Summary
本稿では、実験用げっ歯類の「アバター」筋を用いて、ex vivoワークループ実験中にin vivo筋力の産生をエミュレートし、筋力応答に対するひずみ過渡現象と活性化の寄与を評価する方法論について詳述する。
Abstract
運動行動は、筋力の生成と仕事の出力から生じる動的システムの創発的特徴です。神経系と機械系の相互作用は、走っているときの脚の筋肉特性の調整から、地面と相互作用する手足のダイナミクスまで、生物学的組織のすべてのレベルで同時に発生します。動物が神経制御戦略を制御階層の内在的な筋力学(「前反射」)にシフトする条件を理解することで、筋肉モデルは生体内の筋力を予測し、より正確に機能できるようになります。in vivoの筋力学を理解するためには、in vivoの運動と同様に、動的に変化するひずみや負荷条件下での筋力や作業のex vivoによる研究が必要です。in vivoのひずみの軌跡は、通常、神経活性化、筋骨格運動学、および環境によって加えられる負荷の間の相互作用から生じる急激な変化(すなわち、ひずみと速度の過渡現象)を示します。私たちの「アバター」技術の主な目的は、筋力の生成に対する固有の機械的特性の寄与が最大になる可能性があるときに、ひずみ速度と負荷の急激な変化中に筋肉がどのように機能するかを調査することです。「アバター」技術では、従来のワークループアプローチを、測定されたin vivoのひずみ軌跡と、動的な動き中の動物からの筋電図(EMG)信号を使用して修正し、複数の伸長短縮サイクルを通じてex vivo筋肉を駆動します。このアプローチはワークループ法と似ていますが、in vivoひずみの軌跡が適切にスケーリングされ、サーボモーターに取り付けられたex vivoマウスの筋肉に課せられる点が異なります。この手法により、(1)in vivoのひずみ、活性化、歩幅周波数、およびワークループパターンをエミュレートします。(2)これらのパターンを変化させて、in vivoの力の応答を最も正確に一致させます。(3)制御された組み合わせでひずみおよび/または活性化の特定の特徴を変化させて、メカニズム仮説をテストします。
Introduction
動く動物は、複雑な環境の中で、持久力、スピード、敏捷性という印象的な運動能力を発揮します。動物の移動は、人間が操作した機械とは対照的に、特に印象的であり、現在の脚を持つロボット、義足、外骨格の安定性と敏捷性は、動物に比べて劣っています。自然地形での脚移動では、速度と操縦環境の特徴を変化させるために、正確な制御と迅速な調整が必要であり、予期せぬ摂動として作用します1,2,3,4。しかし、非定常運動を理解することは、ダイナミクスが物理的環境、筋骨格力学、感覚運動制御の間の複雑な相互作用に依存するため、本質的に困難です1,2。脚移動には、感覚情報の迅速なマルチモーダル処理と、四肢と関節の協調的な作動により、予期せぬ摂動に対応する必要があります1,5。究極的には、運動は、筋骨格系の本質的な機械的特性と神経制御によって力を生み出す筋肉によって可能になります1,5,6,7。ニューロメカニクスの未解決の問題は、これらの要因がどのように相互作用して、予期せぬ摂動に応答して協調的な動きを生み出すかということです。次の手法は、「アバター」筋肉を使用した制御可能なex vivo実験中に、in vivoひずみ軌跡を使用して、変形に対する筋肉の固有の機械的応答を利用します。
筋運動ループ法は、周期的な動きの間の内在的な筋肉力学を理解するための重要なフレームワークを提供しました8,9,10。従来のワークループ法は、in vivo実験中に測定された周波数と活性化パターンを使用して、事前に定義された、通常は正弦波のひずみ軌道を介して筋肉を駆動します2,8,9,11。正弦波長の軌跡を用いることで、環境との相互作用や筋骨格系の運動学によってひずみの軌跡が急激に変化しない条件下で、フライト12とスイミング2中の仕事量と出力を現実的に見積もることができます。しかし、脚の移動中のin vivoでの筋緊張の軌跡は、神経活性化、筋骨格運動学、および環境によって加えられる負荷の間の相互作用から動的に発生します5,7,13,14。in vivoの筋腱のダイナミクスに対応し、内因的な筋肉力学と神経制御がどのように相互作用して摂動に直面したときに協調的な動きを生み出すかについての洞察を提供する、荷重、ひずみ軌跡、および力の生成をエミュレートするには、より現実的なワークループ技術が必要です。
本研究では、時間とともに変化するin vivo負荷を表すin vivoひずみの軌跡を用いて、制御されたex vivo実験中に実験用げっ歯類の「アバター」筋肉を使用することにより、トレッドミル移動中のin vivo筋力をエミュレートする新しい方法を紹介します。 制御されたex vivo実験中に、標的筋から測定されたin vivoひずみ軌跡を実験動物の筋肉に使用すると、移動中に経験する負荷をエミュレートします。本稿に記載する実験において、ex vivoマウス長指伸筋(EDL)筋は、トレッドミルでの歩行、速歩、およびギャロップ中に、in vivoラット内側腓腹筋(MG)の「アバター」として使用される13。このアプローチはワークループ法と似ていますが、in vivoひずみの軌跡が適切にスケーリングされ、サーボモーターに取り付けられたex vivoマウスの筋肉に課せられる点が異なります。マウスEDLの筋肉は、ラットMGと比較してサイズ、繊維の種類、構造が異なりますが、これらの違いを制御することは可能です。「アバター」技術により、(1)in vivoのひずみ、活性化、歩幅の周波数、およびワークループパターンをエミュレートします。(2)これらのパターンを変化させて、in vivoの力の応答を最も正確に一致させます。(3)制御された組み合わせでひずみおよび/または活性化の特定の特徴を変化させて、メカニズム仮説をテストします。
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Protocol
すべての動物実験は、北アリゾナ大学のInstitutional Animal Care and Use Committeeによって承認されました。本研究では、60-280日齢の雌雄の野生型マウス(B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J株)の長指伸筋(EDL)を用いた。動物は商業的な供給源( 資料表を参照)から入手し、北アリゾナ大学のコロニーに設立されました。
1. in vivo のひずみ軌道を選択し、 ex vivo ワークループ実験での使用に備える
注:このプロトコルでは、著者(Nicolai Konow、UMass Lowell、私信)に直接提供された in vivo動的運動からの以前の測定値をex vivo 実験で使用しました。元のデータは Wakeling et al.15 のために収集されました。プロトコルを再現するには、時間、長さまたはひずみ、EMG/活性化、および力のデータが必要です。
- 任意のプログラミング プラットフォーム (補足コーディング ファイル 1 で提供されている MATLab コード) を使用して、in vivo 試験全体を個々のストライドにセグメント化します。
- 長さの変化 をプロットします。 in vivo 試験全体の時間です。これは、個々の歩幅(立位から立位)を視覚化し、歩幅間のばらつきを評価するために使用されます(図1)。
- 試行全体のひずみを計算します(長さ(L)/最適長さL0での最大等尺性力)。
- 試行全体から、すべてのストライドを代表し、同様の長さで開始および終了するストライドを選択します。これは、各歩幅を比較するために、互いの長さをグラフ化することで視覚的に行うことができます。
- 代表的なストライドを選択した後、任意のプログラミング プラットフォームを使用して、試験全体からひずみ、筋電図/活性化、および力のデータをセグメント化します (MATLab16 で使用されるコードについては、補足コーディング ファイル 1 を参照)。
- ひずみ、EMG/活性化、または力のサンプリング周波数が異なる場合は、すべてのデータポイントが同じ周波数でサンプリングされるようにデータを補間します。
注:研究者は、試験全体でサンプリングされた各ポイント間の時間間隔に基づいて、キャプチャの頻度を決定できます。変数が同じ頻度でキャプチャされる場合、サンプリング時間は同じになります。
- セグメント化されたストライドの頻度を計算します。
- セグメント化されたストライドの継続時間を秒単位で決定し、1 (秒) を継続時間 (1/duration = # ストライド/秒) で割って、頻度を計算します。
- 頻度に一致させるために 、ex vivo 実験で取得する必要があるデータポイントの数を手動で決定します。
- 2歩するのに必要な時間を計算します。その後の統計分析に必要となる筋肉測定誤差を推定するために、少なくとも1回はストライドを繰り返します。
- 測定されたEMG活動を使用して、ひずみ入力に対する刺激の段階を決定し、 ex vivo ワークループの刺激の開始と期間を決定します。任意のプログラミング プラットフォームを使用できます (この調査で使用したコードについては 、補足コーディング ファイル 1 を参照してください)。
- ひずみ変化と同じx軸範囲(時間)のEMG信号を表示します(図1)。EMG信号を拡大して見えるようにします。これは、EMG信号に任意の数を掛けたり、ひずみとEMGを同じスケールになるように再スケーリングしたり、EMG信号をひずみに追加したりすることで行うことができます。
注:著者らは、MATLabの「rescale」関数を使用して、ひずみとEMGを同じスケールになるように再スケーリングしました( 補足図1を参照)。 - 2つの標準偏差17,18の強度の変化によって示されるように、EMG活動が開始および停止する場所を見つけます。
注:動物や筋肉によっては、筋電図の発症が足の接触(モニカ・デイリー、カリフォルニア大学アーバイン校、パーソナルコミュニケーション)と一致する場合と対応しない場合があります(「ディスカッション」セクションを参照)。 - 筋電図活性化が始まるひずみサイクルの割合(例:40%)と、刺激が発生する時間(例:222 ms)を計算します。
注:研究者は、in vivoでの移動とex vivoでの作業ループで異なり、動物や筋肉ごとに異なる可能性のある励起収縮カップリング(ECC)遅延を考慮する必要があります(たとえば、in vivo ECCはラットMGで24.5 ms、ex vivo ECCはマウスEDLで~5 ms)。
- ひずみ変化と同じx軸範囲(時間)のEMG信号を表示します(図1)。EMG信号を拡大して見えるようにします。これは、EMG信号に任意の数を掛けたり、ひずみとEMGを同じスケールになるように再スケーリングしたり、EMG信号をひずみに追加したりすることで行うことができます。
- ワークループコントローラプログラム用の代表的なひずみ入力を準備します。ひずみと刺激の入力で力の出力をキャプチャできるプログラムであれば、ワークループコントローラプログラムに使用できます(「説明」セクションを参照)。
- 選択したストライドを取り、2サイクルの間 、in vivo 周波数でステップをキャプチャーするために必要な適切な数のポイントまで補間します(ステップ1.2を参照)。
- あらかじめ決められた長さのエクスカーション(ステップ3.3を参照)でストレッチした後、「ひずみゼロ」(L0または95%L0など)で開始および停止するようにストライドを再スケーリングします。
- 必要に応じて、マウスEDLで歪み変化の入力として使用する「スケール」選択ストライド(「説明」セクションを参照)。スケーリングするには、マウスEDLを損傷なく伸縮できる長さのエクスカーションを選択します(例えば、通常、in vivoの種に関係なく、マウスEDLを10%L0で伸ばします)。これは、暫定的な結果に基づいて変更する必要がある場合があります(ステップ3.3を参照)。
図1: in vivo 試験全体の経時的な長さ。 ラットMGの時間に対してプロットされた長さ(mm)ストライドは、最短の長さから最短の長さまでの円で区切られ、単一のストライドと見なされます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
2. ex vivoにおけるマウス筋の最大等尺性力の評価
- 機器と手術のセットアップ。
注: ex vivo ワークループに必要な機器の説明については、「ディスカッション」セクションを参照してください。- オキシチューブニードルバルブをウォータージャケット組織浴に挿入して、組織臓器浴を準備します( 材料表を参照)。オキシチューブを95%02〜5%CO2のガスボンベに接続します。20psiでウォータージャケットティッシュバスを満たします。
- 手術部位の近くにあるKrebs-Henseleit溶液で満たされた結晶化皿(ステップ2.1.3)にガスラインから追加の酸素管を流して、手術部位を準備します。これは、手術中および手術後に筋肉の通気と水分補給を維持するために使用されます。
注:一度に複数の筋肉をマウスから取り出す場合、筋肉はこの曝気溶液に最大4時間保存することもできます。 - (mmol l-1)を含むKrebs-Henseleit溶液1Lを調製する:NaCl(118)。KCl(4.75);MgSO4(1.18);KH2PO4 (1.18);CaCl 2(2.54);HClおよびNaOHを使用して、室温およびpHで7.4までのグルコース(10.0)を添加します(材料表を参照)。HClとNaOHを取り扱うときは、ゴーグルと手袋の適切なPPEを着用してください。
- 室温、pH 7.4のKrebs-Henseleit溶液を浴槽に充填します。筋肉とフックを溶液に完全に浸します。
- すべての機器の電源を入れます。デュアルモードマッスルレバーシステム、スティミュレータ、および信号インターフェース(DAQボード)( 材料表を参照)。
- EDL筋肉解剖。
- マウスに深く麻酔をかけた後、子宮頸部脱臼による安楽死を行います。マウスを右または左の横臥位に置き、上部の後肢を伸ばし、つま先を解剖ボードに触れさせます。足首から膝関節の上まで毛皮を取り除きます。
- 鉗子で皮膚をテント状にし、足首の関節から股関節の部分まで切ります。筋肉が露出したら、ズボンの「裾」のように足首の周りをカットします。皮膚を引き上げて、脚の筋肉をよりはっきりと露出させます。
- 前脛骨筋(TA)と腓腹筋を隔てる筋膜ラインを見つけ、解剖ハサミを使用して分離し、膝の腱を露出させます。露出した2つの膝の腱の間に解剖ハサミを置きます。はさみは、露出した膝の腱のすぐ下のポケットに「引っ掛かる」でしょう。ブラントは、はさみが足首に達するまでハサミを脚から引き離してEDLを露出させながら、「ポケット」を解剖します。
- サイズ4-0のシルク手術用縫合糸( 材料表を参照)の結び目のあるループノットを使用して、縫合糸の一端を膝に最も近い腱の下にひもで締めます。近位筋と腱の接合部の上に二重の四角い結び目を、筋肉の上に置かず、腱を含めずに結びます。結び目の上に切ります。腱に結ばれたループをそっと引っ張ると、EDLが「ポケット」から出てきます。
- ループを解剖領域にテープで固定し、EDLに張力をかけます。遠位筋と腱の接合部で別の事前に結ばれたループノットを使用して、筋肉に置いたり、腱を含めたりせずに、二重の正方形の結び目を結びます。脚に近い側の結び目をカットして、EDL全体をマウスから取り外します。筋肉の近位側と遠位側にある二重の四角い結び目から余分な縫合糸を切り取り、手術部位のそばの通気槽に筋肉を入れます。
注:筋肉を曝気浴に入れる場合は、どちら側が近位側か遠位側かを確認してください。 - サーボモーターレバーリグに配置するには、吊り下げられた白金電極の間にEDLを垂直に取り付けます。遠位ループノットを固定フックに取り付け、近位ループノットをサーボモーターアームに取り付けられたフックに取り付けます。組織浴を持ち上げて、通気したKrebs-Henseleit溶液に筋肉を沈めます。
注意: エアレーションは、水没時に筋肉を乱してはなりません。その場合は、ガスの圧力を下げます。刺激を開始する前に、筋肉を10分間平衡化させます。
- EDL筋の最大等尺性力を測定します。
注:けいれんおよび破傷風を使用して最大等尺性力を測定する方法のプロトコルについては、 表1 を参照してください。著者が使用したプログラムの図については、 補足図1 を参照してください。- 手術中に筋肉が損傷していないことを確認するために、最大上けいれんで筋肉を刺激します(80 V、1 pps、1ms; 表1; 補足図2参照)。損傷が発生していない場合は、マッスルレバーシステムの長さノブを使用して、アクティブテンションが~1V / 0.1271 Nで、パッシブテンションが~0.1V / 0.01271N未満の筋肉の長さをけいれん刺激を使用して見つけます。
- 縫合糸の結び目から縫合糸の結び目までの筋肉の開始長さをボルトとミリメートルで記録します。開始長さのプログラムのキャリブレーション部分に測定値を入力します( 補足図1を参照)。
- EDLの最適長さ(L0)における最大痙攣最大等尺性力を求める(表1)。技術的には休息時間は必要ありませんが、刺激と刺激の間に1分間待つことで受動的な緊張が安定します。最大上痙攣が最大になる長さ(ボルト単位)を記録します。これは、けいれんの筋肉の最適な長さ(L0)です。
- この長さのノギスで筋肉を測定します。縫合糸の結び目から縫合糸の結び目まで筋肉を測定します。L 0 が見つかったら、筋肉を開始長さ (アクティブ テンション ~1V / 0.1271 N) まで短くします。
- 破傷風上最大値を求める EDLの最大等尺性力(80 V、180 pps、500 ms; 表1)。L0 での超最大破傷風力の長さ (ボルトとミリメートル) を記録し、ノギスを使用して縫合糸の結び目から縫合糸の結び目までの繊維を再度測定します。
注:筋肉の長さを0.5 V / 0.65 mm刻みで増やすと、けいれんと破傷風の両方でより正確なL0 が得られます。 - EDLの最大下等尺性力を求めます(45 V、110 pps、500ms; 表1)実験の前後にL0 で、刺激プロトコルから疲労が発生していないことを確認しました。力が10%減少すると、「疲労」した筋肉と見なされます。
| 実験 | シミュレーション強度(V) | パルス周波数(pps / Hz) | 刺激時間(ms) | コメント | ||||||||
| 1.「ウォームアップ」 | 80 | 1 | 1 | 長さを0.50V増減して、1Vの受動張力を求めます | ||||||||
| 2.最適な筋肉長のけいれん(L0) | 80 | 1 | 1 | 長さを0.50Vずつ増減して、~1Vの受動張力を求めます | ||||||||
| 3.最適な筋長破傷風(L0) | 80 | 180 | 500 | 長さを0.50V変更するまでに3分間休止 | ||||||||
| 4.実験前の最大下L0 | 45 | 110 | 500 | L0 の長さ | ||||||||
| 6. アバターの実験 | 45 | 110 | マウスEDLの代表的な長さ変化を周期的に使用 | |||||||||
| 7.実験後の最大下L0 | 45 | 110 | 500 | 実験後、L0に戻り、L0を測定 | ||||||||
表1:刺激プロトコル。 最大上および最大下痙攣および破傷風の最適な長さを見つけるための刺激プロトコル。プロトコルは、刺激の強度、タイミング、および毎秒のパルスによって異なります。
3. 選択された in vivo ひずみ軌跡を用いた「アバター」ワークループ手法の完成
- 「アバター」ワークループテクニックを完成させるために必要なソフトウェアをセットアップします( 材料表を参照)。
注: 各時間ステップでの筋肉の長さを指定する入力ファイル(.csvまたは類似のもの)が必要です(ステップ1.4を参照)。刺激が始まる周期のパーセンテージと刺激の持続時間の入力が必要です(たとえば、 補足図3 を参照)。 - 完全な「アバター」ワークループテクニック。
注:カスタムLabViewプログラムを使用していますが、研究者は、サーボモーターレバーでのマウスEDLの長さ変化の制御、特定の時間での刺激の開始(%サイクル)と持続時間(ms)の制御、および筋力の測定を可能にする任意のプログラムを使用できます。著者が使用するプログラムの図については、 補足図 3 を参照してください。- ステップ1.4から、スケーリングされた長さのエクスカーションを伴うスケーリングされたひずみの変化をプログラムにアップロードします。ステップ1.4、3.3、および「スケールドひずみ変化」の詳細については、「ディスカッション」セクションを参照してください。
- 必要に応じて、筋肉の開始長さを調整します(セクション3.3を参照)。開始長さをVとmmで入力して、結果を校正します( 補足図3を参照)。
- ステップ1.3で計算した刺激の開始と持続時間を使用します。
- 2サイクルの間、決定された長さのエクスカーションでスケーリングされた長さの変化を通して筋肉を走らせます。
- データを保存します。同じ筋肉に複数の刺激プロトコルが収集される場合は、各刺激の間に3分間待ちます。
- 最大下活性化を使用して最適な長さ(L0)で刺激し、疲労が発生したかどうかを判断します。力が10%以上減少すると、筋肉が疲労していると見なされます。刺激プロトコルについては、 表1 を参照してください。
- お風呂から筋肉を取り除きます。筋肉からループの結び目をカットし、筋肉から余分な溶液を軽くたたきます。筋肉の重さを量ります。標準式を使用して生理学的断面積を決定します:筋肉量/(L0 * 1.06)19。
- 「アバター」作業ループ手法のパラメーターを調整します (「説明」セクションを参照)。
- ex vivoの受動的張力上昇をin vivoで観察された受動的張力上昇に一致させることにより、開始長さと長さの偏位を決定します(図2)。
注:この研究では、開始長さ(mm)と偏位(%L0;ステップ1.4および「考察」セクションを参照)をスケーリングするためにパーセントL0を使用しました。ex vivoマウスEDLの張力上昇をin vivoラットMGの張力上昇と一致させるには、L0からの開始長が最適であることがわかりました(図2)。 - 開始長さを 3 つ選択します (例: -5% L 0、L 0、+5% L0)。これらの開始長さのそれぞれで、指定された長さのエクスカーション(例:10%L0)で「アバター」ワークループを実行します。
注:マウスEDLを用いた本「アバター」実験では、10%L0 の長さの逸脱が用いられた。 - ex vivo 受動的張力上昇率が in vivo 受動的張力上昇率と同程度になるまで、新しい開始長さおよび/または逸脱を繰り返します (図 2B を参照)。
- 使用する筋肉の繊維の種類と活性化ダイナミクスに応じて、刺激の持続時間を増減して、 ex vivo と in vivo の力の一致を最適化します。したがって、「アバター」実験中に、 in vivo の力産生に最も一致するように刺激の開始および/または持続時間を変更する必要があるかもしれません。
- これが必要かどうかを判断するには(考察のセクションを参照)、"アバター"と in vivo の筋肉の力を経時的にプロットし(図3)、ターゲットと"アバター"の筋力の間のスケーリングされた相関を二乗することによって決定係数R2 を計算します(代表的な結果を参照)。
- ex vivoの受動的張力上昇をin vivoで観察された受動的張力上昇に一致させることにより、開始長さと長さの偏位を決定します(図2)。
図2:パッシブテンションの上昇に合わせる。 受動的緊張(矢印)の in vivoおよび ex vivo の上昇を示す作業ループ。2.9 Hzで歩行するラットMG(黒)の in vivo スケールのワークループ(Wakeling et al.15のデータ)。2.9 Hz でのマウス EDL (緑) からの Ex vivo スケーリングされた作業ループ。 (A) マウス EDL 筋の開始長さは +5% L0 です。(b)マウスEDL筋の開始長さはL0である。ex vivoの受動的張力上昇は、Aの in vivo 張力上昇と一致するが、Bでは一致しないことに注意してください。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ラットMGのin vivo力と一致するようにマウスEDLの刺激時間を最適化した(黒線)。 筋電図ベースの刺激(緑色の破線)を使用してマウスEDLによって生成される力は、in vivoの力よりも早く減少しますが、これはおそらくラットMGと比較してマウスEDLの不活性化が速いためです。in vivo力とex vivo力の適合を最適化するために、マウスEDLをより長い時間刺激しました(緑色の実線)。筋電図ベースの刺激R2=0.55、最適化された刺激R2=0.91。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Representative Results
「アバター」実験の目標は、ex vivoワークループ実験中に、in vivoの力の生成と仕事の出力を可能な限り忠実に再現することです。この研究では、マウスEDLとラットMGはどちらも主に速筋で構成されているため、ラットMGの「アバター」としてマウスEDLを使用することを選択しました20,21。どちらの筋肉も、足首関節(EDL足首背屈筋、MG足首足底屈筋)の主要な動きであり、同様のペネーション角度(マウスEDL 12.4 + 2.12°22、ラットMG 20°、この研究で使用15)を持っています。ラットMG15のスケーリングされた代表的な作業ループを、2つの異なる刺激プロトコル(1つは測定されたEMG活動から、もう1つはステップ3.3として最適化)を使用して、ex vivoの「アバター」実験(図4)と比較しました。ここで示すR2値は、各サイクルが自発運動速度に対応する2000ポイント以上(歩行=5521ポイント、トロット=5002、ギャロップ=2502ポイント)を持つ、スケーリングされた伸長-短縮サイクル全体(2サイクル/条件)を使用して計算された。ワークループは、筋肉の大きさ、P0、およびPCSAの違いを説明するためにスケーリングされました。スケーリングは、力とひずみを同様のスケール(0-1)に線形マッピングして、ラットMGとマウスEDLを比較することによって行われました。視覚的には、マウスのEDLとラットのMG筋の異なる活性化ダイナミクスを考慮して刺激プロトコル(図4B)を最適化すると、筋電図ベースの活性化と比較して、in vivoラットのMG力への適合性が向上することは明らかです(「考察」の項を参照)。マウスEDLでは、より遅いひずみ軌跡(歩行および速歩)の刺激時間を約2倍にすると、歩行で62%、速歩で109%R2が増加した。より速いひずみ軌跡(ギャロップ)では、刺激時間を観測時間の半分に増やすと、R2が22%増加した。
図4:in vivoとex vivoのワークループの比較。 in vivoひずみ軌跡を用いた歩行中(2.9Hz)のin vivoラットMG(黒)とex vivoマウスEDL(緑)のワークループ。 太い線は、in vivoとex vivoの両方のワークループで刺激があることを示しています。(A)筋電図ベースの刺激プロトコルを使用した歩行中のin vivoラットMG(黒)とex vivoマウスEDL(破線緑)の作業ループ。 (B)歩行中(2.9Hz)のin vivoラットMG(黒)とex vivoマウスEDL(緑一色)の最適化された刺激を使用した作業ループ。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
マウスEDLのex vivo力産生とラット内側腓腹筋(MG)15のin vivo力産生の間の高いR2は、良好な複製を示します(図5)。筋電図ベースの刺激実験では、平均R2値は、歩行、速歩、およびギャロップでそれぞれ0.535、0.428、および0.77でした。最適化された刺激実験では、平均R2値は、歩行、速歩、およびギャロップでそれぞれ0.872、0.895、および0.936でした。前述したように(ステップ3.3、図5)、使用する筋肉の活性化ダイナミクスによっては、刺激プロトコルも最適化する必要があるかもしれません。ex vivoマウスEDLを用いたin vivoのMG力の予測は、刺激の最適化、R2の増加(図5A、B)、二乗平均平方根誤差(RMSE)の減少により、すべての自発運動速度で改善されました。RMSEは、すべての速度で最適化後に減少しました(図6)。筋電図ベースの刺激の平均RMSEは、歩行、速歩、ギャロップで0.31、0.43、0.158でした。最適化された刺激の平均RMSEは、歩行、速歩、ギャロップで0.181、0.116、0.101であった。
図5:in vivoおよびex vivo力産生のR2値:in vivoおよびex vivo力の比較におけるR2値の箱ひげ図。 プロットされた個々の観測値、中央値、25パーセンタイル、および75パーセンタイルが示されました。(A)2.9Hz(緑)での歩行、3.2Hz(マゼンタ)での速歩、および6.2Hz(シアン)でのギャロップ中に測定されたin vivoEMG信号に基づく刺激プロトコルを用いたin vivoおよびex vivo力産生のR2値。(b)最適化された刺激を用いたin vivoおよびex vivoの力産生に関するR2値(図2を参照のこと)。刺激の開始と持続時間を最適化すると、すべての歩行でR2が増加しました。EMGベースの刺激:歩行R 2 = 0.50-0.55、速歩R 2 = 0.37-0.47、ギャロップR2 = 0.62-0.90;最適化された刺激:歩行R 2 = 0.74-0.93、速歩R 2 = 0.85-0.92、ギャロップR2 = 0.87-0.97。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:in vivoおよびex vivo力産生の二乗平均平方根誤差(RMSE)。 in vivoおよびex vivoの力比較のためのRMSE値の箱ひげ図。プロットされた個々の観測値、中央値、25パーセンタイル、および75パーセンタイルが示されました。(A)EMGベースの刺激プロトコルを使用したin vivoおよびex vivo力産生のRMSE値。 (B)最適化された刺激プロトコルを使用したin vivoおよびex vivoのRMSE値。 刺激の開始と持続時間を最適化することで、すべての歩行でRMSEが減少しました。2.9 Hz(緑)、3.2 Hz(マゼンタ)で速歩、6.4 Hz(シアン)でギャロップします。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
in vivoの筋力を予測する従来のワークループ法の性能をテストするために、in vivoラットMG株の軌跡を使用した「アバター」実験と同じ頻度、長さの逸脱、開始長さ、刺激の開始、および持続時間で、マウスEDLに対して正弦波ワークループも実行しました。R2値は、EMGベースの刺激プロトコルと最適化された刺激プロトコルの両方で、in vivo株の軌跡よりも有意に低かった(図7)。正弦波の長さの軌跡を用いたEMGベースの刺激の平均R2値は、歩行、速歩、およびギャロップの周波数で0.062、0.067、および0.141であった。正弦波長軌跡を用いた最適化刺激の平均R2値は、歩行、速歩、ギャロップの周波数で0.09、0.067、0.141であった。
図7:正弦波の長さ変化を使用したin vivoおよびex vivo力生産のR2値。 in vivoおよびex vivoの力比較のためのRMSE値の箱ひげ図。プロットされた個々の観測値、中央値、25パーセンタイル、および75パーセンタイルが示されました。歩行(緑、2.9Hz)、速歩(マゼンタ、3.2Hz)、ギャロップ(シアン、6.2Hz)のR2値(EMGベース(半透明)および最適化(不透明)刺激プロトコルによる正弦波の長さ変化を用いた。EMGベースの刺激と最適化された刺激の両方について、R2値は、in vivoの長さの変化よりも正弦波の長さの変化の方が低かった。筋電図ベースの刺激:歩行R 2 = 0.00 - 0.30、速歩R 2 = 0.00 - 0.02、ギャロップR2 = 0.03 - 0.07;最適化された刺激:歩行R 2 = 0.02 - 0.21、速歩R 2 = 0.02 - 0.12、ギャロップR2 = 0.12 - 0.17。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
ex vivoマウスEDL筋が正弦波長の軌跡を用いて作製したワークループは、in vivo株の軌跡と比較して、in vivoラットのMG力を正確にエミュレートしません(図8)。正弦波とin vivoのひずみ軌跡によって生じる仕事の変化は、正弦波の軌跡にひずみと速度の過渡現象がないことで説明できます(図9)。筋は、正弦波軌道とin vivoベースの緊張軌跡の両方で、収縮の活発な短縮期に同様の長さで刺激されましたが、刺激の開始はサイクルの異なる段階で起こりました(例えば、刺激の開始は、速歩筋電図ベースの刺激では74%の段階で発生しましたが、歩行筋電図ベースの刺激では43%の段階で発生しました;「考察」セクションを参照)。
図8:in vivoとex vivoの正弦波ワークループの比較。 (A)正弦波ひずみ軌跡とEMGベースの刺激を用いたラットMGのin vivoワークループ(黒)およびマウスEDLのex vivoワークループ(破線マゼンタ)。(B)正弦波ひずみ軌跡と最適化された刺激を用いたラットMGのin vivoワークループ(黒)およびマウスEDLのex vivoワークループ(マゼンタの実線)。正弦波の仕事ループは、正弦波軌道にひずみと速度の過渡現象がないため、in vivoの仕事が過大評価されることに注意してください。筋電図ベースの刺激R2=0.0003、最適化刺激R2=0.084。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図9:in vivo株とex vivo正弦波の長さの軌跡の比較。 歩行(緑)、速歩(マゼンタ)、ギャロップ(青)におけるin vivoひずみとex vivo正弦波の長さの軌跡の比較。実線はin vivoひずみの軌跡です。破線ex vivo正弦波長の軌跡。強調表示された部分は刺激です。ストライドの短縮期に同じ長さで刺激が始まりました。ひずみと速度の過渡現象を示す矢印。正弦波からの偏差は、筋肉に対する外力からのインピーダンスです。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図1:最適な長さで等尺性の最大力を収集するために使用されるプログラム。 このプログラムは、最大上および最大下痙攣および破傷風刺激中の最適な長さを決定するために使用されます。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図2:生存可能なけいれん反応。 マウスEDLのけいれん反応けいれん力は急速に上昇および下降し、~1 Vのアクティブ張力に達するはずです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足図3:ワークループデータの収集に使用されるプログラム。 ex vivoワークループにおける筋肉の長さと刺激のタイミングを制御するために使用されるプログラム。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足コーディング ファイル 1: ワーク ループの実験プロトコルをセグメント化して作成するために使用される MATLab コード。 ターゲットの歩数情報 (長さ、筋電図の活性化、力) を個々のストライドにセグメント化するために使用された MATLab コード。コードには、 ex vivo マウスのEDLが引き伸ばすことができる長さに、ターゲット動物のステップをスケーリングおよび補間することが含まれます。さらに、筋電図信号を平滑化し、活性化を比較して、 ex vivo ワークループ実験での刺激の開始と持続時間を選択するコードが含まれています。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
生物は風景の中をシームレスに移動しますが、筋肉が経験する根本的な負荷と緊張は大きく異なります1,6,23。in vivoでの移動運動1,24と「アバター」実験の両方で、筋肉は周期的で非定常な条件下で最大限に刺激されます。等尺性の力と長さ、および等張力と速度の関係は、これらの条件下での筋力の予測にはあまり適していません2。非定常ひずみ(非定常ひずみ)と荷重の影響を理解することは、in vivo運動中の力の生成を予測するために不可欠であり、したがって、これらの「アバター」実験を開発する主な理論的根拠です2。「アバター」実験では、力の出力を測定しながら、筋肉への負荷と緊張の軌跡を制御することができます。「アバター」技術は、神経制御と腱コンプライアンスの交絡因子なしに、in vivoのような条件下での筋肉の力応答を調査します。「アバター」実験を行うには、研究者は、筋肉が所定の長さの変化を経験し、さまざまな開始長さとさまざまな持続時間で刺激する能力を持つプログラムを必要とします(著者が使用するプログラムについては、補足図3を参照)。研究者は、実験を行う前に、開始筋肉の長さ(mm)、エクスカーションの長さ(mm)、刺激の開始(サイクル期間の%)、および刺激の持続時間(ms)を指定する必要があります(これらのパラメータの値を取得するには、ステップ1.3-1.4を参照してください)。一般に、試験におけるすべてのストライドを代表するストライドを選択することが望ましい場合が多い(例えば、同様の長さで開始および終了する、同様のピーク力に達する、平均的な筋電図活動を有するなど)。選択したストライドの筋電図/活性化および力のデータが、同じ試験の他のストライドを代表しているかどうかを判断することは、ターゲット動物の筋肉を使用して試験全体の作業ループ(力対長さ)をプロットすることによって行うことができる、後の「調整」に役立ちます。二足歩行および四足歩行では、通常、最短の長さから最短の長さまでがストライド全体(つま先からつま先まで)を画定しますが、EMGの活性化はさまざまです。いくつかの動物や筋肉では、EMGの活性化は、ここに示したラットMGのように、足の接触と密接に相関している22。ホロホロチョウの外側腓腹筋のような他の動物では、EMGの活性化は一般に、未知の地形でより安定した状態を達成するために最も長い長さで起こる25。
「アバター」実験を行うためには、 ex vivo の力データのノイズを最小限に抑えることが重要です。力の測定は、手術中の筋肉の裂傷、ループノットが長すぎる場合の縫合糸のコンプライアンス、長さの入力とエクスカーションの不適切なスケーリング、筋肉の疲労など、いくつかの問題に敏感です。筋肉の断裂は、「ポケットを解剖」(ステップ2.2.3)し、腱の近位部の周りにループノットを結ぶとき(ステップ2.2.4)によく起こります。「ポケットを解剖する」間、解剖ハサミを筋肉に対して平らで水平に保つと、先端がEDLに傷を付けるのを防ぐことができます。さらに、鈍い解剖中に解剖ハサミを遠位に引き離すと、解剖ハサミとEDL筋肉の接触も制限されます。さらに、筋肉は、手術の準備中およびリグで使用するときに、Krebs-Henseliet溶液で湿らせておく必要があります。
長さ入力を適切にスケーリングすることは、より複雑です。筋肉の受動的および能動的な力は、開始長さおよび/またはエクスカーションが適切にスケーリングされていない場合に影響を受ける可能性があります。受動的張力のex vivo上昇は、受動的張力のin vivo上昇と一致する必要があります(図1を参照)。以前の実験で観察されたスケーリングの問題の1つは、長さの偏位(開始長さから最長の長さまで)が小さすぎたり大きすぎたりすると、受動的張力と能動的張力の両方が影響を受ける可能性があることです。理論的には、筋肉は最適な長さ(L 0)付近でピークフォースに達するはずであり26、そのため、最適な長さ(L0)を使用して、ex vivoの「アバター」実験でin vivoの筋肉の長さをスケーリングし、in vivoの力の生成を正確に再現します。 筋肉間の構造の違いは、開始長さと長さのエクスカーションパラメータを決定する役割を果たします。最適な長さ(L0)は、超最大限に刺激された等張および等尺性条件下で見出されますが、それを「アバター」実験のスケーリング指標として使用すると、周期的な運動中の力と長さおよび力と速度の関係の限界が浮き彫りになり、さらに調査が必要になる可能性があります。ほとんどの定常状態では、筋肉の瞬間的な長さ、速度、および活性化(つまり、力-長さおよび力-速度の特性)を使用して、力と仕事の出力を妥当な精度で予測できます12,24,27。可変荷重の動的条件下では、力は速度28の関数として増加し、ひずみおよび活性化29,30と複雑な関係を有する。これは、筋肉の等張力-速度および等尺性力-長さの特性と矛盾する28。ラットMGでは、ひずみと速度の過渡現象は、足の接触や環境との相互作用(すなわち、起伏の多い地形、風、捕食回避のための急激な方向転換)などの負荷の証拠です(図9)。これらのラットMGひずみの軌跡は、ほとんどの現実的な条件と同様に、加えられた荷重、力の生成、および仕事の出力に急激な変化があります2,28。この実験手法は、従来の力と長さ、力と速度の関係では十分に説明できないin vivo条件下でのひずみ、速度、および活性化ダイナミクス間のこれらの複雑な相互作用を強調することを目的としています。
また、筋肉の初期の長さが短すぎたり長すぎたりすると、他の問題が発生する可能性があります。開始長さが短すぎると、受動的および能動的ストレッチ中の張力の上昇率が低下し(図示せず)、開始長が長すぎると受動の張力の上昇率が増加します( 図1Bを参照)。能動的張力と受動的張力の比率を使用すると便利です。例えば、ラットMGでは、受動的張力(N)は一般に能動的張力の約半分です(図2)。筋肉が長すぎる長さで開始したり、長すぎる長さに引き伸ばされたりすると、受動的な張力が能動的な張力に比べて高すぎる可能性があり( 図1Bを参照)、過度の伸張により力が急速に減少する可能性があります。また、長すぎる長さにストレッチすると、筋肉が損傷し、筋肉が早く疲労する可能性があります。さらに、開始時の長さが短すぎたり、筋肉が十分な長さに引き伸ばされていなかったりすると、アクティブテンションが融合していないように見えることがあります。
L0に基づいて開始長さと偏位を決定するには、予備実験が必要です。使用する筋肉の活性化ダイナミクスが異なる場合は、刺激の持続時間を調整するために追加の予備実験が必要になる場合があります。これらの最適化は、in vivoとex vivoの筋肉の繊維タイプの組成および/または活性化ダイナミクスが異なる可能性があるために必要です。代表的な結果(図4および図5)では、ex vivo実験中にマウスEDLに2つの刺激プロトコルを使用し、in vivoラットのMG力産生を再現しました。 in vivoラットMGに最も適合するようにマウスEDLの力産生を最適化するために、刺激時間を長くしました(図2および図3)。ラットMGは、マウスEDL31,32,33よりも遅い繊維タイプで構成されています。このことは「アバター」実験で明らかであり、ex vivoマウスのEDL筋は、in vivoとex vivoの条件の興奮-収縮遅延の違いを考慮した後でも、ラットMGで観察されたin vivoよりも速く、不活性化後の力の減少速度が速い15(図2)であった34。 ex vivoおよびin vivoの標的筋によっては、他の「アバター」実験でも刺激の最適化が必要になる場合があります。マウスEDLまたはヒラメ筋(SOL)のいずれかを、このex vivoワークループ技術で使用できます。EDLは、筋線維の種類とペネーション構造の類似性から、ラットMGの「アバター」として選ばれました。一部の筋肉は複雑な構造をしており、実験用のげっ歯類の筋肉を「アバター」として使用してエミュレートできない可能性があります。
「アバター」実験では、生体内力の生成を最適に再現するために手動で最適化する必要がありますが、この手法はさまざまな動物や運動モードに適用できます。「アバター」技術は、筋肉が大きすぎる動物や、ex vivo実験ではアクセスできない動物のin vivo力産生を理解するのに特に役立ちます。大型動物では予備的な研究しか行われていないが35、この研究は、実験用マウスを「アバター」として用いた動物、筋肉、および自発運動歩行にこの技術を適用できる可能性を示している。「アバター」実験の有用性は、さまざまな種の脊椎動物のさまざまな筋肉のin vivo力学を理解するために、便利で安価で、すぐに入手でき、十分に特性評価された実験用げっ歯類モデル(マウスEDL)をどれだけ正確に使用できるかにかかっています。ここで紹介した予備的な「アバター」実験(ラットMG)と他の実験(ホロホロチョウLG19)の結果は、この手法が生体内の力を正確に予測するために使用でき、他の動物にも適用できることを示唆しています。この手法の今後の応用により、ex vivoおよびin vitro実験で標的と「アバター」の両方として使用されてきた筋肉や動物の種類が拡大することが期待されます。「アバター」実験では、筋の負荷と緊張が急激に変化するin vivo移動中に筋力と運動出力に影響を与える要因を調べることができます1,2,19。具体的には、「アバター」法により、従来の筋肉モデルや正弦波作業ループ実験では捉えられなかった筋力に対するひずみと速度の過渡現象の影響を調べることができます。
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Disclosures
すべての著者は、利益相反がないことを認めています。
Acknowledgments
この研究で使用したデータを提供してくださったNicolai Konow博士に感謝します。NSF IOS-2016049 および NSF DBI-2021832 によって資金提供されています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0 | Mersilk | 734H | |
| Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) | Sigma-Aldrich | 1086436 | Krebs-Henseleit solution |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | D9434 | Krebs-Henseleit solution |
| HEPES | Sigma-Aldrich | PHR1428 | Krebs-Henseleit solution |
| Hydorchloric Acid (HCl) | Sigma-Aldrich | 1.37055 | Krebs-Henseleit solution |
| LabView Data Collection | Lab-View | ||
| Magnesium Sulfate (MgSO4) | Sigma-Aldrich | M7506 | Krebs-Henseleit solution |
| Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P3911 | Krebs-Henseleit solution |
| Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | 5.43841 | Krebs-Henseleit solution |
| S88 Stimulator | Grass | M643H05 | Available for purchase on Ebay |
| Series 300B Lever System | Aurora | 1200A | includes water-jacket tissue bath |
| Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Krebs-Henseleit solution |
| Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S9888 | Krebs-Henseleit solution |
| Sodium Hydroxide (NaOH) | Sigma-Aldrich | S5881 | Krebs-Henseleit solution |
| Wild Type Mice | Jackson Laboratory | B6C3Fe a/a Ttn mdm/J |
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