Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Avbildning av mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrielt peroksid, i levende gjærceller

Published: June 2, 2023 doi: 10.3791/65428
Automatic Translation
1, 1,2, 2, 1,2, 1,2
1Department of Pathology and Cell Biology, Columbia University Irving Medical Center, 2Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource in the Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University Irving Medical Center

Summary

Hydrogenperoksid (H 2 O2) er både en kilde til oksidativ skade og et signalmolekyl. Denne protokollen beskriver hvordan man måler mitokondriell H2 O2 ved hjelp av mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), en genetisk kodet ratiometrisk biosensor, i levende gjær. Den beskriver hvordan du optimaliserer bildeforholdene og utfører kvantitativ cellulær og subcellulær analyse ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare.

Abstract

Mitokondriell dysfunksjon, eller funksjonell endring, finnes i mange sykdommer og tilstander, inkludert nevrodegenerative og muskuloskeletale lidelser, kreft og normal aldring. Her beskrives en tilnærming for å vurdere mitokondriefunksjonen i levende gjærceller ved cellulære og subcellulære oppløsninger ved hjelp av en genetisk kodet, minimalt invasiv, ratiometrisk biosensor. Biosensoren, mitokondrie-målrettet HyPer7 (mtHyPer7), detekterer hydrogenperoksid (H 2 O2) imitokondrier. Den består av en mitokondriell signalsekvens fusjonert til et sirkulært permutert fluorescerende protein og H2O2-responsivt domene av et bakterielt OxyR-protein. Biosensoren genereres og integreres i gjærgenomet ved hjelp av et CRISPR-Cas9 markørfritt system, for mer konsistent uttrykk sammenlignet med plasmidbårne konstruksjoner.

mtHyPer7 er kvantitativt målrettet mot mitokondrier, har ingen påviselig effekt på gjærvekst eller mitokondriell morfologi, og gir en kvantitativ avlesning for mitokondriell H 2 O2under normale vekstforhold og ved eksponering for oksidativt stress. Denne protokollen forklarer hvordan du optimaliserer bildeforholdene ved hjelp av et konfokalmikroskopsystem med spinnskiver og utfører kvantitativ analyse ved hjelp av fritt tilgjengelig programvare. Disse verktøyene gjør det mulig å samle rik romlig informasjon om mitokondrier både i celler og mellom celler i en populasjon. Videre kan arbeidsflyten beskrevet her brukes til å validere andre biosensorer.

Introduction

Mitokondrier er essensielle eukaryote cellulære organeller som er kjent for sin funksjon i å produsere ATP gjennom oksidativ fosforylering og elektrontransport1. I tillegg er mitokondrier steder for kalsiumlagring, syntese av lipider, aminosyrer, fettsyrer og jern-svovelklynger og signaltransduksjon 2,3. I cellene danner mitokondriene et dynamisk nettverk med karakteristisk morfologi og distribusjon, som varierer etter celletype og metabolsk tilstand. Videre, selv om mitokondrier kan smelte sammen og dele seg, er ikke alle mitokondriene i en celle ekvivalente. Tallrike studier har dokumentert funksjonell heterogenitet av mitokondrier i individuelle celler i attributter som membranpotensial og oksidativ tilstand 4,5,6. Denne variasjonen i mitokondriell funksjon skyldes delvis skade på organellen fra mtDNA-mutasjoner (som forekommer med høyere hastighet enn i nukleært DNA) og oksidativ skade av reaktive oksygenarter (ROS) generert både innenfor og utenfor organellen 7,8,9. Skader på organellen reduseres av mitokondrielle kvalitetskontrollmekanismer som reparerer skaden eller eliminerer mitokondrier som er skadet utover reparasjon10.

Hydrogenperoksid (H 2 O2) er en reaktiv oksygenart som er en kilde til oksidativ skade på cellulære proteiner, nukleinsyrer og lipider. Imidlertid tjener H 2O2 også som et signalmolekyl som regulerer cellulære aktiviteter gjennom reversibel oksidasjon av tioler i målproteiner11,12. H 2 O2er produsert fra elektroner som lekker fra mitokondriell elektrontransportkjede og av spesifikke enzymer, slik som NADPH-oksidase og monoaminoxidaser 13,14,15,16,17,18,19,20. Det er også inaktivert av antioksidantsystemer, inkludert de som er basert på tioredoksin og glutation21,22,23. Dermed er analyse av mitokondrielle H2O2-nivåer avgjørende for å forstå rollen til denne metabolitten i normal mitokondriell og cellulær funksjon og under forhold med oksidativt stress.

Det overordnede målet med denne protokollen er å oppdage mitokondriell H 2O 2 ved hjelp av en genetisk kodet ratiometrisk H 2 O 2biosensor, HyPer7, som er målrettet mot organellen (mtHyPer7). mtHyPer7 er en kimær som består av mitokondriell signalsekvens fra ATP9 (Su9-presekvensen), en sirkulært permutert form av grønt fluorescerende protein (GFP) og H2O2-bindende domene av OxyR-proteinet fra Neisseria meningitidis24 (figur 1). I sirkulært permutert GFP smeltes N- og C-terminalene til innfødt GFP sammen og nye terminaler dannes nær kromoforen, noe som gir større mobilitet til proteinet og større labilitet av dets spektrale egenskaper sammenlignet med innfødt GFP25. Samspillet mellom mtHyPer7s OxyR-domene og H2O2 er høy affinitet,H2O2-selektiv, ogfører til reversibel oksidasjon av konserverte cysteinrester og disulfidbrodannelse. Konformasjonsendringer assosiert med oksidasjon av OxyR overføres til den sirkulært permuterte GFP i mtHyPer7, noe som resulterer i en spektral forskyvning i eksitasjonsmaksimumet av mtHyPer7-kromoforen fra 405 nm i redusert tilstand til 488 nm iH2O2-oksiderttilstand26. Dermed reflekterer forholdet mellom fluorescens fra mtHyPer7 som respons på eksitasjon ved 488 nm mot 405 nm oksydasjonen av sonden ved H 2 O2.

Ideelt sett bør en biosensor gi en sanntids, absolutt, kvantitativ avlesning av målmolekylet. Dessverre er dette imidlertid ikke alltid mulig i virkelige målinger. Når det gjelder oksidasjonssensorer, som mtHyPer7, påvirkes sanntidsavlesningen av reduksjonshastigheten til disulfidbroen. Reduksjonssystemene som brukes av ROS-biosensorer er forskjellige, og disse kan dramatisk endre sonderesponsdynamikken - som vist ved sammenligning av HyPer7, redusert av tioredoksinsystemet, og roGFP2-Tsa2ΔCR, redusert av glutation i gjærcytosol27. For å trekke en konklusjon om den relative H2O2-konsentrasjonen fra mtHyPer7-forhold, må man derfor anta at reduksjonssystemet opprettholder en konstant kapasitet under forsøket. Til tross for disse betraktningene har HyPer7 og relaterte sonder blitt brukt i ulike sammenhenger for å få informasjon om H 2 O2 i levendeceller25,28,29.

Figure 1
Figur 1: Design, molekylær mekanisme og eksitasjon/emisjonsspektra til H 2 O2biosensoren mtHyPer7. (A) mtHyPer7-sonden er avledet ved å sette inn sirkulært permutert GFP i OxyR-RD-domenet fra Neisseria meningitidis. Den inneholder mitokondriell målrettingssekvens fra subenhet 9 av ATP-syntasen fra Neurospora crassa (Su9). (B) Illustrasjon av H 2 O2-sensormekanismentil mtHyPer7. Oksidasjon av cysteiner i RD-domenet øker fluorescensutslipp ved eksitasjon ved 488 nm og reduserer utslipp produsert ved eksitasjon ved 405 nm. (C) Eksitasjons- og emisjonsspektra av HyPer7 i oksiderte og reduserte former. Denne figuren er gjengitt med tillatelse fra Pak et al.24. Forkortelser: GFP = grønt fluorescerende protein; cpGFP = sirkulært permutert GFP. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Denne ratiometriske avbildningen av mtHyPer7 gir viktige fordeler for mitokondriell H2 O2 kvantifisering24,27; Det gir en intern kontroll for sondekonsentrasjon. I tillegg er skiftet i eksitasjonstopp produsert av H 2 O 2 eksponering ikke fullført, selv i mettende konsentrasjoner av H 2 O2. Dermed kan ratio imaging øke følsomheten ved å inkorporere to spektrale punkter i analysen.

mtHyPer7-sonden som brukes her har en meget høy affinitet for H 2 O2og relativt lav følsomhet for pH24, og har blitt målrettet mot Caenorhabditis elegans mitokondrier30. Dette proteinet har også blitt brukt i gjær 27,31. Tidligere studier baserte seg imidlertid på plasmidbårent uttrykk av mtHyPer7, noe som resulterer i celle-til-celle-variabilitet i probeuttrykk27. I tillegg ble konstruksjonen beskrevet i denne protokollen integrert i en konservert, genfri region på kromosom X32 ved hjelp av en CRISPR-basert tilnærming for markørfri integrasjon. Ekspresjon av det integrerte biosensorgenet styres også av den sterke konstitutive TEF1-promotoren (figur 2). Som et resultat er det mer stabilt, konsistent uttrykk for biosensoren i gjærcellepopulasjoner sammenlignet med det som observeres ved bruk av plasmidbåren biosensoruttrykk, og celler som bærer biosensoren kan forplantes uten behov for selektive medier.

Figure 2
Figur 2: Generering av mtHyPer7-uttrykkende celler med CRISPR. Cas9 og sgRNA-holdig plasmid (YN2_1_LT58_X2site) og PCR-forsterket mtHyPer7-holdig biosensorkonstruksjon blir introdusert i spirende gjærceller ved litiumacetattransformasjon. Det genfrie innsettingsstedet på kromosom X (X2) gjenkjennes og kuttes av Cas9-protein med sgRNA, og biosensoren integreres i genomet ved homolog rekombinasjon. Etter identifisering av de vellykkede transformantene ved mikroskopisk screening, koloni-PCR og sekvensering, fjernes Cas9-plasmidet (herdes) ved vekst i ikke-selektive medier. Forkortelser: sgRNA = single guide RNA; TEF = transkripsjonsforsterkerfaktor. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Endelig gir mtHyPer7 fordeler i forhold til andre ROS-biosensorer. For eksempel kan organiske fargestoffer som brukes til å oppdage ROS (f.eks. Dihydroethidium [DHE]2 og MitoSOX3) produsere ujevn eller uspesifikk farging og leveres ofte i løsningsmidler som etanol eller dimetylsulfoksid, som krever ytterligere kontroller for løsningsmiddeleffekter. En annen klasse av ROS-biosensorer er fluorescensresonansenergioverføring (FRET) -baserte biosensorer (f.eks. Redoksfluor for cellulær redokstilstand4, og peroksidsensorene HSP-FRET5, OxyFRET 6 og PerFRET6). Disse probene er genetisk kodede og svært følsomme i prinsippet og kan kvantitativt målrettes mot mitokondrier ved hjelp av godt karakteriserte mitokondrielle signalsekvenser. Det er imidlertid utfordringer ved bruk av FRET-baserte sonder, inkludert bakgrunn på grunn av krysseksitasjon og gjennomblødning, og strenge krav til nærhet og orientering av fluoroforene for at FRET skal forekomme33,34. I tillegg består FRET-sonder av to fluorescerende proteiner som krever større konstruksjoner for ekspresjon i celler av interesse sammenlignet med spektra-skiftende sonder. Protokollen beskrevet her ble utviklet for å dra nytte av styrken til den HyPer7-baserte biosensoren, og for å bruke denne kompakte, ratiometriske, genetisk kodede sonden med høy affinitet for kvantitativ avbildning av peroksid i mitokondrier i levende gjær.

Protocol

1. Generering av biosensorplasmidet, integrering i gjærgenomet, og vurdering av målretting av mtHyPer7 til mitokondrier og effekter på mitokondriell morfologi, cellulær veksthastighet eller oksidativ stressfølsomhet

MERK: Se tilleggsfil 1, tilleggstabell S1, tilleggstabell S2 og tilleggstabell S3 for henholdsvis biosensorplasmidkonstruksjon, stammer, plasmider og primere som brukes til biosensorkonstruksjon og karakterisering. Se materialfortegnelsen for detaljer relatert til alle materialer, reagenser og instrumenter som brukes i denne protokollen.

  1. Forsterk biosensorkonstruksjonen fra biosensorplasmidet ved hjelp av primerne Y290 og Y291 (figur 2) via polymerasekjedereaksjon (PCR).
  2. Bland 500 ng av Cas9 / guide RNA-plasmidet (YN2_1_LT58_X2site32) med 50 μL av PCR-produktet fra trinn 1.1 (biosensorkonstruksjonen). Transformer blandingen til spirende gjær ved hjelp av litiumacetatmetoden35 og velg transformanter på YPD-plater som inneholder 200 mg / ml G418.
  3. Skjermkandidattransformanter ved PCR-amplifisering av genomisk DNA ved bruk av primerne Y292 og Y293. For transformanter som har en innsats av forventet størrelse (positiv: 3,5 kb; negativ: 0,3 kb), sekvenser det innsatte området for videre validering.
  4. Evaluere biosensorens effekt på vekst og mitokondriefunksjon (figur 3). Hvis biosensoren ser ut til å påvirke funksjonen til celler eller mitokondrier, kan du prøve å minimere effekten ved å endre promotoren, integrasjonsstedet eller foreldrestammen.
    1. Bestem effekten av biosensorkonstruksjonen på veksthastigheten i nærvær og fravær av en oksidativ stressor (f.eks. Paraquat), som beskrevet tidligere36.
      1. Fortynn midtloggfaseceller til en optisk tetthet på 600 nm (OD 600) på 0,0035 i200 μL tilsvarende medier med og uten behandling i hver brønn på en 96-brønns flatbunnsplate. Mål den optiske tettheten til kulturen hvert 20. minutt i 72 timer ved hjelp av en plateleser. Beregn maksimal vekstrate (stigningstall) som maksimal endring i OD over et intervall på 240 minutter i løpet av 72 timers kurs.
    2. Visualiser cellene ved fluorescensmikroskopi og evaluer lysstyrken og mitokondriell morfologi som beskrevet tidligere37.
      1. Dyrk cellene til midten av tømmerfasen, beis mitokondriene med 250 nM MitoTracker Red i 30 min, og vask to ganger før avbildning. Fang Z-stabler med 6 μm dybde med 0,3 μm intervaller på et bredfelt- eller konfokalfluorescensmikroskop og inspiser visuelt. Se etter mitokondrier som danner langstrakte rørformede strukturer.

Figure 3
Figur 3: mtHyPer7 er rettet mot mitokondrier og påvirker ikke mitokondriell morfologi, cellevekst eller følsomhet for oksidativt stress. (A) Mitokondriell morfologi i levende gjærceller som uttrykker mtHyPer7. Venstre panel: mtHyPer7 visualisert med 488 nm eksitasjon. Midtpanel: mitokondrier merket med 250 nM MitoTracker Red. Høyre panel: sammenslåtte bilder. Anslag for maksimal intensitet vises. Celleomrisset vises i hvitt. Skala bar = 1 μm. (B,C) Vekstkurver og maksimal veksthastighet for villtypeceller og celler som uttrykker mtHyPer7 dyrket i nærvær (+PQ) eller fravær av 2,5 mM paraquat i YPD-medier. (D,E) Vekstkurver og maksimal veksthastighet for villtype og mtHyPer7-uttrykkende celler dyrket i nærvær (+PQ) eller fravær av 2,5 mM paraquat i SC-medier. Alle vekstkurver er middelet til tre uavhengige replikater. Maksimale vekstrater er representert som gjennomsnitt ± standardfeil for gjennomsnittet (SEM). Vekstkurveanalyse ble gjort ved å fortynne midt-log faseceller til en OD 600 på 0,0035 i200 μL tilsvarende medier i hver brønn i en 96-brønns flatbunnplate. Kulturens OD ble målt hvert 20. minutt i 72 timer ved hjelp av en plateleser. Hver stamme/tilstand ble belagt i triplikat og gjennomsnittlig vekstrate ble plottet. Maksimal vekstrate (stigningstall) ble beregnet ved hjelp av endringene i OD over et intervall på 240 minutter i løpet av 72 timer. Forkortelser: WT = vill type; PQ = paraquat. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Cellekultur og forberedelse til avbildning (figur 4)

  1. Forplante cellene i syntetisk medium til midtloggfasen for avbildning. En 5 ml mid-log fasekultur gir nok celler til fire eller fem lysbilder og totalt >100 budded celler for analyse.
    1. Om morgenen dagen før forsøket, lag flytende prekulturer ved å inokulere 5 ml syntetisk komplett (SC) medium i et 50 ml konisk bunnrør med en enkelt koloni av gjærceller.
    2. Inkuber prekulturen i en orbital shaker ved 200 o / min og 30 ° C i 6-8 timer. Mål OD 600 i prekulturen, som skal være i midten av loggfasen: ~ 0,5-1 × 107 celler / ml, OD600 ~ 0,1-0,3.
    3. Forbered en kultur i midtloggfasen ved å bruke prekulturen til avbildning neste dag. Beregn mengden prekultur som trengs for en kultur i midtloggfasen etter vekst over natten (8-16 timer). Når cellene dyrkes i SC-medium, er doblingstiden ~ 2 timer. Derfor beregnes volumet (V) av prekultur for inokulering av en 5 ml over natten kultur ved hjelp av ligning (1):
      Equation 1(1)
    4. Inokuler 5 ml SC-medium i et 50 ml konisk-bunnrør med mengden prekultur beregnet i trinn 2.1.3. Dyrk i en orbital shaker ved 200 o / min og 30 ° C i 8-16 timer.
  2. På avbildningsdagen bekrefter du at kulturen som genereres i trinn 2.1.4, er i midtloggfasen (OD600 ~ 0,1-0,3). Konsentrer cellene fra 1 ml av midtloggfasekulturen ved sentrifugering ved 6000 × g i 30 s. Fjern supernatanten, og la 10-20 μL av supernatanten ligge i røret. Resuspender cellepelleten ved forsiktig å blande med gjenværende medier ved hjelp av en mikropipette.
  3. Bruk en luftblåser eller lofri vev for å fjerne støv fra et glassmikroskopglass og legg 1,8 μL av cellesuspensjonen til lysbildet. Dekk cellene med et #1,5 (170 μm tykt) glassdeksel, senk dekselet sakte i vinkel for å unngå å introdusere bobler.
  4. Bilde umiddelbart og kast lysbildet etter 10 min bildebehandling.

Figure 4
Figur 4: Cellevekst og avbildning. Spirende gjærceller som uttrykker mtHyPer7 dyrkes til midten av loggfasen. Bilder i Z-serien samles inn ved spinning-disk konfokalmikroskopi og blir deretter utsatt for 3D-rekonstruksjon og analyse. Se protokollen §§ 2-3. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

3. Optimalisering av bildeforhold og bildeinnsamling (figur 5)

  1. Velg en bildemodus. For optisk seksjonering uten etterbehandling foretrekkes et konfokalinstrument med spinnskive. Men hvis signalet er lavt, eller dette instrumentet er utilgjengelig, bruk bredfeltsbilder, og sørg for at bredfeltbildene er deconvolved for å fjerne uskarphet ute av fokus, som beskrevet tidligere38.
  2. Velg optikk. Bruk et olje-nedsenkingsobjektiv med høy numerisk blenderåpning, for eksempel 100x/1.45 Plan-Apochromat.
  3. Velg eksitasjons- og emisjonsbølgelengder. For konfokal avbildning med spinnskiver, bruk en lasereksitasjon ved 405 nm og 488 nm og et standard GFP-utslippsfilter. For bredfeltsavbildning, bruk en lysemitterende diode (LED) eller lampeeksitasjon, men sørg for at filteroppsettet tillater variasjon av eksitasjonen mens du sender utslipp gjennom standard GFP-filter.
    MERK: Dette kan for eksempel oppnås ved å fjerne eksitasjonsfilteret fra en GFP-kube og bruke en LED eller filterhjul for å velge eksitasjon.
  4. Velg eksponeringstid og belysningsintensitet.
    1. Etablere innsamlingsbetingelser som gir et lett detekterbart signal og akseptabel oppløsning i hver fluorescenskanal. For eksempel, på et konfokalmikroskop med spinnskive med et sCMOS-kamera, bruk 2 x 2 binning, 20-40 % lasereffekt og 200-600 ms eksponering.
    2. Undersøk bildehistogrammet. I et 12-biters bilde (4 096 mulige gråtoner) må du kontrollere at det totale dynamiske området for bildepunktverdiene er minst flere hundre gråtoner, uten metning (figur 5A). I tillegg må du sørge for at rekkevidden er en størrelsesorden høyere enn støynivået. Beregn støynivået som standardavviket til bildepunktverdier i et cellefritt område i et bilde, målt som beskrevet i trinn 4.1.3.1.
    3. Test for fotobleking eller bildeindusert mitokondriell stress under de valgte bildeforholdene. Hvis overdreven fotobleking eller en økning i mitokondriellH2O2observeres, reduser lasereffekten og øk eksponeringen eller binning.
      1. Samle en time-lapse-serie med bilder, uten forsinkelse mellom innsamlinger, for å vurdere effekten av avbildningsbetingelsene på signalstabilitet og oksidativt stress i mitokondrier. Ved hjelp av programvaren for innsamling av mikroskop eller ImageJ måler du den gjennomsnittlige pikselverdien i hver fluorescenskanal for å bekrefte signalstabiliteten (<5 % endring; Figur 5B). Hvis eksperimentet ikke involverer time-lapse-avbildning, må du sørge for at fluorescensen er stabil over to eller tre gjentatte Z-stabler (25-35 eksponeringer).
        MERK: En reduksjon i fluorescens av begge kanalene kan indikere fotobleking; Imidlertid kan en reduksjon i 405 nm-eksitert fluorescens ledsaget av en økning i 488 nm-eksitert kanal indikere økt mitokondriellH2O2og bildeindusert oksidativt stress i organellen.
  5. Skaff bilder. Hvis du samler inn Z-stabler, må du kontrollere at Z-intervallet er det samme for alle bildene i datasettet, og inkludere hele cellen. For spirende gjær, bilde med et Z-intervall på 0,5 μm og en total stabeldybde på 6 μm. Skaff bilder i overført lys for å dokumentere cellegrenser.
  6. Analyser bilder manuelt eller halvautomatisk via skriptene som er tilgjengelige i tilleggsfil 2 og https://github.com/theresaswayne/biosensor, ved hjelp av Fiji-distribusjonen av ImageJ39 og den statistiske programvaren R (figur 6). I programvareinstruksjonene vises hierarkiske menykommandoer i fet skrift med "|", noe som indikerer en sekvens med menyvalg. Alternativer og knapper vises i fet skrift.

Figure 5
Figur 5: Optimalisering av bildebehandling . (A) Evaluering av bilder og histogrammer for riktig intensitetsområde. Projeksjoner med maksimal intensitet av konfokale bilder med roterende disk vises. Histogrammene vises med både en lineær Y-akse (svart) og en logskala Y-akse (grå) for å illustrere bildets dynamiske område. Venstre paneler: et støyende bilde med lav intensitet og dynamisk område. Midtpaneler: et bilde med et akseptabelt dynamisk område (~1,000 gråtoner) og intensitet. Høyre panel: et bilde som er forbedret med feil kontrast for å produsere overdreven metning. Skala bar = 1 μm. (B,C) Analyse av fotobleking av mtHyPer7. Påfølgende Z-stabler ble samlet uten forsinkelse, Z-stabler ble summert, og gjennomsnittlig intensitet av mitokondrier ble målt og normalisert til første tidspunkt. Resultater fra de tre første tidspunktene (27 eksponeringer) er vist. (B) Eksitasjonsbølgelengde: 405 nm. (C) Eksitasjonsbølgelengde: 488 nm. Verdiene som vises er gjennomsnittet av tre celler fra hver av tre uavhengige studier. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Semiautomatisert analyse med skript

  1. Generer og mål forholdsbilder ved hjelp av et biosensoranalyseskript (f.eks. biosensor.ijm eller biosensor-image-subtraksjon.ijm).
    1. Velg skriptet du vil bruke. Protokollen for bruk av hvert skript er lik; Eventuelle forskjeller vil bli spesifisert i teksten.
      1. biosensor.ijm: I dette skriptet korrigeres bakgrunn og støy ved hjelp av brukervalgte bildeområder, faste verdier eller ingen subtraksjon. Velge metoder for bakgrunns- og støykorrigering uavhengig av hverandre.
      2. biosensor-image-subtraction.ijm: I dette skriptet håndteres både bakgrunn og støy av samme brukervalgte metode, som kan være ett av følgende: tomt bilde, brukervalgt område i bildet, fast verdi eller ingen korreksjon.
    2. Åpne et flerkanals Z-stakkbilde på Fiji som ble hentet i trinn 3.5. Åpne ønsket skriptfil for biosensoranalyse. Kjør skriptet ved å klikke Kjør i vinduet Skriptredigering . I dialogvinduet som vises, skriv inn den forespurte informasjonen.
      1. Velg kanalnumrene til telleren og nevneren for beregning av forhold. For mtHyPer7 er telleren kanalen eksitert ved 488 nm, og nevneren er kanalen opphisset ved 405 nm. Velg kanalnummeret for bildet i overført lys, hvis det finnes, eller 0 hvis det ikke finnes noen.
      2. Velg ønsket bakgrunnssubtraksjonsmetode fra følgende fire alternativer. Hvis bakgrunnen er relativt ensartet, velger du Velg et bildeområde, som direkte måler bakgrunnsnivået i bildet. Hvis bakgrunnen varierer vesentlig over feltet, bruk biosensor-image-subtraction.ijm-skriptet og velg Tomt bilde (for å samle et tomt bilde for korreksjon, ta en flerkanals Z-stabel med identiske anskaffelsesbetingelser i et cellefritt synsfelt, eller fra et lysbilde laget med cellefritt vekstmedium). Fast verdi tillater registrering av en tidligere målt bakgrunnsverdi. Ingen etterlater bakgrunnen ukorrigert, men kan redusere presisjonen av målingen.
      3. Velg ønsket støysubtraksjonsmetode. Støyverdien brukes som en lavere terskel på bakgrunnssubtraherte, maskerte kanalbilder for å redusere effekten av tilfeldig variasjon i detektoravlesningen. Velg Velg et bildeområde eller Fast verdi for å tillate oppføring av et tidligere målt støynivå, som vanligvis fungerer bra ettersom støynivåene er konstante hvis bildeforholdene holdes konstante. Du kan også velge Ingen og bruke verdien 1 som nedre terskelverdi, noe som kan øke variasjonen i målingene.
      4. Velg en terskelalgoritme for å oppdage mitokondrier nøyaktig og konsekvent; Otsu eller MaxEntropy anbefales. Ideelt sett bør du bruke samme algoritme for alle bilder i et eksperiment, men sikre nøyaktig gjenkjenning av mitokondrier. Bruk en annen terskelmetode hvis det er endringer i morfologi under et eksperiment.
      5. Velg antall interesseområder (ROI) per celle. Hvis du for eksempel måler forskjeller mellom mor og knopp, velger du 2.
      6. Velg utdatamappen der målinger og forholdsbilder skal lagres.
    3. Følg instruksjonene for bakgrunns- og støykorrigering.
      1. Arealvalg (hvis aktuelt): Hvis Velg et bildeområde ble valgt for bakgrunns- eller støymåling, følger du instruksjonene for å tegne et bakgrunnsområde (utenfor celler eller fluorescerende artefakter) ved hjelp av rektangelets ROI-verktøy. Når du har tegnet området, klikker du OK.
      2. Oppføring med fast verdi (hvis aktuelt): Hvis Fast verdi ble valgt for måling av bakgrunn eller støy, følger du instruksjonene for å angi bakgrunns - og/eller støyverdier for hver fluorescenskanal.
      3. Tomt referansebilde (hvis aktuelt): Hvis Tomt bilde ble valgt for bakgrunns- eller støykorrigering i skriptet biosensor-image-subtraction.ijm, følger du instruksjonene for å velge en tom bildefil.
    4. Merk avkastning for måling. I mid-log fasekulturer, begrense analysen til budded celler.
      1. Tegn avkastning som tilsvarer individuelle celler eller subcellulære regioner basert på lysfeltbildet. Avkastningen trenger ikke å samsvare nøyaktig med celleomrisset, da bare terskelmitokondrier innenfor avkastningen vil bli målt. Alternativt kan du åpne et tidligere lagret ROI-sett: Klikk på Mer i ROI Manager, og velg deretter ROI-filen.
      2. Trykk på T etter at du har opprettet hver ROI for å legge til den valgte avkastningen i ROI Manager. Merk av for Vis alle i ROI-behandling for å dokumentere cellene som ble merket. Hvert område som legges til, vises som et nummerert element i ROI Manager-listen. Hvis du analyserer mer enn én avkastning per celle (f.eks. mor og knopp), merker du avkastningen i samme rekkefølge for hver celle som analyseres.
      3. Etter at alle ønskede avkastninger er lagt til i ROI Manager, klikker du OK i dialogboksen Merk celler .
    5. Velg måltabellformat. I dialogboksen MultiMeasure som vises, merker du av for Mål alle stykker. Merk av for En rad per stykke for å lage en tabell med ønsket format. Bruk process_multiROI_tables. R-skript for å behandle tabeller opprettet med alternativet Én rad per stykke; ikke sjekk Tilføy resultater. Gjenta dette trinnet 3x (for måling av telleren [488], nevneren [405] og forholdet [488/405]).
    6. Skriptet lagrer utdatafilene i mappen som ble valgt i trinn 4.1.2.6.
  2. Beregning av vektede gjennomsnittsforhold for hvert område eller hver celle
    1. Ved å bruke resultatene oppnådd i forrige trinn, beregne de vektede gjennomsnittlige forholdene for hver region eller celle ved hjelp av ligning (2). Beregn enten "pikselvise" eller "regionvise" forhold (se diskusjonen for detaljer).
      Equation 2(2)
      MERK: Verdiene for areal og integrert tetthet (IntDen) inkluderer bare pikslene innenfor de terskelformede mitokondriene. Denne beregningen kan automatiseres ved hjelp av process_multiROI_tables. R-skript og R statistisk programvare.
  3. Generere et fargelagt forholdsbilde. Siden endringer i fargetone er tydeligere for det menneskelige øyet enn endringer i intensitet, konverterer du forholdsverdien til en fargeskala for enklere visuell tolkning. colorize_ratio_image.ijm-skriptet vil fargelegge et maskert forholdsbilde.
    1. Åpne et forhold Z-stakkbilde generert i trinn 4.1.6 på Fiji. Åpne skriptfilen colorize_ratio_image.ijm. Kjør skriptet ved å klikke Kjør i vinduet Skriptredigering . I dialogvinduet som vises, skriv inn den forespurte informasjonen.
      1. Fargeleggingsmetode: I alternativet Umodulert vises alle mitokondrielle piksler med samme lysstyrke. Noen bilder kan imidlertid virke støyende ettersom både svake og lyse piksler bidrar til forholdsbildet. For å redusere denne effekten, bruk alternativet Intensitetsmodulert .
      2. Minimum og maksimum vist verdi: Disse verdiene styrer området med forholdsverdier som skal fargelegges. Velg verdier nær gjennomsnitts-, minimums- og maksimumsverdiene som ble observert i et eksperiment (basert på de vektede gjennomsnittsforholdene, beregnet i trinn 4.2.1). I et eksperiment må du sørge for å skaffe alle bilder med identiske bildeforhold og vise alle bilder med identiske minimums- og maksimumsverdier.
      3. Projeksjonsmodus: Z-stabler vises som projeksjoner for å vise hele mitokondriepopulasjonen. Projeksjonen er opprettet før fargelegging. Velg Maks for en projeksjon med maksimal intensitet (beholder maksimumsforholdet og intensitetsverdiene) eller Gjennomsnitt for en projeksjon med gjennomsnittlig intensitet.
      4. Utdatamappe: Velg mappen der du vil lagre de fargelagte bildene.
    2. Hvis alternativet Ikke modulert var valgt, velger du et fargevalg (oppslagstabell; LUT) i dialogvinduet som vises. Bruk Fire eller Rainbow RGB LUTs innebygd i Fiji, eller ønsket LUT i ImageJs .lut-format (Importer fra LUT-fil). Rainbow Smooth40 LUT anbefales (inkludert i tilleggsfil 2 og på GitHub).
    3. Skriptet lagrer utdatafilene i mappen som ble valgt i trinn 4.3.1.4. Disse inkluderer det fargelagte forholdsbildet (Color_RGB.tif) og det fargelagte forholdsbildet med en kalibreringslinje som viser samsvaret mellom forholdsverdier og bildefarge (Color_with_bar.tif).

5. Manuell analyse

MERK: Denne tilnærmingen tar mer tid, men gir fleksibilitet i forbehandling og innstilling av terskelen.

  1. Riktig for bakgrunn.
    1. Angi alternativer på Fiji.
      1. Klikk på Analyser | Angi målinger. I dialogvinduet som vises, merker du av for Area, Mean, StdDev, IntDen og Display Label. Sett desimaler til 3.
      2. Klikk på Rediger | Alternativer | Inngang/utgang. I dialogvinduet som vises, merker du av for Lagre radnumre og Lagre kolonneoverskrifter.
    2. For å øke følsomheten til forholdsberegningen, trekk bakgrunnen fra hver fluorescenskanal. Hvis bakgrunnen er relativt ensartet, måler du gjennomsnittsintensiteten til et cellefritt område i et bilde og trekker denne verdien fra hele bildet (trinn 5.1.2.1). Alternativt, hvis bakgrunnen varierer betydelig over feltet, bruk et tomt bilde for korrigering (trinn 5.1.2.2.).
      1. For å trekke fra en brukervalgt region, klikk på Bilde | Farge | Del kanaler, og hold alle kanalbildene åpne, siden de vil være nødvendige senere. For hver fluorescenskanal, tegn en avkastning på bakgrunnen (utenfor noen celler) og klikk på Analyser | Mål, eller for stabler, klikk Bilde | Stabler | Mål stabel. Observer middelverdien av avkastningen som vises i resultattabellen . Klikk på Rediger | Velg Ingen og deretter Prosess | Matematikk | Trekk fra. I dialogvinduet som vises, angir du den målte gjennomsnittlige bakgrunnsverdien, avrundet til nærmeste heltall.
        MERK: Avrunding forhindrer feil med binære operasjoner senere.
      2. Hvis du vil trekke et tomt bilde fra en datafil, samler du inn et tomt bilde fra et helt cellefritt synsfelt eller fra et lysbilde klargjort med cellefritt vekstmedium. Klikk på Prosess | Bilde Kalkulator. I dialogvinduet som vises, setter du operasjonen til Trekk fra, og setter Bilde1 og Bilde2 til henholdsvis cellebildet og det tomme bildet. Merk av for Opprett nytt vindu og 32-biters resultat.
  2. For å begrense analysen til mitokondrier, utfør segmentering. Fordi hver kanal kan endre intensitet avhengig av biosensorens tilstand, bruk summen av de to kanalene for å definere området av mitokondrier konsekvent.
    1. For å lage et sumbilde, klikk på Prosess | Bilde Kalkulator. I dialogvinduet som vises, setter du operasjonen til Legg til, og setter Bilde1 og Bilde2 til de to bakgrunnsfratrukne fluorescerende kanalene i en hvilken som helst rekkefølge. Merk av for Opprett nytt vindu og 32-biters resultat og vent til et sumbilde vises.
    2. Sett terskelen for å definere mitokondrier på sumbildet.
      1. Klikk på bildet | Justere | Terskel. I terskelvinduet som vises, merker du av for Mørk bakgrunn og Stakkhistogram. Sett metode til ønsket algoritme (f.eks. Otsu eller MaxEntropy). Bruk automatisert terskel for reproduserbarhet, men hvis ingen automatisk metode passer, må du justere terskelverdien manuelt.
        MERK: Ideelt sett bør den samme algoritmen brukes for alle bilder i et eksperiment, men endringer i morfologi under et eksperiment kan nødvendiggjøre en annen terskelmetode under noen forhold.
      2. Når terskelen er tilfredsstillende, klikker du på Bruk. I dialogvinduet som vises, velger du Konverter til maske. I dialogvinduet som vises, merk av Svart bakgrunn og la de andre boksene være umerket. Lagre det resulterende maskebildet for evaluering av segmenteringsnøyaktigheten.
    3. Konverter maskeverdiene fra henholdsvis 0 og 255 til 0 og 1 ved å klikke på Prosess | Matematikk | divisjon. Sett verdien til 255, og når du blir bedt om det, velger du alternativet for å behandle alle bildene.
    4. Påfør masken på de bakgrunnssubtraherte fluorescenskanalene ved å klikke på Prosess | Bilde Kalkulator. I dialogvinduet som vises, sett operasjonen til Multipliser. Sett Bilde1 og Bilde2 til henholdsvis tellerkanalen og masken. Sjekk Opprett nytt vindu og 32-biters resultat; Gjenta maskemultiplikasjonen med nevnerkanalen.
    5. Klargjør hver maskerte kanal for beregning av forholdstall ved å sette bakgrunnsbildepunktene til NaN ("ikke et tall").
      1. Velg den maskerte tellerkanalen og klikk på Bilde | Justere | Terskel. Klikk Angi i Terskelvindu, og i dialogvinduet som vises, setter du minimum til beregnet støynivå eller til 1, og lar maksimumet være som det er.
      2. I terskelvinduet klikker du på Bruk. I den neste dialogboksen velger du Sett til NaN. Gjenta for den maskerte nevnerkanalen.
  3. Generer forholdsbildet.
    1. Klikk på Prosess | Bilde Kalkulator. I dialogvinduet som vises, sett operasjonen til Del. Sett Bilde1 og Bilde2 til henholdsvis de maskerte teller- og nevnerkanalene for bakgrunn. For mtHyPer7 er telleren den oksiderte formen eksitert ved 488 nm, og nevneren er den reduserte formen eksitert ved 405 nm. Derfor indikerer høyere forhold høyere H 2 O2.
    2. Merk av for Opprett nytt vindu og 32-biters resultat. Lagre forholdsbildet for analyse.
  4. Merk og kvantifiser interesseområder. Hver celle eller subcellulære region velges og lagres som en ROI i ROI Manager. Avkastningen trenger ikke å samsvare perfekt med cellekonturene, da bare de maskerte mitokondrieområdene vil bli målt.
    1. Ved å bruke bildet i overført lys for å forhindre skjevhet, opprett avkastning som tilsvarer individuelle celler (eller subcellulære regioner). I mid-log fasekulturer, begrense analysen til gjærceller som bærer knopper, som er aktivt engasjert i celledeling. Trykk på T etter at du har opprettet hver ROI for å legge den til i ROI Manager. Merk av for Vis alle for å dokumentere cellene som ble merket.
    2. Klikk på forholdsbildet som er opprettet ovenfor, og i ROI Manager klikker du på Mer ... | MultiMeasure. I dialogvinduet som vises, merker du av for Mål alle stykker. Ikke sjekk Legg til resultater. Merk av for En rad per stykke for å lage en tabell med ønsket format. Den process_multiROI_tables. R-skriptet vil behandle tabeller opprettet med alternativet En rad per stykke i R-statistikkprogramvaren.
    3. Lagre resultatene. Klikk på resultatvinduet , deretter File | Lagre og lagre resultattabellen i .csv- eller .xls format. Angi filnavnet slik at det samsvarer med bildenavnet.
    4. Spar avkastningen. I ROI Manager må du først kontrollere at ingen avkastning er valgt: klikk Fjern markering og deretter Mer | Lagre. Åpne den lagrede avkastningen sammen med originalbildet på Fiji for å kryssreferere målingene med bildet.
  5. Beregn vektede gjennomsnittlige forhold per celle eller region ved hjelp av resultatene oppnådd i forrige trinn og ligning (3). Beregn enten "pikselvise" eller "regionvise" forhold (se diskusjonen for detaljer).
    Equation 3(3)
    MERK: Arealverdiene og verdiene for integrert tetthet inkluderer bare bildepunktene innenfor de terskelformede mitokondriene. Denne beregningen kan automatiseres ved hjelp av process_multiROI_tables. R-skript i statistikkprogrammet R.
  6. Generere et fargelagt forholdsbilde.
    MERK: Fargelagte bilder kan være umodulerte, der alle mitokondrielle piksler vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmodulert, der pikselintensiteten i det opprinnelige bildet brukes til å angi intensiteter i det fargelagte bildet.
    1. Slik lager du et umodulert fargelagt bilde:
      1. Åpne forholdsbildet generert ovenfor. Klikk på bildet | Dupliser for å generere en kopi av bildet, og lukk deretter originalbildet.
      2. Hvis bildet er en Z-stakk, velger du enten ett enkelt stykke eller genererer en Z-projeksjon for å vise alle mitokondriene. Bruk enten maksimal intensitet (beholder maksimumsforholdet og intensitetsverdiene for hver XY-pikselkoordinat) eller en projeksjon med gjennomsnittlig intensitet.
      3. Klikk på bildet | Slå opp tabeller og sett LUT til ønsket fargevalg (f.eks. Rainbow RGB eller Fire [tilgjengelig som standard i ImageJ]). Alternativt kan du klikke på Fil | Importer LUT og velg ønsket LUT i ImageJs .lut-format, for eksempel Rainbow Smooth40 (inkludert i tilleggsfil 2 og på GitHub). Forsikre deg om at LUT har en mørk farge tilordnet 0-verdien.
      4. Still inn skjermkontrasten ved å klikke på Image | Justere | Lysstyrke/kontrast. I vinduet Lysstyrke/kontrast klikker du på Angi, og i dialogvinduet som vises, skriver du inn de ønskede verdiene for verdiene Minimum og Maksimum som vises. For å maksimere de observerte fargeforskjellene, sett disse til omtrent minimum og maksimum oppnådd på tvers av alle bilder. Sett alle bildene i et eksperiment til de samme kontrastnivåene.
        MERK: Ikke klikk på Bruk, fordi dette vil endre bildepunktverdiene og forhindre generering av en nøyaktig kalibreringslinje i neste trinn.
      5. Legg til en fargekalibreringslinje ved å klikke på Analyser | Verktøy | Kalibreringsstang. I dialogvinduet som vises, sjekk alternativet Overlegg for å fjerne linjen, hvis ønskelig, ved å klikke på Bilde | Overlegg | Fjern overlegg.
      6. Hvis ønskelig, legg til en skalalinje ved å klikke på Analyser | Verktøy | Skala bar. I dialogvinduet som vises, angir du ønsket størrelse, plassering og farge for linjen. Merk av for Overlay-alternativet for å beholde fargen på linjen uavhengig av LUT-en som brukes.
      7. Generer et RGB-bilde for publisering ved å klikke på Bilde | Overlegg | Flat ut. Lagre det resulterende bildet.
        MERK: Dette bildet er kun for presentasjon eller publisering. Intensitetsverdiene endres, slik at de ikke kan måles. Stolpene er også permanent brent på bildet.
    2. Slik lager du et intensitetsmodulert bilde:
      1. Klikk på bildet | Dupliser for å generere en kopi av bildet, og lukk deretter originalen.
      2. Hvis bildet er en Z-stakk, velger du enten ett enkelt stykke eller genererer en Z-projeksjon for å vise alle mitokondriene.
      3. Still inn visningskontrasten til forholdsbildet ved å klikke på Bilde | Justere | Lysstyrke/kontrast, og i vinduet Lysstyrke/kontrast klikker du på Angi. I dialogvinduet som vises, skriver du inn de ønskede verdiene for Minimum og Maksimum som vises. For å maksimere de observerte fargeforskjellene, sett disse til omtrent minimum og maksimum oppnådd på tvers av alle bilder, og sett alle bildene i et eksperiment til samme kontrastnivåer. Klikk Bruk for å skalere bildepunktverdiene på nytt.
      4. Hvis du vil opprette en kalibreringslinje, dupliserer du dette forbedrede bildet og genererer en stolpe ved å navigere til Analyser | Verktøy | Kalibreringsstang. Konverter bildet og overlegget til RGB-format ved å klikke på Bilde | Overlegg | Flat ut. Hvis ønskelig, lim inn denne linjen på det intensitetsmodulerte RGB-bildet som ble oppnådd i trinn 5.6.2.12 for presentasjon eller publisering.
      5. Lag et nytt bilde med samme bredde og høyde som bildet ved å klikke på Fil | Nytt | Bilde.... I dialogvinduet som åpnes, angi parametrene som følger: Type: RGB; Fyll med: Svart; bredde og høyde: 9bredde og høyde på bildet); Skiver: 1.
      6. Konverter den nye stabelen til en HSB (fargetone, metning, lysstyrke) bildestakk ved å klikke på Image | Type | HSB-stabel.
      7. Klikk på kontrastjustert forholdsbilde ved å navigere til Rediger | Velg Alle og deretter Rediger | Kopier. Klikk deretter på HSB-stakken, velg det første stykket (Hue), og klikk på Rediger | Lim inn for å overføre forholdsverdiene.
      8. Velg stykke 2 (metning) av HSB-stabelen. Sett forgrunnsfargen til hvit ved å gå til Rediger | Alternativer | Farger. Klikk på Rediger | Velg Alle og deretter Rediger | Fyll, og velg Nei i dialogvinduet som åpnes, for å fylle bare gjeldende stykke med hvitt.
      9. Åpne rådatabildet og del kanalene ved å klikke på Bilde | Farge | Delte kanaler.
      10. Generer gjennomsnittet av de to forholdskanalene ved hjelp av bildekalkulatoren og klikk på Prosess | Bilde Kalkulator. I dialogvinduet som vises, setter du operasjonen til Gjennomsnitt og setter Bilde1 og Bilde2 til henholdsvis teller- og nevnerbildene. Merk av for Opprett nytt vindu.
      11. Klikk på gjennomsnittsbildet som er opprettet ovenfor ved å navigere til Rediger | Velg Alle og deretter Rediger | Kopier. Klikk deretter på HSB-stakken, velg det tredje stykket (Verdi) og klikk på Rediger | Lim inn for å overføre intensitetsverdiene.
      12. Konverter HSB-stakken til RGB-fargerommet ved å klikke på Bilde | Type | RGB-farge. Lagre det resulterende bildet.

Figure 6
Figur 6: Skjematisk fremstilling av bildeanalyse og presentasjon. Konfokale bilder med roterende disk trekkes først fra bakgrunnen. Mitokondrier er segmentert etter terskel og omdannet til masker for hvert stykke. Disse maskene brukes på begge kanalene, og de maskerte bildene brukes til å beregne forholdsbildet. ROI trekkes for å måle mtHyPer7-forholdet i celler eller subcellulære regioner. Fargelagte forholdsbilder kan også genereres for datapresentasjon. Skala bar = 1 μm. Forkortelse: ROI = interesseområde. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

For å bekrefte at mtHyPer7 er en egnet sonde for å vurdere mitokondriell H2 O2, ble lokaliseringen av mtHyPer7 og dens effekt på gjærmitokondrier og cellehelse vurdert. For å vurdere målrettingen av mtHyPer7 ble mitokondrier farget med det vitale mitokondriespesifikke fargestoffet MitoTracker Red i kontrollgjærceller og gjær som uttrykker mtHyPer7. Ved hjelp av MitoTracker Red-farging ble mitokondrier løst som lange rørformede strukturer som justerte seg langs moderknoppaksen og akkumulerte i spissen av knoppen og spissen av modercellen distalt for knoppen41. Mitokondriell morfologi var lik i kontroll- og mtHyPer7-uttrykkende celler. I tillegg er mtHyPer7 samlokalisert med MitoTracker Red-stained mitokondrier (figur 3A). Dermed ble mtHyPer7 effektivt og kvantitativt målrettet mot mitokondrier uten å påvirke normal mitokondriell morfologi eller distribusjon.

Deretter ble ytterligere valideringseksperimenter utført for å vurdere effekten av mtHyPer7 på cellulær kondisjon og følsomhet for oksidativt stress i mitokondrier. Vekstratene til mtHyPer7-uttrykkende celler i rike eller syntetiske glukosebaserte medier (henholdsvis YPD eller SC) er lik de for utransformerte villtypeceller (figur 3B,D). For å vurdere mulige effekter på oksidativt stress i mitokondrier, ble kontroll og mtHyPer7-uttrykkende gjær behandlet med lave nivåer av paraquat, et redoks-aktivt lite molekyl som akkumuleres i mitokondrier og resulterer i forhøyede superoksidnivåer i organellen24,27. Hvis mtHyPer7-ekspresjon enten induserer oksidativt stress i mitokondrier eller beskytter mitokondrier mot oksidativt stress, bør mtHyPer7-uttrykkende celler utvise henholdsvis økt eller redusert følsomhet for paravatbehandling. Behandling med lave nivåer av paraquat resulterte i en reduksjon i gjærvekstraten. Videre var vekstratene for villtype og mtHyPer7-uttrykkende celler i nærvær av paraquat lik (figur 3C,E). Derfor skapte ekspresjon av biosensoren ikke signifikante cellulære spenninger i spirende gjærceller eller endret følsomheten til gjær for mitokondrielt oksidativt stress.

Gitt bevis på at mtHyPer7 er egnet for å studere mitokondriell H 2 O 2 i spirende gjær, ble det testet om mtHyPer7 kunne oppdage mitokondriell H 2 O 2 i mid-log fase villtype gjær og endringer i mitokondriell H 2 O 2 indusert av eksternt tilsatt H 2 O 2. Et H 2 O2titreringseksperiment ble utført og gjennomsnittlig oksidert: redusert (O / R) mtHyPer7-forhold ble målt i mitokondrier.

De automatiserte analyseskriptene produserte flere utdatafiler.

Forholdsbildet (ratio.tif): En Z-stack som består av forholdet mellom de bakgrunnskorrigerte, terskelbaserte stablene 488 nm og 405 nm. Denne stabelen kan sees på Fiji uten ytterligere behandling; Det anbefales imidlertid å forbedre kontrasten og/eller fargelegge bildet som beskrevet i protokolltrinn 4.3 eller 5.6 før visning.

Maskebildet (maske.tif): En Z-stack som består av de terskelformede mitokondrieområdene som brukes til analyse. Dette bildet må brukes til å evaluere nøyaktigheten av terskelen.

ROIene som brukes til analyse (ROI.zip): Når denne filen åpnes på Fiji, sammen med kildebildet, legges avkastningen over bildet for å kryssreferere resultattabellen og kildebildet. Hver ROI får nytt navn med et cellenummer og ROI-nummer.

Måletabeller (NumResults.csv, DenomResults.csv, Results.csv) som inneholder areal, gjennomsnitt og integrert tetthet av terskelmitokondrier for hvert stykke i henholdsvis teller-, nevner- og forholdsbildene. I skiver der mitokondrier var fraværende eller ute av fokus, registreres NaN.

En loggfil (Log.txt) som dokumenterer alternativene som brukes til bakgrunns- og støykorrigering, terskel og beregning av forhold.

O/R-forholdet mellom mtHyPer7 viste en doseavhengig respons på H2O2-konsentrasjonen, som nådde et platå ved 1-2 mM eksternt tilsattH2O2(figur 7). Overraskende nok var HyPer7-forholdet lavere i cellene utsatt for 0,1 mMH2O2enn i kontrollcellene, selv om denne forskjellen ikke var statistisk signifikant. En forklaring på dette fenomenet kan være en hormeserespons, der eksponering for et lavt stressnivå kan indusere stressresponser, for eksempel antioksidantmekanismer, som igjen reduserer mengden ROS som kan påvises av sonden. Høyere nivåer av stressorer, derimot, kan overvelde de interne stressresponsene og resultere i en høyere avlesning fra HyPer7.

Figure 7
Figur 7: Respons av mtHyPer7 til eksternt tilsatt H 2 O 2. (A) Maksimal projeksjon av 405 nm og 488 nm eksiterte bilder og gjennomsnittlig intensitetsprojeksjon av ratiometriske bilder av mtHyPer7 i midtloggfaseceller utsatt for forskjellige konsentrasjoner av H 2 O2. Pseudocolor indikerer oksidert: redusert mtHyPer7-forhold (skala nederst). Skala bar = 1 μm. Celleomrisset er vist i hvitt; n > 100 celler per tilstand. (B) Kvantifisering av mtHyPer7 oksidert: redusert forhold i spirende gjærceller behandlet med forskjellige konsentrasjoner av H 2 O2. Midlene til fem uavhengige forsøk vises, med forskjellig formede og fargede symboler for hver rettssak. Gjennomsnittlig ± SEM av forholdet mellom oksidert:redusert mtHyPer7: 1,794 ± 0,07627 (ingen behandling), 1,357 ± 0,03295 (0,1 mM), 2,571 ± 0,3186 (0,5 mM), 6,693 ± 0,5194 (1 mM), 7,017 ± 0,1197 (2 mM). p < 0,0001 (enveis ANOVA med Tukeys flere sammenligningstest). p-verdier betegnes som: ****p < 0,0001. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Endelig viste tidligere studier at mitokondrier, som er mer redusert og inneholder mindre superoksid, fortrinnsvis arves av gjærdatterceller4, og at cytosoliske katalaser transporteres til og aktiveres i gjærdatterceller42,43,44,45. Disse studiene dokumenterer den asymmetriske arven av mitokondrier under gjærcelledeling og en rolle for denne prosessen i dattercellekondisjon og levetid, samt aldersasymmetri mellom mor og datter. For å teste om forskjeller i H 2O2 eksisterer mellom mødre og knopper, ble mtHyPer7 målt i knopper og morceller. Forskjeller i mitokondriell H 2 O 2 ble observert i gjærceller, og en subtil, men statistisk signifikant reduksjon i H 2 O 2biosensoravlesning blepåvist i mitokondrier i knoppen sammenlignet med de i modercellen (figur 8). Disse funnene stemmer overens med tidligere funn om at mitokondrier i knoppen er bedre beskyttet mot oksidativt stress. De gir også dokumentasjon på at mtHyPer7 kan gi en kvantitativ avlesning for mitokondriell H2 O2 med cellulær og subcellulær oppløsning i spirende gjær.

Figure 8
Figur 8: MitokondrieltH2O2-nivåer lavere i dattercellen. (A) Maksimal projeksjon av et ratiometrisk bilde av mtHyPer7 i en representativ celle. Pseudocolor indikerer oksidert: redusert mtHyPer7-forhold (skala nederst). Subcellulære forskjeller i forholdet er tydelige (pilspisser). Skala bar = 1 μm. Celleomriss: hvit. (B) Forskjellen mellom mtHyPer7-forholdet i knoppen og modercellen. For hver enkelt celle ble morforholdsverdien trukket fra knoppratioverdien og plottet som et punkt. n = 193 celler samlet fra fem uavhengige eksperimenter, vist med symboler i forskjellige farger for hvert eksperiment. Gjennomsnittlig ± SEM for forskjellen mellom mtHyPer7-forholdet i knopp- og modercellene: -0,04297 ± 0,01266. p = 0,0008 (paret t-test) Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggstabell S1: Stammer brukt i denne studien. Liste over gjærstammer som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S2: Plasmider brukt i denne studien. Liste over plasmider som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S3: Primere brukt i denne studien. Liste over primere som brukes. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 1: Protokoll for konstruksjon av biosensorplasmid. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggsfil 2: Skript for automatisert analyse. For hvert skript leveres eksempelinndatafiler og utdatafiler. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

I denne protokollen beskrives en metode for bruk av mtHyPer7 som biosensor for å vurdere mitokondriellH2O2i levende spirende gjærceller. Biosensoren er konstruert ved hjelp av en CRISPR-basert metode og introdusert i en konservert genfri region i gjærgenomet uten bruk av valgbare markører. Sammenlignet med plasmidbårne biosensorer, uttrykkes integrerte i alle celler og på konsistente nivåer, noe som gir mer pålitelige kvantifiseringsresultater. Ingen valgbare markører brukes til å generere mtHyPer7-uttrykkende celler, noe som muliggjør bruk av et bredere spekter av belastningsbakgrunner og letter den genetiske modifikasjonen av biosensoruttrykkende celler. mtHyPer7-proteinet er riktig målrettet mot mitokondrier uten merkbare effekter på mitokondriell morfologi, funksjon, distribusjon eller cellulære veksthastigheter. mtHyPer7 viser en doseavhengig respons på eksternt tilsatt H 2 O2. Videre er mtHyPer7 i stand til å rapportere om heterogeniteten av mitokondriell kvalitet med subcellulær oppløsning. Til slutt, ved hjelp av et spinnskivekonfokalmikroskop i motsetning til bredfeltsmikroskopi for avbildning av mitokondrie-målrettede biosensorer, forårsaker mindre fotobleking til fluoroforer og genererer høyoppløselige bilder for å analysere subcellulære forskjeller.

Begrensninger og alternative tilnærminger
Denne metoden er ikke egnet for avbildning av celler i mer enn 10 minutter, da cellene vil tørke ut under dekselet. For langsiktig avbildning er det bedre å bruke agarputemetoden46 eller å immobilisere celler i en glassbunnkulturskål fylt med SC-medium.

Valget av biosensor bør styres av konsentrasjonen av målet under eksperimentelle forhold. Hvis følsomheten til HyPer7 er for høy, vil en annen HyPer-versjon anbefales, for eksempel HyPer3 eller HyPerRed47,48. Det skal imidlertid bemerkes at andre HyPer-sonder er mer pH-følsomme. For høyere sensitivitet kan peroksiredoksinbasert roGFP være mer hensiktsmessig (roGFP2Tsa2ΔCR)27.

Oksidasjonsstabil tilstand til H 2 O2-sensorener knyttet til både oksidasjons- og reduksjonshastigheter. Oksidasjonshastigheten til biosensorer er hovedsakelig forårsaket av H 2 O2, men reduksjonshastigheten avhenger av antioksidantreduksjonssystemene som er aktive i cellen og organellen. Det har vist seg at HyPer7 hovedsakelig reduseres av tioredoksinsystemet i gjærcytosol, og reduksjonen er raskere enn for roGFP2Tsa2ΔCR27. Derfor bør sondens forskjellige reduksjonsmekanismer og responsdynamikk tas i betraktning ved tolkning av målinger av H 2 O2 biosensorer. Spesielt, for å utledeH 2 O2 nivåer fra biosensoravlesningen, må det antas at reduksjonssystemet opprettholder en konstant kapasitet under forsøket. Som et alternativ til skriptene som er beskrevet her, har en rekke annen programvare blitt gjort fritt tilgjengelig for analyse av redokssensorer49.

Kritiske skritt
Med enhver biosensor er det avgjørende å demonstrere at biosensoren selv ikke påvirker prosessen som måles. Derfor er det viktig å sammenligne veksten og mitokondriell morfologi av stammer under hver eksperimentell tilstand. Her vurderes mitokondriell morfologi ved hjelp av MitoTracker Red, som flekker mitokondrier på en membranpotensialavhengig måte. Imidlertid kan sammenligning av mitokondriene i utransformerte og biosensortransformerte celler oppnås ved farging med tetrametylrhodaminmetylester (TMRM), et alternativt membranpotensialfølende mitokondrielt vitalt fargestoff, eller MitoTracker Green, som flekker mitokondrier uavhengig av membranpotensial. Hvis det er mistanke om skadelige effekter, kan det hjelpe å redusere uttrykksnivået eller endre integreringsnettstedet.

Validering av sondens dose-respons-oppførsel og signal-støy-forholdet mellom avbildningsteknikken er også avgjørende for å samle robuste resultater. Hvis variabiliteten innen en gruppe overstiger variabiliteten mellom grupper, blir forskjellene vanskelige å oppdage. Variabilitet i gruppen kan skyldes reell populasjonsvariasjon eller støy i deteksjonsprosessen. De viktigste trinnene for å øke signalet: støyforholdet er bildeopptak (pikselverdiområde og støy), bakgrunnssubtraksjon og terskelverdi.

Støyeffekter kan også reduseres under beregningstrinnene. Den enkleste tilnærmingen er å beregne den vektede gjennomsnittlige intensiteten fra forholdsbildemålingene (resultater.csv), der hver piksel representerer det lokale forholdet mellom eksitasjonseffektiviteten. Dette gir et "pikselvis" forhold. Men hvis bildesignalet:støyforholdet er lavt, kan mer robuste resultater oppnås ved å beregne den vektede middelintensiteten for en avkastning i både telleren og nevnerkanalen, og deretter beregne forholdet mellom disse to vektede gjennomsnittene ("regionvis" forhold).

For å velge en terskelmetode, Fiji-kommandoen Bilde | Justere | Autoterskel kan brukes til å prøve alle innebygde Fiji-metoder automatisk. For å evaluere segmentering (terskelverdi) konverteres en lagret maske til et utvalg ved å klikke på Rediger | Utvalg | Opprett markering, lagt til i ROI-behandling (ved å trykke T) og deretter aktivert i RAW-bildefilen. Hvis mitokondrier ikke oppdages tilstrekkelig, bør en annen segmenteringsmetode forsøkes.

Når du sammenligner bilder, er det viktig å skaffe alle bildene med identiske bildeforhold, samt å vise alle bildene med identisk kontrastforbedring.

Mitokondriell bevegelse må vurderes ved optimalisering av bildeforhold. Hvis mitokondriene beveger seg betydelig mellom eksitasjon ved 405 og 488 nm, vil forholdsbildet ikke være nøyaktig. Det anbefales å beholde eksponeringstiden <500 ms og endre eksitasjonen med den raskeste tilgjengelige metoden (f.eks. en utløserpuls eller et akustooptisk justerbart filter). Når du fanger en Z-stabel, bør begge eksitasjonene utføres for hvert Z-trinn før du går videre til neste Z-trinn.

For visning av resultatene er endringer i fargetone (farge) tydeligere for det menneskelige øyet enn endringer i intensitet. Derfor konverteres forholdsverdien til en fargeskala for enklere visuell tolkning. Fargelagte bilder kan unmoduleres, der alle mitokondriepikslene vises med samme lysstyrke, eller intensitetsmodulert, der pikselintensiteten i originalbildet brukes til å angi intensiteter i det fargelagte bildet.

Endring og feilsøking
Som et alternativ til å bekrefte mitokondriell funksjon ved utfordring med paraquat, kan celler replikeres eller inokuleres i gjærbare og ikke-gjærbare karbonkilder.

For subtraksjon i bakgrunnen, rulleballsubtraksjon (ved å navigere til Prosess | Trekk fra bakgrunnen ...) kan også brukes til å fjerne belysning ujevnhet. Det bør sikres at tilstedeværelsen av celler ikke endrer bakgrunnen som trekkes fra (ved å sjekke alternativet Opprett bakgrunn og undersøke resultatet).

Oppsummert gir mtHyPer7-sonden en konsistent, minimalt invasiv metode for å relatere den morfologiske og funksjonelle statusen til gjærmitokondrier i levende celler, og tillater studier av et viktig cellulært stressor- og signalmolekyl i et genetisk håndterbart, lett tilgjengelig modellsystem.

Disclosures

Forfatterne erklærer at de ikke har noen interessekonflikter.

Acknowledgments

Forfatterne takker Katherine Filpo Lopez for ekspert teknisk assistanse. Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra National Institutes of Health (NIH) (GM122589 og AG051047) til LP.

Disse studiene brukte Confocal and Specialized Microscopy Shared Resource fra Herbert Irving Comprehensive Cancer Center ved Columbia University, delvis finansiert gjennom NIH / NCI Cancer Center Support Grant P30CA013696.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
100x/1.45 Plan Apo Lambda objective lens Nikon MRD01905
Adenine sulfate Sigma-Aldrich A9126
Bacto Agar BD Difco DF0145170
Bacto Peptone BD Difco DF0118170
Bacto Tryptone BD Difco DF211705
Bacto Yeast Extract BD Difco DF0127179
BamHI New England Biolabs R0136S
BglII New England Biolabs R0144S
Carbenicilin Sigma-Aldrich C1389
Carl Zeiss Immersol Immersion Oil Carl Zeiss 444960
Dextrose (D-(+)-Glucose) Sigma-Aldrich G8270
E. cloni 10G chemical competent cell Bioserch Technologies 60108
FIJI NIH Schindelin et al 2012
G418 (Geneticin) Sigma-Aldrich A1720
GFP emission filter Chroma 525/50
Gibson assembly New England Biolabs E2611
Graphpad Prism 7 GraphPad https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
H2O2 (stable) Sigma-Aldrich H1009
HO-pGPD-mito-roGFP-KanMX6-HO Pon Lab JYE057/EP41 Liao et al 20201
Incubator Shaker New Brunswick Scientific E24
KAPA HiFi PCR kit Roche Sequencing and Life Science, Kapa Biosystems, Wilmington, MA KK1006
L-arginine hydrochloride Sigma-Aldrich A8094
laser Agilent 405 and 488 nm
L-histidine hydrochloride Sigma-Aldrich H5659
L-leucine Sigma-Aldrich L8912
L-lysine hydrochloride Sigma-Aldrich L8662
L-methionine Sigma-Aldrich M9625
L-phenylalanine Sigma-Aldrich P5482
L-tryptophan Sigma-Aldrich T8941
L-tyrosine Sigma-Aldrich T8566
mHyPer7 plasmid This study JYE116
Microscope coverslips ThermoScientific 3406 #1.5 (170 µm thickness)
Microscope slides ThermoScientific 3050
MitoTracker Red CM-H2Xros ThermoFisherScientific M7513
NaCl Sigma-Aldrich S9888
NEBuilder HiFi Assembly Master Mix New England Biolabs E2621
Nikon Elements Nikon Microscope acquisition software
Nikon Ti Eclipse inverted microscope Nikon
Paraquat (Methyl viologen dichloride hydrate) Sigma-Aldrich Cat. 856177 
RStudio Posit.co Free desktop version
Spectrophotometer Beckman BU530
Stagetop incubator Tokai Hit INU
Uracil Sigma-Aldrich U1128
Yeast nitrogen base (YNB) containing ammonium sulfate without amino acids BD Difco DF0919073
YN2_1_LT58_X2site Addgene 177705 Pianale et al 2021
Zyla 4.2 sCMOS camera Andor

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. vander Bliek, A. M., Sedensky, M. M., Morgan, P. G. Cell biology of the mitochondrion. Genetics. 207 (3), 843-871 (2017).
  2. McBride, H. M., Neuspiel, M., Wasiak, S. Mitochondria: more than just a powerhouse. Current Biology. 16 (14), 551-560 (2006).
  3. Shi, R., Hou, W., Wang, Z. -Q., Xu, X. Biogenesis of iron-sulfur clusters and their role in DNA metabolism. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 735678 (2021).
  4. McFaline-Figueroa, J. R., et al. Mitochondrial quality control during inheritance is associated with lifespan and mother-daughter age asymmetry in budding yeast. Aging Cell. 10 (5), 885-895 (2011).
  5. Higuchi-Sanabria, R., et al. Mitochondrial anchorage and fusion contribute to mitochondrial inheritance and quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Molecular Biology of the Cell. 27 (5), 776-787 (2016).
  6. Higuchi-Sanabria, R., et al. Role of asymmetric cell division in lifespan control in Saccharomyces cerevisiae. FEMS Yeast Research. 14 (8), 1133-1146 (2014).
  7. Lam, Y. T., Aung-Htut, M. T., Lim, Y. L., Yang, H., Dawes, I. W. Changes in reactive oxygen species begin early during replicative aging of Saccharomyces cerevisiae cells. Free Radical Biology & Medicine. 50 (8), 963-970 (2011).
  8. Laun, P., et al. Aged mother cells of Saccharomyces cerevisiae show markers of oxidative stress and apoptosis. Molecular Microbiology. 39 (5), 1166-1173 (2001).
  9. Doudican, N. A., Song, B., Shadel, G. S., Doetsch, P. W. Oxidative DNA damage causes mitochondrial genomic instability in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and Cellular Biology. 25 (12), 5196-5204 (2005).
  10. Roca-Portoles, A., Tait, S. W. G. Mitochondrial quality control: from molecule to organelle. Cellular and Molecular Life Sciences. 78 (8), 3853-3866 (2021).
  11. Sies, H., Berndt, C., Jones, D. P. Oxidative stress. Annual Review of Biochemistry. 86, 715-748 (2017).
  12. Sies, H., Jones, D. P. Reactive oxygen species (ROS) as pleiotropic physiological signalling agents. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 21 (7), 363-383 (2020).
  13. Imlay, J. A., Fridovich, I. Assay of metabolic superoxide production in Escherichia coli. The Journal of Biological Chemistry. 266 (11), 6957-6965 (1991).
  14. Fridovich, I. Mitochondria: are they the seat of senescence. Aging Cell. 3 (1), 13-16 (2004).
  15. Quinlan, C. L., Perevoshchikova, I. V., Hey-Mogensen, M., Orr, A. L., Brand, M. D. Sites of reactive oxygen species generation by mitochondria oxidizing different substrates. Redox Biology. 1 (1), 304-312 (2013).
  16. Griendling, K. K., Minieri, C. A., Ollerenshaw, J. D., Alexander, R. W. Angiotensin II stimulates NADH and NADPH oxidase activity in cultured vascular smooth muscle cells. Circulation Research. 74 (6), 1141-1148 (1994).
  17. Griendling, K. K., Sorescu, D., Ushio-Fukai, M. NAD(P)H oxidase: role in cardiovascular biology and disease. Circulation Research. 86 (5), 494-501 (2000).
  18. Edmondson, D. E., Binda, C., Wang, J., Upadhyay, A. K., Mattevi, A. Molecular and mechanistic properties of the membrane-bound mitochondrial monoamine oxidases. Biochemistry. 48 (20), 4220-4230 (2009).
  19. Ramsay, R. R., Singer, T. P. The kinetic mechanisms of monoamine oxidases A and B. Biochemical Society Transactions. 19 (1), 219-223 (1991).
  20. Ramsay, R. R. Kinetic mechanism of monoamine oxidase A. Biochemistry. 30 (18), 4624-4629 (1991).
  21. Handy, D. E., Loscalzo, J. Redox regulation of mitochondrial function. Antioxidants & Redox Signaling. 16 (11), 1323-1367 (2012).
  22. Wood, Z. A., Schröder, E., Robin Harris, J., Poole, L. B. Structure, mechanism and regulation of peroxiredoxins. Trends in Biochemical Sciences. 28 (1), 32-40 (2003).
  23. Slade, L., et al. Examination of the superoxide/hydrogen peroxide forming and quenching potential of mouse liver mitochondria. Biochimica et Biophysica Acta. General Subjects. 1861 (8), 1960-1969 (2017).
  24. Pak, V. V., et al. Ultrasensitive genetically encoded indicator for hydrogen peroxide identifies roles for the oxidant in cell migration and mitochondrial function. Cell Metabolism. 31 (3), 642-653 (2020).
  25. Topell, S., Hennecke, J., Glockshuber, R. Circularly permuted variants of the green fluorescent protein. FEBS Letters. 457 (2), 283-289 (1999).
  26. Belousov, V. V., et al. Genetically encoded fluorescent indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Methods. 3 (4), 281-286 (2006).
  27. Kritsiligkou, P., Shen, T. K., Dick, T. P. A comparison of Prx- and OxyR-based H2O2 probes expressed in S. cerevisiae. The Journal of Biological Chemistry. 297 (1), 100866 (2021).
  28. Baird, G. S., Zacharias, D. A., Tsien, R. Y. Circular permutation and receptor insertion within green fluorescent proteins. Proceedings of the National Academy of Sciences. 96 (20), 11241-11246 (1999).
  29. Abedi, M. R., Caponigro, G., Kamb, A. Green fluorescent protein as a scaffold for intracellular presentation of peptides. Nucleic Acids Research. 26 (2), 623-630 (1998).
  30. Onukwufor, J. O., et al. A reversible mitochondrial complex I thiol switch mediates hypoxic avoidance behavior in C. elegans. Nature Communications. 13 (1), 2403 (2022).
  31. Vega, M., et al. Antagonistic effects of mitochondrial matrix and intermembrane space proteases on yeast aging. BMC Biology. 20 (1), 160 (2022).
  32. Torello Pianale, L., Rugbjerg, P., Olsson, L. Real-time monitoring of the yeast intracellular state during bioprocesses with a toolbox of biosensors. Frontiers in Microbiology. 12, 802169 (2022).
  33. Imani, M., Mohajeri, N., Rastegar, M., Zarghami, N. Recent advances in FRET-based biosensors for biomedical applications. Analytical Biochemistry. 630, 114323 (2021).
  34. Zadran, S., et al. Fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based biosensors: visualizing cellular dynamics and bioenergetics. Applied Microbiology and Biotechnology. 96 (4), 895-902 (2012).
  35. Gietz, R. D., Woods, R. A. Transformation of yeast by lithium acetate/single-stranded carrier DNA/polyethylene glycol method. Methods in Enzymology. 350, 87-96 (2002).
  36. Liao, P. -C., Wolken, D. M. A., Serrano, E., Srivastava, P., Pon, L. A. Mitochondria-associated degradation pathway (MAD) function beyond the outer membrane. Cell Reports. 32 (2), 107902 (2020).
  37. Higuchi-Sanabria, R., Swayne, T. C., Boldogh, I. R., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondria and the actin cytoskeleton in budding yeast. Methods in Molecular Biology. 1365, 25-62 (2016).
  38. Liao, P. -C., Yang, E. J., Pon, L. A. Live-cell imaging of mitochondrial redox state in yeast cells. STAR Protocols. 1 (3), 100160 (2020).
  39. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  40. Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
  41. Chazotte, B. Labeling mitochondria with MitoTracker dyes. Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 990-992 (2011).
  42. Aguilaniu, H., Gustafsson, L., Rigoulet, M., Nyström, T. Asymmetric inheritance of oxidatively damaged proteins during cytokinesis. Science. 299 (5613), 1751-1753 (2003).
  43. Erjavec, N., Larsson, L., Grantham, J., Nyström, T. Accelerated aging and failure to segregate damaged proteins in Sir2 mutants can be suppressed by overproducing the protein aggregation-remodeling factor Hsp104p. Genes & Development. 21 (19), 2410-2421 (2007).
  44. Erjavec, N., Cvijovic, M., Klipp, E., Nyström, T. Selective benefits of damage partitioning in unicellular systems and its effects on aging. Proceedings of the National Academy of Sciences. 105 (48), 18764-18769 (2008).
  45. Erjavec, N., Nyström, T. Sir2p-dependent protein segregation gives rise to a superior reactive oxygen species management in the progeny of Saccharomyces cerevisiae. Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (26), 10877-10881 (2007).
  46. Davidson, R., Liu, Y., Gerien, K. S., Wu, J. Q. Real-time visualization and quantification of contractile ring proteins in single living cells. Methods in Molecular Biology. 1369, 9-23 (2016).
  47. Bilan, D. S., et al. HyPer-3: a genetically encoded H2O2 probe with improved performance for ratiometric and fluorescence lifetime imaging. ACS Chemical Biology. 8 (3), 535-542 (2013).
  48. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5 (1), 5222 (2014).
  49. Fricker, M. D. Quantitative redox imaging software. Antioxidants & Redox Signaling. 24 (13), 752-762 (2016).
  50. Yang, E. J., Pernice, W. M., Pon, L. A. A role for cell polarity in lifespan and mitochondrial quality control in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. iSCIENCE. 25 (3), 103957 (2022).

Tags

MtHyPer7 ratiometrisk biosensor mitokondrielt peroksid levende gjærceller mitokondriell dysfunksjon nevrodegenerative lidelser muskel- og skjelettlidelser kreft aldring genetisk kodet biosensor minimalt invasiv hydrogenperoksid (H2O2) mitokondrier-målrettet HyPer7 (mtHyPer7) sirkulært permutert fluorescerende protein OxyR-proteindomene CRISPR-Cas9-system markørfritt system gjærgenomintegrasjon spinningsdisk konfokalmikroskopsystem kvantitativ analyse oksidativ Stress Spatiotemporal informasjon
Avbildning av mtHyPer7, en ratiometrisk biosensor for mitokondrielt peroksid, i levende gjærceller
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yang, E. J. N., Boldogh, I. R., Ji,… More

Yang, E. J. N., Boldogh, I. R., Ji, H., Pon, L., Swayne, T. C. Imaging of mtHyPer7, a Ratiometric Biosensor for Mitochondrial Peroxide, in Living Yeast Cells. J. Vis. Exp. (196), e65428, doi:10.3791/65428 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter