsvis ger mtHyPer7-sonden en konsekvent, minimalt invasiv metod för att relatera den morfologiska och funktionella statusen för jästmitokondrier i levande celler, och möjliggör studier av en viktig cellulär stressfaktor och signalmolekyl i ett genetiskt hanterbart, lättillgängligt modellsystem.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några intressekonflikter.
Acknowledgments
Författarna tackar Katherine Filpo Lopez för teknisk experthjälp. Detta arbete stöddes av anslag från National Institutes of Health (NIH) (GM122589 och AG051047) till LP.
Dessa studier använde Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource of the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center vid Columbia University, delvis finansierat genom NIH/NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens | Nikon | MRD01905 | |
| Adenine sulfate | Sigma-Aldrich | A9126 | |
| Bacto Agar | BD Difco | DF0145170 | |
| Bacto Peptone | BD Difco | DF0118170 | |
| Bacto Tryptone | BD Difco | DF211705 | |
| Bacto Yeast Extract | BD Difco | DF0127179 | |
| BamHI | New England Biolabs | R0136S | |
| BglII | New England Biolabs | R0144S | |
| Carbenicilin | Sigma-Aldrich | C1389 | |
| Carl Zeiss Immersol Immersion Oil | Carl Zeiss | 444960 | |
| Dextrose (D-(+)-Glucose) | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| E. cloni 10G chemical competent cell | Bioserch Technologies | 60108 | |
| FIJI | NIH | Schindelin et al 2012 | |
| G418 (Geneticin) | Sigma-Aldrich | A1720 | |
| GFP emission filter | Chroma | 525/50 | |
| Gibson assembly | New England Biolabs | E2611 | |
| Graphpad Prism 7 | GraphPad | https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/ | |
| H2O2 (stable) | Sigma-Aldrich | H1009 | |
| HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO | Pon Lab | JYE057/EP41 | Liao et al 20201 |
| Incubator Shaker | New Brunswick Scientific | E24 | |
| KAPA HiFi PCR kit | Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA | KK1006 | |
| L-arginine hydrochloride | Sigma-Aldrich | A8094 | |
| laser | Agilent | 405 and 488 nm | |
| L-histidine hydrochloride | Sigma-Aldrich | H5659 | |
| L-leucine | Sigma-Aldrich | L8912 | |
| L-lysine hydrochloride | Sigma-Aldrich | L8662 | |
| L-methionine | Sigma-Aldrich | M9625 | |
| L-phenylalanine | Sigma-Aldrich | P5482 | |
| L-tryptophan | Sigma-Aldrich | T8941 | |
| L-tyrosine | Sigma-Aldrich | T8566 | |
| mHyPer7 plasmid | This study | JYE116 | |
| Microscope coverslips | ThermoScientific | 3406 | #1.5 (170 µm thickness) |
| Microscope slides | ThermoScientific | 3050 | |
| MitoTracker Red CM-H2Xros | ThermoFisherScientific | M7513 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888 | |
| NEBuilder HiFi Assembly Master Mix | New England Biolabs | E2621 | |
| Nikon Elements | Nikon | Microscope acquisition software | |
| Nikon Ti Eclipse inverted microscope | Nikon | ||
| Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) | Sigma-Aldrich | Cat. 856177 | |
| RStudio | Posit.co | Free desktop version | |
| Spectrophotometer | Beckman | BU530 | |
| Stagetop incubator | Tokai Hit | INU | |
| Uracil | Sigma-Aldrich | U1128 | |
| Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids | BD Difco | DF0919073 | |
| YN2_1_LT58_X2site | Addgene | 177705 | Pianale et al 2021 |
| Zyla 4.2 sCMOS camera | Andor |
References
- vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G.
- McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
- Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
- McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
- Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
- Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
- Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
- Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
- Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
- Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P.
- Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
- Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
- Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
- Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
- Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
- Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
- Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
- Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
- Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
- Handy, D. E., Loscalzo, J.
- Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
- Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
- Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
- Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
- Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
- Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
- Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
- Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
- Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
- Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
- Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
- Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
- Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
- Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
- Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
- Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
- Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Collins, T. J.
- Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
- Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
- Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
- Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
- Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
- Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
- Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
- Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
- Fricker, M. D.
- Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).
