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Bioengineering

"Avatar", ein modifiziertes Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperiment mit In-vivo-Dehnung und -Aktivierung

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Dieser Artikel beschreibt die Methodik zur Emulation der In-vivo-Muskelkrafterzeugung während Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperimenten unter Verwendung eines "Avatar"-Muskels eines Labornagers, um die Beiträge von Dehnungstransienten und Aktivierung zur Muskelkraftreaktion zu bewerten.

Abstract

Bewegungsverhalten ist ein emergentes Merkmal dynamischer Systeme, das sich aus der Muskelkraftproduktion und der Arbeitsleistung ergibt. Das Zusammenspiel zwischen neuronalen und mechanischen Systemen findet auf allen Ebenen der biologischen Organisation gleichzeitig statt, von der Abstimmung der Beinmuskeleigenschaften beim Laufen bis hin zur Dynamik der Interaktion der Gliedmaßen mit dem Boden. Das Verständnis der Bedingungen, unter denen Tiere ihre neuronalen Kontrollstrategien in Richtung intrinsischer Muskelmechanik ("Preflexe") in der Kontrollhierarchie verschieben, würde es Muskelmodellen ermöglichen, die Muskelkraft in vivo vorherzusagen und genauer zu arbeiten. Um die in vivo Muskelmechanik zu verstehen, ist eine ex vivo Untersuchung der Muskelkraft und der Arbeit unter dynamisch variierenden Belastungs- und Belastungsbedingungen ähnlich wie in vivo der Fortbewegung erforderlich. In-vivo-Stammtrajektorien weisen typischerweise abrupte Änderungen (d. h. Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten) auf, die sich aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und von der Umgebung ausgeübten Lasten ergeben. Das Hauptziel unserer "Avatar"-Technik ist es, zu untersuchen, wie Muskeln bei abrupten Änderungen der Belastungsrate und -belastung funktionieren, wenn der Beitrag der intrinsischen mechanischen Eigenschaften zur Muskelkraftproduktion am höchsten ist. Bei der "Avatar"-Technik wird der traditionelle Work-Loop-Ansatz unter Verwendung von in vivo gemessenen Belastungstrasien und elektromyographischen (EMG) Signalen von Tieren während dynamischer Bewegungen modifiziert, um die Ex-vivo-Muskeln durch mehrere Dehnungs- und Verkürzungszyklen zu treiben. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die In-vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln, die an einem Servomotor befestigt sind, auferlegt werden. Diese Technik ermöglicht es: (1) In-vivo-Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Arbeitsschleifenmuster zu emulieren; (2) diese Muster so zu variieren, dass sie den In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten entsprechen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

Introduction

Sich bewegende Tiere vollbringen beeindruckende athletische Leistungen in Bezug auf Ausdauer, Schnelligkeit und Beweglichkeit in komplexen Umgebungen. Die Fortbewegung von Tieren ist im Gegensatz zu von Menschen konstruierten Maschinen besonders beeindruckend – die Stabilität und Agilität von Robotern, Prothesen und Exoskeletten mit aktuellen Beinen ist im Vergleich zu Tieren nach wie vor schlecht. Die Fortbewegung mit den Beinen in natürlichem Gelände erfordert eine präzise Steuerung und schnelle Anpassungen, um die Geschwindigkeit zu verändern und Umgebungsmerkmale zu manövrieren, die als unerwartete Störungen wirken 1,2,3,4. Das Verständnis der nicht-stationären Fortbewegung ist jedoch von Natur aus eine Herausforderung, da die Dynamik von komplexen Wechselwirkungen zwischen der physischen Umgebung, der muskuloskelettalen Mechanik und der sensomotorischen Kontrolle abhängt 1,2. Die Fortbewegung mit den Beinen erfordert die Reaktion auf unerwartete Störungen mit einer schnellen multimodalen Verarbeitung sensorischer Informationen und einer koordinierten Betätigung von Gliedmaßen und Gelenken 1,5. Letztendlich wird Bewegung durch Muskeln ermöglicht, die Kraft über intrinsische mechanische Eigenschaften des Bewegungsapparates sowie durch neuronale Kontrolle erzeugen 1,5,6,7. Eine offene Frage der Neuromechanik ist, wie diese Faktoren zusammenwirken, um koordinierte Bewegungen als Reaktion auf unerwartete Störungen zu erzeugen. Die folgende Technik nutzt die intrinsische mechanische Reaktion des Muskels auf Verformung unter Verwendung von In-vivo-Dehnungsverläufen während kontrollierbarer ex vivo-Experimente mit einem "Avatar"-Muskel.

Die Technik der Muskelarbeitsschleife hat einen wichtigen Rahmen für das Verständnis der intrinsischen Muskelmechanik während zyklischer Bewegungen geschaffen 8,9,10. Die traditionelle Workloop-Technik treibt die Muskeln durch vordefinierte, typischerweise sinusförmige Dehnungstrajektorien unter Verwendung von Frequenzen und Aktivierungsmustern, die in In-vivo-Experimenten gemessen wurden 2,8,9,11. Durch die Verwendung sinusförmiger Längentrajektorien können Arbeit und Leistungsabgabe während des Fluges12 und des Schwimmens2 unter Bedingungen realistisch abgeschätzt werden, bei denen die Tiere aufgrund der Interaktion mit der Umwelt und der muskuloskelettalen Kinematik keine schnellen Änderungen der Belastungstrajektorien erfahren. In-vivo-Muskelbelastungsträhnen während der Fortbewegung mit den Beinen ergeben sich jedoch dynamisch aus Wechselwirkungen zwischen neuronaler Aktivierung, muskuloskelettaler Kinematik und Belastungen durch die Umgebung 5,7,13,14. Es wird eine realistischere Workloop-Technik benötigt, um Belastungen, Dehnungsverläufe und Kraftproduktion zu emulieren, die der In-vivo-Muskel-Sehnen-Dynamik entspricht und einen Einblick in das Zusammenspiel von intrinsischer Muskelmechanik und neuronaler Kontrolle gibt, um koordinierte Bewegungen angesichts von Störungen zu erzeugen.

Hier stellen wir einen neuartigen Weg vor, um in vivo Muskelkräfte während der Laufbandfortbewegung zu emulieren, indem wir einen "Avatar"-Muskel eines Labornagers während kontrollierter ex vivo Experimente mit in vivo Stammtrajektorien verwenden, die zeitlich variierende in vivo Belastungen darstellen. Durch die Verwendung der in vivo gemessenen Belastungstrajektorien von einem Zielmuskel auf Muskeln eines Labortieres während kontrollierter ex vivo Experimente werden Belastungen während der Fortbewegung nachgebildet. In den hier beschriebenen Experimenten wird der ex vivo Maus Extensor digitorum longus (EDL) Musculus als "Avatar" für den in vivo Ratte medialen Gastrocnemius (MG) Muskel beim Gehen, Traben und Galoppieren auf einem Laufband verwendet13. Dieser Ansatz ähnelt der Work-Loop-Technik, mit dem Unterschied, dass die In-vivo-Dehnungstrajektorien entsprechend skaliert und den ex vivo-Mausmuskeln, die an einem Servomotor befestigt sind, auferlegt werden. Während sich die EDL-Muskeln der Maus in Größe, Fasertyp und Architektur im Vergleich zum MG der Ratte unterscheiden, ist es möglich, diese Unterschiede zu kontrollieren. Die "Avatar"-Technik ermöglicht es: (1) In-vivo-Dehnung, Aktivierung, Schrittfrequenz und Work-Loop-Muster nachzuahmen; (2) diese Muster so zu variieren, dass sie den In-vivo-Kraftreaktionen am genauesten entsprechen; und (3) spezifische Merkmale der Dehnung und/oder Aktivierung in kontrollierten Kombinationen variieren, um mechanistische Hypothesen zu testen.

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Protocol

Alle Tierstudien wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee der Northern Arizona University genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden Extensor digitorum longus (EDL)-Muskeln von männlichen und weiblichen Wildtyp-Mäusen (Stamm B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) im Alter von 60-280 Tagen verwendet. Die Tiere wurden aus einer kommerziellen Quelle bezogen (siehe Materialtabelle) und in einer Kolonie an der Northern Arizona University angesiedelt.

1. Auswahl der In-vivo-Stammtrajektorie und Vorbereitung für die Verwendung während Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperimenten

ANMERKUNG: In diesem Protokoll wurden frühere Messungen der dynamischen Fortbewegung in vivo, die den Autoren (Nicolai Konow, UMass Lowell, persönliche Mitteilung) direkt zur Verfügung gestellt wurden, in ex vivo Experimenten verwendet. Die Originaldaten wurden für Wakeling et al.15 erhoben. Zeit-, Dehnungs-, EMG-/Aktivierungs- und Kraftdaten sind erforderlich, um das Protokoll zu replizieren.

  1. Segmentieren Sie die gesamte In-vivo-Studie mit einer beliebigen Programmierplattform in einzelne Schritte (MATLab-Code in der ergänzenden Kodierungsdatei 1).
    1. Zeichnen Sie die Längenänderungen im Vergleich zu den Zeit für die gesamte In-vivo-Studie . Dies wird verwendet, um einzelne Schritte (Stand zu Stand) zu visualisieren und die Variabilität zwischen den Schritten zu beurteilen (Abbildung 1).
    2. Berechnen Sie die Dehnung für den gesamten Versuch (Länge (L) / Maximale isometrische Kraft bei optimaler Länge L0).
    3. Wählen Sie einen Schritt aus dem gesamten Versuch aus, der für alle Schritte repräsentativ ist und der mit ähnlicher Länge beginnt und endet. Dies kann visuell erfolgen, indem die Längen übereinander grafisch dargestellt werden, um jeden Schritt zu vergleichen.
    4. Nachdem ein repräsentativer Schritt ausgewählt wurde, segmentieren Sie Dehnungs-, EMG-/Aktivierungs- und Kraftdaten aus der gesamten Studie mit einer beliebigen Programmierplattform (siehe Ergänzende Kodierungsdatei 1 für die in MATLab16 verwendeten Codes).
    5. Wenn die Abtastfrequenz für Dehnung, EMG/Aktivierung oder Kraft abweicht, interpolieren Sie die Datenpunkte so, dass alle mit der gleichen Frequenz abgetastet werden.
      HINWEIS: Die Forscher können die Häufigkeit der Erfassung anhand der Zeitintervalle zwischen den einzelnen Punkten bestimmen, die während der gesamten Studie beprobt wurden. Wenn Variablen mit der gleichen Frequenz erfasst werden, sind die Abtastzeiten gleich.
  2. Berechnen Sie die Häufigkeit der segmentierten Schritte.
    1. Berechnen Sie die Häufigkeit, indem Sie die Dauer eines segmentierten Schritts in Sekunden bestimmen und 1 (Sekunde) durch die Dauer dividieren (1/Dauer = # Schritte pro Sekunde).
    2. Bestimmen Sie manuell, wie viele Datenpunkte in Ex-vivo-Experimenten erfasst werden müssen, um der Frequenz zu entsprechen.
    3. Berechnen Sie die Zeit, die für zwei Schritte benötigt wird. Wiederholen Sie die Schritte mindestens einmal, um den Fehler innerhalb der Muskelmessung zu schätzen, der für die anschließende statistische Analyse erforderlich ist.
  3. Bestimmen Sie die Phase der Stimulation relativ zum Dehnungseintrag unter Verwendung der gemessenen EMG-Aktivität, um den Beginn und die Dauer der Stimulation für die Ex-vivo-Arbeitsschleifen zu bestimmen. Es kann jede beliebige Programmierplattform verwendet werden (siehe Supplementary Coding File 1 für den in dieser Studie verwendeten Code).
    1. Zeigen Sie das EMG-Signal über den gleichen x-Achsenbereich (Zeit) wie die Dehnungsänderung an (Abbildung 1). Vergrößern Sie das EMG-Signal, damit es sichtbar ist. Dies kann erreicht werden, indem das EMG-Signal mit einer beliebigen Zahl multipliziert wird, die Dehnung und das EMG neu skaliert werden, um auf der gleichen Skala zu liegen, und/oder das EMG-Signal zur Dehnung addiert wird.
      HINWEIS: Die Autoren haben die Dehnung und das EMG mit der Funktion "rescale" in MATLab neu skaliert, um sie auf der gleichen Skala zu haben (siehe ergänzende Abbildung 1).
    2. Finden Sie heraus, wo die EMG-Aktivität beginnt und endet, was durch eine Änderung der Intensität von zwei Standardabweichungen17,18 angezeigt wird.
      HINWEIS: Je nach Tier und Muskel kann der EMG-Beginn mit dem Fußkontakt korrespondieren oder auch nicht (Monica Daley, UC Irvine, persönliche Mitteilung) (siehe Abschnitt Diskussion).
    3. Berechnen Sie den Prozentsatz des Belastungszyklus (z. B. 40 %), bei dem die EMG-Aktivierung einsetzt und wie lange die Stimulation dauert (z. B. 222 ms).
      HINWEIS: Die Forscher müssen eine Erregungs-Kontraktions-Kopplungsverzögerung (ECC) berücksichtigen, die sich zwischen In-vivo-Bewegung und Ex-vivo-Arbeitsschleifen unterscheidet und für jedes Tier und jeden Muskel unterschiedlich sein kann (z. B. beträgt die In-vivo-ECC 24,5 ms für Ratten-MG, Ex-vivo-ECC ~5 ms für Maus-EDL).
  4. Bereiten Sie repräsentative Dehnungseingaben für das Reglerprogramm des Arbeitskreises vor. Jedes Programm, das die Kraftabgabe mit Eingaben für Dehnung und Stimulation erfassen kann, kann für das Arbeitskreis-Reglerprogramm verwendet werden (siehe Abschnitt Diskussion).
    1. Nehmen Sie den ausgewählten Schritt und interpolieren Sie auf die entsprechende Anzahl von Punkten, die erforderlich sind, um den Schritt mit In-vivo-Frequenz für zwei Zyklen zu erfassen (siehe Schritt 1.2).
    2. Skalieren Sie den Schritt neu, um bei "Null-Dehnung" (z. B. L 0 oder 95 % L0) zu beginnen und zu stoppen, nachdem Sie sich um eine vorgegebene Längenabweichung gedehnt haben (siehe Schritt 3.3).
    3. "Skalieren" Sie den ausgewählten Schritt, falls erforderlich, um ihn als Eingabe für Dehnungsänderungen in der Maus-EDL zu verwenden (siehe Abschnitt Diskussion). Wählen Sie zum Skalieren eine Längenabweichung aus, auf die die Maus-EDL ohne Beschädigung gedehnt werden kann (z. B. dehnen wir die Maus-EDL in der Regel um 10 % L0 , unabhängig von der In-vivo-Spezies ). Dies muss möglicherweise auf der Grundlage der vorläufigen Ergebnisse geändert werden (siehe Schritt 3.3).

Figure 1
Abbildung 1: Dauer der gesamten In-vivo-Studie . Länge (mm) gegen die Zeit der Ratten-MG aufgetragen. Schritte werden durch Kreise abgegrenzt, von der kürzesten Länge bis zur kürzesten Länge, die als Einzelschritt betrachtet werden. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

2. Bewertung der maximalen isometrischen Kraft des Mausmuskels ex vivo

  1. Richten Sie Geräte und Chirurgie ein.
    HINWEIS: Im Abschnitt "Diskussion" finden Sie eine Erläuterung der Ausrüstung, die für die Ex-vivo-Arbeitsschleife benötigt wird.
    1. Bereiten Sie ein Gewebe-Organ-Bad vor, indem Sie das Oxytube-Nadelventil in das Wassermantel-Gewebebad einführen (siehe Materialtabelle). Schließen Sie das Oxytube an eine Gasflasche mit 95% 0 2-5% CO2 an. Warten Sie 20 psi, um das Wassermantel-Taschentuchbad zu füllen.
    2. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie ein zusätzliches Oxyröhrchen von der Gasleitung zu einer mit Krebs-Henseleit-Lösung gefüllten Kristallisationsschale führen (Schritt 2.1.3) in der Nähe des Operationsbereichs. Dies wird verwendet, um die Muskeln während und nach den Operationen belüftet und hydratisiert zu halten.
      HINWEIS: Muskeln können auch bis zu 4 h in dieser belüfteten Lösung gespeichert werden, wenn mehr als ein Muskel gleichzeitig aus der Maus entnommen wird.
    3. Bereiten Sie 1 l Krebs-Henseleit-Lösung mit (in mmol l-1) vor: NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1.18); CaCl 2 (2,54); und Glukose (10,0) bei Raumtemperatur und pH-Wert auf 7,4 unter Verwendung von HCl und NaOH (siehe Materialtabelle). Tragen Sie beim Umgang mit HCl und NaOH die richtige PSA in Form von Schutzbrille und Handschuhen.
    4. Füllen Sie das Bad mit Krebs-Henseleit-Lösung bei Raumtemperatur und pH 7,4. Tauche den Muskel und den Haken vollständig in die Lösung.
    5. Schalten Sie alle Geräte ein. Dual-Mode-Muskelhebelsystem, Stimulator und Signalschnittstelle (DAQ-Platine) (siehe Materialtabelle).
  2. EDL-Muskeldissektion.
    1. Betäuben Sie die Maus gründlich und führen Sie dann Euthanasie durch Zervixluxation durch. Lege die Maus entweder in eine rechte oder linke seitliche Liegeposition, wobei die obere Hintergliedmaße gestreckt ist und die Zehen das Sezierbrett berühren. Entferne das Fell vom Knöchel bis oberhalb des Kniegelenks.
    2. Zelten Sie die Haut mit einer Pinzette und schneiden Sie sie vom Sprunggelenk bis zum Hüftbereich ab. Sobald der Muskel freigelegt ist, schneiden Sie um den Knöchel herum wie einen "Hosensaum". Ziehen Sie die Haut nach oben, um die Beinmuskulatur deutlicher freizulegen.
    3. Lokalisieren Sie die Faszienlinie, die den Tibialis anterior (TA) und den Gastrocnemius trennt, und trennen Sie sie mit einer Sezierschere, um die Kniesehnen freizulegen. Setze die Präparierschere zwischen die beiden freiliegenden Kniesehnen. Die Schere "verfängt" sich in einer Tasche direkt unter den freiliegenden Kniesehnen. Sezieren Sie stumpf eine "Tasche", während Sie die Schere vom Bein wegziehen, bis die Schere den Knöchel erreicht, um die EDL freizulegen.
    4. Mit einem vorgebundenen Schlingenknoten aus chirurgischem Seidennaht der Größe 4-0 (siehe Materialtabelle) schnüren Sie ein Ende der Naht unter der Sehne, die dem Knie am nächsten ist. Binden Sie einen doppelten quadratischen Knoten über der proximalen Muskel-Sehnen-Verbindung, ohne ihn auf den Muskel zu legen oder die Sehne einzubeziehen. Oberhalb des Knotens abschneiden. Ziehen Sie vorsichtig an der Schlaufe, die an der Sehne befestigt ist, und die EDL kommt aus der "Tasche".
    5. Klebe die Schlaufe an den Sezierbereich, um Spannung in der EDL zu erzeugen. Binden Sie einen doppelten quadratischen Knoten mit einem weiteren vorgebundenen Schlaufenknoten an der distalen Muskel-Sehnen-Verbindung, ohne ihn auf den Muskel zu legen oder die Sehne einzubeziehen. Schneiden Sie den Knoten auf der Seite näher am Bein ab, um die gesamte EDL von der Maus zu entfernen. Schneiden Sie die zusätzliche Naht von den doppelten quadratischen Knoten auf der proximalen und distalen Seite des Muskels ab und legen Sie den Muskel in das belüftete Bad neben dem Operationsbereich.
      HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass Sie darauf achten, welche Seite proximal und/oder distal ist, wenn Sie den Muskel in ein belüftetes Bad legen.
    6. Um es auf dem Servomotor-Hebel zu platzieren, befestigen Sie EDL vertikal zwischen aufgehängten Platinelektroden. Befestigen Sie den distalen Schlaufenknoten am stationären Haken und befestigen Sie den proximalen Schlaufenknoten an dem Haken, der am Servomotorarm befestigt ist. Heben Sie das Gewebebad an, um den Muskel in die belüftete Krebs-Henseleit-Lösung einzutauchen.
      HINWEIS: Die Belüftung sollte den Muskel nicht stören, wenn er untergetaucht ist. Wenn dies der Fall ist, senken Sie den Druck des Gases. Lassen Sie die Muskeln 10 Minuten lang ausbalancieren, bevor Sie mit der Stimulation beginnen.
  3. Messen Sie die maximale isometrische Kraft des EDL-Muskels.
    HINWEIS: In Tabelle 1 finden Sie ein Protokoll zur Messung der maximalen isometrischen Kraft mit Zucken und Tetanus. Siehe Ergänzende Abbildung 1 für eine Illustration des von den Autoren verwendeten Programms.
    1. Stimulieren Sie den Muskel mit einem supramaximalen Zucken, um sicherzustellen, dass der Muskel während der Operation nicht beschädigt wurde (80 V, 1 pps, 1ms; Tabelle 1; siehe ergänzende Abbildung 2). Wenn keine Beschädigung aufgetreten ist, verwenden Sie den Längenknopf am Muskelhebelsystem, um mittels Zuckungsstimulation eine Muskellänge zu finden, bei der die aktive Spannung ~1 V / 0,1271 N mit weniger als ~0,1 V / 0,01271 N passiver Spannung beträgt.
    2. Notieren Sie die Anfangslänge des Muskels von Nahtknoten zu Nahtknoten in Volt und Millimetern. Geben Sie die Messwerte für die Startlänge in den Kalibrierungsteil des Programms ein (siehe Ergänzende Abbildung 1).
    3. Ermitteln Sie die maximale isometrische Kraft des supramaximalen Zuckens bei optimaler Länge (L0) von EDL (Tabelle 1). Technisch gesehen ist keine Ruhephase erforderlich, aber das Warten von 1 Minute zwischen den Stimulationen stabilisiert die passive Spannung. Notieren Sie die Länge (in Volt), bei der das supramaximale Zucken am größten ist. Dies ist die optimale Muskellänge (L0) für das Zucken.
    4. Messen Sie den Muskel mit Messschiebern in dieser Länge. Messen Sie den Muskel von Nahtknoten zu Nahtknoten. Sobald L 0 gefunden wurde, wird der Muskel wieder auf die Ausgangslänge verkürzt (aktive Spannung ~1V / 0,1271 N).
    5. Finden Sie die maximale isometrische Kraft des supramaximalen Tetanus der EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabelle 1). Zeichnen Sie die Länge (in Volt und Millimetern) der supramaximalen tetanischen Kraft bei L0 auf und messen Sie die Fasern von Nahtknoten zu Nahtknoten erneut mit Messschiebern.
      HINWEIS: Wenn Sie die Muskellänge in Schritten von 0,5 V/0,65 mm erhöhen, führt dies zu einem genaueren L0 sowohl für Zuckungen als auch für Tetanus.
    6. Ermitteln Sie die submaximale isometrische Kraft von EDL (45 V, 110 pps, 500 ms; Tabelle 1) bei L0 vor und nach dem Experiment, um sicherzustellen, dass keine Ermüdung durch das Stimulationsprotokoll auftrat. Eine Kraftabnahme von 10 % gilt als "ermüdeter" Muskel.
Experiment Intensität der Simulation (V) Pulsfrequenz (pps / Hz) Dauer der Stimulation (ms) Kommentare
1. "Aufwärmen" 80 1 1 Erhöhen oder verringern Sie die Länge um 0,50 V, um eine passive Spannung von 1 V zu erreichen
2. Optimales Muskellängenzucken (L0) 80 1 1 Erhöhen oder verringern Sie die Länge um 0,50 V, um eine passive Spannung von ~1 V zu erreichen
3. Optimale Muskellänge Tetanus (L0) 80 180 500 Pause 3 min zwischen Längenänderung um 0,50 V
4. Submaximales L0 vor dem Experiment 45 110 500 Bei der Länge von L0
6. Avatar-Experimente 45 110 Zyklische Verwendung repräsentativer Längenänderungen für Maus-EDL
7. Submaximales L0 nach dem Experiment 45 110 500 Kehren Sie nach dem Experiment zu L0 zurück und messen Sie L0

Tabelle 1: Stimulationsprotokoll. Stimulationsprotokoll zur Bestimmung der optimalen Länge von supramaximalem und submaximalem Zucken und Tetanus. Das Protokoll variiert je nach Stimulationsintensität, Timing und Impulsen pro Sekunde.

3. Vervollständigung der "Avatar"-Workloop-Technik unter Verwendung ausgewählter In-vivo-Stammtrajektorien

  1. Richten Sie die Software ein, die erforderlich ist, um "Avatar"-Workflow-Techniken durchzuführen (siehe Materialtabelle).
    HINWEIS: Es wird eine Eingabedatei (.csv oder ähnlich) benötigt, die die Muskellänge bei jedem Zeitschritt angibt (siehe Schritt 1.4). Eingaben für den Prozentsatz des Zyklus, bei dem die Stimulation beginnt, und für die Dauer der Stimulation sind erforderlich (siehe z. B. ergänzende Abbildung 3 ).
  2. Schließe die "Avatar"-Workloop-Technik ab.
    HINWEIS: Während wir ein benutzerdefiniertes LabView-Programm verwenden, können Forscher jedes Programm verwenden, das die Steuerung von Längenänderungen in der Maus-EDL über einen servomotorischen Hebel, die Steuerung des Beginns (% Zyklus) und der Dauer (ms) der Stimulation zu bestimmten Zeiten sowie die Messung der Muskelkraft ermöglicht. In der ergänzenden Abbildung 3 finden Sie eine Veranschaulichung des von Autoren verwendeten Programms.
    1. Laden Sie die skalierten Dehnungsänderungen mit skalierter Längenabweichung aus Schritt 1.4 in das Programm hoch. Weitere Informationen zu "skalierten Dehnungsänderungen" finden Sie in den Schritten 1.4, 3.3 und im Abschnitt "Diskussion".
    2. Passen Sie bei Bedarf die Anfangslänge des Muskels an (siehe Abschnitt 3.3). Geben Sie die Startlänge in V und mm ein, um die Ergebnisse zu kalibrieren (siehe ergänzende Abbildung 3).
    3. Verwenden Sie den Beginn und die Dauer der Stimulation, die in Schritt 1.3 berechnet wurden.
    4. Lassen Sie den Muskel zwei Zyklen lang durch die skalierten Längenwechsel mit bestimmter Längenabweichung laufen.
    5. Speichern Sie Daten. Wenn mehrere Stimulationsprotokolle für denselben Muskel gesammelt werden, warten Sie 3 Minuten zwischen den einzelnen Stimulationen.
    6. Stimulieren Sie in optimaler Länge (L0) mit submaximaler Aktivierung, um festzustellen, ob Müdigkeit aufgetreten ist. Wenn die Kraft um mehr als 10 % abnimmt, gelten die Muskeln als ermüdet. Siehe Tabelle 1 für Stimulationsprotokolle.
    7. Entferne den Muskel aus dem Bad. Schneiden Sie Knoten aus dem Muskel und tupfen Sie die überschüssige Lösung vom Muskel ab. Wiegen Sie den Muskel. Bestimmen Sie die physiologische Querschnittsfläche mit der Standardformel: Muskelmasse/(L0*1,06)19.
  3. Tunen Sie die Parameter für die "Avatar"-Workloop-Technik (siehe Abschnitt Diskussion).
    1. Bestimmen Sie die Anfangslänge und die Längenabweichung, indem Sie den passiven Spannungsanstieg ex vivo an den in vivo beobachteten passiven Spannungsanstieg anpassen (Abbildung 2).
      ANMERKUNG: In dieser Studie wurde Prozent L 0 verwendet, um die Anfangslänge (mm) und die Auslenkung (% L0; siehe Schritt 1.4 und Abschnitt Diskussion) zu skalieren. Für die Anpassung des Spannungsanstiegs in der ex vivo Maus-EDL an den des in vivo Ratten-MG stellten die Autoren fest, dass die Startlänge bei L0 die beste Anpassung ergab (Abbildung 2).
    2. Wählen Sie drei Anfangslängen (z. B. -5 % L 0, L 0 und +5 % L0). Führen Sie die "Avatar"-Arbeitsschleife an jeder dieser Anfangslängen mit einer vorgegebenen Längenauslenkung (z. B. 10% L0) durch.
      ANMERKUNG: In den vorliegenden "Avatar"-Experimenten mit Maus-EDL wurde eine Längenabweichung von 10% L0 verwendet.
    3. Wiederholen Sie dies mit neuen Anfangslängen und/oder Auslenkungen, bis die Geschwindigkeit des passiven Spannungsanstiegs ex vivo der Rate des passiven Spannungsanstiegs in vivo ähnlich ist (siehe Abbildung 2B).
    4. Abhängig von den Fasertypen und der Aktivierungsdynamik der verwendeten Muskeln ist die Dauer der Stimulation zu erhöhen oder zu verkürzen, um die Übereinstimmung zwischen Ex-vivo- und In-vivo-Kraft zu optimieren. Daher kann es notwendig sein, den Beginn und/oder die Dauer der Stimulation so zu ändern, dass sie der In-vivo-Kraftproduktion während der "Avatar"-Experimente am besten entspricht.
    5. Um zu entscheiden, ob dies notwendig ist (siehe Abschnitt Diskussion), stellen Sie die Kraft über die Zeit des "Avatar"- und des In-vivo-Muskels dar (Abbildung 3) und berechnen Sie das BestimmtheitsmaßR2 , indem Sie die skalierte Korrelation zwischen Ziel- und "Avatar"-Muskelkraft quadrieren (siehe Repräsentative Ergebnisse).

Figure 2
Abbildung 2: Passender passiver Spannungsanstieg. Arbeitsschleifen, die den in vivo und ex vivo Anstieg der passiven Spannung zeigen (Pfeile). In vivo skalierte Arbeitsschleife von Ratten-MG (schwarz), die bei 2,9 Hz läuft (Daten von Wakeling et al.15). Ex vivo skalierte Arbeitsschleifen aus Maus-EDL (grün) bei 2,9 Hz. (A) Die Anfangslänge des EDL-Muskels der Maus beträgt +5% L0. (B) Die Anfangslänge des EDL-Muskels der Maus beträgt L0. Beachten Sie, dass der passive Spannungsanstieg ex vivo dem in vivo Spannungsanstieg in A, aber nicht in B entspricht. Dickere Linien deuten auf eine Stimulation hin. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Optimierung der Stimulationsdauer von Maus-EDL zur Anpassung an die In-vivo-Kraft von Ratten-MG (schwarze Linie). Die Kraft, die von der Maus-EDL mit Hilfe der EMG-basierten Stimulation (grüne gestrichelte Linie) erzeugt wird, nimmt früher ab als die In-vivo-Kraft, wahrscheinlich aufgrund einer schnelleren Deaktivierung der Maus-EDL im Vergleich zu Ratten-MG. Um die Anpassung zwischen den in vivo und ex vivo Kräften zu optimieren, wurde die Maus-EDL über einen längeren Zeitraum stimuliert (durchgezogene grüne Linie). EMG-basierte Stimulation R2 = 0,55, optimierte StimulationR2 = 0,91. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

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Representative Results

Das Ziel der "Avatar"-Experimente ist es, in vivo Krafterzeugung und Arbeitsleistung während ex vivo Arbeitsschleifenexperimenten so genau wie möglich zu replizieren. In dieser Studie wurde die Verwendung von Maus-EDL als "Avatar" für Ratten-MG ausgewählt, da Maus-EDL und Ratten-MG beide hauptsächlich aus schnell zuckenden Muskeln bestehen20,21. Beide Muskeln sind primäre Beweger des Sprunggelenks (EDL-Knöcheldorsalflexor, MG-Knöchelplantarflexor) mit ähnlichen Pennationswinkeln (Maus EDL 12,4 + 2,12°22, Ratte MG 20° in dieser Studie verwendet15). Skalierte repräsentative Arbeitsschleifen von Ratten-MG15 wurden mit ex vivo "Avatar"-Experimenten (Abbildung 4) unter Verwendung von zwei verschiedenen Stimulationsprotokollen verglichen (eines aus der gemessenen EMG-Aktivität und eines optimiert wie in Schritt 3.3). Die hier dargestellten R2-Werte wurden unter Verwendung des gesamten skalierten Dehnungsverkürzungszyklus (2 Zyklen/Bedingung) berechnet, wobei jeder Zyklus mehr als 2000 Punkte hat, die der Geschwindigkeit des Bewegungsapparates entsprechen (Schritt = 5521 Punkte, Trab = 5002, Galopp = 2502 Punkte). Die Arbeitsschleifen wurden skaliert, um Unterschiede in Muskelgröße, P0 und PCSA zu berücksichtigen. Die Skalierung erfolgte durch lineare Zuordnung von Kraft und Dehnung auf eine ähnliche Skala (0-1), um die MG der Ratte und die EDL der Maus zu vergleichen. Visuell ist es offensichtlich, dass die Optimierung des Stimulationsprotokolls (Abbildung 4B) zur Berücksichtigung der unterschiedlichen Aktivierungsdynamik der Maus-EDL- und Ratten-MG-Muskeln die Anpassung an die in vivo Ratten-MG-Kraft im Vergleich zur EMG-basierten Aktivierung verbessert (siehe Abschnitt Diskussion). Bei der Maus-EDL erhöhte eine etwa Verdoppelung der Stimulationsdauer für langsamere Belastungsverläufe (Schritt und Trab) den R2 um 62 % im Gehen und um 109 % im Trab. Für die schnellere Dehnungstrajektorie (Galopp) erhöhte eine Verlängerung der Stimulationszeit um die Hälfte der beobachteten Zeit den R2 um 22 %.

Figure 4
Abbildung 4: Vergleich von in vivo und ex vivo Arbeitsschleifen. Arbeitsschleifen von in vivo Ratten-MG (schwarz) und ex vivo Maus-EDL (grün) während des Gehens (2,9 Hz) unter Verwendung von in vivo Stammtrajektorien. Die dickere Linie zeigt eine Stimulation sowohl in In-vivo- als auch in Ex-vivo-Arbeitsschleifen an. (A) Arbeitsschleife von in vivo Ratten-MG (schwarz) und ex vivo Maus-EDL (grün gestrichelt) während des Gehens unter Verwendung eines EMG-basierten Stimulationsprotokolls. (B) Arbeitsschleife von in vivo Ratten-MG (schwarz) und ex vivo Maus-EDL (durchgehend grün) während des Gehens (2,9 Hz) unter Verwendung optimierter Stimulation. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ein hoherR2-Wert zwischen der EX-vivo-Kraftproduktion der Maus und der In-vivo-Kraftproduktion des medialen Gastrocnemius (MG)15 der Ratte deutet auf eine gute Replikation hin (Abbildung 5). In EMG-basierten Stimulationsexperimenten betrugen die durchschnittlichenR2-Werte 0,535, 0,428 bzw. 0,77 für Schritt, Trab und Galopp. In optimierten Stimulationsexperimenten betrugen die durchschnittlichen R2-Werte 0,872, 0,895 bzw. 0,936 im Schritt, Trab und Galopp. Wie bereits erwähnt (Schritt 3.3, Abbildung 5), muss je nach Aktivierungsdynamik der verwendeten Muskeln auch das Stimulationsprotokoll optimiert werden. Die Vorhersage der in vivo MG-Kraft mittels ex vivo Maus-EDL wurde über alle Bewegungsgeschwindigkeiten hinweg verbessert, indem die Stimulation optimiert, R2 erhöht (Abbildung 5A,B) und der mittlere quadratische Fehler (RMSE) verringert wurde. Der RMSE nahm nach der Optimierung für alle Geschwindigkeiten ab (Abbildung 6). Der durchschnittliche RMSE für die EMG-basierte Stimulation betrug 0,31, 0,43 und 0,158 für Schritt, Trab und Galopp. Der durchschnittliche RMSE für eine optimierte Stimulation betrug 0,181, 0,116 und 0,101 für Schritt, Trab und Galopp.

Figure 5
Abbildung 5: R2-Werte für die In-vivo- und Ex-vivo-Krafterzeugung: Box- und Whisker-Plot der R2-Werte für In-vivo- und Ex-vivo-Kraftvergleiche . Einzelne Beobachtungen aufgetragen, Median, 25. und 75. Perzentil angegeben. (A) R2-Werte für die In-vivo- und Ex-vivo-Krafterzeugung unter Verwendung eines Stimulationsprotokolls, das auf dem in vivo gemessenen EMG-Signal während des Gehens bei 2,9 Hz (grün), Traben bei 3,2 Hz (Magenta) und Galoppieren bei 6,2 Hz (Cyan) basiert. (B)R2-Werte für die In-vivo- und Ex-vivo-Krafterzeugung unter Verwendung optimierter Stimulation (siehe Abbildung 2). Durch die Optimierung des Stimulationsbeginns und der Stimulationsdauer wurde R2 für alle Gangarten erhöht. EMG-basierte Stimulation: Schritt R 2 = 0,50-0,55, Trab R 2 = 0,37-0,47, Galopp R2 = 0,62-0,90; optimierte Stimulation: Schritt R 2 = 0,74-0,93, Trab R 2 = 0,85-0,92, Galopp R2 = 0,87-0,97. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Root Mean Square Error (RMSE) für die In-vivo- und Ex-vivo-Krafterzeugung. Box- und Whisker-Plot der RMSE-Werte für In-vivo- und Ex-vivo-Kraftvergleiche. Einzelne Beobachtungen aufgetragen, Median, 25. und 75. Perzentil angegeben. (A) RMSE-Werte für die In-vivo- und Ex-vivo-Krafterzeugung unter Verwendung eines EMG-basierten Stimulationsprotokolls. (B) RMSE-Werte für in vivo und ex vivo unter Verwendung eines optimierten Stimulationsprotokolls. Durch die Optimierung des Stimulationsbeginns und der Stimulationsdauer wurde der RMSE für alle Gangarten reduziert. Schritt mit 2,9 Hz (grün), Trab mit 3,2 Hz (Magenta) und Galopp mit 6,4 Hz (Cyan). Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Um die Leistungsfähigkeit traditioneller Arbeitsschleifenmethoden bei der Vorhersage von in vivo Muskelkräften zu testen, wurden auch sinusförmige Arbeitsschleifen für die Maus-EDL mit der gleichen Frequenz, Längenabweichung, Startlänge, Stimulationsbeginn und -dauer wie für die "Avatar"-Experimente mit in vivo Ratten-MG-Stammtrajektorien durchgeführt. DieR2-Werte waren sowohl für EMG-basierte als auch für optimierte Stimulationsprotokolle signifikant niedriger als für die in vivo Stammtrajektorien (Abbildung 7). Die gemittelten R2-Werte für die EMG-basierte Stimulation mit sinusförmigen Längentrajektorien betrugen 0,062, 0,067 und 0,141 bei Schritt-, Trab- und Galoppfrequenzen. Die gemitteltenR2-Werte für eine optimierte Stimulation mit sinusförmigen Längentrajektorien betrugen 0,09, 0,067 und 0,141 bei Schritt-, Trab- und Galoppfrequenzen.

Figure 7
Abbildung 7: R2 Werte für die in vivo und ex vivo Krafterzeugung unter Verwendung sinusförmiger Längenänderungen. Box- und Whisker-Plot der RMSE-Werte für In-vivo- und Ex-vivo-Kraftvergleiche. Einzelne Beobachtungen aufgetragen, Median, 25. und 75. Perzentil angegeben. R2-Werte für Schritt (grün, 2,9 Hz), Trab (Magenta, 3,2 Hz) und Galopp (Cyan, 6,2 Hz) unter Verwendung sinusförmiger Längenänderungen mit EMG-basierten (transluzenten) und optimierten (opaken) Stimulationsprotokollen. Sowohl für die EMG-basierte als auch für die optimierte Stimulation waren dieR2-Werte für die sinusförmigen Längenänderungen niedriger als für die in vivo Längenänderungen. EMG-basierte Stimulation: Schritt R 2 = 0,00 - 0,30, Trab R 2 = 0,00 - 0,02, Galopp R2 = 0,03 - 0,07; optimierte Stimulation: Schritt R 2 = 0,02 - 0,21, Trab R 2 = 0,02 - 0,12, Galopp R2 = 0,12 - 0,17. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Arbeitsschleifen, die vom ex vivo Maus-EDL-Muskel unter Verwendung sinusförmiger Längentrajektorien erzeugt werden, emulieren die MG-Kraft in vivo Ratten im Vergleich zu in vivo Stammtrajektorien nicht so genau (Abbildung 8). Die Veränderung der Arbeit, die durch sinusförmige vs. in vivo Dehnungstrajektorien erzeugt wird, kann durch das Fehlen von Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten in der sinusförmigen Trajektorie erklärt werden (Abbildung 9). Während die Muskeln während der aktiven Verkürzungsphase der Kontraktionen sowohl in sinusförmigen Trajektorien als auch in vivo-basierten Dehnungstrjektorien ähnlich lang stimuliert wurden, trat der Beginn der Stimulation in unterschiedlichen Phasen des Zyklus auf (z. B. trat der Stimulationsbeginn bei einer Phase von 74 % bei der EMG-basierten Stimulation im Trab auf, bei der EMG-basierten Stimulation jedoch in einer Phase von 43 %; siehe Abschnitt Diskussion).

Figure 8
Abbildung 8: Vergleich von in vivo und ex vivo sinusförmigen Arbeitsschleifen. (A) In-vivo-Arbeitsschleife (schwarz) von Ratten-MG und Ex-vivo-Arbeitsschleife (gestricheltes Magenta) von Maus-EDL unter Verwendung sinusförmiger Dehnungstrajektorie und EMG-basierter Stimulation. (B) In-vivo-Arbeitsschleife (schwarz) aus Ratten-MG und ex-vivo-Arbeitsschleife (durchgehendes Magenta) aus Maus-EDL unter Verwendung sinusförmiger Dehnungstrajektorie und optimierter Stimulation. Beachten Sie, dass die sinusförmigen Arbeitsschleifen die In-vivo-Arbeit aufgrund des Fehlens von Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten in der sinusförmigen Trajektorie überschätzen. EMG-basierte Stimulation R2 = 0,0003, optimierte StimulationR2 = 0,084. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 9
Abbildung 9: Vergleich von in vivo Stamm- und ex vivo sinusförmigen Längentrajektorien. Vergleich der in vivo Dehnung und ex vivo sinusförmigen Längentrajektorien im Schritt (grün), Trab (magenta) und Galopp (blau). Die durchgezogene Linie zeigt die In-vivo-Stammtrajektorie. Gestrichelte ex vivo sinusförmige Längentrajektorie. Der hervorgehobene Teil ist die Stimulation. Die Stimulation begann während der Verkürzungsphase des Schrittes mit der gleichen Länge. Pfeile, die Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten anzeigen. Abweichungen von der Sinuskurve sind Impedanzen durch äußere Kräfte auf den Muskel. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: Programm zur Erfassung der isometrischen Maximalkraft bei optimaler Länge. Das Programm, das verwendet wird, um die optimale Länge während der supramaximalen und submaximalen Zuckung und der tetanischen Stimulation zu bestimmen. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 2: Lebensfähige Zuckungsreaktion. Zuckende Reaktion von Maus-EDL. Die Zuckkraft steigt und fällt schnell und sollte eine aktive Spannung von ~1 V erreichen. Das "Rauschen" sollte minimal sein, nachdem die maximale aktive Spannung erreicht ist. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Abbildung 3: Programm zum Sammeln von Arbeitsschleifendaten. Das Programm wird verwendet, um die Muskellänge und den Zeitpunkt der Stimulation in Ex-vivo-Arbeitsschleifen zu steuern. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Ergänzende Kodierungsdatei 1: MATLab-Code, der zum Segmentieren und Erstellen eines experimentellen Protokolls für die Arbeitsschleife verwendet wird. MATLab-Code, der verwendet wurde, um Zielschrittinformationen (Länge, EMG-Aktivierung und Kraft) in einzelne Schritte zu segmentieren. Der Code beinhaltet die Skalierung und Interpolation von Zieltierschritten in Längen, die ex vivo Maus-EDL dehnen kann. Darüber hinaus enthält es einen Code zur Glättung des EMG-Signals und zum Vergleich der Aktivierung zur Auswahl des Beginns und der Dauer der Stimulation in Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperimenten . Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

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Discussion

Während sich Organismen nahtlos durch Landschaften bewegen, variieren die zugrunde liegenden Belastungen und Belastungen, denen die Muskeln ausgesetzt sind, drastisch 1,6,23. Sowohl bei der in vivo Fortbewegung 1,24 als auch in "Avatar"-Experimenten werden die Muskeln unter zyklischen, instationären Bedingungen submaximal stimuliert. Die isometrischen Kraft-Längen- und isotonischen Kraft-Geschwindigkeits-Beziehungen sind nicht gut geeignet, um die Muskelkraft unter diesen Bedingungen vorherzusagen2. Das Verständnis der Auswirkungen von instationärer Dehnung (d.h. Transienten) und Belastung ist für die Vorhersage der Krafterzeugung während der In-vivo-Bewegung unerlässlich und daher der Hauptgrund für die Entwicklung dieser "Avatar"-Experimente2. "Avatar"-Experimente ermöglichen es uns, die Muskelbelastung und die Belastungsverläufe zu kontrollieren und gleichzeitig die Kraftabgabe zu messen. Die "Avatar"-Technik untersucht die Kraftantwort von Muskeln unter in vivo-ähnlichen Bedingungen, ohne Störfaktoren der neuronalen Kontrolle und der Sehnennachgiebigkeit. Um die "Avatar"-Experimente durchführen zu können, benötigen die Forscher ein Programm, das es einem Muskel ermöglicht, vorgeschriebene Längenänderungen mit der Fähigkeit zu durchlaufen, mit unterschiedlichen Anfangslängen und für unterschiedliche Dauer zu stimulieren (siehe ergänzende Abbildung 3 für das von den Autoren verwendete Programm). Die Forscher müssen die Anfangsmuskellänge (mm), die Länge der Exkursion (mm), den Beginn der Stimulation (% der Zyklusdauer) und die Dauer der Stimulation (ms) angeben, bevor sie Experimente durchführen (siehe Schritte 1.3-1.4, um Werte für diese Parameter zu erhalten). Im Allgemeinen ist es oft wünschenswert, Schritte auszuwählen, die für alle Schritte in der Studie repräsentativ sind (z. B. beginnen und enden mit einer ähnlichen Länge, erreichen eine ähnliche Spitzenkraft, haben eine durchschnittliche EMG-Aktivität usw.). Die Bestimmung, ob die EMG-/Aktivierungs- und Kraftdaten eines ausgewählten Schritts repräsentativ für andere Schritte im selben Versuch sind, kann für das spätere "Tuning" hilfreich sein, indem die Arbeitsschleifen (Kraft versus Länge) des gesamten Versuchs unter Verwendung des Muskels des Zieltieres aufgezeichnet werden. Bei der zwei- und vierbeinigen Fortbewegung grenzt die kürzeste Länge zur kürzesten Länge im Allgemeinen einen ganzen Schritt ab (Zehenabdruck zu Zehenabdruck), aber die EMG-Aktivierung kann variieren. Bei einigen Tieren und Muskeln ist die EMG-Aktivierung eng mit dem Fußkontakt korreliert, wie z. B. dem hier gezeigten Ratten-MG22. Bei anderen Tieren, wie z.B. dem seitlichen Gastrocnemius des Perlhuhns, tritt die EMG-Aktivierung in der Regel am längsten auf, um mehr Stabilität in unbekanntem Gelände zu erreichen25.

Um "Avatar"-Experimente durchführen zu können, ist es wichtig, das Rauschen in den Ex-vivo-Kraftdaten zu minimieren. Kraftmessungen reagieren empfindlich auf verschiedene Probleme, einschließlich, aber nicht beschränkt auf das Reißen der Muskeln während der Operation, die Nachgiebigkeit der Nähte, wenn die Schlaufenknoten zu lang sind, eine unsachgemäße Skalierung der Längeneingaben und der Auslenkung sowie Muskelermüdung. Ein Muskelriss tritt häufig beim "Sezieren der Tasche" (Schritt 2.2.3) und beim Binden des Schlingenknotens um den proximalen Teil der Sehne (Schritt 2.2.4) auf. Wenn Sie beim "Sezieren der Tasche" die Sezierschere flach und waagerecht zum Muskel halten, verhindern Sie, dass die Spitzen die EDL einschneiden. Wenn Sie die Präparierschere während des stumpfen Präparierens wegziehen und distal ziehen, wird der Kontakt zwischen der Präzierschere und den EDL-Muskeln ebenfalls eingeschränkt. Zusätzlich sollten die Muskeln während der Operationsvorbereitung und beim Einsatz auf dem Rig mit Krebs-Henseliet-Lösung feucht gehalten werden.

Das richtige Skalieren von Längeneingaben ist komplizierter. Die passive und aktive Kraft der Muskeln kann beeinträchtigt werden, wenn die Anfangslänge und/oder die Auslenkung nicht richtig skaliert sind. Der ex vivo Anstieg der passiven Spannung sollte mit dem in vivo Anstieg der passiven Spannung übereinstimmen (siehe Abbildung 1). Ein Skalierungsproblem, das in früheren Experimenten beobachtet wurde, ist, dass sowohl die passive als auch die aktive Spannung beeinflusst werden können, wenn die Längenabweichung (Anfangslänge zur längsten Länge) zu klein oder zu groß ist. Theoretisch sollten Muskeln eine Spitzenkraft in der Nähe ihrer optimalen Länge (L 0)26 erreichen, weshalb wir die optimale Länge (L0) verwenden, um die in vivo Muskellängen in ex vivo "Avatar"-Experimenten zu skalieren, um die in vivo Kraftproduktion genau zu replizieren. Architektonische Unterschiede zwischen den Muskeln spielen eine Rolle bei der Bestimmung der Startlänge und der Längenauslenkungsparameter. Obwohl die optimale Länge (L0) unter supramaximal stimulierten isotonischen und isometrischen Bedingungen gefunden wird, kann die Verwendung als Skalierungsmetrik in "Avatar"-Experimenten möglicherweise Grenzen der Kraft-Längen- und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehungen während zyklischer Bewegung aufzeigen, die weiter untersucht werden müssen. Unter den meisten stationären Bedingungen können die momentane Länge, Geschwindigkeit und Aktivierung des Muskels (d. h. Kraft-Längen- und Kraft-Geschwindigkeits-Eigenschaften) verwendet werden, um Kraft und Arbeitsleistung mit angemessener Genauigkeit vorherzusagen 12,24,27. Unter dynamischen Bedingungen mit variabler Belastung nimmt die Kraft in Abhängigkeit von der Geschwindigkeit28 zu und steht in einem komplexen Zusammenhang mit Dehnung und Aktivierung29,30. Dies widerspricht den isotonischen Kraft-Geschwindigkeits- und isometrischen Kraft-Längen-Eigenschaften der Muskeln28. Im MG der Ratte sind Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten ein Hinweis auf Belastungen, wie z. B. Fußkontakt oder Interaktion mit der Umgebung (d. h. unwegsames Gelände, Wind, plötzliche Richtungsänderungen zur Vermeidung von Prädationen) (Abbildung 9). Diese Trajektorien von Ratten-MG-Stämmen haben, wie die meisten realistischen Bedingungen, plötzliche Änderungen der aufgebrachten Last, der Kraftproduktion und der Arbeitsleistung 2,28. Diese experimentelle Methode zielt darauf ab, diese komplexen Wechselwirkungen zwischen Dehnungs-, Geschwindigkeits- und Aktivierungsdynamik unter In-vivo-Bedingungen aufzuzeigen, die durch traditionelle Kraft-Längen- und Kraft-Geschwindigkeits-Beziehungen nicht gut erklärt werden können.

Andere Probleme können auftreten, wenn die Ausgangslänge des Muskels zu kurz oder zu lang ist. Eine zu kurze Anfangslänge führt zu einer verringerten Anstiegsrate der Spannung während der passiven und aktiven Dehnung (nicht dargestellt), während eine zu lange Anfangslänge zu einer erhöhten Anstiegsrate der passiven Spannung führt (siehe Abbildung 1B). Die Verwendung des Verhältnisses von aktiver zu passiver Spannung kann hilfreich sein. Zum Beispiel beträgt die passive Spannung (N) bei Ratten-MG im Allgemeinen etwa die Hälfte der aktiven Spannung (Abbildung 2). Wenn ein Muskel mit einer zu langen Länge beginnt und/oder auf eine zu lange Länge gedehnt wird, kann die passive Spannung im Verhältnis zur aktiven Spannung zu hoch sein (siehe Abbildung 1B), und die Kraft kann aufgrund der Überdehnung schnell abnehmen. Auch das Dehnen auf eine zu lange Länge schädigt möglicherweise den Muskel und kann dazu führen, dass der Muskel schneller ermüdet. Darüber hinaus kann eine aktive Spannung unverschmolzen erscheinen, wenn die Ausgangslänge zu kurz ist und/oder der Muskel nicht lang genug gedehnt wird.

Vorversuche sind notwendig, um die Startlänge und die Auslenkung auf Basis von L0 zu bestimmen. Weitere Vorversuche können erforderlich sein, um die Dauer der Stimulation anzupassen, wenn die Aktivierungsdynamik der verwendeten Muskeln unterschiedlich ist. Diese Optimierungen sind notwendig, da die Zusammensetzung des Fasertyps und/oder die Aktivierungsdynamik von In-vivo- und Ex-vivo-Muskeln unterschiedlich sein können. In unseren repräsentativen Ergebnissen (Abbildung 4 und Abbildung 5) haben wir zwei Stimulationsprotokolle für Maus-EDL während ex vivo Experimenten verwendet, um die in vivo MG-Kraftproduktion von Ratten zu replizieren. Um die Kraftproduktion in der Maus-EDL so zu optimieren, dass sie am besten zu in vivo Ratten-MG passt, wurde die Stimulationsdauer verlängert (Abbildung 2 und Abbildung 3). Ratten-MG besteht aus langsameren Fasertypen als Maus-EDL31,32,33. Dies war in "Avatar"-Experimenten offensichtlich, da die ex vivo Maus EDL-Muskeln nach der Erregung schneller Kraft erzeugten und die Kraft nach der Deaktivierung schneller abnahm als in vivo bei der Ratte MG15 beobachtet wurde (Abbildung 2), selbst nach Berücksichtigung der Unterschiede zwischen Erregungs- und Kontraktionsverzögerung zwischen in vivo und ex vivo Bedingungen34. Abhängig von den ex vivo und in vivo Zielmuskeln kann eine Optimierung der Stimulation auch in anderen "Avatar"-Experimenten erforderlich sein. Bei dieser Ex-vivo-Workloop-Technik kann entweder der EDL- oder der Soleus-Muskel (SOL) der Maus verwendet werden. EDL wurde aufgrund der Ähnlichkeiten im Muskelfasertyp und in der Pennationsstruktur als "Avatar" für das Ratten-MG ausgewählt. Es ist möglich, dass einige Muskeln eine komplexe Struktur haben und nicht mit Muskeln von Labornagern als "Avatar" nachgeahmt werden können.

Während "Avatar"-Experimente einige manuelle Optimierungen erfordern, um die In-vivo-Kraftproduktion bestmöglich zu replizieren, ist die Technik auf eine Vielzahl verschiedener Tiere und Bewegungsmodi anwendbar. Die "Avatar"-Technik kann besonders nützlich sein, um die In-vivo-Kraftproduktion bei Tieren zu verstehen, deren Muskeln zu groß oder anderweitig für Ex-vivo-Experimente unzugänglich sind. Obwohl bisher nur Vorarbeiten an größeren Tieren durchgeführt wurden35, haben diese Arbeiten das Potenzial für die Anwendbarkeit dieser Technik auf Tiere, Muskeln und den Bewegungsapparat unter Verwendung von Labormäusen als "Avatare" gezeigt. Die Nützlichkeit von "Avatar"-Experimenten hängt davon ab, wie genau ein praktisches, kostengünstiges, leicht verfügbares und gut charakterisiertes Labor-Nagetiermodell (d.h. Maus-EDL) verwendet werden kann, um die In-vivo-Mechanik verschiedener Muskeln von verschiedenen Arten von Wirbeltieren zu verstehen. Die Ergebnisse von vorläufigen "Avatar"-Experimenten, die hier (Ratten-MG) und anderswo (Perlhuhn LG19) vorgestellt wurden, deuten darauf hin, dass diese Technik zur genauen Vorhersage von In-vivo-Kräften verwendet werden kann und auf andere Tiere angewendet werden könnte. Zukünftige Anwendungen dieser Methode sollten die Arten von Muskeln und Tieren erweitern, die sowohl als Ziele als auch als "Avatar" in Ex-vivo- und In-vitro-Experimenten verwendet wurden. "Avatar"-Experimente ermöglichen es uns, Faktoren zu untersuchen, die die Muskelkraft und die Arbeitsleistung während der In-vivo-Fortbewegung beeinflussen, wenn Muskelbelastung und -belastung abrupt variieren 1,2,19. Insbesondere die "Avatar"-Methode ermöglicht es uns, die Auswirkungen von Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten auf die Muskelkraft zu untersuchen, die von herkömmlichen Muskelmodellen oder sinusförmigen Arbeitsschleifenexperimenten nicht erfasst werden.

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Disclosures

Alle Autoren erkennen an, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Acknowledgments

Wir danken Dr. Nicolai Konow für die Bereitstellung der in dieser Studie verwendeten Daten. Gefördert durch NSF IOS-2016049 und NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

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Avatar Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperimente In-vivo-Belastung Aktivierungsbewegungsverhalten Muskelkraftproduktion Arbeitsleistung neuronale und mechanische Systeme biologische Organisation Kontrollhierarchie Muskelmodelle In-vivo-Muskelkraft In-vivo-Muskelarbeit Muskelmechanik Belastungs- und Belastungsbedingungen In-vivo-Fortbewegung Dehnungs- und Geschwindigkeitstransienten neuronale Aktivierung muskuloskelettale Kinematik Umweltbelastungen Avatar-Technik
"Avatar", ein modifiziertes Ex-vivo-Arbeitsschleifenexperiment mit <em>In-vivo-Dehnung und -</em>Aktivierung <em></em>
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Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

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