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Bioengineering

"Avatar", un experimento de bucle de trabajo ex vivo modificado utilizando cepa y activación in vivo

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Este artículo detalla la metodología para emular la producción de fuerza muscular in vivo durante experimentos de bucle de trabajo ex vivo utilizando un músculo "avatar" de un roedor de laboratorio para evaluar las contribuciones de los transitorios de deformación y la activación a la respuesta de la fuerza muscular.

Abstract

Los comportamientos de movimiento son características emergentes de los sistemas dinámicos que resultan de la producción de fuerza muscular y el rendimiento del trabajo. La interacción entre los sistemas neurales y mecánicos ocurre en todos los niveles de la organización biológica al mismo tiempo, desde el ajuste de las propiedades musculares de las piernas mientras se corre hasta la dinámica de las extremidades que interactúan con el suelo. Comprender las condiciones en las que los animales cambian sus estrategias de control neural hacia la mecánica muscular intrínseca («preflexos») en la jerarquía de control permitiría a los modelos musculares predecir la fuerza muscular in vivo y trabajar con mayor precisión. Para comprender la mecánica muscular in vivo, se requiere una investigación ex vivo de la fuerza muscular y el trabajo bajo condiciones dinámicamente variables de tensión y carga similares a la locomoción in vivo. Las trayectorias de deformación in vivo suelen presentar cambios bruscos (es decir, transitorios de deformación y velocidad) que surgen de las interacciones entre la activación neuronal, la cinemática musculoesquelética y las cargas aplicadas por el entorno. El objetivo principal de nuestra técnica "avatar" es investigar cómo funcionan los músculos durante los cambios bruscos en la velocidad de deformación y la carga, cuando la contribución de las propiedades mecánicas intrínsecas a la producción de fuerza muscular puede ser mayor. En la técnica "avatar", el enfoque tradicional del bucle de trabajo se modifica utilizando trayectorias de deformación medidas in vivo y señales electromiográficas (EMG) de los animales durante los movimientos dinámicos para impulsar los músculos ex vivo a través de múltiples ciclos de estiramiento-acortamiento. Este enfoque es similar a la técnica de bucle de trabajo, excepto que las trayectorias de deformación in vivo se escalan adecuadamente y se imponen a los músculos de ratón ex vivo conectados a un servomotor. Esta técnica permite: (1) emular in vivo la deformación, la activación, la frecuencia de zancada y los patrones de bucle de trabajo; (2) variar estos patrones para que coincidan con la mayor precisión posible con las respuestas de fuerza in vivo; y (3) variar las características específicas de la deformación y/o activación en combinaciones controladas para probar hipótesis mecanicistas.

Introduction

Los animales en movimiento logran impresionantes hazañas atléticas de resistencia, velocidad y agilidad en entornos complejos. La locomoción animal es particularmente impresionante en contraste con las máquinas diseñadas por humanos: la estabilidad y la agilidad de los robots, prótesis y exoesqueletos con patas actuales siguen siendo pobres en comparación con los animales. La locomoción de patas en terreno natural requiere un control preciso y ajustes rápidos para alterar la velocidad y maniobrar las características ambientales que actúan como perturbaciones inesperadas 1,2,3,4. Sin embargo, la comprensión de la locomoción no estacionaria es inherentemente desafiante porque la dinámica depende de interacciones complejas entre el entorno físico, la mecánica musculoesquelética y el control sensoriomotor 1,2. La locomoción de las patas requiere responder a perturbaciones inesperadas con un rápido procesamiento multimodal de la información sensorial y una actuación coordinada de las extremidades y articulaciones 1,5. En última instancia, el movimiento es posible gracias a que los músculos producen fuerza a través de las propiedades mecánicas intrínsecas del sistema musculoesquelético, así como del control neuronal 1,5,6,7. Una cuestión pendiente de la neuromecánica es cómo interactúan estos factores para producir un movimiento coordinado en respuesta a perturbaciones inesperadas. La siguiente técnica utiliza la respuesta mecánica intrínseca del músculo a la deformación utilizando trayectorias de deformación in vivo durante experimentos ex vivo controlables con un músculo "avatar".

La técnica del bucle de trabajo muscular ha proporcionado un marco importante para comprender la mecánica muscular intrínseca durante los movimientos cíclicos 8,9,10. La técnica tradicional del bucle de trabajo impulsa los músculos a través de trayectorias de deformación predefinidas, típicamente sinusoidales, utilizando frecuencias y patrones de activación medidos durante experimentos in vivo 2,8,9,11. El uso de trayectorias de longitud sinusoidal puede estimar de forma realista el trabajo y la potencia de salida durante el vuelo12 y la natación2 en condiciones en las que los animales no experimentan cambios rápidos en las trayectorias de deformación debido a la interacción con el medio ambiente y la cinemática musculoesquelética. Sin embargo, las trayectorias de la tensión muscular in vivo durante la locomoción de las piernas surgen dinámicamente de las interacciones entre la activación neuronal, la cinemática musculoesquelética y las cargas aplicadas por el entorno 5,7,13,14. Se necesita una técnica de bucle de trabajo más realista para emular las cargas, las trayectorias de deformación y la producción de fuerza que corresponda a la dinámica músculo-tendinosa in vivo y proporcione información sobre cómo la mecánica muscular intrínseca y el control neuronal interactúan para producir un movimiento coordinado frente a perturbaciones.

Aquí, presentamos una forma novedosa de emular las fuerzas musculares in vivo durante la locomoción en cinta rodante mediante el uso de un músculo "avatar" de un roedor de laboratorio durante experimentos ex vivo controlados con trayectorias de deformación in vivo que representan cargas in vivo que varían en el tiempo. El uso de las trayectorias de deformación medidas in vivo de un músculo objetivo en músculos de un animal de laboratorio durante experimentos ex vivo controlados emulará las cargas experimentadas durante la locomoción. En los experimentos aquí descritos, el músculo extensor largo de los dedos (EDL) ex vivo del ratón se utiliza como un "avatar" para el músculo gastrocnemio medial (MG) de rata in vivo durante la marcha, el trote y el galope en una cintarodante. Este enfoque es similar a la técnica de bucle de trabajo, excepto que las trayectorias de deformación in vivo se escalan adecuadamente y se imponen a los músculos de ratón ex vivo conectados a un servomotor. Si bien los músculos EDL del ratón difieren en tamaño, tipo de fibra y arquitectura en comparación con el MG de rata, es posible controlar estas diferencias. La técnica del "avatar" permite: (1) emular in vivo la tensión, la activación, la frecuencia de zancada y los patrones de bucle de trabajo; (2) variar estos patrones para que coincidan con la mayor precisión posible con las respuestas de fuerza in vivo; y (3) variar las características específicas de la deformación y/o activación en combinaciones controladas para probar hipótesis mecanicistas.

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Protocol

Todos los estudios en animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad del Norte de Arizona. Para el presente estudio se utilizaron músculos extensores de los dedos largos (EDL) de ratones machos y hembras de tipo salvaje (cepa B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), con edades comprendidas entre los 60 y los 280 días. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales) y se establecieron en una colonia en la Universidad del Norte de Arizona.

1. Selección de la trayectoria de la deformación in vivo y preparación para su uso durante los experimentos de bucle de trabajo ex vivo

NOTA: En este protocolo, se utilizaron mediciones previas de locomoción dinámica in vivo, proporcionadas directamente a los autores (Nicolai Konow, UMass Lowell, comunicación personal), en experimentos ex vivo . Los datos originales fueron recolectados para Wakeling et al.15. Se requieren datos de tiempo, duración o deformación, EMG/activación y fuerza para replicar el protocolo.

  1. Segmente todo el ensayo in vivo en pasos individuales utilizando cualquier plataforma de programación (código MATLab proporcionado en el archivo de codificación suplementaria 1).
    1. Grafique los cambios de longitud frente a los cambios de longitud tiempo para todo el ensayo in vivo . Esto se utiliza para visualizar las zancadas individuales (postura a postura) y para evaluar la variabilidad entre zancadas (Figura 1).
    2. Calcule la deformación para todo el ensayo (Longitud (L) / Fuerza isométrica máxima a la longitud óptima L0).
    3. Seleccione un paso de toda la prueba que sea representativo de todos los pasos y que comience y termine con longitudes similares. Esto se puede hacer visualmente graficando las longitudes una encima de la otra para comparar cada zancada.
    4. Después de seleccionar una zancada representativa, segmente los datos de deformación, EMG/activación y fuerza de todo el ensayo utilizando cualquier plataforma de programación (consulte el Archivo de codificación suplementaria 1 para ver los códigos utilizados en MATLab16).
    5. Si la frecuencia de muestreo difiere en función de la deformación, la EMG/activación o la fuerza, interpole los puntos de datos para que todos se muestreen a la misma frecuencia.
      NOTA: Los investigadores pueden determinar la frecuencia de captura en función de los intervalos de tiempo entre cada punto muestreado en todo el ensayo. Si las variables se capturan con la misma frecuencia, los tiempos de muestreo serán los mismos.
  2. Calcula la frecuencia de las zancadas segmentadas.
    1. Calcule la frecuencia determinando la duración de una zancada segmentada en segundos y dividiendo 1 (segundo) por la duración (1/duración = # zancadas por segundo).
    2. Determine manualmente cuántos puntos de datos deben adquirirse en experimentos ex vivo para que coincidan con la frecuencia.
    3. Calcula el tiempo necesario para dar dos zancadas. Repita las zancadas al menos una vez para estimar el error de medición muscular, que será necesario para el análisis estadístico posterior.
  3. Determine la fase de estimulación en relación con la entrada de deformación utilizando la actividad EMG medida para determinar el inicio y la duración de la estimulación para los bucles de trabajo ex vivo . Se puede utilizar cualquier plataforma de programación (véase el Archivo de codificación suplementaria 1 para el código utilizado en este estudio).
    1. Vea la señal EMG en el mismo rango del eje x (tiempo) que el cambio de deformación (Figura 1). Amplíe la señal EMG para que sea visible; esto se puede hacer multiplicando la señal EMG por un número arbitrario, reescalando la deformación y EMG para que estén en la misma escala y/o agregando la señal EMG a la deformación.
      NOTA: Los autores reescalaron la cepa y el EMG para que estuvieran en la misma escala utilizando la función "reescalar" en MATLab (ver Figura suplementaria 1).
    2. Encuentre dónde comienza y termina la actividad EMG, como lo indica un cambio en la intensidad de dos desviaciones estándar17,18.
      NOTA: Dependiendo del animal y del músculo, el inicio de la EMG puede o no corresponderse con el contacto con el pie (Monica Daley, UC Irvine, comunicación personal) (ver sección de Discusión).
    3. Calcule el porcentaje del ciclo de deformación (p. ej., 40%) en el que se produce el inicio de la activación de EMG y durante cuánto tiempo se producirá la estimulación (p. ej., 222 ms).
      NOTA: Los investigadores tendrán que tener en cuenta un retardo de acoplamiento excitación-contracción (ECC) que difiere entre el movimiento in vivo y los bucles de trabajo ex vivo y puede ser diferente para cada animal y músculo (por ejemplo, el ECC in vivo es de 24,5 ms para la MG de rata, el ECC ex vivo es de ~5 ms para la EDL de ratón).
  4. Prepare entradas de deformación representativas para el programa del controlador de bucle de trabajo. Cualquier programa que pueda capturar la salida de fuerza con entrada para la deformación y la estimulación se puede utilizar para el programa del controlador del bucle de trabajo (consulte la sección Discusión).
    1. Tome la zancada seleccionada e interpole hasta el número apropiado de puntos necesarios para que el paso se capture a frecuencia in vivo durante dos ciclos (véase el paso 1.2).
    2. Vuelva a escalar la zancada para comenzar y detenerse en "tensión cero" (por ejemplo, L 0 o 95% L0) después de estirarse mediante una excursión de longitud predeterminada (consulte el paso 3.3).
    3. "Escala" de zancada seleccionada, si es necesario, para usarla como entrada para los cambios de tensión en la EDL del ratón (consulte la sección Discusión). Para escalar, seleccione una excursión de longitud a la que se pueda estirar la EDL del ratón sin dañarla (por ejemplo, normalmente estiramos la EDL del ratón en un 10% L0 independientemente de la especie in vivo ). Es posible que esto deba cambiar en función de los resultados preliminares (consulte el paso 3.3).

Figure 1
Figura 1: Duración a lo largo del tiempo de todo el ensayo in vivo . Longitud (mm) trazada contra el tiempo de la rata MG. Las zancadas están demarcadas por círculos, desde la longitud más corta hasta la longitud más corta, considerada una zancada única. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Evaluación de la fuerza isométrica máxima del músculo de ratón ex vivo

  1. Instalación de equipos y cirugía.
    NOTA: Consulte la sección de discusión para obtener una explicación del equipo necesario para el bucle de trabajo ex vivo .
    1. Prepare un baño de tejidos y órganos insertando la válvula de aguja de oxitubo en el baño de tejido con camisa de agua (consulte la Tabla de materiales). Conecte el oxitubo a un cilindro de gas con 95% 0 2-5% CO2. Deje que 20 psi llenen el baño de pañuelos con camisa de agua.
    2. Prepare el área de la cirugía colocando un oxitubo adicional desde la línea de gas hasta una placa de cristalización llena de solución de Krebs-Henseleit (paso 2.1.3) cerca del área de la cirugía. Esto se utilizará para mantener los músculos aireados e hidratados durante y después de las cirugías.
      NOTA: Los músculos también se pueden almacenar en esta solución aireada hasta 4 h, si se extrae más de un músculo del ratón a la vez.
    3. Preparar 1 litro de solución de Krebs-Henseleit que contenga (en mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl 2 (2,54); y glucosa (10.0) a temperatura ambiente y pH a 7.4 utilizando HCl y NaOH (ver Tabla de Materiales). Al manipular HCl y NaOH, use el EPP adecuado de gafas y guantes.
    4. Llene el baño con solución de Krebs-Henseleit a temperatura ambiente y pH 7,4. Sumerge el músculo y el gancho completamente en la solución.
    5. Encienda todo el equipo; sistema de palanca muscular de modo dual, estimulador e interfaz de señal (placa DAQ) (consulte la tabla de materiales).
  2. Disección muscular EDL.
    1. Anestesiar profundamente al ratón y luego realizar la eutanasia mediante luxación cervical. Coloque al ratón en posición recostada lateral derecha o izquierda con la extremidad posterior superior estirada y los dedos de los pies tocando la tabla de disección. Retira el pelaje desde el tobillo hasta por encima de la articulación de la rodilla.
    2. Cubra la piel con fórceps y corte desde la articulación del tobillo hasta el área de la cadera. Una vez que el músculo haya sido expuesto, corte alrededor del tobillo como un "dobladillo" de pantalones. Tire de la piel hacia arriba para exponer los músculos de las piernas con mayor claridad.
    3. Localice la línea de la fascia que separa el tibial anterior (TA) y el gastrocnemio, separe con unas tijeras de disección para exponer los tendones de la rodilla. Coloque las tijeras de disección entre los dos tendones de la rodilla expuestos. Las tijeras se "engancharán" en un bolsillo justo debajo de los tendones expuestos de la rodilla. Disecciona un "bolsillo" sin filo mientras tiras de las tijeras lejos de la pierna hasta que las tijeras lleguen al tobillo para exponer la EDL.
    4. Usando un nudo de bucle preatado en sutura quirúrgica de seda tamaño 4-0 (ver Tabla de materiales), ate un extremo de la sutura debajo del tendón más cercano a la rodilla. Haz un nudo cuadrado doble por encima de la unión músculo-tendón proximal sin colocarlo sobre el músculo ni incluir el tendón. Corta por encima del nudo. Tire suavemente del lazo atado al tendón y el EDL saldrá del "bolsillo".
    5. Pega el lazo con cinta adhesiva en el área de disección para crear tensión en el EDL. Haz un nudo cuadrado doble usando otro nudo de bucle preatado en la unión músculo-tendón distal sin colocarlo sobre el músculo ni incluir el tendón. Corta el nudo en el lado más cercano a la pierna para eliminar todo el EDL del mouse. Corte la sutura adicional de los nudos cuadrados dobles en los lados proximal y distal del músculo y coloque el músculo en el baño aireado junto al área de la cirugía.
      NOTA: Asegúrese de anotar qué lado es proximal y/o distal si coloca el músculo en un baño aireado.
    6. Para colocarlo en el equipo de palanca del servomotor, conecte EDL verticalmente entre los electrodos de platino suspendidos. Fije el nudo de bucle distal al gancho estacionario y fije el nudo de bucle proximal al gancho unido al brazo del servomotor. Levante el baño de tejido para sumergir el músculo en la solución aireada de Krebs-Henseleit.
      NOTA: La aireación no debe perturbar el músculo cuando está sumergido. Si es así, baje la presión del gas. Deje que el músculo se equilibre durante 10 minutos antes de comenzar la estimulación.
  3. Mide la fuerza isométrica máxima del músculo EDL.
    NOTA: Consulte la Tabla 1 para conocer el protocolo sobre cómo medir la fuerza isométrica máxima utilizando la contracción y el tétanos. Véase la Figura 1 complementaria para ver una ilustración del programa utilizado por los autores.
    1. Estimular el músculo con una contracción supramáxima para asegurarse de que el músculo no se haya dañado durante la cirugía (80 V, 1 pps, 1 ms; Tabla 1; véase la Figura complementaria 2). Si no se ha producido ningún daño, use la perilla de longitud en el sistema de palanca muscular para encontrar una longitud muscular utilizando la estimulación de contracción en la que la tensión activa sea de ~ 1 V / 0,1271 N con menos de ~ 0,1 V / 0,01271 N de tensión pasiva.
    2. Registre la longitud inicial del músculo de un nudo de sutura a otro en voltios y milímetros. Introduzca las mediciones en la parte de calibración del programa para la longitud inicial (consulte la Figura complementaria 1).
    3. Encuentre la fuerza isométrica máxima de contracción supramáxima a la longitud óptima (L0) de EDL (Tabla 1). Técnicamente no se necesita un período de descanso, pero esperar 1 minuto entre estimulaciones estabilizará la tensión pasiva. Registre la longitud (en voltios) en la que la contracción supramáxima es máxima. Esta es la longitud muscular óptima (L0) para la contracción.
    4. Mide el músculo con pinzas a esta longitud. Mide el músculo de nudo de sutura a nudo de sutura. Una vez que se haya encontrado L 0, acorte el músculo hasta la longitud inicial (tensión activa ~ 1V / 0.1271 N).
    5. Encuentre la fuerza isométrica máxima supramáxima del tétanos de EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabla 1). Registre la longitud (en voltios y milímetros) de la fuerza tetánica supramáxima en L0 y mida las fibras de nudo de sutura a nudo de sutura nuevamente con calibradores.
      NOTA: Aumentar la longitud del músculo en pasos de 0,5 V/0,65 mm dará como resultado un L0 más preciso tanto para la contracción como para el tétanos.
    6. Halla la fuerza isométrica submáxima de EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabla 1) a L0 antes y después del experimento para asegurar que no se produjera fatiga por el protocolo de estimulación. Una disminución del 10% en la fuerza se considera un músculo "fatigado".
Experimento Intensidad de simulación (V) Frecuencia de pulso (pps / Hz) Duración de la estimulación (ms) Comentarios
1. "Calentamiento" 80 1 1 Aumente o disminuya la longitud en 0,50 V para encontrar una tensión pasiva de 1 V
2. Contracción óptima de la longitud muscular (L0) 80 1 1 Aumente o disminuya la longitud en 0,50 V para encontrar una tensión pasiva de ~1 V
3. Longitud muscular óptima tétanos (L0) 80 180 500 Descanso de 3 min entre el cambio de longitud en 0,50 V
4. L0 submáxima previa al experimento 45 110 500 A la longitud de L0
6. Experimentos con avatares 45 110 Usar cíclicamente los cambios de longitud representativos para la EDL del mouse
7. L0 submáxima posterior al experimento 45 110 500 Regrese a L0 después del experimento y mida L0

Tabla 1: Protocolo de estimulación. Protocolo de estimulación para la búsqueda de la contracción supramáxima y submáxima y la longitud óptima del tétanos. El protocolo varía según la intensidad de la estimulación, el tiempo y los pulsos por segundo.

3. Completar la técnica de bucle de trabajo "avatar" utilizando trayectorias de deformación in vivo seleccionadas

  1. Configure el software necesario para completar las técnicas de bucle de trabajo "avatar" (consulte la Tabla de materiales).
    NOTA: Un archivo de entrada (.csv o similar) que especifica la longitud del músculo en cada paso de tiempo que se necesita (consulte el paso 1.4). Son necesarias entradas para el porcentaje del ciclo en el que comienza la estimulación y para la duración de la estimulación (ver Figura 3 suplementaria , por ejemplo).
  2. Completa la técnica de bucle de trabajo "avatar".
    NOTA: Si bien usamos un programa LabView personalizado, los investigadores pueden usar cualquier programa que permita el control de los cambios de longitud en la EDL del mouse en una palanca de servomotor, el control del inicio (% de ciclo) y la duración (ms) de la estimulación en momentos específicos, y la medición de la fuerza muscular. Consulte la Figura complementaria 3 para obtener una ilustración del programa que utilizan los autores.
    1. Cargue los cambios de deformación a escala con excursión de longitud escalada en el programa desde el paso 1.4. Consulte los pasos 1.4, 3.3 y la sección Discusión para obtener más información sobre los "cambios de deformación a escala".
    2. Ajuste la longitud inicial del músculo si es necesario (ver sección 3.3). Introduzca la longitud inicial en V y mm para calibrar los resultados (consulte la Figura complementaria 3).
    3. Utilice el inicio y la duración de la estimulación calculados en el paso 1.3.
    4. Ejecute el músculo a través de los cambios de longitud escalados con una excursión de longitud determinada durante dos ciclos.
    5. Guardar datos. Si se recogen varios protocolos de estimulación en el mismo músculo, esperar 3 min entre cada estimulación.
    6. Estimular a la longitud óptima (L0) utilizando la activación submáxima para determinar si se ha producido fatiga. Si la fuerza disminuye en más de un 10%, los músculos se consideran fatigados. Consulte la Tabla 1 para conocer los protocolos de estimulación.
    7. Retira el músculo del baño. Corta los nudos del músculo y retira el exceso de solución del músculo. Pesa el músculo. Determinar el área fisiológica de la sección transversal utilizando la fórmula estándar: masa muscular/(L0*1,06)19.
  3. Ajuste los parámetros para la técnica de bucle de trabajo "avatar" (consulte la sección Discusión).
    1. Determine la longitud inicial y la excursión de longitud haciendo coincidir el aumento de la tensión pasiva ex vivo con el aumento de la tensión pasiva observado in vivo (Figura 2).
      NOTA: Este estudio utilizó el porcentaje L 0 para escalar la longitud inicial (mm) y la excursión (% L0; consulte el paso 1.4 y la sección Discusión). Para hacer coincidir el aumento de la tensión en la EDL de ratón ex vivo con el de la MG de rata in vivo, los autores encontraron que la longitud inicial en L0 producía el mejor ajuste (Figura 2).
    2. Elija tres longitudes iniciales (por ejemplo, -5% L 0, L 0 y +5% L0). Realice el bucle de trabajo "avatar" en cada una de estas longitudes iniciales con una excursión de longitud especificada (por ejemplo, 10% L0).
      NOTA: En los presentes experimentos de "avatar" utilizando EDL de ratón, se utilizó una excursión de longitud del 10% L0 .
    3. Repetir con nuevas longitudes de arranque y/o excursión hasta que la tasa de aumento de la tensión pasiva ex vivo sea similar a la tasa de aumento de la tensión pasiva in vivo (véase la Figura 2B).
    4. Dependiendo de los tipos de fibra y la dinámica de activación de los músculos utilizados, aumente o disminuya la duración de la estimulación para optimizar la coincidencia entre la fuerza ex vivo e in vivo . Por lo tanto, puede ser necesario cambiar el inicio y/o la duración de la estimulación para que coincida mejor con la producción de fuerza in vivo durante los experimentos de "avatar".
    5. Para decidir si esto es necesario (véase la sección Discusión), se debe trazar la fuerza a lo largo del tiempo del músculo "avatar" e in vivo (Figura 3) y calcular el coeficiente de determinación R2 elevando al cuadrado la correlación a escala entre la fuerza muscular objetivo y la fuerza muscular "avatar" (véase Resultados representativos).

Figure 2
Figura 2: Aumento de tensión pasivo correspondiente. Bucles de trabajo que muestran el aumento in vivo y ex vivo de la tensión pasiva (flechas). Bucle de trabajo a escala in vivo de la rata MG (negra) caminando a 2,9 Hz (datos de Wakeling et al.15). Bucles de trabajo a escala ex vivo de EDL de ratón (verde) a 2,9 Hz. (A) La longitud inicial del músculo EDL de ratón es de +5% L0. (B) La longitud inicial del músculo EDL del ratón es L0. Obsérvese que el aumento de la tensión pasiva ex vivo coincide con el aumento de la tensión in vivo en A, pero no en B. Las líneas más gruesas indican estimulación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Optimización de la duración de la estimulación de la EDL de ratón para que coincida con la fuerza in vivo de la MG de rata (línea negra). La fuerza generada por la EDL del ratón utilizando la estimulación basada en EMG (línea discontinua verde) disminuye antes que la fuerza in vivo, probablemente debido a una desactivación más rápida de la EDL del ratón en comparación con la MG de rata. Para optimizar el ajuste entre las fuerzas in vivo y ex vivo, se estimuló la EDL de ratón durante más tiempo (línea verde continua). Estimulación basada en EMG R 2 = 0,55, Estimulación optimizada R2 = 0,91. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Representative Results

El objetivo de los experimentos "avatar" es replicar la producción de fuerza in vivo y la producción de trabajo lo más fielmente posible durante los experimentos de bucle de trabajo ex vivo. Este estudio optó por utilizar la EDL de ratón como "avatar" de la MG de rata porque la EDL de ratón y la MG de rata están compuestas principalmente por músculos de contracción rápida20,21. Ambos músculos son motores primarios de la articulación del tobillo (dorsiflexor del tobillo EDL, flexor plantar del tobillo MG) con ángulos de pennación similares (EDL de ratón 12,4 + 2,12°22, MG de rata 20° utilizado en este estudio15). Los bucles de trabajo representativos a escala de la rata MG15 se compararon con experimentos ex vivo de "avatar" (Figura 4) utilizando dos protocolos de estimulación diferentes (uno a partir de la actividad EMG medida y otro optimizado como en el paso 3.3). Los valores de R 2 presentados aquí se calcularon utilizando el ciclo completo de estiramiento-acortamiento escalonado (2 ciclos/condición), con cada ciclo con más de 2000 puntos correspondientes a la velocidad locomotora (marcha = 5521 puntos, trote = 5002, galope = 2502 puntos). Los bucles de trabajo se escalaron para tener en cuenta las diferencias en el tamaño muscular, P0 y PCSA. El escalamiento se realizó mediante el mapeo lineal de la fuerza y la deformación en una escala similar (0-1) para comparar la MG de rata y la EDL de ratón. Visualmente, es evidente que la optimización del protocolo de estimulación (Figura 4B) para tener en cuenta las diferentes dinámicas de activación de los músculos EDL de ratón y MG de rata mejora el ajuste a la fuerza de MG de rata in vivo en comparación con la activación basada en EMG (ver sección de discusión). Para el ratón EDL, aproximadamente duplicar la duración de la estimulación para trayectorias de esfuerzo más lentas (caminar y trotar) aumentó la R2 en un 62% al caminar y en un 109% al trote. Para la trayectoria de deformación más rápida (galope), el aumento del tiempo de estimulación a la mitad del tiempo observado aumentó la R2 en un 22%.

Figure 4
Figura 4: Comparación de los bucles de trabajo in vivo y ex vivo. Bucles de trabajo de MG de rata in vivo (negro) y EDL de ratón ex vivo (verde) durante la marcha (2,9 Hz) utilizando trayectorias de deformación in vivo. La línea más gruesa indica la estimulación en los bucles de trabajo in vivo y ex vivo. (A) Bucle de trabajo de MG de rata in vivo (negro) y EDL de ratón ex vivo (verde discontinuo) durante la marcha utilizando el protocolo de estimulación basado en EMG. (B) Bucle de trabajo de MG de rata in vivo (negro) y EDL de ratón ex vivo (verde sólido) durante la marcha (2,9 Hz) utilizando estimulación optimizada. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Un R2 alto entre la producción de fuerza ex vivo de EDL en ratón y la producción de fuerza in vivo de gastrocnemio medial (MG) de rata15 indica una buena replicación (Figura 5). En los experimentos de estimulación basados en EMG, los valores promedio de R2 fueron 0,535, 0,428 y 0,77 para caminar, trotar y galopar, respectivamente. En los experimentos de estimulación optimizada, los valores promedio de R2 fueron de 0,872, 0,895 y 0,936 en la marcha, el trote y el galope, respectivamente. Como se ha comentado anteriormente (paso 3.3, Figura 5), dependiendo de la dinámica de activación de los músculos utilizados, puede ser necesario optimizar el protocolo de estimulación. La predicción de la fuerza de MG in vivo utilizando EDL de ratón ex vivo se mejoró en todas las velocidades locomotoras mediante la optimización de la estimulación, el aumento de R2 (Figura 5A, B) y la disminución del error cuadrático medio (RMSE). El RMSE disminuyó después de la optimización para todas las velocidades (Figura 6). El RMSE promedio para la estimulación basada en EMG fue de 0,31, 0,43 y 0,158 para caminar, trotar y galopar. El RMSE promedio para la estimulación optimizada fue de 0,181, 0,116, 0,101 para caminar, trotar y galopar.

Figure 5
Figura 5: Valores de R 2 para la producción de fuerza in vivo y ex vivo: Diagrama de caja y bigotes de los valores de R2 para comparaciones de fuerza in vivo y ex vivo . Observaciones individuales graficadas, mediana, percentil 25 y 75indicados. (A) Valores de R 2 para la producción de fuerza in vivo y ex vivo utilizando el protocolo de estimulación basado en la señal EMG medida in vivo durante la marcha a 2,9 Hz (verde), el trote a 3,2 Hz (magenta) y el galope a6,2 Hz (cian). (B) Valores de R 2 para la producción de fuerza in vivo y ex vivo utilizando estimulación optimizada (véase la figura 2). La optimización del inicio y la duración de la estimulación aumentó R2 para todas las marchas. Estimulación basada en EMG: caminar R 2 = 0,50-0,55, trote R2 = 0,37-0,47, galope R2= 0,62-0,90; estimulación optimizada: caminar R 2 = 0,74-0,93, trote R 2 = 0,85-0,92, galope R2 = 0,87-0,97. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: Error cuadrático medio (RMSE) para la producción de fuerza in vivo y ex vivo . Diagrama de caja y bigotes de los valores RMSE para comparaciones de fuerza in vivo y ex vivo . Observaciones individuales graficadas, mediana, percentil 25 y 75indicados . (A) Valores RMSE para la producción de fuerza in vivo y ex vivo utilizando el protocolo de estimulación basado en EMG. B) Valores RMSE para in vivo y ex vivo utilizando un protocolo de estimulación optimizado. La optimización del inicio y la duración de la estimulación redujo el RMSE para todas las marchas. Caminar a 2,9 Hz (verde), trotar a 3,2 Hz (magenta) y galopar a 6,4 Hz (cian). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Para probar el rendimiento de los métodos tradicionales de bucle de trabajo en la predicción de fuerzas musculares in vivo, también se realizaron bucles de trabajo sinusoidales para el ratón EDL a la misma frecuencia, excursión de longitud, longitud inicial, inicio de la estimulación y duración que para los experimentos de "avatar" utilizando trayectorias de deformación MG de rata in vivo. Los valores de R2 fueron significativamente más bajos que para las trayectorias de deformación in vivo tanto para los protocolos de estimulación basados en EMG como para los optimizados (Figura 7). Los valores promedio de R2 para la estimulación basada en EMG utilizando trayectorias de longitud sinusoidal fueron 0,062, 0,067 y 0,141 en las frecuencias de caminata, trote y galope. Los valores promedio de R2 para la estimulación optimizada utilizando trayectorias de longitud sinusoidal fueron 0,09, 0,067 y 0,141 en las frecuencias de marcha, trote y galope.

Figure 7
Figura 7: R2 Valores para la producción de fuerza in vivo y ex vivo utilizando cambios de longitud sinusoidal. Diagrama de caja y bigotes de los valores RMSE para comparaciones de fuerza in vivo y ex vivo. Observaciones individuales graficadas, mediana, percentil 25 y 75indicados. Valores de R 2 para caminar (verde, 2,9 Hz), trotar (magenta, 3,2 Hz) y galopar (cian,6,2 Hz) utilizando cambios de longitud sinusoidal con protocolos de estimulación basados en EMG (translúcidos) y optimizados (opacos). Tanto para la estimulación basada en EMG como para la optimizada, los valores de R2 fueron más bajos para los cambios de longitud sinusoidal que para los cambios de longitud in vivo. Estimulación basada en EMG: caminar R 2 = 0,00 - 0,30, trote R 2 = 0,00 - 0,02, galope R2 = 0,03 - 0,07; estimulación optimizada: caminar R 2 = 0,02 - 0,21, trote R 2 = 0,02 - 0,12, galope R2 = 0,12 - 0,17. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los bucles de trabajo producidos por el músculo EDL de ratón ex vivo utilizando trayectorias de longitud sinusoidal no emulan con la misma precisión la fuerza de MG de rata in vivo en comparación con las trayectorias de deformación in vivo (Figura 8). El cambio en el trabajo producido por las trayectorias de deformación sinusoidal frente a las in vivo puede explicarse por la ausencia de transitorios de deformación y velocidad en la trayectoria sinusoidal (Figura 9). Mientras que los músculos fueron estimulados a longitudes similares durante la fase de acortamiento activo de las contracciones tanto en las trayectorias sinusoidales como en las trayectorias de deformación in vivo, el inicio de la estimulación se produjo en diferentes fases del ciclo (p. ej., el inicio de la estimulación se produjo en una fase del 74% para la estimulación basada en EMG al trote, pero en una fase del 43% para la estimulación basada en EMG al caminar; ver sección Discusión).

Figure 8
Figura 8: Comparación de los bucles de trabajo sinusoidales in vivo y ex vivo. (A) Bucle de trabajo in vivo (negro) de MG de rata y bucle de trabajo ex vivo (magenta discontinuo) de EDL de ratón utilizando trayectoria de deformación sinusoidal y estimulación basada en EMG. (B) Bucle de trabajo in vivo (negro) de MG de rata y bucle de trabajo ex vivo (magenta sólido) de EDL de ratón utilizando trayectoria de deformación sinusoidal y estimulación optimizada. Obsérvese que los bucles de trabajo sinusoidal sobreestiman el trabajo in vivo debido a la ausencia de transitorios de deformación y velocidad en la trayectoria sinusoidal. Estimulación basada en EMG R 2 = 0,0003, estimulación optimizada R2 = 0,084. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 9
Figura 9: Comparación de las trayectorias de la deformación in vivo y de la longitud sinusoidal ex vivo . Comparación de las trayectorias de la deformación in vivo y de la longitud sinusoidal ex vivo al caminar (verde), trotar (magenta) y galopar (azul). La línea continua es la trayectoria de la deformación in vivo . Trayectoria de longitud sinusoidal ex vivo de línea discontinua. La parte destacada es la estimulación. La estimulación comenzó con la misma longitud durante la fase de acortamiento de la zancada. Flechas que indican transitorios de deformación y velocidad. Las desviaciones de la sinusoidal son la impedancia de las fuerzas externas sobre el músculo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura suplementaria 1: Programa utilizado para recoger la fuerza máxima isométrica a una longitud óptima. El programa utilizado para determinar la longitud óptima durante la contracción supramáxima y submáxima y la estimulación tetánica. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 2: Respuesta de contracción viable. Respuesta de contracción de la EDL del ratón. La fuerza de contracción sube y baja rápidamente y debe alcanzar una tensión activa de ~1 V. El "ruido" debe ser mínimo después de que se haya alcanzado la tensión activa máxima. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Figura complementaria 3: Programa utilizado para recopilar datos del bucle de trabajo. El programa utilizado para controlar la longitud muscular y el momento de la estimulación en los bucles de trabajo ex vivo . Haga clic aquí para descargar este archivo.

Archivo de codificación suplementario 1: Código MATLab utilizado para segmentar y crear un protocolo experimental para el bucle de trabajo. Código MATLab que se utilizó para segmentar la información del paso objetivo (longitud, activación EMG y fuerza) en zancadas individuales. El código incluye el escalado y la interpolación de los pasos del animal objetivo en longitudes que la EDL de ratón ex vivo puede estirar. Además, incluye código para suavizar la señal EMG y comparar la activación para seleccionar el inicio y la duración de la estimulación en experimentos de bucle de trabajo ex vivo . Haga clic aquí para descargar este archivo.

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Discussion

Si bien los organismos se mueven sin problemas a través de los paisajes, las cargas y tensiones subyacentes que experimentan los músculos varían drásticamente 1,6,23. Tanto durante la locomoción in vivo 1,24 como en los experimentos "avatar", los músculos se estimulan submáximamente en condiciones cíclicas y no estables. Las relaciones isométrica fuerza-longitud y fuerza-velocidad isotónica no son adecuadas para predecir la fuerza muscular en estas condiciones2. Comprender los efectos de la deformación no estacionaria (es decir, los transitorios) y la carga es esencial para predecir la producción de fuerza durante el movimiento in vivo y, por lo tanto, es la principal justificación para desarrollar estos experimentos "avatar"2. Los experimentos "Avatar" nos permiten controlar la carga muscular y las trayectorias de tensión mientras medimos la producción de fuerza. La técnica "avatar" investiga la respuesta a la fuerza de los músculos en condiciones similares a las de in vivo, sin factores de confusión de control neural y distensibilidad tendinosa. Para llevar a cabo los experimentos de "avatar", los investigadores necesitarán un programa que permita a un músculo pasar por cambios de longitud prescritos con la capacidad de estimularse a diferentes longitudes iniciales y durante diferentes duraciones (véase la Figura 3 suplementaria para el programa que utilizan los autores). Los investigadores deben especificar la longitud del músculo inicial (mm), la duración de la excursión (mm), el inicio de la estimulación (% de duración del ciclo) y la duración de la estimulación (ms) antes de realizar experimentos (consulte los pasos 1.3-1.4 para obtener los valores de estos parámetros). En general, a menudo es deseable seleccionar zancadas que sean representativas de todas las zancadas del ensayo (p. ej., comenzar y terminar con una longitud similar, alcanzar una fuerza máxima similar, tener una actividad EMG promedio, etc.). Determinar si los datos de EMG/activación y fuerza de una zancada seleccionada son representativos de otras zancadas en el mismo ensayo puede ser útil para "ajustar" más adelante, lo que se puede hacer trazando los bucles de trabajo (fuerza frente a longitud) de todo el ensayo utilizando el músculo del animal objetivo. Durante la locomoción bípeda y cuadrúpeda, la longitud más corta a la longitud más corta generalmente demarca una zancada completa (de punta a punta), pero la activación de EMG puede variar. En algunos animales y músculos, la activación de la EMG está estrechamente correlacionada con el contacto con el pie, como la MG de rata que se muestra aquí22. En otros animales, como el gastrocnemio lateral de la gallina de Guinea, la activación de la EMG generalmente ocurre en la longitud más larga para lograr una mayor estabilidad durante el terreno desconocido25.

Para realizar experimentos de "avatar", es importante minimizar el ruido en los datos de fuerza ex vivo . Las mediciones de fuerza son sensibles a varios problemas, que incluyen, entre otros, el desgarro de los músculos durante la cirugía, la distensibilidad de las suturas si los nudos del bucle son demasiado largos, el escalado inadecuado de las entradas de longitud y la excursión, y la fatiga muscular. El desgarro de los músculos a menudo ocurre cuando se "disecciona el bolsillo" (paso 2.2.3) y se ata el nudo alrededor de la porción proximal del tendón (paso 2.2.4). Mientras "disecciona el bolsillo", mantener las tijeras de disección planas y horizontales al músculo evitará que las puntas corten el EDL. Además, tirar de las tijeras de disección hacia afuera y distalmente mientras se disecciona sin romos también limitará el contacto entre las tijeras de disección y los músculos EDL. Además, los músculos deben mantenerse húmedos con la solución de Krebs-Henseliet durante la preparación de la cirugía y cuando se usa en el equipo.

Escalar correctamente las entradas de longitud es más complicado. La fuerza pasiva y activa del músculo puede verse afectada si la longitud inicial y/o la excursión no se escalan correctamente. El aumento ex vivo de la tensión pasiva debe coincidir con el aumento in vivo de la tensión pasiva (véase la figura 1). Un problema de escala que se ha observado en experimentos anteriores es que tanto la tensión pasiva como la activa pueden verse afectadas si la excursión de longitud (longitud inicial a longitud más larga) es demasiado pequeña o demasiado grande. Teóricamente, los músculos deberían alcanzar la fuerza máxima cerca de su longitud óptima (L 0)26, por lo que utilizamos la longitud óptima (L0) para escalar las longitudes musculares in vivo en experimentos ex vivo de "avatar" para replicar con precisión la producción de fuerza in vivo. Las diferencias arquitectónicas entre los músculos jugarán un papel importante en la determinación de la longitud inicial y los parámetros de la excursión de longitud. Aunque la longitud óptima (L0) se encuentra durante las condiciones isotónicas e isométricas estimuladas supramáximamente, su uso como métrica de escala en experimentos de "avatar" puede resaltar potencialmente las limitaciones de las relaciones fuerza-longitud y fuerza-velocidad durante el movimiento cíclico que necesitan más investigación. En la mayoría de las condiciones de estado estacionario, la longitud, la velocidad y la activación instantáneas del músculo (es decir, las propiedades fuerza-longitud y fuerza-velocidad) se pueden utilizar para predecir la fuerza y el rendimiento del trabajo con una precisión razonable 12,24,27. En condiciones dinámicas con carga variable, la fuerza aumenta en función de la velocidad28 y tiene una relación compleja con la deformación y la activación29,30. Esto contradice las propiedades isotónicas fuerza-velocidad y fuerza-longitud isométricas de los músculos28. En la MG de rata, los transitorios de deformación y velocidad son evidencia de carga, como el contacto con el pie o la interacción con el medio ambiente (es decir, terreno accidentado, viento, cambio repentino de dirección para evitar la depredación) (Figura 9). Estas trayectorias de deformación MG de rata, como la mayoría de las condiciones realistas, tienen cambios repentinos en la carga aplicada, la producción de fuerza y el rendimiento del trabajo 2,28. Este método experimental tiene como objetivo resaltar estas complejas interacciones entre la deformación, la velocidad y la dinámica de activación en condiciones in vivo que no se explican bien por las relaciones tradicionales fuerza-longitud y fuerza-velocidad.

Otros problemas pueden ocurrir cuando la longitud inicial del músculo es demasiado corta o larga. Una longitud inicial demasiado corta dará como resultado una tasa reducida de aumento de la tensión durante el estiramiento pasivo y activo (no se muestra), mientras que una longitud inicial demasiado larga dará como resultado una mayor tasa de aumento de la tensión pasiva (ver Figura 1B). Usar la relación entre la tensión activa y la pasiva puede ser útil. Por ejemplo, en la MG de rata, la tensión pasiva (N) es generalmente alrededor de la mitad de la tensión activa (Figura 2). Si un músculo comienza con una longitud demasiado larga y/o se estira a una longitud demasiado larga, la tensión pasiva puede ser demasiado alta en relación con la tensión activa (véase la figura 1B) y la fuerza puede disminuir rápidamente debido al estiramiento excesivo. Además, estirarse a una longitud demasiado larga dañará potencialmente el músculo y puede hacer que el músculo se canse más rápidamente. Además, la tensión activa puede parecer no fusionada si la longitud inicial es demasiado corta y/o el músculo no se estira a una longitud lo suficientemente larga.

Son necesarios experimentos preliminares para determinar la longitud inicial y la excursión en función de L0. Es posible que se necesiten experimentos preliminares adicionales para ajustar la duración de la estimulación si la dinámica de activación de los músculos utilizados es diferente. Estas optimizaciones son necesarias porque la composición del tipo de fibra y/o la dinámica de activación de los músculos in vivo y ex vivo pueden ser diferentes. En nuestros resultados representativos (Figura 4 y Figura 5), utilizamos dos protocolos de estimulación para EDL en ratones durante experimentos ex vivo para replicar la producción de fuerza MG en ratas in vivo. Para optimizar la producción de fuerza en la EDL del ratón para que se ajustara mejor a la MG in vivo de rata, se aumentó la duración de la estimulación (Figura 2 y Figura 3). Rat MG se compone de tipos de fibra más lentos que el ratón EDL31,32,33. Esto fue evidente en los experimentos de "avatar" porque los músculos EDL de ratón ex vivo produjeron fuerza más rápido después de la excitación, y la fuerza disminuyó a un ritmo más rápido después de la desactivación que la observada in vivo en la rata MG15 (Figura 2), incluso después de tener en cuenta las diferencias de retraso de excitación-contracción entre las condiciones in vivo y ex vivo 34. Dependiendo de los músculos objetivo ex vivo e in vivo, la optimización de la estimulación también podría ser necesaria en otros experimentos de "avatar". En esta técnica de bucle de trabajo ex vivo se pueden utilizar los músculos EDL o sóleo (SOL) de ratón. EDL fue elegido como un "avatar" para la rata MG debido a las similitudes en el tipo de fibra muscular y la estructura de la penación. Es posible que algunos músculos tengan una estructura compleja y no puedan ser emulados utilizando músculos de roedores de laboratorio como un "avatar".

Si bien los experimentos de "avatar" necesitan cierta optimización manual para replicar mejor la producción de fuerza in vivo, la técnica es aplicable a una variedad de animales y modos locomotores diferentes. La técnica del "avatar" puede ser especialmente útil para comprender la producción de fuerza in vivo en animales cuyos músculos son demasiado grandes o inaccesibles para experimentos ex vivo. Si bien solo se han realizado trabajos preliminares en animales más grandes35, este trabajo ha demostrado potencial para la aplicabilidad de esta técnica en animales, músculos y marcha locomotora utilizando ratones de laboratorio como "avatares". La utilidad de los experimentos de "avatar" depende de la precisión con la que se pueda utilizar un modelo de roedor de laboratorio conveniente, barato, fácilmente disponible y bien caracterizado (es decir, EDL de ratón) para comprender in vivo la mecánica de diferentes músculos de diferentes especies de vertebrados. Los resultados de los experimentos preliminares de "avatar" presentados aquí (rata MG) y en otros lugares (gallina de Guinea LG19), sugieren que esta técnica puede utilizarse para predecir con precisión las fuerzas in vivo y podría aplicarse a otros animales. Las aplicaciones futuras de este método deberían ampliar los tipos de músculos y animales que se han utilizado como objetivos y "avatares" durante los experimentos ex vivo e in vitro. Los experimentos "Avatar" nos permiten examinar los factores que afectan la fuerza muscular y la producción de trabajo durante la locomoción in vivo, cuando la carga muscular y la tensión varían abruptamente 1,2,19. Específicamente, el método "avatar" nos permite examinar los efectos de los transitorios de deformación y velocidad sobre la fuerza muscular que no son capturados por los modelos musculares tradicionales o los experimentos de bucle de trabajo sinusoidal.

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Disclosures

Todos los autores reconocen que no existe conflicto de intereses.

Acknowledgments

Agradecemos al Dr. Nicolai Konow por proporcionar los datos utilizados en este estudio. Financiado por NSF IOS-2016049 y NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

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Avatar Experimentos De Bucle De Trabajo Ex Vivo Tensión In Vivo Conductas De Movimiento De Activación Producción De Fuerza Muscular Producción De Trabajo Sistemas Neurales Y Mecánicos Organización Biológica Jerarquía De Control Modelos Musculares Fuerza Muscular In Vivo Trabajo Muscular In Vivo Mecánica Muscular Condiciones De Tensión Y Carga Locomoción In Vivo Transitorios De Tensión Y Velocidad Activación Neural Cinemática Musculoesquelética Cargas Ambientales Técnica Avatar
"Avatar", un experimento de bucle de trabajo <em>ex</em> vivo modificado utilizando cepa y activación <em>in vivo</em>
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Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

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