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Bioengineering

"Avatar", um loop de trabalho ex vivo modificado usando tensão e ativação in vivo

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Este artigo detalha a metodologia para emular a produção de força muscular in vivo durante experimentos de loop de trabalho ex vivo usando um músculo "avatar" de um roedor de laboratório para avaliar as contribuições dos transientes de tensão e ativação para a resposta de força muscular.

Abstract

Os comportamentos de movimento são características emergentes dos sistemas dinâmicos que resultam da produção de força muscular e do trabalho. A interação entre os sistemas neural e mecânico ocorre em todos os níveis da organização biológica simultaneamente, desde a sintonia das propriedades musculares da perna durante a corrida até a dinâmica dos membros interagindo com o solo. Compreender as condições sob as quais os animais mudam suas estratégias de controle neural para a mecânica muscular intrínseca ("preflexos") na hierarquia de controle permitiria que os modelos musculares predissessem a força muscular in vivo e trabalhassem com mais precisão. Para entender a mecânica muscular in vivo, é necessária a investigação ex vivo da força e do trabalho muscular sob condições de deformação e carga variáveis dinamicamente semelhantes à locomoção in vivo. As trajetórias de deformação in vivo tipicamente exibem mudanças abruptas (isto é, transientes de deformação e velocidade) que surgem de interações entre ativação neural, cinemática musculoesquelética e cargas aplicadas pelo ambiente. O principal objetivo de nossa técnica "avatar" é investigar como os músculos funcionam durante mudanças abruptas na taxa de deformação e carga, quando a contribuição das propriedades mecânicas intrínsecas para a produção de força muscular pode ser maior. Na técnica "avatar", a abordagem tradicional de loop de trabalho é modificada usando trajetórias de deformação medidas in vivo e sinais eletromiográficos (EMG) de animais durante movimentos dinâmicos para conduzir músculos ex vivo através de múltiplos ciclos de alongamento-encurtamento. Esta abordagem é semelhante à técnica de loop de trabalho, exceto que as trajetórias de deformação in vivo são dimensionadas adequadamente e impostas aos músculos de camundongos ex vivo conectados a um servo motor. Essa técnica permite: (1) emular padrões in vivo de deformação, ativação, frequência de passada e loop de trabalho; (2) variar esses padrões para corresponder mais precisamente às respostas de força in vivo; e (3) variar características específicas de deformação e/ou ativação em combinações controladas para testar hipóteses mecanicistas.

Introduction

Animais em movimento alcançam feitos atléticos impressionantes de resistência, velocidade e agilidade em ambientes complexos. A locomoção animal é particularmente impressionante em contraste com as máquinas projetadas por humanos - a estabilidade e a agilidade de robôs, próteses e exoesqueletos com pernas atuais permanecem pobres em comparação com os animais. A locomoção com pernas em terrenos naturais requer controle preciso e ajustes rápidos para alterar a velocidade e manobrar características ambientais que atuam como perturbações inesperadas 1,2,3,4. No entanto, a compreensão da locomoção não constante é inerentemente desafiadora, pois a dinâmica depende de interações complexas entre o ambiente físico, a mecânica musculoesquelética e o controle sensório-motor 1,2. A locomoção das pernas requer resposta a perturbações inesperadas com rápido processamento multimodal das informações sensoriais e atuação coordenada dos membros e articulações 1,5. Em última análise, o movimento é possibilitado pela produção de força pelos músculos via propriedades mecânicas intrínsecas do sistema musculoesquelético e do controle neural 1,5,6,7. Uma questão pendente da neuromecânica é como esses fatores interagem para produzir movimento coordenado em resposta a perturbações inesperadas. A técnica a seguir utiliza a resposta mecânica intrínseca do músculo à deformação usando trajetórias de deformação in vivo durante experimentos ex vivo controláveis com um músculo "avatar".

A técnica de alça de trabalho muscular tem fornecido uma importante estrutura para a compreensão da mecânica muscular intrínseca durante movimentos cíclicos8,9,10. A técnica tradicional de loop de trabalho conduz os músculos através de trajetórias de tensão predefinidas, tipicamente sinusoidais, usando frequências e padrões de ativação medidos durante experimentos in vivo 2,8,9,11. O uso de trajetórias de comprimento senoidal pode estimar realisticamente o trabalho e a potência durante o voo12 e a natação2 em condições em que os animais não sofrem mudanças rápidas nas trajetórias de tensão devido à interação com o ambiente e à cinemática musculoesquelética. Entretanto, as trajetórias de estiramento muscular in vivo durante a locomoção das pernas surgem dinamicamente a partir de interações entre ativação neural, cinemática musculoesquelética e cargas aplicadas pelo ambiente5,7,13,14. Uma técnica de loop de trabalho mais realista é necessária para emular cargas, trajetórias de tensão e produção de força que corresponda à dinâmica músculo-tendão in vivo e forneça informações sobre como a mecânica muscular intrínseca e o controle neural interagem para produzir movimento coordenado diante de perturbações.

Aqui, apresentamos uma nova maneira de emular forças musculares in vivo durante a locomoção em esteira usando um músculo "avatar" de um roedor de laboratório durante experimentos ex vivo controlados com trajetórias de deformação in vivo que representam cargas in vivo variáveis no tempo. Usando as trajetórias de deformação medidas in vivo de um músculo alvo em músculos de um animal de laboratório durante experimentos ex vivo controlados, emularemos as cargas experimentadas durante a locomoção. Nos experimentos aqui descritos, o músculo extensor longo dos dedos (EDL) de camundongos ex vivo é utilizado como "avatar" do músculo gastrocnêmio medial (MG) de ratos in vivo durante a marcha, trote e galope em esteira rolante13. Esta abordagem é semelhante à técnica de loop de trabalho, exceto que as trajetórias de deformação in vivo são dimensionadas adequadamente e impostas aos músculos de camundongos ex vivo conectados a um servo motor. Embora os músculos EDL de camundongos difiram em tamanho, tipo de fibra e arquitetura em comparação com o MG de rato, é possível controlar essas diferenças. A técnica de "avatar" permite: (1) emular padrões in vivo de tensão, ativação, frequência de passada e loop de trabalho; (2) variar esses padrões para corresponder mais precisamente às respostas de força in vivo; e (3) variar características específicas de deformação e/ou ativação em combinações controladas para testar hipóteses mecanicistas.

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Protocol

Todos os estudos em animais foram aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Northern Arizona University. Músculos extensores longos dos dedos (EDL) de camundongos selvagens machos e fêmeas (cepa B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), com idade entre 60-280 dias, foram utilizados para o presente estudo. Os animais foram obtidos de uma fonte comercial (ver Tabela de Materiais) e estabelecidos em uma colônia na Northern Arizona University.

1. Selecção da trajectória de tensão in vivo e preparação para utilização durante experiências de ciclo de trabalho ex vivo

OBS: Neste protocolo, medidas prévias de locomoção dinâmica in vivo, fornecidas diretamente aos autores (Nicolai Konow, UMass Lowell, comunicação pessoal), foram utilizadas em experimentos ex vivo . Os dados originais foram coletados por Wakeling et al.15. Tempo, comprimento ou tensão, EMG/ativação e dados de força são necessários para replicar o protocolo.

  1. Segmente todo o teste in vivo em passos individuais usando qualquer plataforma de programação (código MATLab fornecido no Arquivo de Codificação Suplementar 1).
    1. Plotar as mudanças de comprimento vs. tempo para todo o ensaio in vivo . Isso é usado para visualizar os passos individuais (postura em relação à postura) e para avaliar a variabilidade entre os passos (Figura 1).
    2. Calcular deformação para todo o ensaio (Comprimento (L) /Força Isométrica Máxima no Comprimento Ótimo L0).
    3. Selecione uma passada de toda a prova que seja representativa de todas as passadas, e que comece e termine em comprimentos semelhantes. Isso pode ser feito visualmente, grafando os comprimentos uns sobre os outros para comparar cada passada.
    4. Depois que uma passada representativa for selecionada, segmente a tensão, EMG/ativação e force os dados de todo o teste usando qualquer plataforma de programação (consulte Arquivo de codificação suplementar 1 para obter os códigos usados no MATLab16).
    5. Se a frequência de amostragem diferir em relação à deformação, EMG/ativação ou força, interpole os pontos de dados de modo a que todos sejam amostrados com a mesma frequência.
      NOTA: Os pesquisadores podem determinar a frequência de captura com base nos intervalos de tempo entre cada ponto amostrado em todo o ensaio. Se as variáveis forem capturadas na mesma frequência, os tempos de amostragem serão os mesmos.
  2. Calcule a frequência de passadas segmentadas.
    1. Calcule a frequência determinando a duração de uma passada segmentada em segundos e dividindo 1 (segundo) pela duração (1/duração = # passadas por segundo).
    2. Determine manualmente quantos pontos de dados devem ser adquiridos em experimentos ex vivo para corresponder à frequência.
    3. Calcule o tempo necessário para duas passadas. Repita as passadas pelo menos uma vez para estimar o erro de medição dentro do músculo, que será necessário para a análise estatística subsequente.
  3. Determinar a fase da estimulação em relação à entrada de tensão usando a atividade EMG medida para determinar o início e a duração da estimulação para as malhas de trabalho ex vivo . Qualquer plataforma de programação pode ser usada (consulte Arquivo de codificação suplementar 1 para o código usado neste estudo).
    1. Visualize o sinal EMG na mesma faixa do eixo x (tempo) que a mudança de deformação (Figura 1). Ampliar o sinal EMG para ser visível; isso pode ser feito multiplicando o sinal EMG por um número arbitrário, reescalonando a deformação e EMG para que estejam na mesma escala e/ou adicionando o sinal EMG à deformação.
      NOTA: Os autores redimensionaram a deformação e a EMG para estarem na mesma escala usando a função "rescale" no MATLab (ver Figura Suplementar 1).
    2. Encontrar onde a atividade EMG começa e pára, como indicado por uma mudança na intensidade de dois desvios-padrão17,18.
      NOTA: Dependendo do animal e do músculo, o início da EMG pode ou não corresponder ao contato com o pé (Monica Daley, UC Irvine, comunicação pessoal) (consulte a seção Discussão).
    3. Calcule a porcentagem do ciclo de deformação (por exemplo, 40%) em que ocorre o início da ativação EMG e por quanto tempo a estimulação ocorrerá (por exemplo, 222 ms).
      NOTA: Os pesquisadores precisarão levar em conta um atraso de acoplamento excitação-contração (ECC) que difere entre os ciclos de movimento in vivo e de trabalho ex vivo e pode ser diferente para cada animal e músculo (por exemplo, ECC in vivo é de 24,5 ms para MG de rato, ECC ex vivo é de ~5 ms para EDL de camundongo).
  4. Preparar entradas de tensão representativas para o programa de controlador de malha de trabalho. Qualquer programa que possa capturar a saída de força com entrada para tensão e estimulação pode ser usado para o programa controlador de loop de trabalho (consulte a seção Discussão).
    1. Dê o passo seleccionado e interpole até ao número adequado de pontos necessários para que o passo seja capturado à frequência in vivo durante dois ciclos (ver passo 1.2).
    2. Redimensionar a passada para iniciar e parar em "tensão zero" (por exemplo, L 0 ou 95% L0) após o alongamento por uma excursão de comprimento pré-determinada (ver passo 3.3).
    3. "Escala" selecionou passo, se necessário, para usar como entrada para mudanças de tensão no EDL do mouse (consulte a seção Discussão). Para escalar, selecione uma excursão de comprimento para a qual o EDL do camundongo pode ser esticado sem danos (por exemplo, normalmente esticamos o EDL do camundongo em 10% L0 , independentemente da espécie in vivo ). Isto poderá ter de ser alterado com base nos resultados preliminares (ver passo 3.3).

Figure 1
Figura 1: Duração ao longo do tempo de todo o ensaio in vivo . Comprimento (mm) plotado contra o tempo de MG do rato. As passadas são demarcadas por círculos, do menor comprimento ao menor comprimento, considerados passo único. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

2. Avaliação da força isométrica máxima do músculo de camundongo ex vivo

  1. Montagem de equipamentos e cirurgia.
    NOTA: Consulte a seção Discussão para obter uma explicação do equipamento necessário para o ciclo de trabalho ex vivo .
    1. Prepare um banho de órgão de tecido inserindo a válvula de agulha de oxitubo no banho de tecido de camisa d'água (ver Tabela de Materiais). Conecte o oxitubo a um cilindro de gás com 95% 0 2-5% CO2. Deixe 20 psi para encher o banho de lenço de papel da camisa d'água.
    2. Preparar a área de cirurgia passando um oxitubo adicional da linha de gás para uma placa de cristalização preenchida com solução de Krebs-Henseleit (passo 2.1.3) perto da área de cirurgia. Este será utilizado para manter os músculos aerados e hidratados durante e após as cirurgias.
      NOTA: Os músculos também podem ser armazenados nesta solução aerada até 4 h, se mais de um músculo for retirado do rato de cada vez.
    3. Preparar 1 L de solução de Krebs-Henseleit contendo (em mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl 2 (2,54); e glicose (10,0) à temperatura ambiente e pH a 7,4 usando HCl e NaOH (ver Tabela de Materiais). Ao manusear HCl e NaOH, use os EPIs adequados de óculos e luvas.
    4. Encha o banho com solução de Krebs-Henseleit à temperatura ambiente e pH 7,4. Submergir completamente o músculo e o gancho na solução.
    5. Ligue todos os equipamentos; sistema de alavanca muscular de modo duplo, estimulador e interface de sinal (placa DAQ) (consulte Tabela de Materiais).
  2. Dissecção do músculo EDL.
    1. Anestesiar profundamente o camundongo e, em seguida, realizar a eutanásia por luxação cervical. Coloque o mouse em uma posição recumbente lateral direita ou esquerda com o membro posterior superior esticado e os dedos dos pés tocando a placa de dissecção. Remova o pelo do tornozelo para acima da articulação do joelho.
    2. Tenda a pele com pinça e corte da articulação do tornozelo para a área do quadril. Uma vez que o músculo tenha sido exposto, corte ao redor do tornozelo como uma "bainha" de calças. Puxe a pele para cima para expor os músculos das pernas com mais clareza.
    3. Localizar a linha da fáscia que separa o tibial anterior (TA) e o gastrocnêmio, separar com tesoura de dissecção para expor os tendões do joelho. Coloque uma tesoura de dissecção entre os dois tendões do joelho expostos. A tesoura vai "pegar" em um bolso logo abaixo dos tendões do joelho expostos. Blunt dissecar um "bolso" enquanto puxa a tesoura para longe da perna até que a tesoura atinja o tornozelo para expor o EDL.
    4. Usando um nó de alça pré-amarrado em sutura cirúrgica de seda tamanho 4-0 (ver Tabela de Materiais), amarre uma extremidade da sutura sob o tendão mais próximo do joelho. Amarre um nó duplo quadrado acima da junção músculo-tendão proximal sem colocá-lo sobre o músculo ou incluindo o tendão. Corte acima do nó. Puxe suavemente o laço amarrado ao tendão, e o EDL emergirá do "bolso".
    5. Tape o laço na área de dissecção para criar tensão no EDL. Amarre um nó quadrado duplo usando outro nó de alça pré-amarrado na junção músculo-tendão distal sem colocá-lo sobre o músculo ou incluindo o tendão. Corte o nó do lado mais próximo da perna para remover todo o EDL do mouse. Cortar a sutura extra longe dos nós duplos quadrados nas faces proximal e distal do músculo e colocar o músculo no banho aerado junto à área cirúrgica.
      NOTA: Certifique-se de observar qual lado é proximal e/ou distal se colocar o músculo em um banho aerado.
    6. Para colocar no equipamento de alavanca do servomotor, conecte o EDL verticalmente entre os eletrodos de platina suspensos. Fixar o nó da alça distal ao gancho estacionário e fixar o nó da alça proximal ao gancho preso ao braço servomotor. Elevar o banho de tecido para submergir o músculo na solução de Krebs-Henseleit aerada.
      NOTA: A aeração não deve perturbar o músculo quando este está submerso. Se isso acontecer, diminua a pressão do gás. Deixe o músculo se equilibrar por 10 minutos antes de iniciar a estimulação.
  3. Medir a força isométrica máxima do músculo EDL.
    NOTA: Consulte a Tabela 1 para o protocolo sobre como medir a força isométrica máxima usando contração e tétano. Veja a Figura Suplementar 1 para uma ilustração do programa usado pelos autores.
    1. Estimular o músculo com uma contração supramáxima para garantir que o músculo não tenha sido danificado durante a cirurgia (80 V, 1 pps, 1ms; Tabela 1; ver Figura Suplementar 2). Se nenhum dano tiver ocorrido, use o botão de comprimento no sistema de alavanca muscular para encontrar um comprimento muscular usando estimulação de contração em que a tensão ativa é ~1V / 0,1271 N com menos de ~0,1V / 0,01271N tensão passiva.
    2. Registrar o comprimento inicial do músculo desde o nó de sutura até o nó de sutura em Volts e milímetros. Medições de entrada na parte de calibração do programa para o comprimento inicial (ver Figura 1 Suplementar).
    3. Encontre força isométrica máxima de contração supramáxima no comprimento ótimo (L0) do EDL (Tabela 1). Nenhum período de descanso é tecnicamente necessário, mas esperar 1 min entre os estímulos estabilizará a tensão passiva. Registre o comprimento (em Volts) em que a contração supramáxima é máxima. Este é o comprimento ideal do músculo (L0) para contração.
    4. Meça o músculo com paquímetros neste comprimento. Meça o músculo do nó de sutura ao nó de sutura. Uma vez que L 0 foi encontrado, encurte o músculo de volta ao comprimento inicial (tensão ativa ~1V / 0,1271 N).
    5. Encontrar a força isométrica máxima do tétano supramáximo de EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabela 1). Registrar o comprimento (em Volts e milímetros) da força tetânica supramáxima em L0 e medir as fibras do nó de sutura ao nó de sutura novamente com paquímetro.
      NOTA: Aumentar o comprimento muscular em passos de 0,5 V/0,65 mm resultará em L0 mais preciso tanto para contração quanto para tétano.
    6. Encontre a força isométrica submáxima do EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabela 1) em L0 antes e após o experimento para garantir que não ocorresse fadiga a partir do protocolo de estimulação. Uma diminuição de 10% na força é considerada um músculo "fatigado".
Experimentar Intensidade da simulação (V) Frequência de Pulso (pps/Hz) Duração da estimulação (ms) Comentários
1. "Aquecimento" 80 1 1 Aumentar ou diminuir o comprimento em 0,50 V para encontrar tensão passiva de 1 V
2. Contração ideal do comprimento do músculo (L0) 80 1 1 Aumente ou diminua o comprimento em 0,50 V para encontrar tensão passiva de ~1 V
3. Tétano de comprimento muscular ideal (L0) 80 180 500 Descanse 3 min entre a mudança de comprimento por 0,50 V
4. Pré-experimento submáximo L0 45 110 500 No comprimento de L0
6. Experimentos de avatar 45 110 Ciclicamente usar mudanças representativas de comprimento para EDL de mouse
7. L0 submáximo pós-experimento 45 110 500 Retornar a L0 após o experimento e medir L0

Tabela 1: Protocolo de estimulação. Protocolo de estimulação para encontrar contração supramáxima e submáxima e comprimento ótimo do tétano. O protocolo varia de acordo com a intensidade da estimulação, o tempo e os pulsos por segundo.

3. Completando a técnica de loop de trabalho "avatar" usando trajetórias de tensão in vivo selecionadas

  1. Configure o software necessário para completar as técnicas de loop de trabalho "avatar" (consulte a Tabela de Materiais).
    NOTA: É necessário um ficheiro de introdução (.csv ou similar) que especifica o comprimento do músculo em cada passo de tempo (consulte o passo 1.4). São necessárias entradas para a percentagem do ciclo em que a estimulação se inicia e para a duração da estimulação (ver Figura 3 Suplementar , por exemplo).
  2. Técnica completa de loop de trabalho "avatar".
    NOTA: Enquanto usamos um programa LabView personalizado, os pesquisadores podem usar qualquer programa que permita o controle de mudanças de comprimento no EDL do mouse em uma alavanca servomotora, controle do início (% ciclo) e duração (ms) da estimulação em horários especificados e medição da força muscular. Consulte a Figura Suplementar 3 para obter uma ilustração do uso dos autores do programa.
    1. Carregue as alterações de deformação dimensionadas com excursão de comprimento dimensionado no programa a partir da etapa 1.4. Consulte as etapas 1.4, 3.3 e a seção Discussão para saber mais sobre "alterações de tensão dimensionadas".
    2. Ajustar o comprimento inicial do músculo, se necessário (ver secção 3.3). Insira o comprimento inicial em V e mm para calibrar os resultados (consulte a Figura 3 Suplementar).
    3. Use o início e a duração da estimulação calculados no passo 1.3.
    4. Execute o músculo através das mudanças de comprimento escalado com determinada excursão de comprimento por dois ciclos.
    5. Salve dados. Se vários protocolos de estimulação forem coletados no mesmo músculo, aguarde 3 min entre cada estimulação.
    6. Estimular na duração ideal (L0) usando ativação submáxima para determinar se ocorreu fadiga. Se a força diminui em mais de 10%, os músculos são considerados fatigados. Veja a Tabela 1 para os protocolos de estimulação.
    7. Retire o músculo do banho. Corte nós de laço do músculo e espalhe o excesso de solução do músculo. Pese o músculo. Determinar a área de secção transversa fisiológica usando a fórmula padrão: massa muscular/(L0*1,06)19.
  3. Ajuste parâmetros para a técnica de loop de trabalho "avatar" (consulte a seção Discussão).
    1. Determinar o comprimento inicial e a extensão da excursão combinando o aumento da tensão passiva ex vivo com o aumento da tensão passiva observado in vivo (Figura 2).
      NOTA: Este estudo utilizou a percentagem L 0 para dimensionar o comprimento inicial (mm) e a excursão (% L0; ver passo 1.4 e secção Discussão). Para igualar o aumento da tensão no EDL de camundongo ex vivo com o do MG de rato in vivo, os autores verificaram que o comprimento inicial em L0 produziu o melhor ajuste (Figura 2).
    2. Escolha três comprimentos iniciais (por exemplo, -5% L 0, L 0 e +5% L0). Execute o loop de trabalho "avatar" em cada um desses comprimentos iniciais com uma excursão de comprimento especificado (por exemplo, 10% L0).
      NOTA: No presente experimento "avatar" usando EDL de camundongo, uma excursão de comprimento de 10% L0 foi usada.
    3. Repetir com novos comprimentos de partida e/ou excursão até que a taxa de aumento da tensão passiva ex vivo seja semelhante à taxa de aumento da tensão passiva in vivo (ver figura 2B).
    4. Dependendo do tipo de fibra e da dinâmica de ativação dos músculos utilizados, aumente ou diminua a duração da estimulação para otimizar a correspondência entre a força ex vivo e in vivo . Assim, pode ser necessário alterar o início e/ou a duração da estimulação para melhor combinar a produção de força in vivo durante experimentos "avatar".
    5. Para decidir se isso é necessário (ver seção Discussão), plote a força ao longo do tempo do "avatar" e do músculo in vivo (Figura 3) e calcule o coeficiente de determinação R2 quadrado a correlação escalonada entre a força muscular alvo e "avatar" (ver Resultados representativos).

Figure 2
Figura 2: Elevação da tensão passiva correspondente. Malhas de trabalho mostrando o aumento in vivo e ex vivo da tensão passiva (setas). Loop de trabalho escalonado in vivo de ratos MG (preto) andando a 2,9 Hz (dados de Wakeling et al.15). Loops de trabalho escalonados ex vivo do EDL do rato (verde) a 2,9 Hz. (A) O comprimento inicial do músculo EDL do rato é de +5% L0. (B) O comprimento inicial do músculo EDL do rato é L0. Note que o aumento da tensão passiva ex vivo coincide com o aumento da tensão in vivo em A, mas não em B. Linhas mais grossas indicam estimulação. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 3
Figura 3: Otimização da duração da estimulação do EDL de camundongos para corresponder à força in vivo do MG do rato (linha preta). A força gerada pelo EDL do rato usando a estimulação baseada no EMG (linha tracejada verde) diminui mais cedo do que a força in vivo, provavelmente devido à desativação mais rápida do EDL do rato em comparação com o MG do rato. Para otimizar o ajuste entre as forças in vivo e ex vivo, o EDL de camundongos foi estimulado por uma maior duração (linha verde sólida). Estimulação EMG R 2 = 0,55, Estimulação otimizada R2 = 0,91. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Representative Results

O objetivo dos experimentos "avatar" é replicar a produção de força in vivo e a produção de trabalho o mais próximo possível durante experimentos de loop de trabalho ex vivo. Este estudo optou por utilizar EDL de camundongo como um "avatar" para MG de ratos porque EDL de camundongo e MG de rato são compostos principalmente por músculos de contração rápida20,21. Ambos os músculos são os principais motores da articulação do tornozelo (EDL tornozelo dorsiflexor, MG tornozelo flexor plantar) com ângulos de pennação semelhantes (EDL de camundongo 12,4 + 2,12°22, MG de rato 20° utilizado neste estudo15). Alças de trabalho representativas escalonadas de ratos MG15 foram comparadas com experimentos "avatar" ex vivo (Figura 4) usando dois protocolos de estimulação diferentes (um a partir da atividade EMG medida e outro otimizado como na etapa 3.3). Os valores de R 2 aqui apresentados foram calculados utilizando-se todo o ciclo de alongamento-encurtamento escalonado (2 ciclos/condição), sendo que cada ciclo apresentou mais de 2000 pontos correspondentes à velocidade locomotora (caminhada = 5521 pontos, trote = 5002, galope = 2502 pontos). As alças de trabalho foram dimensionadas para levar em conta as diferenças no tamanho muscular, P0 e PCSA. A escala foi feita por força de mapeamento linear e deformação em uma escala semelhante (0-1) para comparar MG de rato e EDL de camundongo. Visualmente, é aparente que a otimização do protocolo de estimulação (Figura 4B) para levar em conta as diferentes dinâmicas de ativação dos músculos EDL e MG de rato melhora o ajuste à força de MG de rato in vivo em comparação com a ativação baseada em EMG (ver seção Discussão). Para o EDL de camundongos, aproximadamente dobrar a duração da estimulação para trajetórias de esforço mais lentas (andar e trote) aumentou o R2 em 62% na marcha e 109% no trote. Para a trajetória de deformação mais rápida (galope), o aumento do tempo de estimulação pela metade do tempo observado aumentou o R2 em 22%.

Figure 4
Figura 4: Comparação dos circuitos de trabalho in vivo e ex vivo. Loops de trabalho de MG (preto) e EDL de camundongo ex vivo (verde) de camundongo in vivo durante a marcha (2,9Hz) usando trajetórias de deformação in vivo. A linha mais espessa indica estimulação em loops de trabalho in vivo e ex vivo. (A) Malha de trabalho de MG (preto) e EDL de camundongo ex vivo (verde tracejado) de camundongo in vivo durante a marcha usando protocolo de estimulação baseado em EMG. (B) Malha de trabalho de MG (preto) e EDL de camundongo ex vivo (verde sólido) de camundongo in vivo durante a marcha (2,9Hz) utilizando estimulação otimizada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Alto R2 entre a produção de força ex vivo de EDL de camundongos e a produção de força in vivo do gastrocnêmio medial (MG)15 de ratos indica boa replicação (Figura 5). Em experimentos de estimulação EMG, os valores médios de R2 foram 0,535, 0,428 e 0,77 para caminhada, trote e galope, respectivamente. Em experimentos de estimulação otimizada, os valores médios de R2 foram 0,872, 0,895 e 0,936 em caminhada, trote e galope, respectivamente. Como discutido anteriormente (passo 3.3, Figura 5), dependendo da dinâmica de ativação dos músculos utilizados, o protocolo de estimulação também pode precisar ser otimizado. A predição da força de MG in vivo usando EDL de camundongo ex vivo foi melhorada em todas as velocidades locomotoras, otimizando a estimulação, aumentando o R2 (Figura 5A,B) e diminuindo o erro quadrático médio (RMSE). O RMSE diminuiu após a otimização para todas as velocidades (Figura 6). A média do RMSE para estimulação EMG foi de 0,31, 0,43 e 0,158 para caminhada, trote e galope. A média do RMSE para estimulação otimizada foi de 0,181, 0,116, 0,101 para caminhada, trote e galope.

Figure 5
Figura 5: R 2 Valores para a produção de força in vivo e ex vivo: Gráfico de caixa e whisker dos valores de R2 para comparações de forças in vivo e ex vivo. Observações individuais plotadas, mediana, percentil 25 e 75indicaram. (A) Valores de R 2 para produção de força in vivo e ex vivo utilizando protocolo de estimulação baseado no sinal EMG in vivo medido durante caminhada a 2,9 Hz (verde), trote a 3,2 Hz (magenta) e galope a 6,2 Hz (ciano). (B) Valores de R 2 para a produção de força in vivo e ex vivo utilizando estimulação otimizada (ver figura 2). A otimização do início e da duração da estimulação aumentou o R2 para todas as marchas. Estimulação EMG: caminhada R 2 = 0,50-0,55, trote R2 = 0,37-0,47, galope R2= 0,62-0,90; estimulação otimizada: caminhada R 2 = 0,74-0,93, trote R 2 = 0,85-0,92, galope R2 = 0,87-0,97. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 6
Figura 6: Erro quadrático médio (RMSE) para a produção de força in vivo e ex vivo. Gráfico de caixa e whisker dos valores de RMSE para comparações de forças in vivo e ex vivo. Observações individuais plotadas, mediana, percentil 25 e 75indicaram. (A) Valores de RMSE para produção de força in vivo e ex vivo usando protocolo de estimulação baseado em EMG. (B) Valores de RMSE para in vivo e ex vivo usando protocolo de estimulação otimizado. A otimização do início e da duração da estimulação reduziu a EMRM para todas as marchas. Andar a 2,9 Hz (verde), trote a 3,2 Hz (magenta) e galope a 6,4 Hz (ciano). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Para testar o desempenho dos métodos tradicionais de malha de trabalho na predição de forças musculares in vivo, alças de trabalho sinusoidais também foram realizadas para o EDL de camundongos na mesma frequência, comprimento de excursão, comprimento inicial, início de estimulação e duração que para os experimentos "avatar" usando trajetórias in vivo de cepas MG de ratos. Os valores de R2 foram significativamente menores do que para as trajetórias de tensão in vivo para ambos os protocolos de estimulação baseados em EMG e otimizados (Figura 7). Os valores médios de R2 para estimulação EMG usando trajetórias de comprimento sinusoidal foram 0,062, 0,067 e 0,141 nas frequências de caminhada, trote e galope. Os valores médios de R2 para estimulação otimizada usando trajetórias de comprimento senoidal foram 0,09, 0,067 e 0,141 nas frequências de caminhada, trote e galope.

Figure 7
Figura 7: R2 Valores para a produção de força in vivo e ex vivo utilizando alterações do comprimento senoidal. Gráfico de caixa e whisker dos valores de RMSE para comparações de forças in vivo e ex vivo. Observações individuais plotadas, mediana, percentil 25 e 75indicaram. Valores de R 2 para caminhada (verde, 2,9 Hz), trote (magenta, 3,2 Hz) e galope (ciano,6,2 Hz) usando mudanças de comprimento senoidal com protocolos de estimulação baseados em EMG (translúcido) e otimizado (opaco). Tanto para a estimulação EMG quanto para a estimulação otimizada, os valores de R2 foram menores para as mudanças de comprimento senoidal do que para as mudanças de comprimento in vivo. Estimulação EMG: caminhada R 2 = 0,00 - 0,30, trote R2 = 0,00 - 0,02, galope R2= 0,03 - 0,07; estimulação otimizada: marcha R 2 = 0,02 - 0,21, trote R 2 = 0,02 - 0,12, galope R2 = 0,12 - 0,17. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

As alças de trabalho produzidas pelo músculo EDL ex vivo de camundongos usando trajetórias de comprimento senoidal não emulam com tanta precisão a força de MG de ratos in vivo em comparação com as trajetórias de deformação in vivo (Figura 8). A mudança no trabalho produzido pelas trajetórias de deformação senoidal vs. in vivo pode ser explicada pela ausência de transientes de deformação e velocidade na trajetória senoidal (Figura 9). Enquanto os músculos foram estimulados em comprimentos semelhantes durante a fase de encurtamento ativo das contrações em ambas as trajetórias sinusoidais e trajetórias de tensão in vivo, o início da estimulação ocorreu em diferentes fases do ciclo (por exemplo, o início da estimulação ocorreu em uma fase de 74% para estimulação baseada em EMG de trote, mas em uma fase de 43% para estimulação baseada em EMG de caminhada; ver seção Discussão).

Figure 8
Figura 8: Comparação das malhas de trabalho senoidal in vivo e ex vivo. (A) Malha de trabalho in vivo (preto) de MG de rato e loop de trabalho ex vivo (magenta tracejado) de EDL de camundongo usando trajetória de deformação senoidal e estimulação baseada em EMG. (B) Malha de trabalho in vivo (preto) de MG de rato e loop de trabalho ex vivo (magenta sólido) de EDL de camundongo usando trajetória de deformação senoidal e estimulação otimizada. Note-se que as alças de trabalho senoidal superestimam o trabalho in vivo devido à ausência de transientes de deformação e velocidade na trajetória senoidal. Estimulação EMG baseada em R 2 = 0,0003, estimulação otimizada R2 = 0,084. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 9
Figura 9: Comparação das trajetórias in vivo da cepa e do comprimento senoidal ex vivo. Comparação das trajetórias in vivo da cepa e do comprimento senoidal ex vivo em caminhada (verde), trote (magenta) e galope (azul). A linha sólida é a trajetória de deformação in vivo. Trajetória do comprimento senoidal ex vivo da linha tracejada. A parte destacada é a estimulação. A estimulação iniciou-se na mesma duração durante a fase de encurtamento da passada. Setas indicando transientes de deformação e velocidade. Desvios do sinusoidal são impedância de forças externas no músculo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura suplementar 1: Programa utilizado para coletar força máxima isométrica no comprimento ideal. O programa utilizado para determinar o comprimento ideal durante a contração supramáxima e submáxima e estimulação tetânica. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura suplementar 2: Resposta de contração viável. Resposta de contração do EDL do rato. A força de contração sobe e desce rapidamente e deve atingir tensão ativa de ~1 V. O "ruído" deve ser mínimo após o pico de tensão ativa ter sido atingido. Clique aqui para baixar este arquivo.

Figura Suplementar 3: Programa usado para coletar dados de malha de trabalho. O programa utilizado para controlar o comprimento muscular e o tempo de estimulação em malhas de trabalho ex vivo . Clique aqui para baixar este arquivo.

Arquivo de codificação suplementar 1: código MATLab usado para segmentar e criar um protocolo experimental para o loop de trabalho. Código MATLab que foi usado para segmentar as informações da etapa de destino (comprimento, ativação EMG e força) em passadas individuais. O código inclui dimensionamento e interpolação de etapas do animal alvo em comprimentos que o EDL de mouse ex vivo pode esticar. Além disso, inclui código para suavizar o sinal EMG e comparar a ativação para selecionar o início e a duração da estimulação em experimentos de loop de trabalho ex vivo . Clique aqui para baixar este arquivo.

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Discussion

Enquanto os organismos se movem perfeitamente através das paisagens, as cargas e tensões subjacentes que os músculos experimentam variam drasticamente 1,6,23. Tanto na locomoção in vivo 1,24 quanto em experimentos "avatar", os músculos são estimulados submaximamente sob condições cíclicas e não estáveis. As relações força-comprimento isométrico e força-velocidade isotônica não são adequadas para predizer a força muscular nessascondições2. A compreensão dos efeitos da deformação não constante (isto é, transientes) e do carregamento é essencial para prever a produção de força durante o movimento in vivo e, portanto, é a principal justificativa para o desenvolvimento desses experimentos "avatares"2. Os experimentos de "avatar" nos permitem controlar a carga muscular e as trajetórias de tensão enquanto medimos a produção de força. A técnica do "avatar" investiga a resposta de força dos músculos em condições in vivo, sem confundir fatores de controle neural e complacência tendínea. Para realizar os experimentos "avatar", os pesquisadores precisarão de um programa que permita que um músculo passe por mudanças de comprimento prescritas com a capacidade de estimular em diferentes comprimentos iniciais e por durações variadas (veja a Figura Suplementar 3 para o programa que os autores usam). Os pesquisadores precisam especificar o comprimento muscular inicial (mm), o comprimento da excursão (mm), o início da estimulação (% da duração do ciclo) e a duração da estimulação (ms) antes de fazer experimentos (ver passos 1.3-1.4para obter valores para esses parâmetros). Em geral, muitas vezes é desejável selecionar passadas que sejam representativas de todas as passadas no ensaio (por exemplo, começar e terminar em um comprimento semelhante, atingir um pico de força semelhante, ter atividade média de EMG, etc.). Determinar se os dados de EMG/ativação e força de uma passada selecionada são representativos de outras passadas no mesmo ensaio pode ser útil para "ajuste" mais tarde, o que pode ser feito plotando loops de trabalho (força versus comprimento) de todo o ensaio usando o músculo do animal alvo. Durante a locomoção bípede e quadrúpede, o comprimento mais curto para o comprimento mais curto geralmente demarca uma passada inteira (dedo do pé para fora), mas a ativação EMG pode variar. Em alguns animais e músculos, a ativação EMG está intimamente correlacionada com o contato com o pé, como o MG de rato mostrado aqui22. Em outros animais, como o gastrocnêmio lateral da pintada, a ativação EMG geralmente ocorre no maior comprimento para obter maior estabilidade durante terrenosdesconhecidos 25.

Para realizar experimentos de "avatar", é importante minimizar o ruído nos dados de força ex vivo . As medidas de força são sensíveis a várias questões, incluindo, mas não se limitando a, ruptura dos músculos durante a cirurgia, complacência das suturas se os nós de alça forem muito longos, descamação inadequada das entradas de comprimento e excursão e fadiga muscular. A ruptura dos músculos ocorre frequentemente ao "dissecar a bolsa" (passo 2.2.3) e amarrar o nó da alça em torno da porção proximal do tendão (passo 2.2.4). Ao "dissecar a bolsa", manter a tesoura de dissecção plana e horizontal ao músculo evitará que as pontas cortem o EDL. Além disso, puxar a tesoura de dissecção para longe e distalmente enquanto disseca romba também limitará o contato entre a tesoura de dissecção e os músculos EDL. Além disso, os músculos devem ser mantidos úmidos com solução de Krebs-Henseliet durante o preparo da cirurgia e ao serem usados na plataforma.

Dimensionar corretamente as entradas de comprimento é mais complicado. A força muscular passiva e ativa pode ser afetada se o comprimento inicial e/ou a excursão não forem dimensionados adequadamente. O aumento ex vivo da tensão passiva deve corresponder ao aumento in vivo da tensão passiva (ver figura 1). Um problema de escala que foi observado em experimentos anteriores é que tanto a tensão passiva quanto a ativa podem ser afetadas se a excursão de comprimento (comprimento inicial para comprimento mais longo) for muito pequena ou muito grande. Teoricamente, os músculos deveriam atingir o pico de força próximo ao seu comprimento ideal (L 0)26, razão pela qual usamos o comprimento ideal (L0) para dimensionar comprimentos musculares in vivo em experimentos ex vivo de "avatar" para replicar com precisão a produção de força in vivo. Diferenças arquitetônicas entre os músculos desempenharão um papel na determinação do comprimento inicial e parâmetros de excursão de comprimento. Embora o comprimento ótimo (L0) seja encontrado durante condições isotônicas e isométricas supramaximamente estimuladas, usá-lo como uma métrica de escala em experimentos de "avatar" pode potencialmente destacar limitações das relações força-comprimento e força-velocidade durante o movimento cíclico que precisam de mais investigação. Na maioria das condições de estado estacionário, o comprimento, a velocidade e a ativação instantânea do músculo (i.e., propriedades força-comprimento e força-velocidade) podem ser usados para predizer a força e o débito de trabalho com razoável precisão 12,24,27. Em condições dinâmicas com carga variável, a força aumenta em função da velocidade28 e tem uma relação complexa com deformação e ativação29,30. Isso contradiz as propriedades isotônicas força-velocidade e força-comprimento isométrica dos músculos28. No GM do rato, transientes de tensão e velocidade são evidências de carga, como contato com o pé ou interação com o ambiente (i.e., terreno acidentado, vento, mudança brusca de direção para evitar predação) (Figura 9). Essas trajetórias de deformação de MG em ratos, como a maioria das condições realistas, apresentam mudanças bruscas na carga aplicada, na produção de força e na produção de trabalho 2,28. Este método experimental visa destacar essas complexas interações entre deformação, velocidade e dinâmica de ativação sob condições in vivo que não são bem explicadas pelas relações força-comprimento e força-velocidade tradicionais.

Outros problemas podem ocorrer quando o comprimento inicial do músculo é muito curto ou longo. Um comprimento de partida demasiado curto resultará numa taxa reduzida de aumento da tensão durante o estiramento passivo e activo (não mostrado), ao passo que um comprimento de partida demasiado longo resultará numa taxa aumentada de aumento da tensão passiva (ver Figura 1B). Usar a proporção de tensão ativa para passiva pode ser útil. Por exemplo, na MG de ratos, a tensão passiva (N) é geralmente em torno da metade da tensão ativa (Figura 2). Se um músculo começa com um comprimento muito longo e/ou é esticado para um comprimento muito longo, a tensão passiva pode ser muito alta em relação à tensão ativa (ver Figura 1B), e a força pode diminuir rapidamente devido ao alongamento excessivo. Além disso, alongar até um comprimento muito longo potencialmente danificará o músculo e pode causar fadiga muscular mais rapidamente. Além disso, a tensão ativa pode aparecer não fundida se o comprimento inicial for muito curto e/ou se o músculo não for esticado para um comprimento suficientemente longo.

Experimentos preliminares são necessários para determinar o comprimento inicial e a excursão com base em L0. Experimentos preliminares adicionais podem ser necessários para ajustar a duração da estimulação se a dinâmica de ativação dos músculos utilizados for diferente. Essas otimizações são necessárias porque o tipo de fibra, composição e/ou dinâmica de ativação dos músculos in vivo e ex vivo podem ser diferentes. Em nossos resultados representativos (Figura 4 e Figura 5), usamos dois protocolos de estimulação para EDL de camundongos durante experimentos ex vivo para replicar in vivo a produção de força de MG em ratos. Para otimizar a produção de força no EDL de camundongos para melhor ajuste in vivo da MG de ratos, a duração da estimulação foi aumentada (Figura 2 e Figura 3). O camundongo MG é composto por tipos de fibras mais lentos que o EDLde camundongo 31,32,33. Isso ficou evidente em experimentos "avatar" porque os músculos EDL de camundongos ex vivo produziram força mais rapidamente após a excitação, e a força diminuiu a uma taxa mais rápida após a desativação do que a observada in vivo no rato MG15 (Figura 2), mesmo depois de contabilizadas as diferenças de atraso de excitação-contração entre as condições in vivo e ex vivo 34. Dependendo dos músculos-alvo ex vivo e in vivo, a otimização da estimulação pode ser necessária em outros experimentos de "avatar" também. Os músculos EDL ou sóleo (SOL) de camundongo podem ser usados nesta técnica de loop de trabalho ex vivo. EDL foi escolhido como um "avatar" para o GM do rato devido às semelhanças no tipo de fibra muscular e estrutura de pennação. É possível que alguns músculos tenham uma estrutura complexa e não possam ser emulados usando músculos de roedores de laboratório como um "avatar".

Embora os experimentos de "avatar" precisem de alguma otimização manual para melhor replicar a produção de força in vivo, a técnica é aplicável a uma variedade de diferentes animais e modos locomotores. A técnica de "avatar" pode ser especialmente útil para entender a produção de força in vivo em animais cujos músculos são muito grandes ou inacessíveis para experimentos ex vivo. Embora apenas trabalhos preliminares tenham sido realizados em animais maiores35, este trabalho mostrou potencial para a aplicabilidade dessa técnica em animais, músculos e marcha locomotora usando camundongos de laboratório como "avatares". A utilidade dos experimentos de "avatar" depende da precisão com que um modelo de roedor de laboratório conveniente, barato, prontamente disponível e bem caracterizado (i.e., EDL de camundongo) pode ser usado para entender a mecânica in vivo de diferentes músculos de diferentes espécies de vertebrados. Resultados de experimentos preliminares de "avatar" apresentados aqui (ratos MG) e em outros lugares (galinha-da-guiné LG19), sugerem que esta técnica pode ser usada para prever com precisão forças in vivo e pode ser aplicada a outros animais. Aplicações futuras deste método devem expandir os tipos de músculos e animais que têm sido usados como alvos e "avatar" durante experimentos ex vivo e in vitro. Experimentos em "avatar" permitem examinar fatores que afetam a força muscular e o débito de trabalho durante a locomoção in vivo, quando a carga e o estiramento muscular variam abruptamente 1,2,19. Especificamente, o método "avatar" nos permite examinar os efeitos dos transientes de tensão e velocidade sobre a força muscular que não são capturados por modelos musculares tradicionais ou experimentos de loop de trabalho senoidal.

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Disclosures

Todos os autores reconhecem a inexistência de conflitos de interesse.

Acknowledgments

Agradecemos ao Dr. Nicolai Konow por fornecer os dados utilizados neste estudo. Financiado pela NSF IOS-2016049 e NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

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"Avatar", um loop de trabalho <em></em> ex vivo modificado usando tensão e ativação <em>in vivo</em>
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Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

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