Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

"אווטאר", ניסויי לולאת עבודה Ex vivo שונה באמצעות זן והפעלה in vivo

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

מאמר זה מפרט את המתודולוגיה לחיקוי ייצור כוח שריר in vivo במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo באמצעות שריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה כדי להעריך את תרומתם של מעברי מתח והפעלה לתגובת כוח השריר.

Abstract

התנהגויות תנועתיות הן תכונות מתפתחות של מערכות דינמיות הנובעות מייצור כוח שריר ותפוקת עבודה. יחסי הגומלין בין מערכות עצביות ומכניות מתרחשים בכל רמות הארגון הביולוגי במקביל, החל מכוונון תכונות שרירי הרגליים בזמן ריצה ועד לדינמיקה של הגפיים המתקשרות עם הקרקע. הבנת התנאים שבהם בעלי חיים משנים את אסטרטגיות הבקרה העצבית שלהם לעבר מכניקת שרירים פנימית ("preflexes") בהיררכיית הבקרה תאפשר למודלים של שרירים לחזות כוח שריר in vivo ולעבוד בצורה מדויקת יותר. כדי להבין את מכניקת השרירים in vivo, נדרשת חקירה ex vivo של כוח שריר ועבודה בתנאי מאמץ ועומס משתנים באופן דינמי הדומים לתנועה in vivo. מסלולי מתח in vivo מציגים בדרך כלל שינויים פתאומיים (כלומר, מעברי מאמץ ומהירות) הנובעים מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה. המטרה העיקרית של טכניקת ה"אווטאר" שלנו היא לחקור כיצד השרירים מתפקדים במהלך שינויים פתאומיים בקצב המאמץ ובהעמסה, כאשר התרומה של תכונות מכניות פנימיות לייצור כוח שריר עשויה להיות הגבוהה ביותר. בטכניקת ה"אווטאר", הגישה המסורתית של לולאת עבודה משתנה באמצעות מסלולי מאמץ נמדדים in vivo ואותות אלקטרומיוגרפיים (EMG) מבעלי חיים במהלך תנועות דינמיות כדי להניע את שרירי ex vivo דרך מחזורי קיצור מתיחה מרובים. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי מאמץ in vivo מותאמים ומוטלים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. טכניקה זו מאפשרת: (1) לחקות זן in vivo, הפעלה, תדירות צעדים, ודפוסי לולאת עבודה; (2) לשנות דפוסים אלה כך שיתאימו לתגובות כוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות תכונות ספציפיות של מאמץ ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

Introduction

בעלי חיים נעים משיגים הישגים ספורטיביים מרשימים של סיבולת, מהירות וזריזות בסביבות מורכבות. תנועת בעלי חיים מרשימה במיוחד בניגוד למכונות מהונדסות-אדם - היציבות והזריזות של רובוטים, תותבות ושלד חיצוני בעלי רגליים נוכחיות נותרו דלות בהשוואה לבעלי חיים. תנועה רגלית בשטח טבעי דורשת שליטה מדויקת והתאמות מהירות כדי לשנות את המהירות ולתמרן תכונות סביבתיות הפועלות כהפרעות בלתי צפויות 1,2,3,4. עם זאת, הבנת תנועה לא יציבה היא מאתגרת מטבעה מכיוון שהדינמיקה תלויה באינטראקציות מורכבות בין הסביבה הפיזית, מכניקת השלד והשרירים והשליטה הסנסומוטורית 1,2. תנועה ברגל דורשת תגובה להפרעות בלתי צפויות עם עיבוד רב-מודאלי מהיר של מידע חושי והפעלה מתואמת של הגפיים והמפרקים 1,5. בסופו של דבר, התנועה מתאפשרת על ידי שרירים המייצרים כוח באמצעות תכונות מכניות פנימיות של מערכת השלד והשרירים, כמו גם משליטה עצבית 1,5,6,7. שאלה בולטת של נוירומכניקה היא כיצד גורמים אלה מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת בתגובה להפרעות בלתי צפויות. הטכניקה הבאה משתמשת בתגובה המכנית הפנימית של השריר לעיוות באמצעות מסלולי מאמץ in vivo במהלך ניסויים נשלטים של ex vivo עם שריר "אווטאר".

טכניקת לולאת העבודה על השרירים סיפקה מסגרת חשובה להבנת מכניקת השרירים הפנימית במהלך תנועות מחזוריות 8,9,10. טכניקת לולאת העבודה המסורתית מניעה שרירים דרך מסלולי מאמץ מוגדרים מראש, בדרך כלל סינוסואידליים, באמצעות תדרים ודפוסי הפעלה שנמדדו במהלך ניסויי in vivo 2,8,9,11. שימוש במסלולי אורך סינוסואידים יכול להעריך באופן מציאותי את תפוקת העבודה והכוח במהלך טיסה12 ושחייה2 בתנאים בהם בעלי חיים אינם עוברים שינויים מהירים במסלולי המאמץ עקב אינטראקציה עם הסביבה וקינמטיקה של שרירים ושלד. עם זאת, מסלולי מאמץ שרירי in vivo במהלך תנועת רגליים נובעים באופן דינמי מאינטראקציות בין הפעלה עצבית, קינמטיקה של שרירים ושלד ועומסים המופעלים על ידי הסביבה 5,7,13,14. יש צורך בטכניקת לולאת עבודה מציאותית יותר כדי לחקות עומסים, מסלולי מאמץ וייצור כוח המתאימים לדינמיקה בין שריר לגיד in vivo ומספקים תובנה כיצד מכניקת שרירים פנימית ושליטה עצבית מתקשרים כדי לייצר תנועה מתואמת לנוכח הפרעות.

כאן, אנו מציגים דרך חדשנית לחקות כוחות שריר in vivo במהלך תנועת הליכון באמצעות שריר "אווטאר" ממכרסם מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים של ex vivo עם מסלולי זן in vivo המייצגים עומסי vivo משתנים בזמן. שימוש במסלולי המאמץ הנמדדים in vivo משריר מטרה על שרירים מחיית מעבדה במהלך ניסויים מבוקרים של ex vivo יחקה עומסים שנחוו במהלך תנועה. בניסויים המתוארים כאן, שריר Extensor digitorum longus (EDL) עכבר ex vivo משמש כ"אווטאר" עבור שריר הגסטרוקנמיוס המדיאלי של חולדה in vivo (MG) במהלך הליכה, הליכה ודהירה על הליכון13. גישה זו דומה לטכניקת לולאת העבודה, אלא שמסלולי מאמץ in vivo מותאמים ומוטלים על שרירי עכבר ex vivo המחוברים למנוע סרוו. בעוד שרירי EDL של עכבר שונים בגודל, סוג הסיב והארכיטקטורה בהשוואה לעכברוש MG, ניתן לשלוט בהבדלים אלה. טכניקת ה"אווטאר" מאפשרת לאדם: (1) לחקות מתח in vivo, הפעלה, תדירות צעדים ותבניות לולאת עבודה; (2) לשנות דפוסים אלה כך שיתאימו לתגובות כוח in vivo בצורה המדויקת ביותר; ו-(3) לשנות תכונות ספציפיות של מאמץ ו/או הפעלה בשילובים מבוקרים כדי לבחון השערות מכניסטיות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

כל המחקרים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת צפון אריזונה. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשרירי Extensor digitorum longus (EDL) מעכברי בר זכרים ונקבות (זן B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), בגילאי 60-280 ימים. בעלי החיים נלקחו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים), והוקמו במושבה באוניברסיטת צפון אריזונה.

1. בחירת מסלול זן in vivo והכנה לשימוש במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo

הערה: בפרוטוקול זה, מדידות קודמות מתנועה דינמית in vivo , שסופקו ישירות למחברים (Nicolai Konow, UMass Lowell, תקשורת אישית), שימשו בניסויים ex vivo . הנתונים המקוריים נאספו עבור Wakeling et al.15. זמן, אורך או מתח, EMG/הפעלה ונתוני כוח נדרשים כדי לשכפל את הפרוטוקול.

  1. חלק את כל גירסת הניסיון in vivo לצעדים בודדים באמצעות כל פלטפורמת תכנות (קוד MATLab מסופק בקובץ קידוד Suplementary 1).
    1. עלילה האורך משתנה לעומת זמן לכל משפט in vivo . זה משמש כדי להמחיש צעדים בודדים (עמדה לעמידה) ולהעריך שונות בין צעדים (איור 1).
    2. חשב מאמץ עבור כל תקופת הניסיון (אורך (L) / כוח איזומטרי מרבי באורך אופטימלי L0).
    3. בחר פסיעה מגירסת הניסיון כולה המייצגת את כל הצעדים, שמתחילה ומסתיימת באורכים דומים. ניתן לעשות זאת באופן חזותי על ידי גרפים של האורכים זה על גבי זה כדי להשוות כל צעד.
    4. לאחר בחירת צעד מייצג, פלח את המתח, EMG/הפעלה וכפה נתונים מכל גירסת הניסיון באמצעות כל פלטפורמת תכנות (ראה קובץ קידוד משלים 1 עבור הקודים המשמשים ב- MATLab16).
    5. אם תדירות הדגימה שונה עבור זן, EMG/הפעלה או כוח, בצע אינטרפולציה של נקודות הנתונים כך שכולם יידגמו באותה תדירות.
      הערה: חוקרים יכולים לקבוע את תדירות הלכידה בהתבסס על מרווחי הזמן בין כל נקודה שנדגמה בניסוי כולו. אם משתנים נלכדים באותה תדירות, זמני הדגימה יהיו זהים.
  2. חשב את תדירות הצעדים המקוטעים.
    1. חשב את התדירות על ידי קביעת משך הצעד המקוטע בשניות וחלוקת 1 (שנייה) במשך (1/משך = # צעדים לשנייה).
    2. קבע באופן ידני כמה נקודות נתונים יש לרכוש בניסויי ex vivo כדי להתאים לתדירות.
    3. חשב את הזמן הדרוש לשני צעדים. חזור על הצעדים לפחות פעם אחת לצורך אומדן בתוך טעות מדידת שריר, שתידרש לניתוח סטטיסטי לאחר מכן.
  3. קבע את שלב הגירוי ביחס לקלט המאמץ באמצעות פעילות EMG הנמדדת כדי לקבוע את תחילת ומשך הגירוי עבור לולאות העבודה ex vivo . ניתן להשתמש בכל פלטפורמת תכנות (ראה קובץ קידוד משלים 1 עבור הקוד המשמש במחקר זה).
    1. צפו באות EMG על אותו טווח (זמן) של ציר X כמו שינוי מאמץ (איור 1). הגדל את אות ה- EMG כך שיהיה גלוי; ניתן לעשות זאת על ידי הכפלת אות ה- EMG במספר שרירותי, שינוי קנה המידה של הזן וה- EMG כך שיהיו באותו קנה מידה, ו / או הוספת אות ה- EMG למתח.
      הערה: המחברים שינו את קנה המידה של הזן וה-EMG כך שיהיו באותו קנה מידה באמצעות פונקציית "קנה מידה מחדש" ב-MATLab (ראו איור משלים 1).
    2. מצא היכן פעילות EMG מתחילה ונפסקת, כפי שמצוין על ידי שינוי בעוצמה של שתי סטיות תקן17,18.
      הערה: בהתאם לבעל החיים ולשריר, הופעת EMG עשויה להתאים או לא להתאים למגע ברגל (מוניקה דיילי, UC אירווין, תקשורת אישית) (ראה סעיף דיון).
    3. חשב את אחוז מחזור המאמץ (למשל, 40%) שבו מתרחשת הפעלת EMG ולמשך כמה זמן יתרחש הגירוי (למשל, 222 אלפיות השנייה).
      הערה: החוקרים יצטרכו לקחת בחשבון עיכוב צימוד עירור-התכווצות (ECC) השונה בין תנועת in vivo לבין לולאות עבודה ex vivo ועשוי להיות שונה עבור כל חיה ושריר (למשל, in vivo ECC הוא 24.5 ms עבור חולדה MG, ex vivo ECC הוא ~ 5 ms עבור EDL עכבר).
  4. הכן תשומות מאמץ מייצגות עבור תוכנית בקר לולאת העבודה. כל תוכנית שיכולה ללכוד פלט כוח עם קלט למאמץ וגירוי יכולה לשמש לתוכנית בקר לולאת העבודה (ראה סעיף דיון).
    1. קח את הצעד שנבחר ובצע אינטרפולציה למספר הנקודות המתאים הדרוש כדי שהצעד יילכד בתדירות in vivo במשך שני מחזורים (ראה שלב 1.2).
    2. שנה את קנה המידה של הצעד כדי להתחיל ועצור ב"מתח אפס" (למשל, L 0 או 95% L0) לאחר מתיחה בטיול אורך שנקבע מראש (ראה שלב 3.3).
    3. "קנה מידה" בחר צעד, במידת הצורך, לשימוש כקלט לשינויי מאמץ ב- EDL של העכבר (ראה סעיף דיון). כדי לשנות את קנה המידה, בחר טווח אורך שאליו ניתן למתוח את EDL העכבר ללא נזק (לדוגמה, אנו בדרך כלל מותחים את העכבר EDL ב -10% L0 ללא קשר למין in vivo ). ייתכן שיהיה צורך לשנות זאת בהתבסס על תוצאות ראשוניות (ראה שלב 3.3).

Figure 1
איור 1: אורך לאורך זמן של ניסוי in vivo שלם. אורך (מ"מ) משורטט כנגד הזמן של חולדה MG. צעדים מתוחמים על ידי מעגלים, מהאורך הקצר ביותר לאורך הקצר ביותר, נחשב צעד יחיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

2. הערכת הכוח האיזומטרי המרבי של שריר העכבר ex vivo

  1. הגדרת ציוד וניתוח.
    הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת הסבר על הציוד הדרוש ללולאת העבודה ex vivo .
    1. הכינו אמבט רקמות-איבר על ידי החדרת שסתום מחט האוקסיטיוב לאמבט רקמת מעיל המים (ראו טבלת חומרים). חבר את צינור האוקסי לבלון גז עם 95% 0 2-5% CO2. אפשר 20 psi למלא את אמבט רקמות מעיל המים.
    2. הכינו את אזור הניתוח על ידי הזרמת צינור אוקסי נוסף מקו הגז לצלחת מגבשת מלאה בתמיסת קרבס-הנסלייט (שלב 2.1.3) בסמוך לאזור הניתוח. זה ישמש כדי לשמור על השרירים מאווררים ו hydrated במהלך ואחרי הניתוחים.
      הערה: ניתן לאחסן שרירים בתמיסה מאווררת זו עד 4 שעות, אם מוציאים יותר משריר אחד מהעכבר בכל פעם.
    3. הכינו 1 ליטר של תמיסת קרבס-הנסלייט המכילה (ב-mmol l-1): NaCl (118); KCl (4.75); MgSO4 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl 2 (2.54); וגלוקוז (10.0) בטמפרטורת החדר ו-pH עד 7.4 באמצעות HCl ו-NaOH (ראו טבלת חומרים). בעת טיפול HCl ו- NaOH, יש ללבוש PPE מתאים של משקפי מגן וכפפות.
    4. מלאו את האמבטיה בתמיסת קרבס-הנסלייט בטמפרטורת החדר וב-pH 7.4. השקיעו את השריר ואת הקרס לחלוטין בתמיסה.
    5. הפעל את כל הציוד; מערכת ידית שרירים דו-מצבית, ממריץ וממשק אותות (לוח DAQ) (ראה טבלת חומרים).
  2. דיסקציה של שריר EDL.
    1. להרדים עמוק את העכבר ולאחר מכן לבצע המתת חסד על ידי נקע צוואר הרחם. הנח את העכבר במצב שכיבה צדדית ימנית או שמאלית כאשר הגפה האחורית העליונה מתוחה והבהונות נוגעות בלוח הנתיחה. הסירו את הפרווה מהקרסול אל מעל מפרק הברך.
    2. מלקחיים את העור וחתכו ממפרק הקרסול לאזור הירך. לאחר שהשריר נחשף, חתכו סביב הקרסול כמו "מכפלת" מכנסיים. משוך את העור למעלה כדי לחשוף את שרירי הרגליים בצורה ברורה יותר.
    3. אתרו את קו הפאשיה המפריד בין הטיביאליס הקדמי (TA) לגסטרוקנמיוס, הפרידו באמצעות מספריים לדיסקציה כדי לחשוף את גידי הברך. מניחים מספריים לדיסקציה בין שני גידי הברך החשופים. מספריים "יתפוסו" על כיס ממש מתחת לגידי הברך החשופים. חותכים "כיס" תוך משיכת המספריים מהרגל עד שהמספריים מגיעים לקרסול כדי לחשוף את ה-EDL.
    4. באמצעות קשר לולאה קשור מראש בתפר כירורגי משי במידה 4-0 (ראה טבלת חומרים), שרוכים קצה אחד של התפר מתחת לגיד הקרוב ביותר לברך. קשרו קשר מרובע כפול מעל צומת השריר-גיד הפרוקסימלי מבלי להניח אותו על השריר או לכלול את הגיד. חותכים מעל הקשר. משוך בעדינות את הלולאה הקשורה לגיד, וה- EDL ייצא מה"כיס".
    5. הדביקו את הלולאה לאזור הדיסקציה כדי ליצור מתח ב-EDL. קשרו קשר מרובע כפול באמצעות קשר לולאה נוסף שנקשר מראש בצומת השריר-גיד הדיסטלי מבלי להניח אותו על השריר או לכלול את הגיד. חתך את הקשר בצד קרוב יותר לרגל כדי להסיר את כל ה- EDL מהעכבר. חתכו את התפר הנוסף מהקשרים המרובעים הכפולים בצד הפרוקסימלי והדיסטלי של השריר והניחו את השריר באמבטיה המאווררת ליד אזור הניתוח.
      הערה: הקפד לשים לב איזה צד הוא פרוקסימלי ו / או דיסטלי אם מניחים את השריר באמבטיה מאווררת.
    6. כדי למקם על מתקן ידית הסרוו-מוטור, חבר את EDL אנכית בין אלקטרודות פלטינה תלויות. חבר את קשר הלולאה הדיסטלית לוו הנייח וחבר את קשר הלולאה הפרוקסימלי לוו המחובר לזרוע הסרוו-מוטורית. הרימו את אמבט הרקמה כדי לטבול את השריר בתמיסת קרבס-הנסלייט המאווררת.
      הערה: אוורור לא אמור להפריע לשריר כאשר הוא שקוע. אם כן, להוריד את הלחץ של הגז. יש לאפשר לשריר להתאזן למשך 10 דקות לפני תחילת הגירוי.
  3. למדוד את הכוח האיזומטרי המרבי של שריר EDL.
    הערה: עיין בטבלה 1 לקבלת פרוטוקול כיצד למדוד כוח איזומטרי מרבי באמצעות עווית וטטנוס. ראו איור משלים 1 להמחשה של התוכנית שבה השתמשו המחברים.
    1. לעורר את השריר עם עווית supramaximal כדי להבטיח את השריר לא ניזוק במהלך הניתוח (80 V, 1 pps, 1ms; טבלה 1; ראו תרשים משלים 2). אם לא נגרם נזק, השתמש בידית האורך במערכת ידיות השרירים כדי למצוא אורך שריר באמצעות גירוי עווית שבו המתח הפעיל הוא ~ 1V / 0.1271 N עם פחות מ ~ 0.1V / 0.01271N מתח פסיבי.
    2. רשום את אורך ההתחלה של השריר מקשר תפר לקשר תפר בוולט ובמילימטרים. מדידות קלט לחלק הכיול של התוכנית עבור אורך התחלה (ראה איור משלים 1).
    3. מצא כוח איזומטרי מרבי על-מקסימלי באורך אופטימלי (L0) של EDL (טבלה 1). מבחינה טכנית אין צורך במנוחה, אך המתנה של דקה בין הגירויים תייצב את המתח הפסיבי. רשום את האורך (בוולט) שבו העווית העל-מקסימלית היא מקסימלית. זהו אורך השריר האופטימלי (L0) לעווית.
    4. מדדו את השריר בעזרת קליפרים באורך זה. מדדו את השריר מקשר תפר לקשר תפר. לאחר מציאת L 0, קצר את השריר בחזרה לאורך ההתחלה (מתח פעיל ~ 1V / 0.1271 N).
    5. מצא כוח איזומטרי מרבי של טטנוס על-מקסימלי של EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; טבלה 1). רשום את האורך (בוולט ובמילימטרים) של כוח טטני על-מקסימלי ב-L0 ומדוד את הסיבים מקשר תפר לקשר תפר שוב עם קליפרים.
      הערה: הגדלת אורך השריר בצעדים של 0.5 V/0.65 מ"מ תביא ל-L0 מדויק יותר הן לעווית והן לטטנוס.
    6. מצא את הכוח האיזומטרי התת-מקסימלי של EDL (45 V, 110 pps, 500ms; טבלה 1) ב L0 לפני ואחרי הניסוי כדי להבטיח עייפות לא התרחשה מפרוטוקול הגירוי. ירידה של 10% בכוח נחשבת לשריר "עייף".
ניסוי עוצמת סימולציה (V) תדר פולס (pps / Hz) משך גירוי (ms) הערות
1. "חימום" 80 1 1 הגדל או הקטן את האורך ב- 0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של 1 V
2. עווית אופטימלית באורך שריר (L0) 80 1 1 הגדל או הקטן את האורך ב- 0.50 V כדי למצוא מתח פסיבי של ~ 1 V
3. טטנוס באורך שריר אופטימלי (L0) 80 180 500 מנוחה של 3 דקות בין שינוי אורך ב- 0.50 V
4. טרום ניסוי תת-מקסימלי L0 45 110 500 באורך L0
6. ניסויי אווטר 45 110 שימוש מחזורי בשינויי אורך מייצגים עבור EDL של עכבר
7. תת-מקסימלי L0 לאחר הניסוי 45 110 500 חזור ל- L0 לאחר ניסוי ומדוד L0

טבלה 1: פרוטוקול גירוי. פרוטוקול גירוי למציאת אורך אופטימלי של עווית וטטנוס על-מקסימליים ותת-מקסימליים. הפרוטוקול משתנה בהתאם לעוצמת הגירוי, העיתוי והפולסים לשנייה.

3. השלמת טכניקת לולאת עבודה "אווטארית" באמצעות מסלולי זן in vivo נבחרים

  1. הגדר את התוכנה הדרושה להשלמת טכניקות לולאת עבודה של "אווטאר" (ראה טבלת חומרים).
    הערה: קובץ קלט (.csv או דומה) המציין את אורך השריר בכל שלב נדרש (ראה שלב 1.4). יש צורך בתשומות עבור אחוז המחזור שבו מתחיל הגירוי ולמשך הגירוי (ראו איור משלים 3 למשל).
  2. טכניקת לולאת עבודה "אווטארית" מלאה.
    הערה: בעוד אנו משתמשים בתוכנית LabView מותאמת אישית, חוקרים יכולים להשתמש בכל תוכנית המאפשרת שליטה על שינויי אורך ב- EDL של עכבר על מנוף סרוו-מוטורי, שליטה על תחילת (% מחזור) ומשך (ms) של גירוי בזמנים מוגדרים, ומדידת כוח שריר. ראו איור משלים 3 להמחשה של השימוש של מחברי התוכנית.
    1. העלה את שינויי המתח בקנה מידה עם אורך קנה מידה לתוכנית משלב 1.4. ראה שלבים 1.4, 3.3 וסעיף הדיון לקבלת מידע נוסף על "שינויי מתח בקנה מידה גדול".
    2. התאם את אורך ההתחלה של השריר במידת הצורך (ראה סעיף 3.3). הזן את אורך ההתחלה ב- V וב- mm כדי לכייל את התוצאות (ראה איור משלים 3).
    3. השתמש בתחילת הגירוי ובמשך הזמן המחושב בשלב 1.3.
    4. הפעל את השריר דרך שינויי האורך בקנה מידה עם טיול אורך מוגדר במשך שני מחזורים.
    5. שמור נתונים. אם נאספים מספר פרוטוקולי גירוי על אותו שריר, יש להמתין 3 דקות בין כל גירוי.
    6. לעורר באורך אופטימלי (L0) באמצעות הפעלה תת-מקסימלית כדי לקבוע אם התרחשה עייפות. אם הכוח יורד ביותר מ -10%, השרירים נחשבים עייפים. ראו טבלה 1 לפרוטוקולי גירוי.
    7. הסר את השריר מהאמבטיה. חותכים קשרים בלולאה מהשריר ומטשטשים את התמיסה העודפת מהשריר. לשקול את השריר. קבע אזור חתך פיזיולוגי באמצעות הנוסחה הסטנדרטית: מסת שריר/(L0*1.06)19.
  3. כוונון פרמטרים עבור טכניקת לולאת עבודה "אווטאר" (ראה סעיף דיון).
    1. קבעו את אורך הטיול ההתחלתי ואת אורך הטיול על-ידי התאמת עליית המתח הפסיבי ex vivo לעליית המתח הפסיבית שנצפתה in vivo (איור 2).
      הערה: במחקר זה נעשה שימוש באחוז L 0 כדי לשנות את קנה המידה של אורך התחלה (מ"מ) וטיול (% L0; ראה שלב 1.4 וסעיף דיון). כדי להתאים את עליית המתח בעכבר ex vivo EDL לזו של חולדה in vivo MG, החוקרים מצאו שאורך התחלתי ב-L0 יצר את ההתאמה הטובה ביותר (איור 2).
    2. בחר שלושה אורכי התחלה (לדוגמה, -5% L 0, L 0 ו- +5% L0). בצע את לולאת העבודה "אווטאר" בכל אחד מאורכי ההתחלה הללו עם טיול אורך מוגדר (למשל, 10% L0).
      הערה: בניסויי "אווטאר" הנוכחיים באמצעות EDL עכבר, נעשה שימוש בטיול אורך של 10% L0 .
    3. חזור על הפעולה עם אורכי התחלה חדשים ו/או טיול עד שקצב עליית המתח הפסיבי ex vivo יהיה דומה לקצב עליית המתח הפסיבי in vivo (ראה איור 2B).
    4. בהתאם לסוגי הסיבים ולדינמיקת ההפעלה של השרירים המשמשים, הגדילו או הפחיתו את משך הגירוי כדי למטב את ההתאמה בין כוח ex vivo לכוח in vivo . לכן, ייתכן שיהיה צורך לשנות את תחילת ו / או משך הגירוי כדי להתאים בצורה הטובה ביותר לייצור כוח in vivo במהלך ניסויי "אווטאר".
    5. כדי להחליט אם זה הכרחי (ראו פרק דיון), התוו כוח לאורך זמן של "אווטאר" ושריר in vivo (איור 3) וחשבו את מקדם הקביעה R2 על ידי כריעת המתאם המדרג בין כוח שריר המטרה לכוח שריר "אווטאר" (ראו תוצאות מייצגות).

Figure 2
איור 2: עליית מתח פסיבית תואמת. לולאות עבודה המציגות את העלייה in vivo ו - ex vivo במתח פסיבי (חצים). In vivo קנה מידה של לולאת עבודה מחולדה MG (שחורה) הולכת ב 2.9 הרץ (נתונים מ Wakeling et al.15). לולאות עבודה בקנה מידה של Ex vivo מעכבר EDL (ירוק) ב- 2.9 הרץ. (A) אורך התחלתי של שריר EDL של עכבר הוא +5% L0. (B) אורך ההתחלה של שריר ה-EDL של העכבר הוא L0. שימו לב שעליית המתח הפסיבי ex vivo תואמת את עליית המתח in vivo ב-A אך לא ב-B. קווים עבים יותר מצביעים על גירוי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: מיטוב משך הגירוי של EDL עכברי כך שיתאים לכוח in vivo של חולדה MG (קו שחור). הכוח שנוצר על ידי EDL העכבר באמצעות גירוי מבוסס EMG (קו מקווקו ירוק) פוחת מוקדם יותר מאשר כוח in vivo, ככל הנראה עקב השבתה מהירה יותר של EDL העכבר בהשוואה לחולדה MG. כדי למטב את ההתאמה בין כוחות in vivo ו- ex vivo, EDL העכבר היה מגורה למשך זמן ארוך יותר (קו ירוק מלא). גירוי מבוסס EMG R 2 = 0.55, גירוי אופטימלי R2 = 0.91. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

מטרת ניסויי ה"אווטאר" היא לשכפל את ייצור הכוח in vivo ואת תפוקת העבודה קרוב ככל האפשר במהלך ניסויי לולאת עבודה ex vivo. מחקר זה בחר להשתמש בעכבר EDL כ"אווטאר" עבור עכבר MG מכיוון שעכבר EDL ועכברוש MG מורכבים שניהם בעיקר משרירים מהירים20,21. שני השרירים הם המניעים העיקריים של מפרק הקרסול (EDL ankle dorsiflexor, MG ankle plantarflexor) עם זוויות חדירה דומות (עכבר EDL 12.4 + 2.12°22, חולדה MG 20° בשימוש במחקר זה15). לולאות עבודה ייצוגיות בקנה מידה של חולדה MG15 הושוו לניסויי "אווטאר" ex vivo (איור 4) באמצעות שני פרוטוקולי גירוי שונים (אחד מפעילות EMG שנמדדה ואחד ממוטב כמו בשלב 3.3). ערכי R 2 המוצגים כאן חושבו באמצעות כל מחזור קיצור המתיחה בקנה מידה (2 מחזורים / מצב), כאשר לכל מחזור יש יותר מ -2000 נקודות המתאימות למהירות המנוע (הליכה = 5521 נקודות, טרוט = 5002, דהרה = 2502 נקודות). לולאות העבודה הוגדלו כדי להסביר את ההבדלים בגודל השרירים, P0 ו- PCSA. קנה המידה נעשה על ידי מיפוי ליניארי של כוח ומאמץ לסולם דומה (0-1) כדי להשוות בין MG חולדה ועכבר EDL. מבחינה חזותית, ברור שאופטימיזציה של פרוטוקול הגירוי (איור 4B) כדי להסביר דינמיקות הפעלה שונות של שרירי EDL עכבר ו-MG של חולדות משפרת את ההתאמה לכוח ה-in vivo של חולדה MG בהשוואה להפעלה מבוססת EMG (ראו פרק דיון). עבור EDL עכבר, הכפלה בקירוב של משך הגירוי עבור מסלולי מאמץ איטיים יותר (הליכה וטרוט) הגדילה את R2 ב -62% בהליכה וב -109% בטרוט (trot). עבור מסלול המאמץ המהיר יותר (דהירה), הגדלת זמן הגירוי במחצית הזמן הנצפה הגדילה את R2 ב -22%.

Figure 4
איור 4: השוואה בין לולאות עבודה in vivo ו-ex vivo. לולאות עבודה של עכבר in vivo חולדה MG (שחור) ועכבר ex vivo EDL (ירוק) במהלך הליכה (2.9Hz) באמצעות מסלולי מאמץ in vivo. הקו העבה יותר מצביע על גירוי הן בלולאות העבודה in vivo והן ב- ex vivo. (A) לולאת עבודה של עכבר in vivo חולדה MG (שחור) ועכבר ex vivo EDL (ירוק מקווקו) במהלך הליכה באמצעות פרוטוקול גירוי מבוסס EMG. (B) לולאת עבודה של עכבר in vivo חולדה MG (שחור) ועכבר ex vivo EDL (ירוק מלא) במהלך הליכה (2.9Hz) באמצעות גירוי אופטימלי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

R2 גבוה בין ייצור כוח EDL ex vivo של עכבר לבין ייצור כוח in vivo של גסטרוקנמיוס מדיאלי של חולדה (MG)15 מצביע על שכפול טוב (איור 5). בניסויי גירוי מבוססי EMG, ערכי R2 ממוצעים היו 0.535, 0.428 ו-0.77 עבור הליכה, הליכה ודהירה, בהתאמה. בניסויי גירוי אופטימליים, ערכי R2 ממוצעים היו 0.872, 0.895 ו-0.936 בהליכה, הליכה ודהרה, בהתאמה. כפי שנדון קודם לכן (שלב 3.3, איור 5), בהתאם לדינמיקת ההפעלה של השרירים שבהם נעשה שימוש, ייתכן שיהיה צורך למטב גם את פרוטוקול הגירוי. החיזוי של כוח in vivo MG באמצעות עכבר ex vivo EDL השתפר בכל מהירויות המנוע על ידי אופטימיזציה של גירוי, הגדלת R2 (איור 5A,B) והקטנת שגיאת ריבוע ממוצע שורש (RMSE). RMSE ירד לאחר מיטוב עבור כל המהירויות (איור 6). ממוצע RMSE עבור גירוי מבוסס EMG היה 0.31, 0.43 ו- 0.158 עבור הליכה, הליכה ודהרה. RMSE ממוצע עבור גירוי אופטימלי היה 0.181, 0.116, 0.101 עבור הליכה, הליכה ודהרה.

Figure 5
איור 5: R 2 ערכים עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo: תרשים קופסה ושפם של ערכי R2 עבור השוואות כוח in vivo ו- ex vivo . צוינו תצפיות בודדות, חציון, אחוזון 25ואחוזון 75. (A) ערכי R 2 עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo באמצעות פרוטוקול גירוי המבוסס על מדידת אות EMG in vivo במהלך הליכה ב- 2.9 הרץ (ירוק), הליכה ב- 3.2 הרץ (מגנטה) ודהירה ב- 6.2 הרץ (ציאן). (B) ערכי R 2 עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo באמצעות גירוי אופטימלי (ראה איור 2). מיטוב תחילת הגירוי ומשכם הגדיל את R2 עבור כל ההילוכים. גירוי מבוסס EMG: הליכה R 2 = 0.50-0.55, trot R 2 = 0.37-0.47, דהרה R 2 = 0.62-0.90; גירוי אופטימלי: ללכת R 2 = 0.74-0.93, trot R 2 = 0.85-0.92, לדהור R2 = 0.87-0.97. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 6
איור 6: שגיאת ריבוע ממוצע שורש (RMSE) עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo. תרשים קופסה ושפם של ערכי RMSE עבור השוואות כוח in vivo ו- ex vivo. צוינו תצפיות בודדות, חציון, אחוזון 25ואחוזון 75. (A) ערכי RMSE עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo באמצעות פרוטוקול גירוי מבוסס EMG. (B) ערכי RMSE עבור in vivo ו- ex vivo באמצעות פרוטוקול גירוי ממוטב. מיטוב תחילת הגירוי ומשך הזמן הפחית את RMSE עבור כל ההילוכים. הליכה ב-2.9 הרץ (ירוק), הליכה ב-3.2 הרץ (מגנטה) ודהרה ב-6.4 הרץ (ציאן). אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

כדי לבחון את הביצועים של שיטות לולאת עבודה מסורתיות בחיזוי כוחות שריר in vivo, לולאות עבודה סינוסואידליות בוצעו גם עבור EDL העכבר באותה תדירות, אורך טיול, אורך התחלה, תחילת גירוי ומשך כמו עבור ניסויי "אווטאר" המשתמשים במסלולי זן MG של חולדות in vivo. ערכי R2 היו נמוכים משמעותית מאשר במסלולי זן in vivo הן עבור פרוטוקולי גירוי מבוססי EMG והן עבור פרוטוקולי גירוי ממוטבים (איור 7). ערכי R2 ממוצעים עבור גירוי מבוסס EMG באמצעות מסלולי אורך סינוסואידים היו 0.062, 0.067 ו- 0.141 בתדרי הליכה, טרוט ודהרה. ערכי R2 ממוצעים לגירוי אופטימלי באמצעות מסלולי אורך סינוסואידים היו 0.09, 0.067 ו-0.141 בתדרי הליכה, טרוט ודהרה.

Figure 7
איור 7: R2 ערכים עבור ייצור כוח in vivo ו- ex vivo באמצעות שינויי אורך סינוסואידליים. תרשים קופסה ושפם של ערכי RMSE עבור השוואות כוח in vivo ו- ex vivo. צוינו תצפיות בודדות, חציון, אחוזון 25ואחוזון 75. ערכי R 2 עבור הליכה (ירוק, 2.9 הרץ), טרוט (מגנטה, 3.2 הרץ) ודהרה (ציאן,6.2 הרץ) באמצעות שינויי אורך סינוסואידים עם פרוטוקולי גירוי מבוססי EMG (שקוף) וממוטבים (אטומים). הן עבור גירוי מבוסס EMG והן עבור גירוי ממוטב, ערכי R2 היו נמוכים יותר עבור שינויי אורך סינוסואידים מאשר עבור שינויים באורך in vivo. גירוי מבוסס EMG: ללכת R 2 = 0.00 - 0.30, trot R 2 = 0.00 - 0.02, דהרה R 2 = 0.03 - 0.07; גירוי אופטימלי: הליכה R 2 = 0.02 - 0.21, trot R 2 = 0.02 - 0.12, דהרה R2 = 0.12 - 0.17. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

לולאות עבודה המיוצרות על-ידי שריר ה-EDL של עכבר ex vivo באמצעות מסלולי אורך סינוסואידים אינן מחקות במדויק את כוח ה-MG של עכברוש ה-vivo בהשוואה למסלולי ה-in vivo strain (איור 8). השינוי בעבודה שנוצר על ידי מסלולי מתח סינוסואידלי לעומת in vivo יכול להיות מוסבר על ידי היעדר מעברי מתח ומהירות במסלול הסינוסואידלי (איור 9). בעוד השרירים היו מגורים באורכים דומים במהלך שלב הקיצור הפעיל של ההתכווצויות הן במסלולים סינוסואידים והן במסלולי מאמץ מבוססי vivo, תחילת הגירוי התרחשה בשלבים שונים של המחזור (למשל, הופעת הגירוי התרחשה בשלב של 74% עבור גירוי מבוסס EMG trot, אך בשלב של 43% עבור הליכה גירוי מבוסס EMG; ראה פרק דיון).

Figure 8
איור 8: השוואה בין לולאות עבודה סינוסיואידליות in vivo ו-ex vivo. (A) לולאת עבודה In vivo (שחורה) מחולדה MG ולולאת עבודה ex vivo (מגנטה מקווקוות) מעכבר EDL באמצעות מסלול מאמץ סינוסואידלי וגירוי מבוסס EMG. (B) לולאת עבודה In vivo (שחורה) מחולדה MG ולולאת עבודה ex vivo (מגנטה מוצקה) מעכבר EDL באמצעות מסלול מאמץ סינוסואידלי וגירוי אופטימלי. שימו לב שלולאות העבודה הסינוסואידליות מעריכות יתר על המידה את העבודה in vivo בשל היעדר מעברי מתח ומהירות במסלול הסינוסואידלי. גירוי מבוסס EMG R 2 = 0.0003, גירוי אופטימלי R2 = 0.084. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 9
איור 9: השוואה בין מסלולי אורך סינוסיואידים של זן in vivo ו- ex vivo. השוואה בין מסלולי אורך in vivo ו-ex vivo sinusoidal בהליכה (ירוק), טרוט (מגנטה) ודהרה (כחול). הקו המוצק הוא מסלול זן in vivo. קו מקווקו ex vivo מסלול אורך סינוסואידלי. החלק המודגש הוא גירוי. הגירוי החל באותו אורך בשלב הקיצור של הצעד. חצים המציינים מעברי מתח ומהירות. סטיות מסינוסואידל הן עכבה מכוחות חיצוניים על השריר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים 1: תוכנית המשמשת לאיסוף כוח איזומטרי מקסימלי באורך אופטימלי. התוכנית שימשה לקביעת אורך אופטימלי במהלך עווית תת-מקסימלית ותת-מקסימלית וגירוי טטני. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 2: תגובת עוויתות בת קיימא. תגובת Twitch של EDL עכבר. כוח העווית עולה ויורד במהירות ואמור להגיע למתח פעיל של ~1 V. "רעש" צריך להיות מינימלי לאחר שהגיע לשיא המתח הפעיל. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

איור משלים 3: תוכנית המשמשת לאיסוף נתוני לולאת עבודה. התוכנית שימשה לשליטה באורך השריר ובתזמון הגירוי בלולאות עבודה ex vivo . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

קובץ קידוד משלים 1: קוד MATLab המשמש לפילוח ויצירת פרוטוקול ניסיוני עבור לולאת העבודה. קוד MATLab ששימש לפילוח מידע על צעדי מטרה (אורך, הפעלת EMG וכוח) לצעדים בודדים. הקוד כולל שינוי קנה מידה ואינטרפולציה של צעדי חיות מטרה לאורכים שעכבר ex vivo EDL יכול למתוח. בנוסף, כולל קוד להחלקת אות EMG והשוואת ההפעלה לבחירת התחלה ומשך גירוי בניסויי לולאת עבודה ex vivo . אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

בעוד אורגניזמים נעים בצורה חלקה על פני נופים, העומסים והמתחים הבסיסיים שהשרירים חווים משתנים באופן דרסטי 1,6,23. הן במהלך תנועת in vivo 1,24 והן בניסויי "אווטאר", השרירים מגורים באופן תת-מקסימלי בתנאים מחזוריים ולא יציבים. יחסי כוח-אורך איזומטריים ויחסי כוח-מהירות איזוטוניים אינם מתאימים היטב לחיזוי כוח שריר בתנאים אלה2. הבנת ההשפעות של מאמץ לא יציב (כלומר, ארעי) והעמסה חיונית לחיזוי ייצור כוח במהלך תנועת in vivo, ולכן היא הרציונל העיקרי לפיתוח ניסויי "אווטאר" אלה2. ניסויי "אווטאר" מאפשרים לנו לשלוט בעומס השרירים ובמסלולי המאמץ תוך מדידת תפוקת הכוח. טכניקת ה"אווטאר" חוקרת את תגובת הכוח של שרירים בתנאים דמויי in vivo, ללא גורמים מבלבלים של שליטה עצבית ותאימות גידים. כדי לבצע את ניסויי ה"אווטאר", החוקרים יזדקקו לתוכנית המאפשרת לשריר לעבור שינויי אורך שנקבעו מראש עם היכולת לגרות באורכי התחלה שונים ולפרקי זמן משתנים (ראו איור משלים 3 עבור התוכנית שבה משתמשים המחברים). החוקרים צריכים לציין אורך שריר התחלתי (מ"מ), אורך טיול (מ"מ), תחילת גירוי (% ממשך המחזור) ומשך הגירוי (ms) לפני ביצוע ניסויים (ראה שלבים 1.3-1.4כדי לקבל ערכים עבור פרמטרים אלה). באופן כללי, לרוב רצוי לבחור צעדים המייצגים את כל הצעדים בניסוי (למשל, התחלה וסיום באורך דומה, הגעה לכוח שיא דומה, פעילות EMG ממוצעת וכו'). קביעה אם EMG/הפעלה ונתוני כוח מצעד נבחר מייצגים צעדים אחרים באותו ניסוי יכולה להיות מועילה ל"כוונון" מאוחר יותר, אשר יכול להיעשות על ידי תכנון לולאות עבודה (כוח לעומת אורך) של הניסוי כולו באמצעות שריר חיית המטרה. במהלך תנועה דו-רגלית ומרובעת, האורך הקצר ביותר לאורך הקצר ביותר בדרך כלל תוחם צעד שלם (מבוהן לבוהן לבוהן אוף), אך הפעלת EMG יכולה להשתנות. אצל חלק מבעלי החיים והשרירים, הפעלת EMG קשורה קשר הדוק למגע עם כף הרגל, כמו החולדה MG המוצגת כאן22. בבעלי חיים אחרים, כגון גסטרוקנמיוס רוחבי של עופות גינאה, הפעלת EMG מתרחשת בדרך כלל באורך הארוך ביותר כדי להשיג יציבות רבה יותר בשטח לא ידוע25.

כדי לבצע ניסויי "אווטאר", חשוב למזער את הרעש בנתוני הכוח ex vivo . מדידות כוח רגישות למספר נושאים, כולל אך לא מוגבל לקרע של השרירים במהלך הניתוח, תאימות התפרים אם קשרי הלולאה ארוכים מדי, קנה מידה לא נכון של קלט האורך וטיול, ועייפות שרירים. קריעת השרירים מתרחשת לעיתים קרובות בעת "ניתוח הכיס" (שלב 2.2.3) וקשירת קשר הלולאה סביב החלק הפרוקסימלי של הגיד (שלב 2.2.4). בזמן "ניתוח הכיס", שמירה על מספריים לדיסקציה שטוחה ואופקית לשריר תמנע מהקצוות לנקב את ה-EDL. בנוסף, משיכת מספריים הדיסקציה הצידה ובאופן מרוחק תוך כדי ניתוח קהה תגביל גם את המגע בין מספריים הדיסקציה לשרירי ה-EDL. בנוסף, יש לשמור על השרירים לחים עם תמיסת קרבס-הנסלייט במהלך ההכנה לניתוח ובעת השימוש על האסדה.

שינוי קנה מידה נכון של קלטי אורך הוא מסובך יותר. כוח פסיבי ואקטיבי בשרירים יכול להיות מושפע אם אורך ההתחלה ו / או הטיול אינם בקנה מידה כראוי. העלייה של ex vivo במתח פסיבי צריכה להתאים לעלייה in vivo במתח פסיבי (ראו איור 1). אחת מבעיות קנה המידה שנצפתה בניסויים קודמים היא שגם מתח פסיבי וגם מתח אקטיבי יכולים להיות מושפעים אם טיול האורך (אורך ההתחלה לאורך הארוך ביותר) קטן מדי או גדול מדי. באופן תיאורטי, השרירים צריכים להגיע לשיא הכוח קרוב לאורכם האופטימלי (L 0)26, ולכן אנו משתמשים באורך אופטימלי (L0) כדי לשנות את קנה המידה של אורכי שרירי in vivo בניסויי "אווטאר" ex vivo כדי לשכפל במדויק את ייצור הכוח in vivo. הבדלים אדריכליים בין השרירים ישחקו תפקיד בקביעת הפרמטרים של אורך ואורך ההתחלה. אף על פי שאורך אופטימלי (L0) נמצא בתנאים איזוטוניים ואיזומטריים בעלי גירוי על-מקסימלי, השימוש בו כמדד קנה מידה בניסויי "אווטאר" יכול להדגיש את המגבלות של יחסי כוח-אורך וכוח-מהירות במהלך תנועה מחזורית הדורשות חקירה נוספת. ברוב תנאי המצב היציב, ניתן להשתמש באורך, במהירות ובהפעלה המיידיים של השריר (כלומר, תכונות אורך הכוח ומהירות הכוח) כדי לחזות כוח ותפוקת עבודה בדיוק סביר 12,24,27. בתנאים דינמיים עם עומס משתנה, הכוח גדל כפונקציה של מהירות28 ויש לו קשר מורכב עם מאמץ והפעלה 29,30. זה סותר את תכונות הכוח-מהירות האיזוטוניות ואורך הכוח האיזומטרי של שרירים28. בחולדה MG, מעברי מתח ומהירות הם עדות להעמסה, כמו למשל מגע ברגל או אינטראקציה עם הסביבה (כלומר, שטח קשה, רוח, שינוי פתאומי בכיוון כדי להימנע מטריפה) (איור 9). במסלולים אלה של זני MG חולדות, כמו ברוב התנאים המציאותיים, יש שינויים פתאומיים בעומס המופעל, בייצור הכוח ובתפוקת העבודה 2,28. שיטה ניסיונית זו שואפת להדגיש אינטראקציות מורכבות אלה בין דינמיקת מתח, מהירות והפעלה בתנאי in vivo שאינם מוסברים היטב על ידי יחסי אורך כוח וכוח ומהירות כוח.

בעיות אחרות יכולות להתרחש כאשר אורך ההתחלה של השריר קצר או ארוך מדי. אורך התחלה קצר מדי יגרום לקצב עלייה מופחת במתח במהלך המתיחה הפסיבית והאקטיבית (לא מוצג), בעוד שאורך התחלה ארוך מדי יגרום לקצב עלייה מוגבר במתח הפסיבי (ראה איור 1B). שימוש ביחס בין מתח אקטיבי לפסיבי יכול להיות מועיל. לדוגמה, בחולדה MG, מתח פסיבי (N) הוא בדרך כלל כמחצית מהמתח הפעיל (איור 2). אם שריר מתחיל באורך ארוך מדי ו/או נמתח לאורך ארוך מדי, המתח הפסיבי עשוי להיות גבוה מדי ביחס למתח האקטיבי (ראו איור 1B), והכוח עשוי לרדת במהירות עקב מתיחת יתר. כמו כן, מתיחה לאורך ארוך מדי עלולה לפגוע בשריר ויכולה לגרום לשריר להתעייף מהר יותר. בנוסף, מתח פעיל עשוי להיראות בלתי מאוחה אם אורך ההתחלה קצר מדי ו / או השריר אינו מתוח לאורך ארוך מספיק.

ניסויים ראשוניים נחוצים כדי לקבוע אורך התחלה וטיול בהתבסס על L0. ייתכן שיהיה צורך בניסויים מקדימים נוספים כדי להתאים את משך הגירוי אם דינמיקת ההפעלה של השרירים המשמשים שונה. אופטימיזציות אלה נחוצות מכיוון שהרכב סוג הסיבים ו / או דינמיקת ההפעלה של שרירי in vivo ו- ex vivo עשויים להיות שונים. בתוצאות המייצגות שלנו (איור 4 ואיור 5), השתמשנו בשני פרוטוקולי גירוי עבור EDL של עכברים במהלך ניסויים של ex vivo כדי לשכפל את ייצור הכוח של MG בחולדה in vivo. כדי למטב את ייצור הכוח בעכבר EDL כך שיתאים בצורה הטובה ביותר לחולדה MG של vivo, משך הגירוי הוגדל (איור 2 ואיור 3). עכבר MG מורכב מסוגי סיבים איטיים יותר מאשר עכבר EDL31,32,33. זה ניכר בניסויי "אווטאר" מאחר ששרירי EDL של עכבר ex vivo הפיקו כוח מהר יותר לאחר עירור, והכוח ירד בקצב מהיר יותר לאחר ההשבתה מאשר נצפה in vivo בחולדה MG15 (איור 2), אפילו לאחר שקלול הבדלי עיכוב עירור-כיווץ בין תנאי in vivo ו-ex vivo 34. בהתאם לשרירי המטרה של ex vivo ו-in vivo, אופטימיזציה של גירוי עשויה להידרש גם בניסויי "אווטאר" אחרים. ניתן להשתמש בשרירי EDL או סוליאוס (SOL) של העכבר בטכניקת לולאת עבודה זו ex vivo. EDL נבחר כ"אווטאר" עבור MG החולדה בשל הדמיון בסוג סיבי השריר ובמבנה החדירה. ייתכן כי שרירים מסוימים עשויים להיות בעלי מבנה מורכב ולא ניתן לחקות אותם באמצעות שרירים ממכרסמים מעבדה כ"אווטאר".

בעוד שניסויי "אווטאר" זקוקים לאופטימיזציה ידנית מסוימת כדי לשכפל בצורה הטובה ביותר את ייצור הכוח in vivo, הטכניקה ישימה למגוון רחב של בעלי חיים שונים ומצבים מוטוריים. טכניקת ה"אווטאר" יכולה להיות שימושית במיוחד להבנת ייצור כוח in vivo בבעלי חיים ששריריהם גדולים מדי או בלתי נגישים בדרך אחרת לניסויים ex vivo. בעוד שנעשתה רק עבודה ראשונית על בעלי חיים גדולים יותר35, עבודה זו הראתה פוטנציאל ליישומה של טכניקה זו על פני בעלי חיים, שרירים והליכה מוטורית באמצעות עכברי מעבדה כ"אווטארים". התועלת של ניסויי "אווטאר" תלויה במידת הדיוק שבה מודל נוח, זול, זמין ומאופיין היטב של מכרסמים במעבדה (כלומר, EDL עכבר) יכול לשמש להבנת מכניקת in vivo של שרירים שונים ממינים שונים של בעלי חוליות. תוצאות מניסויי "אווטאר" ראשוניים שהוצגו כאן (חולדה MG) ובמקומות אחרים (עופות גינאה LG19), מצביעות על כך שניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לחזות במדויק כוחות in vivo וניתן ליישם אותה על בעלי חיים אחרים. יישומים עתידיים של שיטה זו אמורים להרחיב את סוגי השרירים ובעלי החיים ששימשו הן כמטרות והן כ"אווטאר" במהלך ניסויים באקס ויו ובמבחנה. ניסויי "אווטאר" מאפשרים לנו לבחון גורמים המשפיעים על כוח השרירים ותפוקת העבודה במהלך תנועה in vivo כאשר עומס שרירים ומאמץ משתנים בפתאומיות 1,2,19. באופן ספציפי, שיטת ה"אווטאר" מאפשרת לנו לבחון את ההשפעות של מעברי מאמץ ומהירות על כוח שריר שאינם נלכדים על ידי מודלים מסורתיים של שרירים או ניסויי לולאת עבודה סינוסואידליים.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

כל המחברים מודים שאין ניגוד אינטרסים.

Acknowledgments

אנו מודים לד"ר ניקולאי קונוב על שסיפק את הנתונים ששימשו במחקר זה. ממומן על ידי NSF IOS-2016049 ו- NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561 (2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242 (2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312 (2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721 (2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669 (2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019 (2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Tags

אווטאר ניסויי לולאת עבודה של ex vivo בזן vivo התנהגויות תנועה של הפעלה ייצור כוח שרירים תפוקת עבודה מערכות עצביות ומכניות ארגון ביולוגי היררכיית בקרה מודלים של שרירים בכוח שריר vivo בעבודת שרירים ב- vivo מכניקת שרירים תנאי מאמץ והעמסה בתנועת vivo מעברי מתח ומהירות הפעלה עצבית קינמטיקה של שרירים ושלד עומסי סביבה טכניקת אווטר
"אווטאר", ניסויי לולאת עבודה <em>Ex</em> vivo שונה באמצעות זן <em>והפעלה in vivo</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter