Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

"Avatar", een gemodificeerde ex vivo werklus experimenten met in vivo stam en activering

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Dit artikel beschrijft de methodologie voor het nabootsen van in vivo spierkrachtproductie tijdens ex vivo werklusexperimenten met behulp van een "avatar"-spier van een laboratoriumknaagdier om de bijdragen van spanningstransiënten en activering aan de spierkrachtrespons te beoordelen.

Abstract

Bewegingsgedrag zijn emergente kenmerken van dynamische systemen die het resultaat zijn van spierkrachtproductie en werkoutput. Het samenspel tussen neurale en mechanische systemen vindt tegelijkertijd plaats op alle niveaus van biologische organisatie, van het afstemmen van beenspiereigenschappen tijdens het hardlopen tot de dynamiek van de ledematen die in wisselwerking staan met de grond. Inzicht in de omstandigheden waaronder dieren hun neurale controlestrategieën verschuiven naar intrinsieke spiermechanica ('preflexes') in de controlehiërarchie, zou spiermodellen in staat stellen om in vivo spierkracht te voorspellen en nauwkeuriger te werken. Om in vivo spiermechanica te begrijpen, is ex vivo onderzoek van spierkracht en arbeid onder dynamisch variërende belastings- en belastingsomstandigheden vergelijkbaar met in vivo voortbeweging vereist. In vivo rektrajecten vertonen doorgaans abrupte veranderingen (d.w.z. rek- en snelheidstransiënten) die het gevolg zijn van interacties tussen neurale activering, musculoskeletale kinematica en belastingen die door de omgeving worden uitgeoefend. Het belangrijkste doel van onze "avatar"-techniek is om te onderzoeken hoe spieren functioneren tijdens abrupte veranderingen in belastingssnelheid en belasting wanneer de bijdrage van intrinsieke mechanische eigenschappen aan de productie van spierkracht het hoogst kan zijn. In de "avatar"-techniek wordt de traditionele work-loop-benadering aangepast met behulp van gemeten in vivo rektrajecten en elektromyografische (EMG) signalen van dieren tijdens dynamische bewegingen om ex vivo spieren door meerdere rek-verkortingscycli te sturen. Deze benadering is vergelijkbaar met de work-loop-techniek, behalve dat in vivo rektrajecten op de juiste manier worden geschaald en opgelegd aan ex vivo muisspieren die zijn bevestigd aan een servomotor. Deze techniek stelt het mogelijk om: (1) in vivo stam-, activerings-, pasfrequentie- en werkluspatronen na te bootsen; (2) varieer deze patronen om in vivo krachtreacties zo nauwkeurig mogelijk overeen te laten komen; en (3) specifieke kenmerken van rek en/of activering variëren in gecontroleerde combinaties om mechanistische hypothesen te testen.

Introduction

Bewegende dieren bereiken indrukwekkende atletische prestaties op het gebied van uithoudingsvermogen, snelheid en behendigheid in complexe omgevingen. De voortbeweging van dieren is bijzonder indrukwekkend in tegenstelling tot door mensen ontworpen machines - de stabiliteit en behendigheid van robots, prothesen en exoskeletten met huidige poten blijven slecht in vergelijking met dieren. Voortbeweging op poten in natuurlijk terrein vereist nauwkeurige controle en snelle aanpassingen om de snelheid te veranderen en omgevingskenmerken te manoeuvreren die fungeren als onverwachte verstoringen 1,2,3,4. Toch is het begrijpen van niet-stabiele voortbeweging inherent een uitdaging omdat de dynamiek afhankelijk is van complexe interacties tussen de fysieke omgeving, musculoskeletale mechanica en sensomotorische controle 1,2. Voortbeweging met poten vereist het reageren op onverwachte verstoringen met snelle multimodale verwerking van sensorische informatie en gecoördineerde activering van ledematen en gewrichten 1,5. Uiteindelijk wordt beweging mogelijk gemaakt door spieren die kracht produceren via intrinsieke mechanische eigenschappen van het bewegingsapparaat en door neurale controle 1,5,6,7. Een openstaande vraag van de neuromechanica is hoe deze factoren op elkaar inwerken om gecoördineerde beweging te produceren als reactie op onverwachte verstoringen. De volgende techniek maakt gebruik van de intrinsieke mechanische reactie van de spier op vervorming met behulp van in vivo rektrajecten tijdens controleerbare ex vivo-experimenten met een "avatar"-spier.

De spierwerklustechniek heeft een belangrijk raamwerk opgeleverd voor het begrijpen van intrinsieke spiermechanica tijdens cyclische bewegingen 8,9,10. De traditionele werklustechniek drijft spieren door vooraf gedefinieerde, meestal sinusvormige, spanningstrajecten met behulp van frequenties en activeringspatronen gemeten tijdens in vivo experimenten 2,8,9,11. Het gebruik van sinusvormige lengtetrajecten kan een realistische schatting maken van de arbeid en het vermogen tijdens vlucht12 en zwemmen2 onder omstandigheden waarin dieren geen snelle veranderingen in belastingstrajecten ondergaan als gevolg van interactie met de omgeving en musculoskeletale kinematica. In vivo spierspanningstrajecten tijdens voortbeweging met benen komen echter dynamisch voort uit interacties tussen neurale activering, musculoskeletale kinematica en belastingen die door de omgeving worden uitgeoefend 5,7,13,14. Er is een meer realistische werklustechniek nodig om belastingen, spanningstrajecten en krachtproductie na te bootsen die overeenkomt met in vivo spier-peesdynamiek en inzicht geeft in hoe intrinsieke spiermechanica en neurale controle op elkaar inwerken om gecoördineerde bewegingen te produceren bij verstoringen.

Hier presenteren we een nieuwe manier om in vivo spierkrachten na te bootsen tijdens de voortbeweging van de loopband door een "avatar"-spier van een laboratoriumknaagdier te gebruiken tijdens gecontroleerde ex vivo-experimenten met in vivo stamtrajecten die in de tijd variërende in vivo belastingen vertegenwoordigen. Door gebruik te maken van de gemeten in vivo rektrajecten van een doelspier op spieren van een proefdier tijdens gecontroleerde ex vivo-experimenten, zullen belastingen worden nagebootst die worden ervaren tijdens voortbeweging. In de hier beschreven experimenten wordt de ex vivo muis extensor digitorum longus (EDL) spier gebruikt als een "avatar" voor de in vivo rat mediale gastrocnemius (MG) spier tijdens het lopen, draven en galopperen op een loopband13. Deze benadering is vergelijkbaar met de work-loop-techniek, behalve dat in vivo rektrajecten op de juiste manier worden geschaald en opgelegd aan ex vivo muisspieren die zijn bevestigd aan een servomotor. Hoewel de EDL-spieren van muizen verschillen in grootte, vezeltype en architectuur in vergelijking met de MG van de rat, is het mogelijk om deze verschillen te controleren. De "avatar"-techniek stelt iemand in staat om: (1) in vivo stam-, activerings-, pasfrequentie- en werkluspatronen na te bootsen; (2) varieer deze patronen om in vivo krachtreacties zo nauwkeurig mogelijk overeen te laten komen; en (3) specifieke kenmerken van rek en/of activering variëren in gecontroleerde combinaties om mechanistische hypothesen te testen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle dierstudies werden goedgekeurd door de Institutional Animal Care and Use Committee van de Northern Arizona University. Extensor digitorum longus (EDL)-spieren van mannelijke en vrouwelijke wildtype muizen (stam B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), in de leeftijd van 60-280 dagen, werden gebruikt voor de huidige studie. De dieren werden verkregen uit een commerciële bron (zie Tabel met materialen) en gevestigd in een kolonie aan de Northern Arizona University.

1. Selectie van het in-vivo-rektraject en voorbereiding voor gebruik tijdens ex vivo werklusexperimenten

OPMERKING: In dit protocol werden eerdere metingen van in vivo dynamische voortbeweging, rechtstreeks verstrekt aan de auteurs (Nicolai Konow, UMass Lowell, persoonlijke communicatie), gebruikt in ex vivo experimenten. De oorspronkelijke gegevens werden verzameld voor Wakeling et al.15. Tijd-, lengte- of rek-, EMG-/activerings- en krachtgegevens zijn vereist om het protocol te repliceren.

  1. Segmenteer de hele in vivo studie in individuele stappen met behulp van een programmeerplatform (MATLab-code in Suplementary Coding File 1).
    1. Plot de lengteveranderingen vs. tijd voor de hele in vivo studie. Dit wordt gebruikt om individuele passen te visualiseren (houding tot houding) en om de variabiliteit tussen passen te beoordelen (Figuur 1).
    2. Bereken de rek voor de gehele proef (lengte (L) / maximale isometrische kracht bij optimale lengte L0).
    3. Kies een pas uit de hele proef die representatief is voor alle passen en die begint en eindigt met dezelfde lengte. Dit kan visueel worden gedaan door de lengtes op elkaar af te zetten om elke stap te vergelijken.
    4. Nadat een representatieve pas is geselecteerd, segmenteert u rek-, EMG-/activerings- en krachtgegevens van de hele proef met behulp van een programmeerplatform (zie aanvullend coderingsbestand 1 voor de codes die worden gebruikt in MATLab16).
    5. Als de bemonsteringsfrequentie verschilt voor rek, EMG/activering of kracht, interpoleer dan de gegevenspunten zodat ze allemaal met dezelfde frequentie worden bemonsterd.
      OPMERKING: Onderzoekers kunnen de frequentie van de vangst bepalen op basis van de tijdsintervallen tussen elk punt dat in de hele proef is bemonsterd. Als variabelen met dezelfde frequentie worden vastgelegd, zijn de bemonsteringstijden hetzelfde.
  2. Bereken de frequentie van gesegmenteerde passen.
    1. Bereken de frequentie door de duur van een gesegmenteerde pas in seconden te bepalen en 1 (seconde) te delen door de duur (1/duur = # passen per seconde).
    2. Bepaal handmatig hoeveel datapunten in ex vivo experimenten moeten worden verkregen om de frequentie te evenaren.
    3. Bereken de tijd die nodig is voor twee passen. Herhaal de stappen minstens één keer voor het schatten van de spiermeetfout, die nodig is voor de daaropvolgende statistische analyse.
  3. Bepaal de fase van stimulatie ten opzichte van de belastingsinput met behulp van de gemeten EMG-activiteit om het begin en de duur van de stimulatie voor de ex vivo werklussen te bepalen. Elk programmeerplatform kan worden gebruikt (zie Supplementary Coding File 1 voor de code die in dit onderzoek wordt gebruikt).
    1. Bekijk het EMG-signaal over hetzelfde x-asbereik (tijd) als rekverandering (Figuur 1). Vergroot het EMG-signaal om zichtbaar te zijn; dit kan worden gedaan door het EMG-signaal te vermenigvuldigen met een willekeurig getal, de rek en EMG opnieuw te schalen om op dezelfde schaal te komen en/of het EMG-signaal aan de stam toe te voegen.
      OPMERKING: Auteurs hebben de stam en EMG opnieuw geschaald om op dezelfde schaal te zijn met behulp van de "herschaal"-functie in MATLab (zie aanvullende figuur 1).
    2. Zoek waar EMG-activiteit begint en stopt, zoals aangegeven door een verandering in intensiteit van twee standaarddeviaties17,18.
      OPMERKING: Afhankelijk van het dier en de spier kan het begin van EMG al dan niet overeenkomen met voetcontact (Monica Daley, UC Irvine, persoonlijke communicatie) (zie de sectie Discussie).
    3. Bereken het percentage van de rekcyclus (bijv. 40%) waarbij de EMG-activering begint en hoe lang de stimulatie zal plaatsvinden (bijv. 222 ms).
      OPMERKING: Onderzoekers zullen rekening moeten houden met een excitatie-contractiekoppeling (ECC)-vertraging die verschilt tussen in vivo beweging en ex vivo werklussen en die voor elk dier en elke spier anders kan zijn (bijv. in vivo ECC is 24,5 ms voor rat MG, ex vivo ECC is ~5 ms voor muis EDL).
  4. Bereid representatieve rekingangen voor het werkluscontrollerprogramma voor. Elk programma dat de krachtoutput kan vastleggen met input voor belasting en stimulatie kan worden gebruikt voor het werkluscontrollerprogramma (zie de sectie Discussie).
    1. Neem de geselecteerde pas en interpoleer naar het juiste aantal punten dat nodig is om de stap gedurende twee cycli met een in-vivofrequentie te laten vastleggen (zie stap 1.2).
    2. Herschaal de pas om te beginnen en te stoppen bij "nulspanning" (bijv. L 0 of 95% L0) na het strekken met een vooraf bepaalde lengte-excursie (zie stap 3.3).
    3. "Schaal" geselecteerde pas, indien nodig, om te gebruiken als input voor rekveranderingen in muis EDL (zie Discussie sectie). Om te schalen, selecteert u een lengte-excursie tot waar de muis-EDL zonder schade kan worden uitgerekt (we rekken bijvoorbeeld de muis-EDL meestal uit met 10% L0 , ongeacht de in vivo soort). Dit moet mogelijk veranderen op basis van voorlopige resultaten (zie stap 3.3).

Figure 1
Figuur 1: Duur in de tijd van de gehele in-vivoproef . Lengte (mm) uitgezet tegen de tijd van rat MG. Passen worden afgebakend door cirkels, van de kortste lengte tot de kortste lengte, beschouwd als enkele pas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

2. Evaluatie van de maximale isometrische kracht van de muisspier ex vivo

  1. Apparatuur en operatie instellen.
    OPMERKING: Zie de sectie Discussie voor een uitleg van de apparatuur die nodig is voor de ex vivo werklus.
    1. Bereid een weefsel-orgaanbad voor door het oxytube-naaldventiel in het weefselbad van de watermantel te steken (zie Materiaaltabel). Sluit de oxytube aan op een gasfles met 95% 0 2-5% CO2. Laat 20 psi het tissuebad van de watermantel vullen.
    2. Bereid het operatiegebied voor door een extra oxytube van de gasleiding naar een kristalliseerschaal gevuld met Krebs-Henseleit-oplossing (stap 2.1.3) in de buurt van het operatiegebied te leiden. Dit wordt gebruikt om de spieren te beluchten en gehydrateerd te houden tijdens en na de operaties.
      OPMERKING: Spieren kunnen ook tot 4 uur in deze beluchte oplossing worden bewaard, als er meer dan één spier tegelijk uit de muis wordt gehaald.
    3. Bereid 1 L Krebs-Henseleit-oplossing met (in mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1.18); CaCl 2 (2,54); en glucose (10,0) bij kamertemperatuur en pH tot 7,4 met behulp van HCl en NaOH (zie materiaaltabel). Draag bij het hanteren van HCl en NaOH de juiste PBM's van een veiligheidsbril en handschoenen.
    4. Vul het bad met Krebs-Henseleit-oplossing bij kamertemperatuur en pH 7,4. Dompel de spier en de haak volledig onder in de oplossing.
    5. Zet alle apparatuur aan; dual-mode spierhefboomsysteem, stimulator en signaalinterface (DAQ-kaart) (zie Materiaaltabel).
  2. EDL-spierdissectie.
    1. Verdoof de muis diep en voer vervolgens euthanasie uit door cervicale dislocatie. Leg de muis in een rechter of linker zijwaartse ligpositie met de bovenste achterpoot gestrekt en de tenen die de dissectieplaat raken. Verwijder de vacht van de enkel tot boven het kniegewricht.
    2. Tent de huid met een tang en snijd van het enkelgewricht tot het heupgebied. Zodra de spier is blootgelegd, knipt u rond de enkel als een "zoom" van een broek. Trek de huid omhoog om de beenspieren duidelijker bloot te leggen.
    3. Lokaliseer de fascialijn die de tibialis anterior (TA) en gastrocnemius scheidt, scheid met een dissectieschaar om de kniepezen bloot te leggen. Plaats een dissectieschaar tussen de twee blootliggende kniepezen. Een schaar "blijft haken" aan een zak net onder de blootliggende kniepezen. Blunt ontleedt een "zak" terwijl je de schaar wegtrekt van het been totdat de schaar de enkel bereikt om de EDL bloot te leggen.
    4. Gebruik een voorgeknoopte lusknoop in maat 4-0 zijden chirurgische hechtdraad (zie Materiaaltabel) en rijg het ene uiteinde van de hechtdraad onder de pees die zich het dichtst bij de knie bevindt. Leg een dubbele vierkante knoop boven de proximale spier-peesovergang zonder deze op de spier te plaatsen of de pees op te nemen. Knip boven de knoop af. Trek voorzichtig aan de lus die aan de pees is vastgemaakt en de EDL komt uit de "zak".
    5. Plak de lus op het dissectiegebied om spanning in de EDL te creëren. Leg een dubbele vierkante knoop met behulp van een andere voorgebonden lusknoop bij de distale spier-peesovergang zonder deze op de spier te plaatsen of de pees op te nemen. Knip de knoop aan de kant dichter bij het been door om de hele EDL van de muis te verwijderen. Knip de extra hechting weg van de dubbele vierkante knopen aan de proximale en distale zijden van de spier en plaats de spier in het beluchte bad bij het operatiegebied.
      OPMERKING: Let op welke kant proximaal en/of distaal is als u de spier in een belucht bad plaatst.
    6. Om op de servomotorhendelrig te plaatsen, bevestigt u EDL verticaal tussen hangende platina-elektroden. Bevestig de distale lusknoop aan de stationaire haak en bevestig de proximale lusknoop aan de haak die aan de servomotorarm is bevestigd. Breng het weefselbad omhoog om de spier onder te dompelen in de beluchte Krebs-Henseleit-oplossing.
      NOTITIE: Beluchting mag de spier niet verstoren wanneer deze ondergedompeld is. Als dit het geval is, verlaag dan de druk van het gas. Laat de spieren 10 minuten in evenwicht zijn voordat u met de stimulatie begint.
  3. Meet de maximale isometrische kracht van de EDL-spier.
    NOTITIE: Raadpleeg Tabel 1 voor een protocol voor het meten van de maximale isometrische kracht met behulp van spiertrekkingen en tetanus. Zie aanvullende figuur 1 voor een illustratie van het programma dat door de auteurs is gebruikt.
    1. Stimuleer de spier met een supramaximale spiertrekkingen om ervoor te zorgen dat de spier niet is beschadigd tijdens de operatie (80 V, 1 pps, 1ms; Tabel 1; zie aanvullende figuur 2). Als er geen schade is opgetreden, gebruik dan de lengteknop op het spierhefboomsysteem om een spierlengte te vinden met behulp van twitch-stimulatie waarbij de actieve spanning ~1V / 0.1271 N is met minder dan ~0.1V / 0.01271N passieve spanning.
    2. Noteer de startlengte van de spier van hechtknoop tot hechtknoop in volt en millimeters. Voer metingen in het kalibratiegedeelte van het programma in voor de startlengte (zie aanvullende afbeelding 1).
    3. Vind de maximale isometrische kracht van de supramaximale spiertrekkingen op de optimale lengte (L0) van EDL (tabel 1). Technisch gezien is er geen rustperiode nodig, maar 1 minuut wachten tussen stimulaties stabiliseert de passieve spanning. Noteer de lengte (in Volt) waarop de supramaximale spiertrekkingen maximaal zijn. Dit is de optimale spierlengte (L0) voor spiertrekkingen.
    4. Meet de spier met schuifmaten op deze lengte. Meet de spier van hechtknoop tot hechtknoop. Zodra L 0 is gevonden, verkort u de spier terug tot de startlengte (actieve spanning ~1V / 0,1271 N).
    5. Vind de maximale isometrische kracht van EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabel 1). Noteer de lengte (in volt en millimeter) van de supramaximale tetanische kracht bij L0 en meet de vezels van hechtknoop tot hechtknoop opnieuw met schuifmaten.
      OPMERKING: Het vergroten van de spierlengte in stappen van 0,5 V/0,65 mm zal resulteren in een nauwkeurigere L0 voor zowel spiertrekkingen als tetanus.
    6. Zoek de submaximale isometrische kracht van EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabel 1) op L0 voor en na het experiment om ervoor te zorgen dat er geen vermoeidheid optrad door het stimulatieprotocol. Een afname van 10% in kracht wordt beschouwd als een "vermoeide" spier.
Experiment Simulatie-intensiteit (V) Pulsfrequentie (pps / Hz) Stimulatieduur (ms) Opmerkingen
1. "Opwarmen" 80 1 1 Verhoog of verklein de lengte met 0,50 V om een passieve spanning van 1 V te vinden
2. Optimale spierlengte spiertrekkingen (L0) 80 1 1 Verhoog of verklein de lengte met 0,50 V om een passieve spanning van ~1 V te vinden
3. Optimale spierlengte tetanus (L0) 80 180 500 Rust 3 minuten tussen het veranderen van de lengte met 0.50 V
4. Pre-experiment submaximale L0 45 110 500 Lengte van L0
6. Avatar experimenten 45 110 Gebruik cyclisch representatieve lengteveranderingen voor muis EDL
7. Submaximale L0 na het experiment 45 110 500 Keer terug naar L0 na experiment en meet L0

Tabel 1: Stimulatieprotocol. Stimulatieprotocol voor het vinden van supramaximale en submaximale spiertrekkingen en tetanus optimale lengte. Het protocol varieert per stimulatie-intensiteit, timing en pulsen per seconde.

3. Voltooiing van de "avatar"-werklustechniek met behulp van geselecteerde in vivo rektrajecten

  1. Stel de software in die nodig is om "avatar"-werklustechnieken te voltooien (zie Tabel met materialen).
    OPMERKING: Een invoerbestand (.csv of iets dergelijks) dat de spierlengte bij elke stap specificeert, is nodig (zie stap 1.4). Inputs voor het percentage van de cyclus waarbij de stimulatie begint en voor de duur van de stimulatie zijn nodig (zie bijvoorbeeld aanvullende figuur 3 ).
  2. Voltooi de "avatar" werklustechniek.
    OPMERKING: Hoewel we een aangepast LabView-programma gebruiken, kunnen onderzoekers elk programma gebruiken waarmee lengteveranderingen in de EDL van de muis op een servomotorhendel kunnen worden geregeld, het begin (%-cyclus) en de duur (ms) van stimulatie op bepaalde tijdstippen kunnen worden gecontroleerd en spierkracht kan worden gemeten. Zie aanvullende figuur 3 voor een illustratie van het programma dat de auteurs gebruiken.
    1. Upload de geschaalde rekveranderingen met geschaalde lengte-excursie in het programma vanaf stap 1.4. Zie stap 1.4, 3.3 en de sectie Discussie voor meer informatie over "geschaalde stamveranderingen".
    2. Pas indien nodig de startlengte van de spier aan (zie rubriek 3.3). Voer de startlengte in V en mm in om de resultaten te kalibreren (zie aanvullende afbeelding 3).
    3. Gebruik het begin en de duur van de stimulatie zoals berekend in stap 1.3.
    4. Laat de spier gedurende twee cycli door de geschaalde lengteveranderingen lopen met een bepaalde lengte-excursie.
    5. Gegevens opslaan. Als er meerdere stimulatieprotocollen op dezelfde spier worden verzameld, wacht dan 3 minuten tussen elke stimulatie.
    6. Stimuleer op optimale lengte (L0) met behulp van submaximale activering om te bepalen of er vermoeidheid is opgetreden. Als de kracht met meer dan 10% afneemt, worden spieren als vermoeid beschouwd. Zie tabel 1 voor stimulatieprotocollen.
    7. Haal de spier uit het bad. Knip de knopen van de spier door en dep de overtollige oplossing van de spier. Weeg de spier. Bepaal de fysiologische dwarsdoorsnede met behulp van de standaardformule: spiermassa/(L0*1,06)19.
  3. Stem de parameters af voor de "avatar"-werklustechniek (zie de sectie Discussie).
    1. Bepaal de beginlengte en lengte-uitloop door de ex vivo passieve spanningsstijging af te stemmen op de passieve spanningsstijging die in vivo wordt waargenomen (Figuur 2).
      OPMERKING: Deze studie gebruikte percentage L 0 om de startlengte (mm) en de excursie te schalen (% L0; zie stap 1.4 en de sectie Discussie). Voor het afstemmen van de spanningsstijging in ex vivo muis EDL met die van de in vivo rat MG, vonden de auteurs dat de startlengte bij L0 de beste pasvorm opleverde (Figuur 2).
    2. Kies drie startlengtes (bijv. -5% L 0, L 0 en +5% L0). Voer de "avatar"-werklus uit op elk van deze startlengtes met een gespecificeerde lengte-excursie (bijv. 10% L0).
      OPMERKING: In de huidige "avatar"-experimenten met EDL van muizen werd een lengte-excursie van 10% L0 gebruikt.
    3. Herhaal dit met nieuwe startlengtes en/of excursie totdat de snelheid van de ex vivo passieve spanningsstijging vergelijkbaar is met de snelheid van de in vivo passieve spanningsstijging (zie figuur 2B).
    4. Afhankelijk van de vezeltypes en de activeringsdynamiek van de gebruikte spieren, verhoogt of verkort u de duur van de stimulatie om de match tussen ex vivo en in vivo kracht te optimaliseren. Het kan dus nodig zijn om het begin en/of de duur van de stimulatie aan te passen aan de in vivo krachtproductie tijdens "avatar"-experimenten.
    5. Om te beslissen of dit nodig is (zie de sectie Discussie), zet u de kracht in de tijd van de "avatar" en de in vivo spier uit (Figuur 3) en berekent u de bepalingscoëfficiënt R2 door de geschaalde correlatie tussen de spierkracht van het doel en de "avatar" te kwadrateren (zie Representatieve resultaten).

Figure 2
Figuur 2: Bijpassende passieve spanningsstijging. Werklussen die de in vivo en ex vivo stijging van de passieve spanning aangeven (pijlen). In vivo geschaalde werklus van rat MG (zwart) die loopt met 2,9 Hz (gegevens van Wakeling et al.15). Ex vivo geschaalde werklussen van muis EDL (groen) bij 2.9 Hz. (A) Startlengte van muis EDL-spier is +5% L0. (B) De startlengte van de EDL-spier van de muis is L0. Merk op dat de ex vivo passieve spanningsstijging overeenkomt met de in vivo spanningsstijging in A, maar niet in B. Dikkere lijnen duiden op stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: Optimalisatie van de stimulatieduur van EDL bij muizen om in vivo de kracht van MG bij ratten te evenaren (zwarte lijn). De kracht die wordt gegenereerd door de EDL van de muis met behulp van de op EMG gebaseerde stimulatie (groene stippellijn) neemt eerder af dan de in vivo kracht, waarschijnlijk als gevolg van een snellere deactivering van de EDL van de muis in vergelijking met MG bij ratten. Om de fit tussen de in vivo en ex vivo krachten te optimaliseren, werd de muis EDL voor een langere duur gestimuleerd (ononderbroken groene lijn). EMG-gebaseerde stimulatie R 2 = 0,55, geoptimaliseerde stimulatie R2 = 0,91. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Het doel van de "avatar"-experimenten is om in vivo krachtproductie en werkoutput zo goed mogelijk na te bootsen tijdens ex vivo werklusexperimenten. Deze studie koos ervoor om muizen-EDL te gebruiken als een "avatar" voor MG bij ratten, omdat EDL bij muizen en MG bij ratten beide voornamelijk bestaan uit snellespiertrekkingen20,21. Beide spieren zijn primaire bewegers van het enkelgewricht (EDL enkel dorsiflexor, MG enkel plantairflexor) met vergelijkbare pennatiehoeken (muis EDL 12,4 + 2,12°22, rat MG 20° gebruikt in deze studie15). Geschaalde representatieve werklussen van MG15 bij ratten werden vergeleken met ex vivo "avatar"-experimenten (Figuur 4) met behulp van twee verschillende stimulatieprotocollen (één van gemeten EMG-activiteit en één geoptimaliseerd zoals in stap 3.3). De hier gepresenteerde R 2-waarden zijn berekend met behulp van de volledige geschaalde rek-verkortingscyclus (2 cycli/conditie), waarbij elke cyclus meer dan 2000 punten heeft die overeenkomen met de bewegingssnelheid (stap = 5521 punten, draf = 5002, galop = 2502 punten). Werklussen werden geschaald om rekening te houden met verschillen in spieromvang, P0 en PCSA. Schalen werd gedaan door kracht en rek lineair in kaart te brengen op een vergelijkbare schaal (0-1) om MG bij ratten en EDL bij muizen te vergelijken. Visueel is het duidelijk dat het optimaliseren van het stimulatieprotocol (Figuur 4B) om rekening te houden met verschillende activeringsdynamieken van de EDL- en ratten-MG-spieren van muizen de pasvorm voor de in vivo MG-kracht van de rat verbetert in vergelijking met de op EMG gebaseerde activering (zie de sectie Discussie). Voor de EDL van de muis verhoogde een ongeveer verdubbeling van de stimulatieduur voor langzamere belastingstrajecten (stap en draf) de R2 met 62% in stap en 109% in draf. Voor het snellere spanningstraject (galop) verhoogde het verhogen van de stimulatietijd met de helft van de waargenomen tijd de R2 met 22%.

Figure 4
Figuur 4: Vergelijking van in vivo en ex vivo werklussen. Werklussen van in vivo rat MG (zwart) en ex vivo muis EDL (groen) tijdens het lopen (2,9 Hz) met behulp van in vivo rektrajecten. De dikkere lijn duidt op stimulatie in zowel in vivo als ex vivo werklussen. (A) Werklus van in vivo rat MG (zwart) en ex vivo muis EDL (groen gestippeld) tijdens het lopen met behulp van een op EMG gebaseerd stimulatieprotocol. (B) Werklus van in vivo rat MG (zwart) en ex vivo muis EDL (continu groen) tijdens het lopen (2,9 Hz) met behulp van geoptimaliseerde stimulatie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Een hoge R2 tussen de ex vivo krachtproductie van EDL bij muizen en de in vivo krachtproductie van mediale gastrocnemius (MG)15 bij ratten duidt op een goede replicatie (figuur 5). In EMG-gebaseerde stimulatie-experimenten waren de gemiddelde R2-waarden 0,535, 0,428 en 0,77 voor respectievelijk stap, draf en galop. In geoptimaliseerde stimulatie-experimenten waren de gemiddelde R2-waarden respectievelijk 0,872, 0,895 en 0,936 in stap, draf en galop. Zoals eerder besproken (stap 3.3, figuur 5), kan het zijn dat het stimulatieprotocol, afhankelijk van de activeringsdynamiek van de gebruikte spieren, ook moet worden geoptimaliseerd. De voorspelling van in vivo MG-kracht met behulp van ex vivo EDL bij muizen werd verbeterd voor alle locomotorische snelheden door de stimulatie te optimaliseren, R2 te verhogen (Figuur 5A,B) en de gemiddelde kwadraatfout (RMSE) te verlagen. RMSE verlaagd na optimalisatie voor alle snelheden (Figuur 6). De gemiddelde RMSE voor EMG-gebaseerde stimulatie was 0,31, 0,43 en 0,158 voor stap, draf en galop. De gemiddelde RMSE voor geoptimaliseerde stimulatie was 0,181, 0,116, 0,101 voor stap, draf en galop.

Figure 5
Figuur 5: R 2 Waarden voor in vivo en ex vivo krachtproductie: Doos en snorharen grafiek van R2 waarden voor in vivo en ex vivo krachtvergelijkingen. Individuele waarnemingen uitgezet, mediaan, 25e en 75epercentiel aangegeven. (A) R 2-waarden voor in vivo en ex vivo krachtproductie met behulp van stimulatieprotocol op basis van gemeten in vivo EMG-signaal tijdens stappen bij 2,9 Hz (groen), draven bij 3,2 Hz (magenta) en galopperen bij 6,2 Hz (cyaan). (B) R 2-waarden voor in vivo en ex vivo krachtproductie met behulp van geoptimaliseerde stimulatie (zie figuur 2). Het optimaliseren van het begin en de duur van de stimulatie verhoogde R2 voor alle gangen. EMG-gebaseerde stimulatie: stap R 2 = 0,50-0,55, draf R2 = 0,37-0,47, galop R2= 0,62-0,90; geoptimaliseerde stimulatie: stap R 2 = 0,74-0,93, draf R 2 = 0,85-0,92, galop R2 = 0,87-0,97. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 6
Figuur 6: Wortelgemiddelde kwadratische fout (RMSE) voor in vivo en ex vivo krachtproductie. Doos- en snorhaardiagram van RMSE-waarden voor in vivo en ex vivo krachtvergelijkingen. Individuele waarnemingen uitgezet, mediaan, 25e en 75epercentiel aangegeven. (A) RMSE-waarden voor in vivo en ex vivo krachtproductie met behulp van een op EMG gebaseerd stimulatieprotocol. (B) RMSE-waarden voor in vivo en ex vivo met behulp van een geoptimaliseerd stimulatieprotocol. Door het begin en de duur van de stimulatie te optimaliseren, werd de RMSE voor alle gangen verminderd. Lopen met 2,9 Hz (groen), draven met 3,2 Hz (magenta) en galopperen met 6,4 Hz (cyaan). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Om de prestaties van traditionele werklusmethoden te testen bij het voorspellen van in vivo spierkrachten, werden ook sinusvormige werklussen uitgevoerd voor de muis EDL met dezelfde frequentie, lengte-excursie, startlengte, stimulatiebegin en duur als voor de "avatar"-experimenten met behulp van in vivo MG-stamtrajecten bij ratten. R2-waarden waren significant lager dan voor de in vivo stamtrajecten voor zowel EMG-gebaseerde als geoptimaliseerde stimulatieprotocollen (Figuur 7). Gemiddelde R2-waarden voor EMG-gebaseerde stimulatie met behulp van sinusvormige lengtetrajecten waren 0,062, 0,067 en 0,141 bij stap-, draf- en galopfrequenties. Gemiddelde R2-waarden voor geoptimaliseerde stimulatie met behulp van sinusvormige lengtetrajecten waren 0,09, 0,067 en 0,141 bij stap-, draf- en galopfrequenties.

Figure 7
Figuur 7: R2 Waarden voor in vivo en ex vivo krachtproductie met behulp van sinusvormige lengteveranderingen. Doos- en snorhaardiagram van RMSE-waarden voor in vivo en ex vivo krachtvergelijkingen. Individuele waarnemingen uitgezet, mediaan, 25e en 75epercentiel aangegeven. R 2-waarden voor stap (groen, 2,9 Hz), draf (magenta, 3,2 Hz) en galop (cyaan,6,2 Hz) met behulp van sinusvormige lengteveranderingen met EMG-gebaseerde (doorschijnende) en geoptimaliseerde (ondoorzichtige) stimulatieprotocollen. Voor zowel EMG-gebaseerde als geoptimaliseerde stimulatie waren de R2-waarden lager voor de sinusvormige lengteveranderingen dan voor in vivo lengteveranderingen. EMG-gebaseerde stimulatie: stap R 2 = 0,00 - 0,30, draf R2 = 0,00 - 0,02, galop R2= 0,03 - 0,07; optimale stimulatie: stap R 2 = 0,02 - 0,21, draf R 2 = 0,02 - 0,12, galop R2 = 0,12 - 0,17. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Werklussen geproduceerd door de ex vivo muis EDL-spier met behulp van sinusvormige lengtetrajecten bootsen in vivo de MG-kracht van de rat niet zo nauwkeurig na in vivo in vergelijking met in vivo stamtrajecten (Figuur 8). De verandering in het werk dat wordt veroorzaakt door sinusvormige versus in vivo rektrajecten kan worden verklaard door de afwezigheid van rek- en snelheidstransiënten in het sinusvormige traject (figuur 9). Terwijl de spieren op vergelijkbare lengtes werden gestimuleerd tijdens de actieve verkortingsfase van de contracties in zowel sinusvormige trajecten als in vivo-gebaseerde rektrajecten, vond het begin van stimulatie plaats in verschillende fasen van de cyclus (bijv. het begin van de stimulatie vond plaats in een fase van 74% voor stimulatie op basis van draf-EMG, maar in een fase van 43% voor op EMG gebaseerde stimulatie op basis van lopen EMG; zie sectie Discussie).

Figure 8
Figuur 8: Vergelijking van in vivo en ex vivo sinusvormige werklussen. (A) In vivo werklus (zwart) van rat MG en ex vivo werklus (gestippeld magenta) van muis EDL met behulp van sinusoïdale rektraject en EMG-gebaseerde stimulatie. (B) In vivo werklus (zwart) van rat MG en ex vivo werklus (vast magenta) van muis EDL met behulp van sinusoïdale rektraject en geoptimaliseerde stimulatie. Merk op dat de sinusvormige werklussen het in vivo werk overschatten vanwege de afwezigheid van rek- en snelheidstransiënten in het sinusvormige traject. EMG-gebaseerde stimulatie R 2 = 0,0003, geoptimaliseerde stimulatie R2 = 0,084. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Figure 9
Figuur 9: Vergelijking van in vivo rek en ex vivo sinusvormige lengtetrajecten. Vergelijking van in vivo stam en ex vivo sinusvormige lengtetrajecten bij stap (groen), draf (magenta) en galop (blauw). De ononderbroken lijn is in vivo stamtraject. Stippellijn ex vivo sinusvormig lengtetraject. Het gemarkeerde gedeelte is stimulatie. De stimulatie begon op dezelfde lengte tijdens de verkortingsfase van de pas. Pijlen die rek- en snelheidstransiënten aangeven. Afwijkingen van sinusvormig zijn impedantie van krachten van buitenaf op spieren. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Aanvullende afbeelding 1: Programma dat wordt gebruikt om isometrische maximale kracht op optimale lengte te verzamelen. Het programma dat wordt gebruikt om de optimale lengte te bepalen tijdens supramaximale en submaximale spiertrekkingen en tetanische stimulatie. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende figuur 2: Levensvatbare twitch-respons . Twitch-reactie van muis EDL. Twitch-kracht stijgt en daalt snel en moet een actieve spanning bereiken van ~1 V. "Ruis" moet minimaal zijn nadat de maximale actieve spanning is bereikt. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullende afbeelding 3: Programma dat wordt gebruikt om werklusgegevens te verzamelen. Het programma dat wordt gebruikt om de spierlengte en timing van stimulatie in ex vivo werklussen te regelen. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Aanvullend coderingsbestand 1: MATLab-code die wordt gebruikt om een experimenteel protocol voor de werklus te segmenteren en te maken. MATLab-code die werd gebruikt om informatie over doelstappen (lengte, EMG-activering en kracht) te segmenteren in individuele stappen. Code omvat het schalen en interpoleren van stappen van doeldieren in lengtes die ex vivo muis EDL kan uitrekken. Bevat bovendien code om het EMG-signaal af te vlakken en de activering te vergelijken om het begin en de duur van de stimulatie te selecteren in ex vivo werklusexperimenten. Klik hier om dit bestand te downloaden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Terwijl organismen zich naadloos door landschappen bewegen, variëren de onderliggende belastingen en spanningen die de spieren ervaren drastisch 1,6,23. Tijdens zowel in vivo voortbeweging 1,24 als in "avatar" experimenten worden spieren submaximaal gestimuleerd onder cyclische, niet-stabiele omstandigheden. De isometrische kracht-lengte- en isotone kracht-snelheidsrelaties zijn niet goed geschikt voor het voorspellen van spierkracht onder deze omstandigheden2. Het begrijpen van de effecten van niet-stabiele spanning (d.w.z. transiënten) en belasting is essentieel voor het voorspellen van krachtproductie tijdens in vivo beweging, en is daarom de belangrijkste reden voor het ontwikkelen van deze "avatar"-experimenten2. "Avatar"-experimenten stellen ons in staat om spierbelasting en spanningstrajecten te controleren terwijl we de krachtoutput meten. De "avatar"-techniek onderzoekt de krachtrespons van spieren onder in vivo-achtige omstandigheden, zonder verstorende factoren van neurale controle en peescompliantie. Om de "avatar"-experimenten uit te voeren, hebben onderzoekers een programma nodig waarmee een spier voorgeschreven lengteveranderingen kan ondergaan met het vermogen om te stimuleren bij verschillende startlengtes en voor verschillende duur (zie aanvullende figuur 3 voor het programma dat de auteurs gebruiken). Onderzoekers moeten de startspierlengte (mm), de lengte van de excursie (mm), het begin van de stimulatie (% van de cyclusduur) en de duur van de stimulatie (ms) specificeren voordat ze experimenten uitvoeren (zie stappen 1.3-1.4om waarden voor deze parameters te verkrijgen). In het algemeen is het vaak wenselijk om stappen te kiezen die representatief zijn voor alle stappen in de proef (bijv. beginnen en eindigen met een vergelijkbare lengte, een vergelijkbare piekkracht bereiken, gemiddelde EMG-activiteit hebben, enz.). Bepalen of EMG/activatie- en krachtgegevens van een geselecteerde pas representatief zijn voor andere stappen in dezelfde proef kan nuttig zijn voor "afstemming" later, wat kan worden gedaan door werklussen (kracht versus lengte) van de hele proef uit te zetten met behulp van de spier van het doeldier. Tijdens tweevoetige en viervoetige voortbeweging bakent de kortste lengte tot de kortste lengte over het algemeen een hele pas af (toe-af tot teen-af), maar EMG-activering kan variëren. Bij sommige dieren en spieren is EMG-activering nauw gecorreleerd met voetcontact, zoals de hier getoonde MG bij ratten22. Bij andere dieren, zoals de zijdelingse gastrocnemius van parelhoenders, vindt EMG-activering over het algemeen plaats op de langste lengte om meer stabiliteit te bereiken tijdens onbekend terrein25.

Om "avatar"-experimenten uit te voeren, is het belangrijk om de ruis in de ex vivo krachtgegevens te minimaliseren. Krachtmetingen zijn gevoelig voor verschillende problemen, waaronder maar niet beperkt tot het scheuren van de spieren tijdens de operatie, compliantie van de hechtingen als de lusknopen te lang zijn, onjuiste schaling van de lengte-invoer en -excursie, en spiervermoeidheid. Spierscheuren komen vaak voor bij het "ontleden van de pocket" (stap 2.2.3) en het leggen van de lusknoop rond het proximale deel van de pees (stap 2.2.4). Tijdens het "ontleden van de zak" voorkomt u dat de uiteinden van de EDL de EDL inkerven. Bovendien zal het wegtrekken van de dissectieschaar en distaal tijdens het stomp ontleden ook het contact tussen de dissectieschaar en de EDL-spieren beperken. Bovendien moeten de spieren vochtig worden gehouden met de Krebs-Henseliet-oplossing tijdens de voorbereiding van de operatie en bij gebruik op de rig.

Het correct schalen van lengte-invoer is ingewikkelder. De passieve en actieve kracht van de spieren kunnen worden beïnvloed als de startlengte en/of excursie niet goed worden geschaald. De ex vivo stijging van de passieve spanning moet overeenkomen met de in vivo stijging van de passieve spanning (zie figuur 1). Een schaalprobleem dat in eerdere experimenten is waargenomen, is dat zowel passieve als actieve spanning kan worden beïnvloed als de lengte-excursie (beginnende lengte naar langste lengte) te klein of te groot is. Theoretisch zouden spieren een piekkracht moeten bereiken in de buurt van hun optimale lengte (L 0)26, daarom gebruiken we de optimale lengte (L0) om in vivo spierlengtes te schalen in ex vivo "avatar" -experimenten om de in vivo krachtproductie nauwkeurig te repliceren. Architecturale verschillen tussen spieren zullen een rol spelen bij het bepalen van de startlengte en lengte-excursieparameters. Hoewel de optimale lengte (L0) wordt gevonden tijdens supramaximaal gestimuleerde isotone en isometrische omstandigheden, kan het gebruik ervan als een schaalmetriek in "avatar"-experimenten mogelijk beperkingen van de kracht-lengte- en kracht-snelheidsrelaties tijdens cyclische beweging aan het licht brengen die meer onderzoek behoeven. In de meeste steady-state omstandigheden kunnen de momentane lengte, snelheid en activering van de spier (d.w.z. kracht-lengte en kracht-snelheidseigenschappen) worden gebruikt om kracht en werkoutput met redelijke nauwkeurigheid te voorspellen 12,24,27. Onder dynamische omstandigheden met variabele belasting neemt de kracht toe als functie van snelheid28 en heeft een complexe relatie met rek en activering29,30. Dit is in tegenspraak met de isotone kracht-snelheid en isometrische kracht-lengte eigenschappen van spieren28. Bij de MG van de rat zijn rek- en snelheidstransiënten het bewijs van belasting, zoals voetcontact of interactie met de omgeving (d.w.z. ruw terrein, wind, plotselinge verandering van richting om predatie te voorkomen) (Figuur 9). Deze MG-stamtrajecten van ratten hebben, zoals de meeste realistische omstandigheden, plotselinge veranderingen in de toegepaste belasting, krachtproductie en werkoutput 2,28. Deze experimentele methode heeft tot doel deze complexe interacties tussen rek, snelheid en activeringsdynamiek te benadrukken onder in vivo omstandigheden die niet goed worden verklaard door traditionele kracht-lengte- en kracht-snelheidsrelaties.

Andere problemen kunnen optreden wanneer de startlengte van de spier te kort of te lang is. Een te korte startlengte zal resulteren in een verminderde stijging van de spanning tijdens de passieve en actieve stretch (niet afgebeeld), terwijl een te lange startlengte zal resulteren in een verhoogde stijgingssnelheid van de passieve spanning (zie figuur 1B). Het gebruik van de verhouding tussen actieve en passieve spanning kan nuttig zijn. Bij MG bij ratten is de passieve spanning (N) bijvoorbeeld over het algemeen ongeveer de helft van de actieve spanning (Figuur 2). Als een spier op een te lange lengte begint en/of tot een te lange lengte wordt uitgerekt, kan de passieve spanning te hoog zijn ten opzichte van de actieve spanning (zie figuur 1B) en kan de kracht snel afnemen door overstrekking. Ook zal het uitrekken tot een te lange lengte de spier mogelijk beschadigen en ervoor zorgen dat de spier sneller vermoeid raakt. Bovendien kan actieve spanning niet gefuseerd lijken als de startlengte te kort is en/of de spier niet lang genoeg is uitgerekt.

Voorbereidende experimenten zijn nodig om de startlengte en excursie te bepalen op basis van L0. Aanvullende voorbereidende experimenten kunnen nodig zijn om de duur van de stimulatie aan te passen als de activeringsdynamiek van de gebruikte spieren anders is. Deze optimalisaties zijn nodig omdat de vezeltypesamenstelling en/of activeringsdynamiek van in vivo en ex vivo spieren kunnen verschillen. In onze representatieve resultaten (Figuur 4 en Figuur 5) gebruikten we twee stimulatieprotocollen voor EDL bij muizen tijdens ex vivo-experimenten om in vivo de MG-krachtproductie van ratten te repliceren. Om de krachtproductie in de EDL van de muis te optimaliseren om zo goed mogelijk in vivo MG bij ratten te passen, werd de stimulatieduur verlengd (Figuur 2 en Figuur 3). Rat MG bestaat uit langzamere vezeltypes dan muis EDL31,32,33. Dit was duidelijk in "avatar"-experimenten omdat ex vivo EDL-spieren van muizen sneller kracht produceerden na excitatie, en kracht sneller afnam na deactivering dan in vivo werd waargenomen bij MG15 bij ratten (Figuur 2), zelfs na rekening te hebben gehouden met verschillen in excitatie-contractievertraging tussen in vivo en ex vivo condities34. Afhankelijk van de ex vivo en in vivo doelspieren, kan optimalisatie van stimulatie ook nodig zijn in andere "avatar" -experimenten. Zowel de EDL- als de soleus-spieren (SOL) van de muis kunnen worden gebruikt in deze ex vivo werklustechniek. EDL werd gekozen als een "avatar" voor de rat MG vanwege de overeenkomsten in spiervezeltype en pennatiestructuur. Het is mogelijk dat sommige spieren een complexe structuur hebben en niet kunnen worden nagebootst met behulp van spieren van laboratoriumknaagdieren als een "avatar".

Hoewel "avatar"-experimenten enige handmatige optimalisatie nodig hebben om de in vivo krachtproductie zo goed mogelijk na te bootsen, is de techniek toepasbaar op een verscheidenheid aan verschillende dieren en bewegingsmodi. De "avatar"-techniek kan vooral nuttig zijn om in vivo krachtproductie te begrijpen bij dieren waarvan de spieren te groot of anderszins ontoegankelijk zijn voor ex vivo experimenten. Hoewel er alleen voorbereidend werk is gedaan op grotere dieren35, heeft dit werk potentieel aangetoond voor de toepasbaarheid van deze techniek op dieren, spieren en locomotorische gang met behulp van laboratoriummuizen als "avatars". Het nut van "avatar"-experimenten hangt af van hoe nauwkeurig een handig, goedkoop, direct beschikbaar en goed gekarakteriseerd laboratoriumknaagdiermodel (d.w.z. muis EDL) kan worden gebruikt voor het begrijpen van in vivo mechanica van verschillende spieren van verschillende soorten gewervelde dieren. Resultaten van voorlopige "avatar"-experimenten die hier (rat MG) en elders (parelhoen LG19) worden gepresenteerd, suggereren dat deze techniek kan worden gebruikt om in vivo krachten nauwkeurig te voorspellen en kan worden toegepast op andere dieren. Toekomstige toepassingen van deze methode zouden de soorten spieren en dieren moeten uitbreiden die zijn gebruikt als zowel doelwit als "avatar" tijdens ex vivo en in vitro experimenten. "Avatar"-experimenten stellen ons in staat om factoren te onderzoeken die van invloed zijn op spierkracht en werkoutput tijdens in vivo voortbeweging wanneer spierbelasting en -spanning abrupt variëren 1,2,19. In het bijzonder stelt de "avatar"-methode ons in staat om de effecten van rek- en snelheidstransiënten op spierkracht te onderzoeken die niet worden vastgelegd door traditionele spiermodellen of sinusvormige werklusexperimenten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle auteurs erkennen dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.

Acknowledgments

We danken Dr. Nicolai Konow voor het verstrekken van de gegevens die in deze studie zijn gebruikt. Gefinancierd door NSF IOS-2016049 en NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561 (2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242 (2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312 (2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721 (2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669 (2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019 (2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Tags

Avatar Ex Vivo Work Loop Experimenten In Vivo Spanning Activering Bewegingsgedrag Spierkrachtproductie Werkoutput Neurale En Mechanische Systemen Biologische Organisatie Controlehiërarchie Spiermodellen In Vivo Spierkracht In Vivo Spierwerk Spiermechanica Rek- en Belastingsomstandigheden In Vivo Voortbeweging Rek- en Snelheidstransiënten Neurale Activering Musculoskeletale Kinematica Omgevingsbelastingen Avatar Techniek
"Avatar", een gemodificeerde <em>ex</em> vivo werklus experimenten met in <em>vivo</em> stam en activering
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter