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Bioengineering

"Avatar", un ciclo di lavoro ex vivo modificato sperimenta utilizzando la deformazione e l'attivazione in vivo

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Questo articolo descrive in dettaglio la metodologia per emulare la produzione di forza muscolare in vivo durante esperimenti di loop di lavoro ex vivo utilizzando un muscolo "avatar" di un roditore di laboratorio per valutare i contributi dei transitori di deformazione e dell'attivazione alla risposta alla forza muscolare.

Abstract

I comportamenti di movimento sono caratteristiche emergenti dei sistemi dinamici che derivano dalla produzione di forza muscolare e dalla produzione di lavoro. L'interazione tra sistemi neurali e meccanici si verifica contemporaneamente a tutti i livelli dell'organizzazione biologica, dalla regolazione delle proprietà muscolari delle gambe durante la corsa alla dinamica degli arti che interagiscono con il suolo. Comprendere le condizioni in cui gli animali spostano le loro strategie di controllo neurale verso la meccanica muscolare intrinseca ("preflex") nella gerarchia di controllo consentirebbe ai modelli muscolari di prevedere la forza muscolare in vivo e di lavorare in modo più accurato. Per comprendere la meccanica muscolare in vivo, è necessario studiare ex vivo la forza muscolare e lavorare in condizioni di deformazione e carico dinamicamente variabili simili alla locomozione in vivo. Le traiettorie di deformazione in vivo mostrano tipicamente cambiamenti improvvisi (cioè transitori di deformazione e velocità) che derivano dalle interazioni tra l'attivazione neurale, la cinematica muscoloscheletrica e i carichi applicati dall'ambiente. L'obiettivo principale della nostra tecnica "avatar" è quello di studiare come funzionano i muscoli durante i bruschi cambiamenti nella velocità di deformazione e nel carico, quando il contributo delle proprietà meccaniche intrinseche alla produzione di forza muscolare può essere più elevato. Nella tecnica "avatar", l'approccio tradizionale del ciclo di lavoro viene modificato utilizzando traiettorie di deformazione misurate in vivo e segnali elettromiografici (EMG) dagli animali durante i movimenti dinamici per guidare i muscoli ex vivo attraverso più cicli di allungamento-accorciamento. Questo approccio è simile alla tecnica del ciclo di lavoro, tranne per il fatto che le traiettorie di deformazione in vivo vengono scalate in modo appropriato e imposte ai muscoli del topo ex vivo collegati a un servomotore. Questa tecnica consente di: (1) emulare in vivo la deformazione, l'attivazione, la frequenza del passo e i modelli di work-loop; (2) variare questi modelli in modo che corrispondano in modo più accurato alle risposte alla forza in vivo; e (3) variare le caratteristiche specifiche della deformazione e/o dell'attivazione in combinazioni controllate per testare ipotesi meccanicistiche.

Introduction

Gli animali in movimento raggiungono impressionanti imprese atletiche di resistenza, velocità e agilità in ambienti complessi. La locomozione animale è particolarmente impressionante in contrasto con le macchine progettate dall'uomo: la stabilità e l'agilità dei robot con zampe attuali, delle protesi e degli esoscheletri rimangono scarse rispetto agli animali. La locomozione delle gambe in terreni naturali richiede un controllo preciso e regolazioni rapide per alterare la velocità e manovrare le caratteristiche ambientali che agiscono come perturbazioni inaspettate 1,2,3,4. Tuttavia, la comprensione della locomozione non stazionaria è intrinsecamente impegnativa perché la dinamica dipende da complesse interazioni tra l'ambiente fisico, la meccanica muscolo-scheletrica e il controllo sensomotorio 1,2. La locomozione delle gambe richiede la risposta a perturbazioni inaspettate con una rapida elaborazione multimodale delle informazioni sensoriali e l'attuazione coordinata di arti e articolazioni 1,5. In definitiva, il movimento è reso possibile dai muscoli che producono forza attraverso le proprietà meccaniche intrinseche del sistema muscolo-scheletrico e dal controllo neurale 1,5,6,7. Una questione in sospeso della neuromeccanica è come questi fattori interagiscono per produrre un movimento coordinato in risposta a perturbazioni inaspettate. La seguente tecnica utilizza la risposta meccanica intrinseca del muscolo alla deformazione utilizzando traiettorie di deformazione in vivo durante esperimenti ex vivo controllabili con un muscolo "avatar".

La tecnica del loop di lavoro muscolare ha fornito un quadro importante per la comprensione della meccanica muscolare intrinseca durante i movimenti ciclici 8,9,10. La tecnica tradizionale del ciclo di lavoro guida i muscoli attraverso traiettorie di deformazione predefinite, tipicamente sinusoidali, utilizzando frequenze e modelli di attivazione misurati durante gli esperimenti in vivo 2,8,9,11. L'utilizzo di traiettorie di lunghezza sinusoidale può stimare realisticamente il lavoro e la potenza erogata durante il volo12 e il nuoto2 in condizioni in cui gli animali non subiscono rapidi cambiamenti nelle traiettorie di deformazione a causa dell'interazione con l'ambiente e la cinematica muscoloscheletrica. Tuttavia, le traiettorie di deformazione muscolare in vivo durante la locomozione delle gambe derivano dinamicamente dalle interazioni tra l'attivazione neurale, la cinematica muscoloscheletrica e i carichi applicati dall'ambiente 5,7,13,14. È necessaria una tecnica di ciclo di lavoro più realistica per emulare i carichi, le traiettorie di deformazione e la produzione di forza che corrisponda alle dinamiche muscolo-tendinee in vivo e fornisca informazioni su come la meccanica muscolare intrinseca e il controllo neurale interagiscono per produrre un movimento coordinato di fronte alle perturbazioni.

Qui, presentiamo un nuovo modo per emulare le forze muscolari in vivo durante la locomozione su tapis roulant utilizzando un muscolo "avatar" di un roditore da laboratorio durante esperimenti ex vivo controllati con traiettorie di deformazione in vivo che rappresentano carichi in vivo variabili nel tempo. L'utilizzo delle traiettorie di deformazione misurate in vivo da un muscolo bersaglio sui muscoli di un animale da laboratorio durante esperimenti ex vivo controllati emulerà i carichi sperimentati durante la locomozione. Negli esperimenti qui descritti, il muscolo estensore lungo delle dita (EDL) del topo ex vivo viene utilizzato come "avatar" per il muscolo gastrocnemio mediale (MG) del ratto in vivo durante la camminata, il trotto e il galoppo su un tapis roulant13. Questo approccio è simile alla tecnica del ciclo di lavoro, tranne per il fatto che le traiettorie di deformazione in vivo vengono scalate in modo appropriato e imposte ai muscoli del topo ex vivo collegati a un servomotore. Mentre i muscoli EDL del topo differiscono per dimensioni, tipo di fibra e architettura rispetto al ratto MG, è possibile controllare queste differenze. La tecnica "avatar" consente di: (1) emulare in vivo la deformazione, l'attivazione, la frequenza del passo e i modelli di ciclo di lavoro; (2) variare questi modelli in modo che corrispondano in modo più accurato alle risposte alla forza in vivo; e (3) variare le caratteristiche specifiche della deformazione e/o dell'attivazione in combinazioni controllate per testare ipotesi meccanicistiche.

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Protocol

Tutti gli studi sugli animali sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Northern Arizona University. Per il presente studio sono stati utilizzati muscoli estensori lunghi delle dita lunghe (EDL) di topi wild-type maschi e femmine (ceppo B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J), di età compresa tra 60 e 280 giorni. Gli animali sono stati ottenuti da una fonte commerciale (vedi Tabella dei materiali) e stabiliti in una colonia presso la Northern Arizona University.

1. Selezione della traiettoria del ceppo in vivo e preparazione per l'uso durante esperimenti in loop di lavoro ex vivo

NOTA: In questo protocollo, le misurazioni precedenti della locomozione dinamica in vivo, fornite direttamente agli autori (Nicolai Konow, UMass Lowell, comunicazione personale), sono state utilizzate in esperimenti ex vivo . I dati originali sono stati raccolti per Wakeling et al.15. Per replicare il protocollo sono necessari i dati relativi al tempo, alla durata o alla deformazione, all'EMG/attivazione e alla forza.

  1. Segmentare l'intero studio in vivo in singoli step utilizzando qualsiasi piattaforma di programmazione (codice MATLab fornito nel file di codifica complementare 1).
    1. Tracciare le variazioni di lunghezza rispetto a. tempo per l'intero studio in vivo . Questo viene utilizzato per visualizzare i singoli passi (da posizione a posizione) e per valutare la variabilità tra i passi (Figura 1).
    2. Calcolare la deformazione per l'intera prova (Lunghezza (L) /Forza isometrica massima alla lunghezza ottimale L0).
    3. Selezionare una falcata dall'intera prova che sia rappresentativa di tutte le falcate e che inizi e finisca con lunghezze simili. Questo può essere fatto visivamente rappresentando graficamente le lunghezze l'una sull'altra per confrontare ogni falcata.
    4. Dopo aver selezionato una falcata rappresentativa, segmentare i dati di deformazione, EMG/attivazione e forza dall'intero studio utilizzando qualsiasi piattaforma di programmazione (vedere il file di codifica supplementare 1 per i codici utilizzati in MATLab16).
    5. Se la frequenza di campionamento differisce per deformazione, EMG/attivazione o forza, interpolare i punti dati in modo che tutti vengano campionati alla stessa frequenza.
      NOTA: I ricercatori possono determinare la frequenza di cattura in base agli intervalli di tempo tra ciascun punto campionato nell'intero studio. Se le variabili vengono acquisite alla stessa frequenza, i tempi di campionamento saranno gli stessi.
  2. Calcola la frequenza delle falcate segmentate.
    1. Calcola la frequenza determinando la durata di una falcata segmentata in secondi e dividendo 1 (secondo) per la durata (1/durata = # falcate al secondo).
    2. Determinare manualmente il numero di punti dati che devono essere acquisiti negli esperimenti ex vivo per far corrispondere la frequenza.
    3. Calcola il tempo necessario per due falcate. Ripetere i passi almeno una volta per stimare l'errore di misurazione muscolare, che sarà necessario per la successiva analisi statistica.
  3. Determinare la fase di stimolazione rispetto all'input di sforzo utilizzando l'attività EMG misurata per determinare l'insorgenza e la durata della stimolazione per i cicli di lavoro ex vivo . È possibile utilizzare qualsiasi piattaforma di programmazione (vedere il file di codifica supplementare 1 per il codice utilizzato in questo studio).
    1. Visualizza il segnale EMG sullo stesso intervallo dell'asse x (tempo) della variazione di deformazione (Figura 1). Ingrandire il segnale EMG in modo che sia visibile; questo può essere fatto moltiplicando il segnale EMG per un numero arbitrario, ridimensionando la deformazione e l'EMG in modo che siano sulla stessa scala e/o aggiungendo il segnale EMG alla deformazione.
      NOTA: Gli autori hanno riscalato la deformazione e l'EMG in modo che fossero sulla stessa scala utilizzando la funzione "rescale" in MATLab (vedere la Figura 1 supplementare).
    2. Trova dove inizia e finisce l'attività EMG, come indicato da una variazione di intensità di due deviazioni standard17,18.
      NOTA: A seconda dell'animale e del muscolo, l'insorgenza dell'EMG potrebbe corrispondere o meno al contatto con il piede (Monica Daley, UC Irvine, comunicazione personale) (vedere la sezione Discussione).
    3. Calcolare la percentuale del ciclo di deformazione (ad esempio, 40%) in cui si verifica l'inizio dell'attivazione EMG e per quanto tempo si verificherà la stimolazione (ad esempio, 222 ms).
      NOTA: I ricercatori dovranno tenere conto di un ritardo di accoppiamento eccitazione-contrazione (ECC) che differisce tra il movimento in vivo e i cicli di lavoro ex vivo e può essere diverso per ogni animale e muscolo (ad esempio, l'ECC in vivo è di 24,5 ms per la MG di ratto, l'ECC ex vivo è di ~5 ms per l'EDL di topo).
  4. Preparare input di deformazione rappresentativi per il programma di controllo del ciclo di lavoro. Qualsiasi programma in grado di catturare l'uscita della forza con l'input per la deformazione e la stimolazione può essere utilizzato per il programma di controllo del ciclo di lavoro (vedere la sezione Discussione).
    1. Prendere la falcata selezionata e interpolarla fino al numero appropriato di punti necessari per acquisire il passo con frequenza in vivo per due cicli (vedere il passaggio 1.2).
    2. Ridimensionare la falcata per iniziare e arrestarsi a "sforzo zero" (ad esempio, L 0 o 95% L0) dopo l'allungamento con un'escursione di lunghezza predeterminata (vedere il passaggio 3.3).
    3. "Scalare" la falcata selezionata, se necessario, da utilizzare come input per i cambiamenti di deformazione nell'EDL del topo (vedere la sezione Discussione). Per scalare, selezionare un'escursione di lunghezza a cui l'EDL del topo può essere allungato senza danni (ad esempio, in genere allunghiamo l'EDL del topo del 10% L0 indipendentemente dalla specie in vivo ). Potrebbe essere necessario modificare questo aspetto in base ai risultati preliminari (vedere il punto 3.3).

Figure 1
Figura 1: Durata nel tempo dell'intero studio in vivo . Lunghezza (mm) tracciata rispetto al tempo di ratto MG. Le falcate sono delimitate da cerchi, dalla lunghezza più corta alla lunghezza più corta, considerate falcata singola. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

2. Valutazione della forza isometrica massima del muscolo del topo ex vivo

  1. Allestire l'attrezzatura e l'ambulatorio.
    NOTA: Vedere la sezione Discussione per una spiegazione dell'attrezzatura necessaria per il ciclo di lavoro ex vivo .
    1. Preparare un bagno tessuto-organo inserendo la valvola a spillo oxytube nel bagno tissutale della camicia d'acqua (vedere Tabella dei materiali). Collegare l'ossitubo a una bombola di gas con il 95% 0 2-5% di CO2 . Lasciare che 20 psi riempiano il bagno di tessuto della camicia d'acqua.
    2. Preparare l'area chirurgica facendo scorrere un ossitubo aggiuntivo dalla linea del gas a un piatto di cristallizzazione riempito con la soluzione di Krebs-Henseleit (passaggio 2.1.3) vicino all'area chirurgica. Questo verrà utilizzato per mantenere i muscoli aerati e idratati durante e dopo gli interventi chirurgici.
      NOTA: I muscoli possono anche essere immagazzinati in questa soluzione aerata fino a 4 ore, se più di un muscolo viene estratto dal mouse alla volta.
    3. Preparare 1 L di soluzione di Krebs-Henseleit contenente (in mmol l-1): NaCl (118); KCl (4,75); MgSO4 (1,18); KH2PO4 (1,18); CaCl 2 (2,54); e glucosio (10,0) a temperatura ambiente e pH a 7,4 utilizzando HCl e NaOH (vedi Tabella dei materiali). Quando si maneggiano HCl e NaOH, indossare i DPI adeguati di occhiali e guanti.
    4. Riempire il bagno con la soluzione di Krebs-Henseleit a temperatura ambiente e pH 7,4. Immergere completamente il muscolo e l'uncino nella soluzione.
    5. Accendere tutte le apparecchiature; sistema di leva muscolare dual-mode, stimolatore e interfaccia di segnale (scheda DAQ) (vedi Tabella dei materiali).
  2. Dissezione muscolare EDL.
    1. Anestetizzare profondamente il topo e poi eseguire l'eutanasia mediante lussazione cervicale. Appoggiare il topo in posizione sdraiata laterale destra o sinistra con l'arto posteriore superiore allungato e le dita dei piedi che toccano la tavola di dissezione. Rimuovere il pelo dalla caviglia fino a sopra l'articolazione del ginocchio.
    2. Avvolgere la pelle con una pinza e tagliare dall'articolazione della caviglia alla zona dell'anca. Una volta che il muscolo è stato esposto, taglia intorno alla caviglia come un "orlo" di pantaloni. Tira la pelle verso l'alto per esporre più chiaramente i muscoli delle gambe.
    3. Individua la linea della fascia che separa il tibiale anteriore (TA) e il gastrocnemio, separa usando le forbici da dissezione per esporre i tendini del ginocchio. Posizionare le forbici di dissezione tra i due tendini del ginocchio esposti. Le forbici si "impigliano" in una tasca appena sotto i tendini del ginocchio esposti. Blunt seziona una "tasca" mentre allontani le forbici dalla gamba finché le forbici non raggiungono la caviglia per esporre l'EDL.
    4. Utilizzando un nodo ad anello pre-legato nella sutura chirurgica in seta di misura 4-0 (vedi Tabella dei materiali), allacciare un'estremità della sutura sotto il tendine più vicino al ginocchio. Fai un doppio nodo quadrato sopra la giunzione muscolo-tendinea prossimale senza posizionarlo sul muscolo o includere il tendine. Taglia sopra il nodo. Tira delicatamente l'anello legato al tendine e l'EDL emergerà dalla "tasca".
    5. Fissare l'anello all'area di dissezione per creare tensione nell'EDL. Fai un doppio nodo quadrato usando un altro nodo ad anello pre-legato alla giunzione distale muscolo-tendineo senza posizionarlo sul muscolo o includere il tendine. Taglia il nodo sul lato più vicino alla gamba per rimuovere l'intero EDL dal mouse. Tagliare la sutura extra dai doppi nodi quadrati sui lati prossimali e distali del muscolo e posizionare il muscolo nel bagno aerato vicino all'area chirurgica.
      NOTA: Assicurarsi di annotare quale lato è prossimale e/o distale se si posiziona il muscolo in un bagno aerato.
    6. Per posizionarlo sul rig della leva del servomotore, collegare EDL verticalmente tra gli elettrodi di platino sospesi. Fissare il nodo dell'anello distale al gancio fisso e fissare il nodo dell'anello prossimale al gancio attaccato al braccio del servomotore. Sollevare il bagno di tessuto per immergere il muscolo nella soluzione aerata di Krebs-Henseleit.
      NOTA: L'aerazione non deve disturbare il muscolo quando è immerso. In tal caso, abbassare la pressione del gas. Lasciare che il muscolo si equilibri per 10 minuti prima di iniziare la stimolazione.
  3. Misura la forza isometrica massima del muscolo EDL.
    NOTA: Fare riferimento alla Tabella 1 per il protocollo su come misurare la forza isometrica massima utilizzando la contrazione e il tetano. Vedere la Figura 1 supplementare per un'illustrazione del programma utilizzato dagli autori.
    1. Stimolare il muscolo con una contrazione sopramassimale per garantire che il muscolo non sia stato danneggiato durante l'intervento chirurgico (80 V, 1 pps, 1ms; Tabella 1; si veda la figura 2 supplementare). Se non si è verificato alcun danno, utilizzare la manopola della lunghezza sul sistema di leve muscolari per trovare una lunghezza muscolare utilizzando la stimolazione della contrazione in cui la tensione attiva è ~1V / 0.1271 N con una tensione passiva inferiore a ~0.1V / 0.01271N.
    2. Registra la lunghezza iniziale del muscolo da un nodo di sutura all'altro in Volt e millimetri. Inserire le misurazioni nella parte di calibrazione del programma per la lunghezza iniziale (vedere la Figura 1 supplementare).
    3. Trova la forza isometrica massima di contrazione sopramassimale alla lunghezza ottimale (L0) di EDL (Tabella 1). Tecnicamente non è necessario alcun periodo di riposo, ma attendere 1 minuto tra una stimolazione e l'altra stabilizzerà la tensione passiva. Registrare la lunghezza (in Volt) alla quale la contrazione sopramassimale è massima. Questa è la lunghezza ottimale del muscolo (L0) per la contrazione.
    4. Misura il muscolo con i calibri a questa lunghezza. Misura il muscolo da un nodo di sutura all'altro. Una volta trovato L 0, accorciare il muscolo fino alla lunghezza iniziale (tensione attiva ~1V / 0,1271 N).
    5. Trova la forza isometrica massima del tetano sopramassimale di EDL (80 V, 180 pps, 500 ms; Tabella 1). Registrare la lunghezza (in Volt e millimetri) della forza tetanica sopramassimale a L0 e misurare di nuovo le fibre da un nodo di sutura all'altro con un calibro.
      NOTA: Aumentando la lunghezza del muscolo con incrementi di 0,5 V/0,65 mm si otterrà un L0 più accurato sia per la contrazione che per il tetano.
    6. Trova la forza isometrica submassimale di EDL (45 V, 110 pps, 500ms; Tabella 1) a L0 prima e dopo l'esperimento per garantire che non si verificasse affaticamento dal protocollo di stimolazione. Una diminuzione del 10% della forza è considerata un muscolo "affaticato".
Rsperimento Intensità di simulazione (V) Frequenza dell'impulso (pps / Hz) Durata della stimolazione (ms) Commenti
1. "Riscaldamento" 80 1 1 Aumentare o diminuire la lunghezza di 0,50 V per trovare una tensione passiva di 1 V
2. Contrazione ottimale della lunghezza del muscolo (L0) 80 1 1 Aumentare o diminuire la lunghezza di 0,50 V per trovare una tensione passiva di ~1 V
3. Lunghezza muscolare ottimale tetano (L0) 80 180 500 Riposo 3 minuti tra il cambio di lunghezza di 0,50 V
4. L0 submassimale pre-esperimento 45 110 500 Alla lunghezza di L0
6. Esperimenti con gli avatar 45 110 Utilizzare ciclicamente le variazioni di lunghezza rappresentative per l'EDL del topo
7. L0 submassimale post-esperimento 45 110 500 Ritorna a L0 dopo l'esperimento e misura L0

Tabella 1: Protocollo di stimolazione. Protocollo di stimolazione per la ricerca della durata ottimale della contrazione sopramassimale e submassimale e del tetano. Il protocollo varia in base all'intensità della stimolazione, alla tempistica e agli impulsi al secondo.

3. Completamento della tecnica del ciclo di lavoro "avatar" utilizzando traiettorie di ceppi in vivo selezionate

  1. Impostare il software necessario per completare le tecniche del ciclo di lavoro "avatar" (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: È necessario un file di input (.csv o simile) che specifichi la lunghezza muscolare ad ogni passo temporale (vedi passaggio 1.4). Sono necessari input per la percentuale del ciclo in cui inizia la stimolazione e per la durata della stimolazione (vedere ad esempio la figura 3 supplementare ).
  2. Completa la tecnica del ciclo di lavoro "avatar".
    NOTA: Mentre utilizziamo un programma LabView personalizzato, i ricercatori possono utilizzare qualsiasi programma che consenta il controllo delle variazioni di lunghezza nell'EDL del topo su una leva del servomotore, il controllo dell'insorgenza (% del ciclo) e della durata (ms) della stimolazione in momenti specifici e la misurazione della forza muscolare. Vedere la Figura 3 supplementare per un'illustrazione del programma utilizzato dagli autori.
    1. Caricare le variazioni di deformazione scalate con l'escursione di lunghezza scalata nel programma dal passaggio 1.4. Vedere i passaggi 1.4, 3.3 e la sezione Discussione per ulteriori informazioni sulle "variazioni di deformazione scalate".
    2. Regolare la lunghezza iniziale del muscolo se necessario (vedere paragrafo 3.3). Inserire la lunghezza iniziale in V e mm per calibrare i risultati (vedere la Figura 3 supplementare).
    3. Utilizzare l'inizio e la durata della stimolazione calcolati al punto 1.3.
    4. Far scorrere il muscolo attraverso i cambiamenti di lunghezza scalati con un'escursione di lunghezza determinata per due cicli.
    5. Salvare i dati. Se vengono raccolti più protocolli di stimolazione sullo stesso muscolo, attendere 3 minuti tra una stimolazione e l'altra.
    6. Stimolare alla lunghezza ottimale (L0) utilizzando l'attivazione submassimale per determinare se si è verificato affaticamento. Se la forza diminuisce di oltre il 10%, i muscoli sono considerati affaticati. Vedere la Tabella 1 per i protocolli di stimolazione.
    7. Rimuovi il muscolo dal bagno. Tagliare i nodi dal muscolo e tamponare la soluzione in eccesso dal muscolo. Pesa il muscolo. Determinare l'area fisiologica della sezione trasversale utilizzando la formula standard: massa muscolare/(L0*1,06)19.
  3. Ottimizza i parametri per la tecnica del ciclo di lavoro "avatar" (vedi la sezione Discussione).
    1. Determinare la lunghezza iniziale e l'escursione di lunghezza confrontando l'aumento della tensione passiva ex vivo con l'aumento della tensione passiva osservato in vivo (Figura 2).
      NOTA: Questo studio ha utilizzato la percentuale L 0 per scalare la lunghezza iniziale (mm) e l'escursione (% L0; vedere il passaggio 1.4 e la sezione Discussione). Per far corrispondere l'aumento di tensione nell'EDL di topo ex vivo a quello del ratto in vivo MG, gli autori hanno scoperto che la lunghezza iniziale a L0 produceva il miglior adattamento (Figura 2).
    2. Scegli tre lunghezze iniziali (ad esempio, -5% L 0, L 0 e +5% L0). Eseguire il ciclo di lavoro "avatar" a ciascuna di queste lunghezze iniziali con un'escursione di lunghezza specificata (ad esempio, 10% L0).
      NOTA: Nei presenti esperimenti di "avatar" che utilizzano EDL di topo, è stata utilizzata un'escursione di lunghezza del 10% L0 .
    3. Ripetere con nuove lunghezze iniziali e/o escursioni fino a quando il tasso di aumento della tensione passiva ex vivo è simile al tasso di aumento della tensione passiva in vivo (vedere Figura 2B).
    4. A seconda dei tipi di fibre e delle dinamiche di attivazione dei muscoli utilizzati, aumentare o diminuire la durata della stimolazione per ottimizzare la corrispondenza tra forza ex vivo e forza in vivo . Pertanto, potrebbe essere necessario modificare l'inizio e/o la durata della stimolazione per adattarsi al meglio alla produzione di forza in vivo durante gli esperimenti "avatar".
    5. Per decidere se ciò è necessario (vedi sezione Discussione), tracciare la forza nel tempo del muscolo "avatar" e in vivo (Figura 3) e calcolare il coefficiente di determinazione R2 elevando al quadrato la correlazione tra la forza muscolare bersaglio e quella "avatar" (vedi Risultati rappresentativi).

Figure 2
Figura 2: Aumento della tensione passiva corrispondente. Anelli di lavoro che mostrano l'aumento in vivo ed ex vivo della tensione passiva (frecce). Ciclo di lavoro in scala in vivo da ratto MG (nero) che cammina a 2,9 Hz (dati da Wakeling et al.15). Loop di lavoro in scala ex vivo da EDL di topo (verde) a 2,9 Hz. (A) La lunghezza iniziale del muscolo EDL del topo è +5% L0. (B) La lunghezza iniziale del muscolo EDL del topo è L0. Si noti che l'aumento della tensione passiva ex vivo corrisponde all'aumento della tensione in vivo in A ma non in B. Linee più spesse indicano la stimolazione. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3: Ottimizzazione della durata della stimolazione dell'EDL nel topo per abbinare la forza in vivo della MG di ratto (linea nera). La forza generata dall'EDL di topo utilizzando la stimolazione basata su EMG (linea tratteggiata verde) diminuisce prima della forza in vivo, probabilmente a causa di una disattivazione più rapida dell'EDL di topo rispetto alla MG di ratto. Per ottimizzare l'adattamento tra le forze in vivo ed ex vivo, l'EDL del topo è stato stimolato per una durata più lunga (linea verde continua). Stimolazione basata su EMG R 2 = 0,55, Stimolazione ottimizzata R2 = 0,91. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Representative Results

L'obiettivo degli esperimenti "avatar" è quello di replicare la produzione di forza in vivo e l'output del lavoro il più fedelmente possibile durante gli esperimenti di ciclo di lavoro ex vivo. Questo studio ha scelto di utilizzare l'EDL di topo come "avatar" per la MG di ratto perché l'EDL di topo e la MG di ratto sono entrambi costituiti principalmente da muscoli a contrazione rapida20,21. Entrambi i muscoli sono motori primari dell'articolazione della caviglia (EDL flessore dorsale della caviglia, flessore plantare della caviglia MG) con angoli di pennazione simili (EDL di topo 12,4 + 2,12°22, MG di ratto 20° utilizzato in questo studio15). I cicli di lavoro rappresentativi in scala di MG15 di ratto sono stati confrontati con esperimenti "avatar" ex vivo (Figura 4) utilizzando due diversi protocolli di stimolazione (uno dall'attività EMG misurata e uno ottimizzato come nel passaggio 3.3). I valori di R 2 qui presentati sono stati calcolati utilizzando l'intero ciclo di allungamento-accorciamento in scala (2 cicli/condizione), con ogni ciclo che ha più di 2000 punti corrispondenti alla velocità locomotoria (passo = 5521 punti, trotto = 5002, galoppo = 2502 punti). I cicli di lavoro sono stati ridimensionati per tenere conto delle differenze nelle dimensioni dei muscoli, P0 e PCSA. Il ridimensionamento è stato eseguito mappando linearmente la forza e la deformazione su una scala simile (0-1) per confrontare la MG di ratto e l'EDL di topo. Visivamente, è evidente che l'ottimizzazione del protocollo di stimolazione (Figura 4B) per tenere conto delle diverse dinamiche di attivazione dei muscoli EDL di topo e MG di ratto migliora l'adattamento alla forza MG di ratto in vivo rispetto all'attivazione basata su EMG (vedere la sezione Discussione). Per l'EDL del topo, circa il doppio della durata della stimolazione per le traiettorie di sforzo più lente (camminata e trotto) ha aumentato l'R2 del 62% nella deambulazione e del 109% nella trotto. Per la traiettoria di deformazione più veloce (galoppo), l'aumento del tempo di stimolazione della metà del tempo osservato ha aumentato l'R2 del 22%.

Figure 4
Figura 4: Confronto tra cicli di lavoro in vivo ed ex vivo. Anelli di lavoro di MG di ratto in vivo (nero) e EDL di topo ex vivo (verde) durante la deambulazione (2,9 Hz) utilizzando traiettorie di deformazione in vivo. La linea più spessa indica la stimolazione sia nei cicli di lavoro in vivo che in quelli ex vivo. (A) Ciclo di lavoro di MG di ratto in vivo (nero) e EDL di topo ex vivo (tratteggiato in verde) durante la deambulazione utilizzando il protocollo di stimolazione basato su EMG. (B) Ciclo di lavoro di MG di ratto in vivo (nero) e EDL di topo ex vivo (verde fisso) durante la deambulazione (2,9 Hz) utilizzando una stimolazione ottimizzata. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Un alto R2 tra la produzione di forza ex vivo EDL nel topo e la produzione di forza in vivo del gastrocnemio mediale (MG) di ratto15 indica una buona replicazione (Figura 5). Negli esperimenti di stimolazione basati su EMG, i valori medi di R2 erano 0,535, 0,428 e 0,77 rispettivamente per la camminata, il trotto e il galoppo. Negli esperimenti di stimolazione ottimizzata, i valori medi di R2 erano rispettivamente 0,872, 0,895 e 0,936 nella camminata, nel trotto e nel galoppo. Come discusso in precedenza (passaggio 3.3, Figura 5), a seconda delle dinamiche di attivazione dei muscoli utilizzati, potrebbe essere necessario ottimizzare anche il protocollo di stimolazione. La previsione della forza MG in vivo utilizzando EDL di topo ex vivo è stata migliorata in tutte le velocità locomotorie ottimizzando la stimolazione, aumentando R2 (Figura 5A, B) e diminuendo l'errore quadratico medio (RMSE). L'RMSE è diminuito dopo l'ottimizzazione per tutte le velocità (Figura 6). L'RMSE medio per la stimolazione basata su EMG è stato di 0,31, 0,43 e 0,158 per la camminata, il trotto e il galoppo. L'RMSE medio per la stimolazione ottimizzata è stato di 0,181, 0,116, 0,101 per la camminata, il trotto e il galoppo.

Figure 5
Figura 5: Valori R 2 per la produzione di forza in vivo ed ex vivo: Grafico a scatola e baffo dei valori R2 per confronti di forza in vivo ed ex vivo . Osservazioni individuali tracciate, mediana, 25° e 75° percentile indicati. (A) Valori R 2 per la produzione di forza in vivo ed ex vivo utilizzando un protocollo di stimolazione basato sul segnale EMG misurato in vivo durante la camminata a 2,9 Hz (verde), il trotto a 3,2 Hz (magenta) e il galoppo a 6,2 Hz (ciano). (B) Valori di R 2 per la produzione di forza in vivo ed ex vivo utilizzando una stimolazione ottimizzata (vedi Figura 2). L'ottimizzazione dell'insorgenza e della durata della stimolazione ha aumentato R2 per tutte le andature. Stimolazione basata sull'EMG: camminata R 2 = 0,50-0,55, trotto R2 = 0,37-0,47, galoppo R2= 0,62-0,90; stimolazione ottimizzata: camminata R 2 = 0,74-0,93, trotto R 2 = 0,85-0,92, galoppo R2 = 0,87-0,97. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 6
Figura 6: Errore quadratico medio (RMSE) per la produzione di forza in vivo ed ex vivo . Grafico a scatola e a baffo dei valori RMSE per confronti di forze in vivo ed ex vivo . Osservazioni individuali tracciate, mediana, 25° e 75° percentile indicati. (A) Valori RMSE per la produzione di forza in vivo ed ex vivo utilizzando il protocollo di stimolazione basato su EMG. (B) Valori RMSE per in vivo ed ex vivo utilizzando un protocollo di stimolazione ottimizzato. L'ottimizzazione dell'insorgenza e della durata della stimolazione ha ridotto l'RMSE per tutte le andature. Camminata a 2,9 Hz (verde), trotto a 3,2 Hz (magenta) e galoppo a 6,4 Hz (ciano). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Per testare le prestazioni dei metodi tradizionali di loop di lavoro nel predire le forze muscolari in vivo, sono stati eseguiti anche loop di lavoro sinusoidali per l'EDL di topo alla stessa frequenza, escursione di lunghezza, lunghezza di partenza, inizio della stimolazione e durata degli esperimenti "avatar" utilizzando traiettorie di ceppo MG di ratto in vivo. I valori di R2 erano significativamente inferiori rispetto alle traiettorie di deformazione in vivo sia per i protocolli di stimolazione basati su EMG che per quelli ottimizzati (Figura 7). I valori medi di R2 per la stimolazione basata su EMG utilizzando traiettorie di lunghezza sinusoidale erano 0,062, 0,067 e 0,141 alle frequenze di camminata, trotto e galoppo. I valori medi di R2 per una stimolazione ottimizzata utilizzando traiettorie di lunghezza sinusoidale erano 0,09, 0,067 e 0,141 alle frequenze di camminata, trotto e galoppo.

Figure 7
Figura 7: R2 Valori per la produzione di forza in vivo ed ex vivo utilizzando variazioni di lunghezza sinusoidale. Grafico a scatola e a baffo dei valori RMSE per confronti di forze in vivo ed ex vivo. Osservazioni individuali tracciate, mediana, 25° e 75° percentile indicati. Valori R 2 per la camminata (verde, 2,9 Hz), il trotto (magenta, 3,2 Hz) e il galoppo (ciano,6,2 Hz) utilizzando variazioni di lunghezza sinusoidale con protocolli di stimolazione basati su EMG (traslucido) e ottimizzato (opaco). Sia per la stimolazione basata su EMG che per quella ottimizzata, i valori di R2 erano inferiori per le variazioni di lunghezza sinusoidale rispetto alle variazioni di lunghezza in vivo. Stimolazione basata su EMG: camminata R 2 = 0,00 - 0,30, trotto R2 = 0,00 - 0,02, galoppo R2= 0,03 - 0,07; stimolazione ottimizzata: camminata R 2 = 0,02 - 0,21, trotto R 2 = 0,02 - 0,12, galoppo R2 = 0,12 - 0,17. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

I cicli di lavoro prodotti dal muscolo EDL del topo ex vivo utilizzando traiettorie di lunghezza sinusoidale non emulano in modo altrettanto accurato la forza MG del ratto in vivo rispetto alle traiettorie di deformazione in vivo (Figura 8). Il cambiamento nel lavoro prodotto dalle traiettorie di deformazione sinusoidale rispetto a quelle in vivo può essere spiegato dall'assenza di transitori di deformazione e velocità nella traiettoria sinusoidale (Figura 9). Mentre i muscoli sono stati stimolati a lunghezze simili durante la fase di accorciamento attivo delle contrazioni sia nelle traiettorie sinusoidali che nelle traiettorie di deformazione in vivo, l'inizio della stimolazione si è verificato in diverse fasi del ciclo (ad esempio, l'inizio della stimolazione si è verificato in una fase del 74% per la stimolazione basata su EMG del trotto, ma in una fase del 43% per la stimolazione basata su EMG della camminata; vedere la sezione Discussione).

Figure 8
Figura 8: Confronto tra cicli di lavoro sinusoidali in vivo ed ex vivo. (A) Ciclo di lavoro in vivo (nero) da MG di ratto e anello di lavoro ex vivo (magenta tratteggiato) da EDL di topo utilizzando la traiettoria di deformazione sinusoidale e la stimolazione basata su EMG. (B) Anello di lavoro in vivo (nero) da MG di ratto e anello di lavoro ex vivo (magenta solido) da EDL di topo utilizzando la traiettoria della deformazione sinusoidale e la stimolazione ottimizzata. Si noti che i cicli di lavoro sinusoidali sovrastimano il lavoro in vivo a causa dell'assenza di transitori di deformazione e velocità nella traiettoria sinusoidale. Stimolazione basata su EMG R 2 = 0,0003, stimolazione ottimizzata R2 = 0,084. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 9
Figura 9: Confronto tra le traiettorie di deformazione in vivo e di lunghezza sinusoidale ex vivo . Confronto tra le traiettorie di deformazione in vivo e di lunghezza sinusoidale ex vivo al passo (verde), al trotto (magenta) e al galoppo (blu). La linea continua è la traiettoria del ceppo in vivo . Traiettoria tratteggiata, ex vivo della lunghezza sinusoidale. La parte evidenziata è la stimolazione. La stimolazione è iniziata alla stessa lunghezza durante la fase di accorciamento del passo. Frecce che indicano i transitori di deformazione e velocità. Le deviazioni dalla sinusoidale sono l'impedenza da forze esterne sul muscolo. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figura 1 supplementare: Programma utilizzato per raccogliere la forza massima isometrica alla lunghezza ottimale. Il programma utilizzato per determinare la lunghezza ottimale durante la contrazione sopramassimale e submassimale e la stimolazione tetanica. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 2 supplementare: Risposta vitale alle contrazioni. Risposta di contrazione dell'EDL del mouse. La forza di contrazione sale e scende rapidamente e dovrebbe raggiungere una tensione attiva di ~1 V. Il "rumore" dovrebbe essere minimo dopo che è stata raggiunta la tensione attiva di picco. Fare clic qui per scaricare il file.

Figura 3 supplementare: Programma utilizzato per raccogliere i dati del ciclo di lavoro. Il programma utilizzato per controllare la lunghezza muscolare e la tempistica della stimolazione in loop di lavoro ex vivo . Fare clic qui per scaricare il file.

File di codifica supplementare 1: codice MATLab utilizzato per segmentare e creare un protocollo sperimentale per il ciclo di lavoro. Codice MATLab utilizzato per segmentare le informazioni sul passo target (lunghezza, attivazione EMG e forza) in singole falcate. Il codice include il ridimensionamento e l'interpolazione dei passaggi dell'animale bersaglio in lunghezze che l'EDL del topo ex vivo può allungare. Inoltre, include il codice per uniformare il segnale EMG e confrontare l'attivazione per selezionare l'insorgenza e la durata della stimolazione negli esperimenti di loop di lavoro ex vivo . Fare clic qui per scaricare il file.

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Discussion

Mentre gli organismi si muovono senza soluzione di continuità attraverso i paesaggi, i carichi e le tensioni sottostanti che i muscoli subiscono variano drasticamente 1,6,23. Sia durante la locomozione in vivo 1,24 che negli esperimenti "avatar", i muscoli vengono stimolati in modo submassimale in condizioni cicliche e non stazionarie. Le relazioni isometriche forza-lunghezza e isotoniche forza-velocità non sono adatte per prevedere la forza muscolare in queste condizioni2. Comprendere gli effetti della deformazione non stazionaria (cioè dei transienti) e del carico è essenziale per prevedere la produzione di forza durante il movimento in vivo, e quindi è la logica principale per lo sviluppo diquesti esperimenti "avatar". Gli esperimenti "Avatar" ci permettono di controllare il carico muscolare e le traiettorie di deformazione mentre misuriamo la forza emessa. La tecnica "avatar" studia la risposta alla forza dei muscoli in condizioni simili a quelle in vivo, senza confondere i fattori di controllo neurale e di compliance tendinea. Per eseguire gli esperimenti di "avatar", i ricercatori avranno bisogno di un programma che consenta a un muscolo di passare attraverso cambiamenti di lunghezza prescritti con la capacità di stimolare a diverse lunghezze iniziali e per durate variabili (vedi Figura 3 supplementare per il programma utilizzato dagli autori). I ricercatori devono specificare la lunghezza del muscolo di partenza (mm), la lunghezza dell'escursione (mm), l'inizio della stimolazione (% della durata del ciclo) e la durata della stimolazione (ms) prima di eseguire esperimenti (vedere i passaggi 1.3-1.4 per ottenere i valori per questi parametri). In generale, è spesso auspicabile selezionare falcate che siano rappresentative di tutte le falcate della prova (ad esempio, iniziare e terminare a una lunghezza simile, raggiungere una forza di picco simile, avere un'attività EMG media, ecc.). Determinare se i dati EMG/attivazione e forza di una falcata selezionata sono rappresentativi di altre falcate nella stessa prova può essere utile per la "messa a punto" in seguito, che può essere fatta tracciando i cicli di lavoro (forza contro lunghezza) dell'intera prova utilizzando il muscolo dell'animale bersaglio. Durante la locomozione bipede e quadrupede, la lunghezza più corta alla lunghezza più corta generalmente delimita un'intera falcata (da punta a punta), ma l'attivazione dell'EMG può variare. In alcuni animali e muscoli, l'attivazione dell'EMG è strettamente correlata al contatto con il piede, come nel caso della MG di ratto mostrata qui22. In altri animali, come il gastrocnemio laterale della faraona, l'attivazione dell'EMG avviene generalmente alla lunghezza più lunga per ottenere una maggiore stabilità in un terreno sconosciuto25.

Per eseguire esperimenti "avatar", è importante ridurre al minimo il rumore nei dati di forza ex vivo . Le misurazioni della forza sono sensibili a diversi problemi, tra cui, a titolo esemplificativo ma non esaustivo, la lacerazione dei muscoli durante l'intervento chirurgico, la conformità delle suture se i nodi ad anello sono troppo lunghi, il ridimensionamento improprio degli input di lunghezza e dell'escursione e l'affaticamento muscolare. La lacerazione dei muscoli si verifica spesso quando si "seziona la tasca" (passaggio 2.2.3) e si lega il nodo ad anello attorno alla porzione prossimale del tendine (passaggio 2.2.4). Durante la "dissezione della tasca", mantenere le forbici da dissezione piatte e orizzontali rispetto al muscolo impedirà alle punte di intaccare l'EDL. Inoltre, allontanando le forbici di dissezione e distalmente durante la dissezione smussata si limiterà anche il contatto tra le forbici di dissezione e i muscoli EDL. Inoltre, i muscoli devono essere mantenuti umidi con la soluzione di Krebs-Henseliet durante la preparazione dell'intervento chirurgico e quando vengono utilizzati sul rig.

Scalare correttamente gli input di lunghezza è più complicato. La forza muscolare passiva e attiva può essere influenzata se la lunghezza di partenza e/o l'escursione non sono scalate correttamente. L'aumento ex vivo della tensione passiva dovrebbe corrispondere all'aumento in vivo della tensione passiva (vedi Figura 1). Un problema di scala che è stato osservato in esperimenti precedenti è che sia la tensione passiva che quella attiva possono essere influenzate se l'escursione di lunghezza (dalla lunghezza iniziale alla lunghezza massima) è troppo piccola o troppo grande. In teoria, i muscoli dovrebbero raggiungere la forza di picco vicino alla loro lunghezza ottimale (L 0)26, motivo per cui utilizziamo la lunghezza ottimale (L0) per scalare le lunghezze muscolari in vivo negli esperimenti "avatar" ex vivo per replicare accuratamente la produzione di forza in vivo. Le differenze architettoniche tra i muscoli giocheranno un ruolo nel determinare la lunghezza di partenza e i parametri di escursione della lunghezza. Sebbene la lunghezza ottimale (L0) si trovi durante condizioni isotoniche e isometriche stimolate sopramassimamente, il suo utilizzo come metrica di scala negli esperimenti "avatar" può potenzialmente evidenziare i limiti delle relazioni forza-lunghezza e forza-velocità durante il movimento ciclico che richiedono ulteriori indagini. Nella maggior parte delle condizioni di stato stazionario, la lunghezza, la velocità e l'attivazione istantanee del muscolo (cioè le proprietà forza-lunghezza e forza-velocità) possono essere utilizzate per prevedere la forza e la produzione di lavoro con ragionevole precisione 12,24,27. In condizioni dinamiche con carico variabile, la forza aumenta in funzione della velocità28 e ha una relazione complessa con la deformazione e l'attivazione 29,30. Ciò contraddice le proprietà isotoniche forza-velocità e isometria forza-lunghezza dei muscoli28. Nel ratto MG, i transitori di deformazione e velocità sono la prova del carico, come il contatto con i piedi o l'interazione con l'ambiente (ad esempio, terreno accidentato, vento, improvviso cambiamento di direzione per evitare la predazione) (Figura 9). Queste traiettorie di deformazione MG di ratto, come la maggior parte delle condizioni realistiche, hanno cambiamenti improvvisi nel carico applicato, nella produzione di forza e nella produzione di lavoro 2,28. Questo metodo sperimentale ha lo scopo di evidenziare queste complesse interazioni tra deformazione, velocità e dinamica di attivazione in condizioni in vivo che non sono ben spiegate dalle tradizionali relazioni forza-lunghezza e forza-velocità.

Altri problemi possono verificarsi quando la lunghezza iniziale del muscolo è troppo corta o troppo lunga. Una lunghezza iniziale troppo corta si tradurrà in una riduzione della velocità di aumento della tensione durante l'allungamento passivo e attivo (non mostrato), mentre una lunghezza iniziale troppo lunga si tradurrà in un aumento della velocità di aumento della tensione passiva (vedi Figura 1B). L'uso del rapporto tra tensione attiva e passiva può essere utile. Ad esempio, nel ratto MG, la tensione passiva (N) è generalmente circa la metà della tensione attiva (Figura 2). Se un muscolo inizia a una lunghezza troppo lunga e/o viene allungato a una lunghezza troppo lunga, la tensione passiva potrebbe essere troppo alta rispetto alla tensione attiva (vedere la Figura 1B) e la forza potrebbe diminuire rapidamente a causa dell'allungamento eccessivo. Inoltre, l'allungamento a una lunghezza troppo lunga potrebbe danneggiare il muscolo e può causare l'affaticamento del muscolo più rapidamente. Inoltre, la tensione attiva può apparire non fusa se la lunghezza iniziale è troppo corta e/o il muscolo non è allungato a una lunghezza sufficientemente lunga.

Sono necessari esperimenti preliminari per determinare la lunghezza di partenza e l'escursione in base a L0. Ulteriori esperimenti preliminari possono essere necessari per regolare la durata della stimolazione se le dinamiche di attivazione dei muscoli utilizzati sono diverse. Queste ottimizzazioni sono necessarie perché la composizione del tipo di fibra e/o le dinamiche di attivazione dei muscoli in vivo ed ex vivo possono essere diverse. Nei nostri risultati rappresentativi (Figura 4 e Figura 5), abbiamo utilizzato due protocolli di stimolazione per l'EDL di topo durante esperimenti ex vivo per replicare in vivo la produzione di forza MG di ratto. Per ottimizzare la produzione di forza nell'EDL di topo per adattarla al meglio alla MG di ratto in vivo, la durata della stimolazione è stata aumentata (Figura 2 e Figura 3). La MG del ratto è composta da tipi di fibre più lente rispetto all'EDL31,32,33 del topo. Ciò è stato evidente negli esperimenti "avatar" perché i muscoli EDL di topo ex vivo hanno prodotto forza più velocemente dopo l'eccitazione e la forza è diminuita a un ritmo più veloce dopo la disattivazione rispetto a quanto osservato in vivo nel ratto MG15 (Figura 2), anche dopo aver tenuto conto delle differenze di ritardo di eccitazione-contrazione tra le condizioni in vivo ed ex vivo 34. A seconda dei muscoli bersaglio ex vivo e in vivo, l'ottimizzazione della stimolazione potrebbe essere necessaria anche in altri esperimenti "avatar". In questa tecnica di loop di lavoro ex vivo possono essere utilizzati sia i muscoli EDL del topo che i muscoli soleo (SOL). EDL è stato scelto come "avatar" per il ratto MG a causa delle somiglianze nel tipo di fibra muscolare e nella struttura della pennazione. È possibile che alcuni muscoli abbiano una struttura complessa e non possano essere emulati utilizzando i muscoli dei roditori da laboratorio come "avatar".

Mentre gli esperimenti "avatar" necessitano di alcune ottimizzazioni manuali per replicare al meglio la produzione di forza in vivo, la tecnica è applicabile a una varietà di animali e modalità locomotorie diverse. La tecnica "avatar" può essere particolarmente utile per comprendere la produzione di forza in vivo in animali i cui muscoli sono troppo grandi o comunque inaccessibili per esperimenti ex vivo. Sebbene sia stato svolto solo un lavoro preliminare su animali più grandi, questo lavoro ha mostrato il potenziale per l'applicabilità di questa tecnicasu animali, muscoli e andatura locomotoria utilizzando topi di laboratorio come "avatar". L'utilità degli esperimenti "avatar" dipende dall'accuratezza con cui un modello di roditore da laboratorio comodo, economico, prontamente disponibile e ben caratterizzato (ad esempio, l'EDL del topo) può essere utilizzato per comprendere in vivo la meccanica di diversi muscoli di diverse specie di vertebrati. I risultati degli esperimenti preliminari di "avatar" presentati qui (ratto MG) e altrove (faraona LG19), suggeriscono che questa tecnica può essere utilizzata per prevedere con precisione le forze in vivo e potrebbe essere applicata ad altri animali. Le future applicazioni di questo metodo dovrebbero espandere i tipi di muscoli e animali che sono stati utilizzati sia come bersagli che come "avatar" durante esperimenti ex vivo e in vitro. Gli esperimenti "Avatar" ci permettono di esaminare i fattori che influenzano la forza muscolare e la produzione di lavoro durante la locomozione in vivo, quando il carico muscolare e lo sforzo variano bruscamente 1,2,19. In particolare, il metodo "avatar" ci permette di esaminare gli effetti dei transitori di deformazione e velocità sulla forza muscolare che non sono catturati dai modelli muscolari tradizionali o dagli esperimenti di work loop sinusoidale.

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Disclosures

Tutti gli autori riconoscono che non vi è alcun conflitto di interessi.

Acknowledgments

Ringraziamo il Dr. Nicolai Konow per aver fornito i dati utilizzati in questo studio. Finanziato da NSF IOS-2016049 e NSF DBI-2021832.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

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Avatar Esperimenti Ex Vivo Work Loop Ceppo In Vivo Comportamenti Di Movimento Di Attivazione Produzione Di Forza Muscolare Output Di Lavoro Sistemi Neurali E Meccanici Organizzazione Biologica Gerarchia Di Controllo Modelli Muscolari Forza Muscolare In Vivo Lavoro Muscolare In Vivo Meccanica Muscolare Condizioni Di Deformazione E Carico Locomozione In Vivo Transitori Di Deformazione E Velocità Attivazione Neurale Cinematica Muscoloscheletrica Carichi Ambientali Tecnica Avatar
"Avatar", un ciclo di lavoro <em>ex</em> vivo modificato sperimenta utilizzando la deformazione e l'attivazione <em>in vivo</em>
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Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

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