Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

"Avatar", In vivo Gerinim ve Aktivasyon Kullanılarak Değiştirilmiş Bir Ex vivo İş Döngüsü Deneyi

Published: August 18, 2023 doi: 10.3791/65610
Automatic Translation
1, 1
1Northern Arizona University

Summary

Bu makale, gerilme geçişlerinin ve aktivasyonun kas kuvveti tepkisine katkılarını değerlendirmek için bir laboratuvar kemirgeninden bir "avatar" kası kullanılarak ex vivo iş döngüsü deneyleri sırasında in vivo kas kuvveti üretimini taklit etme metodolojisini detaylandırmaktadır.

Abstract

Hareket davranışları, kas kuvveti üretimi ve iş çıktısından kaynaklanan dinamik sistemlerin ortaya çıkan özellikleridir. Nöral ve mekanik sistemler arasındaki etkileşim, koşarken bacak kası özelliklerinin ayarlanmasından yerle etkileşime giren uzuvların dinamiklerine kadar biyolojik organizasyonun tüm seviyelerinde aynı anda gerçekleşir. Hayvanların nöral kontrol stratejilerini kontrol hiyerarşisindeki içsel kas mekaniğine ('prefleksler') kaydırdığı koşulları anlamak, kas modellerinin in vivo kas kuvvetini tahmin etmesine ve daha doğru çalışmasına izin verecektir. İn vivo kas mekaniğini anlamak için, kas kuvvetinin ex vivo araştırılması ve in vivo lokomosyona benzer şekilde dinamik olarak değişen gerilme ve yükleme koşulları altında çalışması gerekir. İn vivo gerinim yörüngeleri tipik olarak nöral aktivasyon, kas-iskelet kinematiği ve çevre tarafından uygulanan yükler arasındaki etkileşimlerden kaynaklanan ani değişiklikler (yani gerinim ve hız geçişleri) sergiler. "Avatar" tekniğimizin temel amacı, içsel mekanik özelliklerin kas kuvveti üretimine katkısının en yüksek olabileceği durumlarda, gerilme hızı ve yüklemedeki ani değişiklikler sırasında kasların nasıl çalıştığını araştırmaktır. "Avatar" tekniğinde, geleneksel çalışma döngüsü yaklaşımı, ex vivo kasları çoklu esneme-kısalma döngüleri boyunca sürmek için dinamik hareketler sırasında hayvanlardan ölçülen in vivo gerinim yörüngeleri ve elektromiyografik (EMG) sinyaller kullanılarak değiştirilir. Bu yaklaşım, in vivo gerinim yörüngelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesi ve bir servo motora bağlı ex vivo fare kaslarına uygulanması dışında, çalışma döngüsü tekniğine benzer. Bu teknik, kişinin şunları yapmasına izin verir: (1) in vivo gerilme, aktivasyon, adım frekansı ve çalışma döngüsü modellerini taklit etmek; (2) bu kalıpları in vivo kuvvet tepkilerini en doğru şekilde eşleştirecek şekilde değiştirin; ve (3) mekanik hipotezleri test etmek için kontrollü kombinasyonlarda gerinim ve/veya aktivasyonun spesifik özelliklerini değiştirir.

Introduction

Hareket eden hayvanlar, karmaşık ortamlarda etkileyici atletik dayanıklılık, hız ve çeviklik özellikleri elde eder. Hayvan hareketi, insan tarafından tasarlanmış makinelerin aksine özellikle etkileyicidir - mevcut bacaklı robotların, protezlerin ve dış iskeletlerin stabilitesi ve çevikliği hayvanlara kıyasla zayıf kalır. Doğal arazide bacaklı hareket, beklenmedik bozulmalar olarak hareket eden hız ve manevra çevresel özelliklerini değiştirmek için hassas kontrol ve hızlı ayarlamalar gerektirir 1,2,3,4. Yine de, sabit olmayan hareketi anlamak doğası gereği zordur çünkü dinamikler fiziksel çevre, kas-iskelet mekaniği ve sensorimotor kontrol arasındaki karmaşık etkileşimlere bağlıdır 1,2. Bacaklı hareket, duyusal bilgilerin hızlı çok modlu işlenmesi ve uzuvların ve eklemlerin koordineli bir şekilde çalıştırılması ile beklenmedik bozulmalara yanıt vermeyi gerektirir 1,5. Sonuç olarak, hareket, kas-iskelet sisteminin içsel mekanik özelliklerinin yanı sıra sinirsel kontrol 1,5,6,7 yoluyla kuvvet üreten kaslar tarafından mümkün kılınır. Nöromekaniğin göze çarpan bir sorusu, bu faktörlerin beklenmedik bozulmalara yanıt olarak koordineli hareket üretmek için nasıl etkileşime girdiğidir. Aşağıdaki teknik, bir "avatar" kası ile kontrol edilebilir ex vivo deneyler sırasında in vivo gerinim yörüngelerini kullanarak kasın deformasyona içsel mekanik tepkisini kullanır.

Kas çalışma döngüsü tekniği, döngüsel hareketler sırasında içsel kas mekaniğini anlamak için önemli bir çerçeve sağlamıştır 8,9,10. Geleneksel çalışma döngüsü tekniği, in vivo deneyler 2,8,9,11 sırasında ölçülen frekansları ve aktivasyon modellerini kullanarak kasları önceden tanımlanmış, tipik olarak sinüzoidal, gerinim yörüngeleri boyunca hareket ettirir. Sinüzoidal uzunluk yörüngelerinin kullanılması, hayvanların çevre ve kas-iskelet sistemi kinematiği ile etkileşim nedeniyle gerinim yörüngelerinde hızlı değişikliklere uğramadığı koşullar altında, uçuş12 ve yüzme2 sırasında iş ve güç çıkışını gerçekçi bir şekilde tahmin edebilir. Bununla birlikte, bacaklı hareket sırasında in vivo kas gerilme yörüngeleri, nöral aktivasyon, kas-iskelet kinematiği ve çevre tarafından uygulanan yükler arasındaki etkileşimlerden dinamik olarak kaynaklanır 5,7,13,14. İn vivo kas-tendon dinamiklerine karşılık gelen yükleri, gerinim yörüngelerini ve kuvvet üretimini taklit etmek için daha gerçekçi bir çalışma döngüsü tekniğine ihtiyaç vardır ve içsel kas mekaniği ile nöral kontrolün pertürbasyonlar karşısında koordineli hareket üretmek için nasıl etkileşime girdiğine dair fikir verir.

Burada, zamanla değişen in vivo yükleri temsil eden in vivo gerinim yörüngeleri ile kontrollü ex vivo deneyler sırasında bir laboratuvar kemirgeninden bir "avatar" kası kullanarak koşu bandı hareketi sırasında in vivo kas kuvvetlerini taklit etmenin yeni bir yolunu sunuyoruz. Kontrollü ex vivo deneyler sırasında bir laboratuvar hayvanından alınan kaslar üzerindeki bir hedef kastan ölçülen in vivo gerinim yörüngelerinin kullanılması, hareket sırasında yaşanan yükleri taklit edecektir. Burada açıklanan deneylerde, ex vivo fare ekstansör digitorum longus (EDL) kası, bir koşu bandında yürüme, paça ve dörtnala koşma sırasında in vivo sıçan medial gastroknemius (MG) kası için bir "avatar" olarak kullanılır13. Bu yaklaşım, in vivo gerinim yörüngelerinin uygun şekilde ölçeklendirilmesi ve bir servo motora bağlı ex vivo fare kaslarına uygulanması dışında, çalışma döngüsü tekniğine benzer. Fare EDL kasları, sıçan MG'ye kıyasla boyut, lif tipi ve mimari bakımından farklılık gösterse de, bu farklılıkları kontrol etmek mümkündür. "Avatar" tekniği kişinin şunları yapmasına izin verir: (1) in vivo gerilme, aktivasyon, adım frekansı ve çalışma döngüsü modellerini taklit etmek; (2) bu kalıpları in vivo kuvvet tepkilerini en doğru şekilde eşleştirecek şekilde değiştirin; ve (3) mekanik hipotezleri test etmek için kontrollü kombinasyonlarda gerinim ve/veya aktivasyonun spesifik özelliklerini değiştirir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm hayvan çalışmaları, Kuzey Arizona Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu çalışma için 60-280 günlük erkek ve dişi vahşi tip farelerden (suş B6C3Fe a/a-Ttnmdm/J) alınan ekstansör digitorum longus (EDL) kasları kullanıldı. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edildi (Malzeme Tablosuna bakınız) ve Kuzey Arizona Üniversitesi'nde bir kolonide kuruldu.

1. İn vivo gerinim yörüngesinin seçilmesi ve ex vivo iş döngüsü deneyleri sırasında kullanıma hazırlanması

NOT: Bu protokolde, doğrudan yazarlara (Nicolai Konow, UMass Lowell, kişisel iletişim) sağlanan in vivo dinamik hareketten elde edilen önceki ölçümler, ex vivo deneylerde kullanılmıştır. Orijinal veriler Wakeling ve ark.15 için toplanmıştır. Protokolü çoğaltmak için zaman, uzunluk veya gerinim, EMG/aktivasyon ve kuvvet verileri gereklidir.

  1. Herhangi bir programlama platformunu kullanarak tüm in vivo denemeyi bireysel adımlara ayırın (Ek Kodlama Dosyası 1'de sağlanan MATLab kodu).
    1. Uzunluk değişikliklerini çizin vs. Tüm in vivo denemenin zamanı. Bu, bireysel adımları (duruştan duruşa) görselleştirmek ve adımlar arasındaki değişkenliği değerlendirmek için kullanılır (Şekil 1).
    2. Tüm deneme için gerinim hesaplayın (Uzunluk (L) /Optimum Uzunlukta Maksimum İzometrik Kuvvet L0).
    3. Tüm denemeden, tüm adımları temsil eden ve benzer uzunluklarda başlayıp biten bir adım seçin. Bu, her adımı karşılaştırmak için uzunlukları üst üste grafiklendirerek görsel olarak yapılabilir.
    4. Temsili bir adım seçildikten sonra, herhangi bir programlama platformunu kullanarak tüm denemeden gerginlik, EMG/aktivasyon ve kuvvet verilerini bölümlere ayırın (MATLab16'da kullanılan kodlar için Ek Kodlama Dosyası 1'e bakın).
    5. Örnekleme frekansı gerinim, EMG / aktivasyon veya kuvvet için farklılık gösteriyorsa, veri noktalarını enterpolasyon yapın, böylece hepsi aynı frekansta örneklenir.
      NOT: Araştırmacılar, tüm denemede örneklenen her nokta arasındaki zaman aralıklarına dayalı olarak yakalama sıklığını belirleyebilirler. Değişkenler aynı frekansta yakalanırsa, örnekleme süreleri aynı olacaktır.
  2. Segmentli adımların sıklığını hesaplayın.
    1. Segmentli bir adımın süresini saniye cinsinden belirleyerek ve 1'i (saniye) süreye bölerek (1/süre = saniyede # adım) sıklığı hesaplayın.
    2. Frekansı eşleştirmek için ex vivo deneylerde kaç veri noktasının alınması gerektiğini manuel olarak belirleyin.
    3. İki adım için gereken süreyi hesaplayın. Daha sonraki istatistiksel analiz için gerekli olacak kas ölçüm hatasını tahmin etmek için adımları en az bir kez tekrarlayın.
  3. Ex vivo çalışma döngüleri için stimülasyonun başlangıcını ve süresini belirlemek için ölçülen EMG aktivitesini kullanarak stimülasyon girdisine göre stimülasyon fazını belirleyin. Herhangi bir programlama platformu kullanılabilir (bu çalışmada kullanılan kod için Ek Kodlama Dosyası 1'e bakın).
    1. Gerinim değişimi ile aynı x ekseni aralığında (zaman) EMG sinyalini görüntüleyin (Şekil 1). EMG sinyalini görünür olacak şekilde büyütün; bu, EMG sinyalinin rastgele bir sayı ile çarpılması, suş ve EMG'nin aynı ölçekte olması için yeniden ölçeklendirilmesi ve/veya EMG sinyalinin suşa eklenmesi ile yapılabilir.
      NOT: Yazarlar, MATLab'daki "yeniden ölçeklendirme" işlevini kullanarak suş ve EMG'yi aynı ölçekte olacak şekilde yeniden ölçeklendirdiler (bkz. Ek Şekil 1).
    2. EMG aktivitesinin nerede başladığını ve nerede durduğunu, iki standart sapmanın yoğunluğundaki bir değişikliklegösterildiği gibi bulun 17,18.
      NOT: Hayvana ve kasa bağlı olarak, EMG başlangıcı ayak temasıyla uyuşabilir veya olmayabilir (Monica Daley, UC Irvine, kişisel iletişim) (Tartışma bölümüne bakınız).
    3. EMG aktivasyon başlangıcının gerçekleştiği gerinim döngüsünün yüzdesini (örneğin, %40) ve stimülasyonun ne kadar süreyle gerçekleşeceğini (örneğin, 222 ms) hesaplayın.
      NOT: Araştırmacıların, in vivo hareket ve ex vivo çalışma döngüleri arasında farklılık gösteren ve her hayvan ve kas için farklı olabilen bir uyarma-kasılma eşleşmesi (ECC) gecikmesini hesaba katmaları gerekecektir (örneğin, in vivo ECC, sıçan MG için 24.5 ms'dir, ex vivo ECC, fare EDL için ~5 ms'dir).
  4. İş döngüsü kontrolör programı için temsili gerinim girişleri hazırlayın. Gerinim ve stimülasyon için girdi ile kuvvet çıkışını yakalayabilen herhangi bir program, iş döngüsü denetleyici programı için kullanılabilir (Tartışma bölümüne bakın).
    1. Seçilen adımı atın ve adımın iki döngü boyunca in vivo frekansta yakalanması için gerekli olan uygun sayıda noktaya enterpolasyon yapın (bkz. adım 1.2).
    2. Önceden belirlenmiş bir uzunluk sapması ile esnedikten sonra "sıfır gerinim"de (örneğin, L 0 veya %95 L0) başlamak ve durmak için adımı yeniden ölçeklendirin (bkz. adım 3.3).
    3. Gerekirse, fare EDL'sindeki gerinim değişiklikleri için bir girdi olarak kullanmak üzere seçilen adımı "ölçeklendirin" (Tartışma bölümüne bakın). Ölçeklendirmek için, fare EDL'sinin hasar görmeden uzatılabileceği bir uzunluk aralığı seçin (örneğin, in vivo türlerden bağımsız olarak fare EDL'sini tipik olarak %10 L0 uzatırız). Bunun ön sonuçlara göre değişmesi gerekebilir (bkz. adım 3.3).

Figure 1
Şekil 1: İn vivo tüm çalışmanın zaman içindeki uzunluğu. Uzunluk (mm) sıçan MG'nin zamanına göre çizilir. Adımlar, tek adım olarak kabul edilen en kısa uzunluktan en kısa uzunluğa kadar dairelerle sınırlandırılır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

2. Fare kasının maksimum izometrik kuvvetinin ex vivo olarak değerlendirilmesi

  1. Ekipman ve ameliyat kurun.
    NOT: Ex vivo çalışma döngüsü için gerekli ekipmanın açıklaması için Tartışma bölümüne bakın.
    1. Oksitüp iğne valfini su ceketi doku banyosuna sokarak bir doku-organ banyosu hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu). Oksitüpü %95 0%2-5 CO2 içeren bir gaz tüpüne bağlayın. Su ceketi doku banyosunu doldurmak için 20 psi izin verin.
    2. Gaz hattından ameliyat alanının yakınındaki Krebs-Henseleit solüsyonu ile doldurulmuş kristalleştirici bir kaba (adım 2.1.3) ek bir oksitüp geçirerek ameliyat alanını hazırlayın. Bu, ameliyatlar sırasında ve sonrasında kasları havalandırmak ve nemli tutmak için kullanılacaktır.
      NOT: Bir seferde fareden birden fazla kas çıkarılırsa, kaslar bu havalandırılmış solüsyonda 4 saate kadar saklanabilir.
    3. Aşağıdakileri içeren 1 L Krebs-Henseleit çözeltisi hazırlayın (mmol l-1 cinsinden): NaCl (118); KCl (4.75); MgS04 (1.18); KH2PO4 (1.18); CaCl 2 (2.54); ve oda sıcaklığında glikoz (10.0) ve HCl ve NaOH kullanılarak pH'dan 7.4'e kadar (bkz. HCl ve NaOH ile çalışırken, uygun KKD gözlük ve eldiven kullanın.
    4. Banyoyu oda sıcaklığında ve pH 7.4'te Krebs-Henseleit çözeltisi ile doldurun. Kası ve kancayı tamamen çözeltiye batırın.
    5. Tüm ekipmanı açın; çift modlu kas kolu sistemi, stimülatör ve sinyal arayüzü (DAQ kartı) (bkz.
  2. EDL kas diseksiyonu.
    1. Fareyi derin bir şekilde uyuşturun ve ardından servikal çıkık ile ötenazi yapın. Fareyi, üst arka bacak gergin ve ayak parmakları diseksiyon tahtasına değecek şekilde sağ veya sol yanal yaslanmış pozisyonda yatırın. Kürkü ayak bileğinden diz ekleminin üstüne çıkarın.
    2. Cildi forseps ile örtün ve ayak bileği ekleminden kalça bölgesine kadar kesin. Kas açığa çıktıktan sonra, ayak bileğinin etrafını bir pantolon "etek" gibi kesin. Bacak kaslarını daha net ortaya çıkarmak için cildi yukarı çekin.
    3. Tibialis anterior (TA) ve gastroknemius'u ayıran fasya çizgisini bulun, diz tendonlarını ortaya çıkarmak için diseksiyon makası kullanarak ayırın. Açıkta kalan iki diz tendonu arasına diseksiyon makası yerleştirin. Makas, açıkta kalan diz tendonlarının hemen altındaki bir cebe "takılacaktır". Kör, EDL'yi ortaya çıkarmak için makas ayak bileğine ulaşana kadar makası bacaktan çekerken bir "cebi" inceleyin.
    4. 4-0 numara ipek cerrahi sütürde önceden bağlanmış bir ilmek düğümü kullanarak (bkz. Malzeme Tablosu), dikişin bir ucunu dize en yakın tendonun altına bağlayın. Proksimal kas-tendon bileşkesinin üzerine, kas üzerine yerleştirmeden veya tendonu dahil etmeden çift kare bir düğüm atın. Düğümün üstünü kesin. Tendona bağlı halkayı yavaşça çekin ve EDL "cepten" çıkacaktır.
    5. EDL'de gerginlik oluşturmak için halkayı diseksiyon alanına bantlayın. Distal kas-tendon kavşağında önceden bağlanmış başka bir ilmek düğümü kullanarak, kasın üzerine yerleştirmeden veya tendonu dahil etmeden çift kare bir düğüm bağlayın. Tüm EDL'yi fareden çıkarmak için bacağına yakın taraftaki düğümü kesin. Ekstra dikişi kasın proksimal ve distal taraflarındaki çift kare düğümlerden kesin ve kası ameliyat alanının yanındaki havalandırmalı banyoya yerleştirin.
      NOT: Kası havalandırmalı bir banyoya yerleştirirken hangi tarafın proksimal ve/veya distal olduğuna dikkat edin.
    6. Servo motor kolu donanımına yerleştirmek için, EDL'yi asılı platin elektrotlar arasına dikey olarak takın. Distal halka düğümünü sabit kancaya takın ve proksimal halka düğümünü servo motor koluna bağlı kancaya takın. Kası havalandırılmış Krebs-Henseleit çözeltisine batırmak için doku banyosunu kaldırın.
      NOT: Havalandırma, suya batırıldığında kası rahatsız etmemelidir. Varsa, gazın basıncını düşürün. Stimülasyona başlamadan önce kasın 10 dakika dengelenmesine izin verin.
  3. EDL kasının maksimum izometrik kuvvetini ölçün.
    NOT: Seğirme ve tetanoz kullanarak maksimum izometrik kuvvetin nasıl ölçüleceğine ilişkin protokol için Tablo 1'e bakın. Yazarlar tarafından kullanılan programın bir gösterimi için Ek Şekil 1'e bakınız.
    1. Ameliyat sırasında kasın hasar görmediğinden emin olmak için kası supramaksimal seğirme ile uyarın (80 V, 1 pps, 1ms; Tablo 1; Ek Şekil 2'ye bakınız). Herhangi bir hasar meydana gelmediyse, aktif gerilimin ~1V / 0.1271N'den az pasif gerilimle ~0.1V / 0.01271N olduğu seğirme stimülasyonunu kullanarak bir kas uzunluğu bulmak için kas kolu sistemindeki uzunluk düğmesini kullanın.
    2. Sütür düğümünden dikiş düğümüne kadar kasın başlangıç uzunluğunu Volt ve milimetre cinsinden kaydedin. Başlangıç uzunluğu için programın kalibrasyon kısmına ölçümleri girin (bkz. Ek Şekil 1).
    3. EDL'nin optimum uzunluğunda (L0) supramaksimal seğirme maksimum izometrik kuvvetini bulun (Tablo 1). Teknik olarak dinlenme süresine gerek yoktur, ancak stimülasyonlar arasında 1 dakika beklemek pasif gerginliği stabilize edecektir. Supramaksimal seğirmenin maksimum olduğu uzunluğu (Volt cinsinden) kaydedin. Bu, seğirme için optimum kas uzunluğudur (L0).
    4. Kası bu uzunlukta kaliperlerle ölçün. Sütür düğümünden dikiş düğümüne kadar kası ölçün. L 0 bulunduğunda, kası başlangıç uzunluğuna kadar kısaltın (aktif gerginlik ~ 1V / 0.1271 N).
    5. EDL'nin supramaksimal tetanoz maksimum izometrik kuvvetini bulun (80 V, 180 pps, 500 ms; Tablo 1). Supramaksimal tetanik kuvvetin uzunluğunu (Volt ve milimetre cinsinden) L0'da kaydedin ve sütür düğümünden sütür düğümüne kadar lifleri kaliperlerle tekrar ölçün.
      NOT: Kas uzunluğunu 0,5 V/0,65 mm'lik adımlarla artırmak, hem seğirme hem de tetanoz için daha doğru L0 ile sonuçlanacaktır.
    6. EDL'nin submaksimal izometrik kuvvetini bulun (45 V, 110 pps, 500ms; Tablo 1) Stimülasyon protokolünden yorgunluğun oluşmadığından emin olmak için deneyden önce ve sonra L0'da . Kuvvette% 10'luk bir azalma "yorgun" bir kas olarak kabul edilir.
Deney Simülasyon Yoğunluğu (V) Nabız Frekansı (pps / Hz) Stimülasyon Süresi (ms) Yorum
1. "Isınma" 80 1 1 1 V'luk pasif gerilimi bulmak için uzunluğu 0,50 V artırın veya azaltın
2. Optimal kas uzunluğu seğirmesi (L0) 80 1 1 ~0.50 V'luk pasif gerilimi bulmak için uzunluğu 1 V artırın veya azaltın
3. Optimal kas uzunluğu tetanoz (L0) 80 180 500 Uzunluğu 0,50 V değiştirmek arasında 3 dakika dinlenin
4. Deney öncesi submaksimal L0 45 110 500 L0 uzunluğunda
6. Avatar deneyleri 45 110 Fare EDL'si için döngüsel olarak temsili uzunluk değişikliklerini kullanın
7. Deney sonrası submaksimal L0 45 110 500 Deneyden sonra L0'a dönün ve L0'ı ölçün

Tablo 1: Stimülasyon protokolü. Supramaksimal ve submaksimal seğirme ve tetanoz optimal uzunluğunu bulmak için stimülasyon protokolü. Protokol, stimülasyon yoğunluğuna, zamanlamasına ve saniyedeki darbelere göre değişir.

3. Seçilen in vivo gerinim yörüngelerini kullanarak "avatar" iş döngüsü tekniğinin tamamlanması

  1. "Avatar" çalışma döngüsü tekniklerini tamamlamak için gerekli yazılımı kurun (bkz.
    NOT: Her adımın gerekli olduğu her zaman kas uzunluğunu belirten bir girdi dosyası (.csv veya benzeri) (bkz. adım 1.4). Stimülasyonun başladığı döngünün yüzdesi ve stimülasyon süresi için girdiler gereklidir (örneğin Ek Şekil 3'e bakınız).
  2. Komple "avatar" çalışma döngüsü tekniği.
    NOT: Özel bir LabView programı kullanırken, araştırmacılar bir servo motor kolunda fare EDL'sindeki uzunluk değişikliklerinin kontrolüne, belirli zamanlarda stimülasyonun başlangıcının (% döngüsü) ve süresinin (ms) kontrolüne ve kas kuvvetinin ölçülmesine izin veren herhangi bir programı kullanabilirler. Program yazarlarının kullandığı bir örnek için Ek Şekil 3'e bakın.
    1. Ölçeklendirilmiş uzunluk gezisi ile ölçeklendirilmiş gerinim değişikliklerini adım 1.4'ten programa yükleyin. "Ölçeklendirilmiş gerinim değişiklikleri" hakkında daha fazla bilgi için 1.4, 3.3 adımlarına ve Tartışma bölümüne bakın.
    2. Gerekirse kasın başlangıç uzunluğunu ayarlayın (bkz. bölüm 3.3). Sonuçları kalibre etmek için başlangıç uzunluğunu V ve mm cinsinden girin (bkz. Ek Şekil 3).
    3. Adım 1.3'te hesaplanan stimülasyon başlangıcını ve süresini kullanın.
    4. İki döngü için belirlenen uzunluk gezisi ile kası ölçekli uzunluk değişikliklerinden geçirin.
    5. Verileri kaydedin. Aynı kas üzerinde birkaç stimülasyon protokolü toplanırsa, her stimülasyon arasında 3 dakika bekleyin.
    6. Yorgunluğun oluşup oluşmadığını belirlemek için submaksimal aktivasyonu kullanarak optimum uzunlukta (L0) uyarın. Kuvvet %10'dan fazla azalırsa, kasların yorgun olduğu kabul edilir. Stimülasyon protokolleri için Tablo 1'e bakınız.
    7. Kası banyodan çıkarın. Kastan düğümleri kesin ve fazla çözeltiyi kastan silin. Kası tartın. Standart formülü kullanarak fizyolojik kesit alanını belirleyin: kas kütlesi / (L0 * 1.06) 19.
  3. "Avatar" çalışma döngüsü tekniği için parametreleri ayarlayın (Tartışma bölümüne bakın).
    1. Ex vivo pasif gerilim artışını in vivo olarak gözlemlenen pasif gerilim artışıyla eşleştirerek başlangıç uzunluğunu ve uzunluk gezisini belirleyin (Şekil 2).
      NOT: Bu çalışmada başlangıç uzunluğunu (mm) ve sapmayı (% L 0; adım 1.4 ve Tartışma bölümüne bakın) ölçeklendirmek için yüzde L0 kullanılmıştır. Yazarlar, ex vivo fare EDL'deki gerilim artışını in vivo sıçan MG'ninkiyle eşleştirmek için, L0'daki başlangıç uzunluğunun en iyi uyumu sağladığını bulmuşlardır (Şekil 2).
    2. Üç başlangıç uzunluğu seçin (örneğin, -%5 L 0, L 0 ve +%5 L0). Bu başlangıç uzunluklarının her birinde belirli bir uzunluk sapması ile (örneğin, %10 L0) "avatar" çalışma döngüsünü gerçekleştirin.
      NOT: Fare EDL'si kullanılarak yapılan mevcut "avatar" deneylerinde, %10 L0'lık bir uzunluk gezisi kullanılmıştır.
    3. Ex vivo pasif gerilim artış hızı, in vivo pasif gerilim artış hızına benzer olana kadar yeni başlangıç uzunlukları ve/veya sapma ile tekrarlayın (bkz. Şekil 2B).
    4. Kullanılan kasların lif tiplerine ve aktivasyon dinamiklerine bağlı olarak, ex vivo ve in vivo kuvvet arasındaki eşleşmeyi optimize etmek için stimülasyon süresini artırın veya azaltın. Bu nedenle, "avatar" deneyleri sırasında in vivo kuvvet üretimine en iyi şekilde uyması için stimülasyonun başlangıcını ve/veya süresini değiştirmek gerekebilir.
    5. Bunun gerekli olup olmadığına karar vermek için (Tartışma bölümüne bakın), "avatar" ve in vivo kasın zaman içindeki kuvvetini çizin (Şekil 3) ve hedef ve "avatar" kas kuvveti arasındaki ölçeklendirilmiş korelasyonun karesini alarak R2 belirleme katsayısını hesaplayın (bkz.

Figure 2
Şekil 2: Eşleşen pasif gerilim artışı. Pasif gerilimde in vivo ve ex vivo artışı gösteren çalışma döngüleri (oklar). 2.9 Hz'de yürüyen sıçan MG'den (siyah) in vivo ölçekli çalışma döngüsü (Wakeling ve ark.15'ten alınan veriler). 2,9 Hz'de fare EDL'sinden (yeşil) ex vivo ölçekli çalışma döngüleri. (A) Fare EDL kasının başlangıç uzunluğu +%5 L0'dır. (B) Fare EDL kasının başlangıç uzunluğu L0'dır. Ex vivo pasif gerilim artışının A'daki in vivo gerilim artışıyla eşleştiğini, ancak B'de eşleşmediğini unutmayın. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Fare EDL'nin stimülasyon süresinin, sıçan MG'nin (siyah çizgi) in vivo kuvvetine uyacak şekilde optimize edilmesi. EMG tabanlı stimülasyon (yeşil kesikli çizgi) kullanılarak fare EDL'si tarafından üretilen kuvvet, muhtemelen fare EDL'sinin sıçan MG'ye kıyasla daha hızlı devre dışı bırakılması nedeniyle, in vivo kuvvetten daha erken azalır. İn vivo ve ex vivo kuvvetler arasındaki uyumu optimize etmek için, fare EDL'si daha uzun bir süre boyunca uyarıldı (düz yeşil çizgi). EMG tabanlı stimülasyon R 2 = 0.55, Optimize stimülasyon R2 = 0.91. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

"Avatar" deneylerinin amacı, ex vivo iş döngüsü deneyleri sırasında in vivo kuvvet üretimini ve iş çıktısını mümkün olduğunca yakın bir şekilde çoğaltmaktır. Bu çalışma, fare EDL'sini sıçan MG için bir "avatar" olarak kullanmayı seçti, çünkü fare EDL ve sıçan MG'nin her ikisi de çoğunlukla hızlı kasılan kaslardan oluşuyor20,21. Her iki kas da ayak bileği ekleminin birincil taşıyıcılarıdır (EDL ayak bileği dorsifleksörü, MG ayak bileği plantarfleksörü) ve benzer pennasyon açılarına sahiptir (fare EDL 12.4 + 2.12 ° 22, sıçan MG 20 ° bu çalışmada kullanılmıştır15). Sıçan MG15'in ölçekli temsili çalışma döngüleri, iki farklı stimülasyon protokolü (biri ölçülen EMG aktivitesinden ve diğeri adım 3.3'teki gibi optimize edilmiş) kullanılarak ex vivo "avatar" deneyleriyle (Şekil 4) karşılaştırıldı. Burada sunulan R2 değerleri, her bir çevrimin lokomotor hıza karşılık gelen 2000'den fazla noktaya sahip olduğu (yürüyüş = 5521 puan, tırıs = 5002, dörtnala = 2502 puan) ölçeklendirilmiş esneme-kısalma döngüsünün tamamı (2 döngü/koşul) kullanılarak hesaplanmıştır. Çalışma döngüleri, kas boyutu, P0 ve PCSA'daki farklılıkları hesaba katacak şekilde ölçeklendirildi. Ölçekleme, sıçan MG ve fare EDL'sini karşılaştırmak için benzer bir ölçekte (0-1) doğrusal olarak haritalama kuvveti ve gerinim ile yapıldı. Görsel olarak, fare EDL ve sıçan MG kaslarının farklı aktivasyon dinamiklerini hesaba katmak için stimülasyon protokolünün (Şekil 4B) optimize edilmesinin, EMG tabanlı aktivasyona kıyasla in vivo sıçan MG kuvvetine uyumu iyileştirdiği açıktır (Tartışma bölümüne bakınız). Fare EDL için, daha yavaş gerinim yörüngeleri (yürüme ve tırıs) için stimülasyon süresinin yaklaşık iki katına çıkarılması, R2'yi yürümede%62 ve tırısta% 109 artırdı. Daha hızlı gerinim yörüngesi (dörtnala) için, stimülasyon süresinin gözlemlenen sürenin yarısı kadar arttırılması, R2'yi%22 artırdı.

Figure 4
Şekil 4: İn vivo ve ex vivo çalışma döngülerinin karşılaştırılması. Yürüme sırasında (2,9 Hz) in vivo sıçan MG (siyah) ve ex vivo fare EDL'nin (yeşil) in vivo gerinim yörüngeleri kullanılarak çalışma döngüleri. Daha kalın çizgi, hem in vivo hem de ex vivo çalışma döngülerinde stimülasyonu gösterir. (A) EMG tabanlı stimülasyon protokolünü kullanarak yürüme sırasında in vivo sıçan MG (siyah) ve ex vivo fare EDL'nin (kesikli yeşil) çalışma döngüsü. (B) Optimize edilmiş stimülasyon kullanarak yürüme sırasında (2.9Hz) in vivo sıçan MG (siyah) ve ex vivo fare EDL'nin (sabit yeşil) çalışma döngüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Fare EDL ex vivo kuvvet üretimi ile sıçan medial gastroknemisinin (MG)15 in vivo kuvvet üretimi arasındaki yüksekR2, iyi replikasyonu gösterir (Şekil 5). EMG tabanlı stimülasyon deneylerinde ortalama R2 değerleri yürüyüş, tırıs ve dörtnala için sırasıyla 0.535, 0.428 ve 0.77 idi. Optimize edilmiş stimülasyon deneylerinde, ortalama R2 değerleri yürüyüş, tırıs ve dörtnala sırasıyla 0.872, 0.895 ve 0.936 idi. Daha önce tartışıldığı gibi (adım 3.3, Şekil 5), kullanılan kasların aktivasyon dinamiklerine bağlı olarak, stimülasyon protokolünün de optimize edilmesi gerekebilir. Ex vivo fare EDL kullanılarak in vivo MG kuvvetinin tahmini, stimülasyonu optimize ederek,R2'yi artırarak (Şekil 5A,B) ve kök ortalama kare hatasını (RMSE) azaltarak tüm lokomotor hızlarda iyileştirildi. RMSE, tüm hızlar için optimizasyondan sonra azaldı (Şekil 6). EMG tabanlı stimülasyon için ortalama RMSE, yürüyüş, tırıs ve dörtnala için 0.31, 0.43 ve 0.158 idi. Optimize edilmiş stimülasyon için ortalama RMSE, yürüyüş, tırıs ve dörtnala için 0.181, 0.116, 0.101 idi.

Figure 5
Şekil 5: İn vivo ve ex vivo kuvvet üretimi için R 2 değerleri: İn vivo ve ex vivo kuvvet karşılaştırmaları için R2 değerlerinin kutu ve bıyık grafiği. Bireysel gözlemler çizildi, medyan, 25. ve 75. yüzdelik dilim belirtildi. (A) 2.9 Hz'de (yeşil) yürüme, 3.2 Hz'de (macenta) paça ve 6.2 Hz'de (camgöbeği) dörtnala koşma sırasında ölçülen in vivo EMG sinyaline dayanan stimülasyon protokolü kullanılarak in vivo ve ex vivo kuvvet üretimi için R2 değerleri. (B) Optimize edilmiş stimülasyon kullanılarak in vivo ve ex vivo kuvvet üretimi içinR2 değerleri (bkz. Şekil 2). Stimülasyon başlangıcını ve süresini optimize etmek, tüm yürüyüşler içinR2'yi arttırdı. EMG tabanlı stimülasyon: yürüyüş R 2 = 0.50-0.55, tırıs R 2 = 0.37-0.47, dörtnala R2 = 0.62-0.90; optimize edilmiş stimülasyon: yürüyüş R2 = 0.74-0.93, tırıs R 2 = 0.85-0.92, dörtnala R2 = 0.87-0.97. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: İn vivo ve ex vivo kuvvet üretimi için kök-ortalama kare hatası (RMSE). İn vivo ve ex vivo kuvvet karşılaştırmaları için RMSE değerlerinin kutu ve yatay çizgi grafiği. Bireysel gözlemler çizildi, medyan, 25. ve 75. yüzdelik dilim belirtildi. (A) EMG tabanlı stimülasyon protokolü kullanılarak in vivo ve ex vivo kuvvet üretimi için RMSE değerleri. (B) Optimize edilmiş stimülasyon protokolünü kullanarak in vivo ve ex vivo için RMSE değerleri. Stimülasyon başlangıcını ve süresini optimize etmek, tüm yürüyüşler için RMSE'yi azalttı. 2,9 Hz'de (yeşil) yürüme, 3,2 Hz'de (macenta) tırıs ve 6,4 Hz'de dörtnala (camgöbeği). Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

İn vivo kas kuvvetlerini tahmin etmede geleneksel çalışma döngüsü yöntemlerinin performansını test etmek için, fare EDL'si için in vivo sıçan MG suş yörüngelerini kullanan "avatar" deneylerinde olduğu gibi aynı frekansta, uzunluk gezisinde, başlangıç uzunluğunda, stimülasyon başlangıcında ve süresinde sinüzoidal çalışma döngüleri de gerçekleştirildi. R2 değerleri, hem EMG tabanlı hem de optimize edilmiş stimülasyon protokolleri için in vivo gerinim yörüngelerinden anlamlı olarak daha düşüktü (Şekil 7). Sinüzoidal uzunluk yörüngeleri kullanılarak EMG tabanlı stimülasyon için ortalama R2 değerleri yürüyüş, tırıs ve dörtnala frekanslarında 0.062, 0.067 ve 0.141 idi. Sinüzoidal uzunluk yörüngeleri kullanılarak optimize edilmiş stimülasyon için ortalamaR2 değerleri, yürüyüş, tırıs ve dörtnala frekanslarında 0.09, 0.067 ve 0.141 idi.

Figure 7
Şekil 7: R2 Sinüzoidal uzunluk değişiklikleri kullanılarak in vivo ve ex vivo kuvvet üretimi için değerler. İn vivo ve ex vivo kuvvet karşılaştırmaları için RMSE değerlerinin kutu ve yatay çizgi grafiği. Bireysel gözlemler çizildi, medyan, 25. ve 75. yüzdelik dilim belirtildi. EMG tabanlı (yarı saydam) ve optimize edilmiş (opak) stimülasyon protokolleri ile sinüzoidal uzunluk değişiklikleri kullanılarak yürüyüş (yeşil, 2.9 Hz), tırıs (macenta, 3.2 Hz) ve dörtnala (camgöbeği, 6.2 Hz) için R2 değerleri. Hem EMG tabanlı hem de optimize edilmiş stimülasyon için, R2 değerleri sinüzoidal uzunluk değişiklikleri için in vivo uzunluk değişikliklerine göre daha düşüktü. EMG tabanlı stimülasyon: yürüyüş R 2 = 0.00 - 0.30, tırıs R 2 = 0.00 - 0.02, dörtnala R2 = 0.03 - 0.07; optimize edilmiş stimülasyon: yürüyüş R2 = 0.02 - 0.21, tırıs R 2 = 0.02 - 0.12, dörtnala R2 = 0.12 - 0.17. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Sinüzoidal uzunluk yörüngeleri kullanılarak ex vivo fare EDL kası tarafından üretilen çalışma döngüleri, in vivo gerinim yörüngelerine kıyasla in vivo sıçan MG kuvvetini doğru bir şekilde taklit etmez (Şekil 8). Sinüzoidal ve in vivo gerinim yörüngeleri tarafından üretilen işteki değişiklik, sinüzoidal yörüngede gerinim ve hız geçişlerinin olmaması ile açıklanabilir (Şekil 9). Hem sinüzoidal yörüngelerde hem de in vivo tabanlı gerilme yörüngelerinde kasılmaların aktif kısalma fazı sırasında kaslar benzer uzunluklarda uyarılırken, stimülasyonun başlangıcı döngünün farklı aşamalarında meydana geldi (örneğin, stimülasyon başlangıcı tırıs EMG tabanlı stimülasyon için %74'lük bir fazda, ancak yürüme EMG tabanlı stimülasyon için %43'lük bir fazda meydana geldi; Tartışma bölümüne bakın).

Figure 8
Şekil 8: İn vivo ve ex vivo sinüzoidal çalışma döngülerinin karşılaştırılması. (A) Sinüzoidal gerinim yörüngesi ve EMG tabanlı stimülasyon kullanılarak sıçan MG'den in vivo çalışma döngüsü (siyah) ve fare EDL'den ex vivo çalışma döngüsü (kesikli macenta). (B) Sinüzoidal gerinim yörüngesi ve optimize edilmiş stimülasyon kullanılarak sıçan MG'den in vivo çalışma döngüsü (siyah) ve fare EDL'den ex vivo çalışma döngüsü (katı macenta). Sinüzoidal iş döngülerinin, sinüzoidal yörüngede gerinim ve hız geçişlerinin olmaması nedeniyle in vivo işi fazla tahmin ettiğine dikkat edin. EMG tabanlı stimülasyon R 2 = 0.0003, optimize stimülasyon R2 = 0.084. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 9
Şekil 9: İn vivo gerinim ve ex vivo sinüzoidal uzunluk yörüngelerinin karşılaştırılması. Yürüme (yeşil), tırıs (macenta) ve dörtnala (mavi) in vivo gerinim ve ex vivo sinüzoidal uzunluk yörüngelerinin karşılaştırılması. Düz çizgi in vivo gerinim yörüngesidir. Kesikli çizgi ex vivo sinüzoidal uzunluk yörüngesi. Vurgulanan kısım stimülasyondur. Stimülasyon, adımın kısalma aşamasında aynı uzunlukta başladı. Gerinim ve hız geçişlerini gösteren oklar. Sinüzoidalden sapmalar, kas üzerindeki dış kuvvetlerden kaynaklanan empedanstır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 1: Optimum uzunlukta izometrik maksimum kuvveti toplamak için kullanılan program. Supramaksimal ve submaksimal seğirme ve tetanik stimülasyon sırasında optimal uzunluğu belirlemek için kullanılan program. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 2: Uygulanabilir seğirme tepkisi. Fare EDL'sinin seğirme yanıtı. Seğirme kuvveti hızla yükselir ve düşer ve ~1 V'luk aktif gerilime ulaşmalıdır. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Şekil 3: İş döngüsü verilerini toplamak için kullanılan program. Kas uzunluğunu ve stimülasyonun zamanlamasını ex vivo çalışma döngülerinde kontrol etmek için kullanılan program. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Ek Kodlama Dosyası 1: Çalışma döngüsü için deneysel bir protokolü segmentlere ayırmak ve oluşturmak için kullanılan MATLab kodu. Hedef adım bilgilerini (uzunluk, EMG aktivasyonu ve kuvvet) bireysel adımlara bölmek için kullanılan MATLab kodu. Kod, hedef hayvan adımlarının ex vivo fare EDL'sinin esnetebileceği uzunluklara ölçeklendirilmesini ve enterpolasyonunu içerir. Ek olarak, ex vivo iş döngüsü deneylerinde stimülasyonun başlangıcını ve süresini seçmek için EMG sinyalini yumuşatmak ve aktivasyonu karşılaştırmak için kod içerir. Bu Dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Organizmalar manzaralar arasında sorunsuz bir şekilde hareket ederken, kasların yaşadığı altta yatan yükler ve gerilmeler büyük ölçüde değişir 1,6,23. Hem in vivo hareket 1,24 hem de "avatar" deneyleri sırasında, kaslar döngüsel, sabit olmayan koşullar altında submaksimal olarak uyarılır. İzometrik kuvvet-uzunluk ve izotonik kuvvet-hız ilişkileri, bu koşullar altında kas kuvvetini tahmin etmek için pek uygun değildir2. Kararlı olmayan gerinimin (yani geçici akımların) ve yüklemenin etkilerini anlamak, in vivo hareket sırasında kuvvet üretimini tahmin etmek için esastır ve bu nedenle bu "avatar" deneylerini geliştirmenin ana mantığıdır2. "Avatar" deneyleri, kuvvet çıkışını ölçerken kas yükünü ve gerilme yörüngelerini kontrol etmemizi sağlar. "Avatar" tekniği, nöral kontrol ve tendon uyumu gibi kafa karıştırıcı faktörler olmadan, in vivo benzeri koşullar altında kasların kuvvet tepkisini araştırır. "Avatar" deneylerini gerçekleştirmek için araştırmacılar, bir kasın farklı başlangıç uzunluklarında ve değişen sürelerde uyarma yeteneği ile öngörülen uzunluk değişikliklerinden geçmesine izin veren bir programa ihtiyaç duyacaklardır (yazarların kullandığı program için Ek Şekil 3'e bakınız). Araştırmacıların deney yapmadan önce başlangıç kası uzunluğunu (mm), gezi uzunluğunu (mm), stimülasyonun başlangıcını (döngü süresinin% 'si) ve stimülasyon süresini (ms) belirtmeleri gerekir (bu parametrelerin değerlerini elde etmek için 1.3-1.4 adımlarına bakın). Genel olarak, denemedeki tüm adımları temsil eden adımların seçilmesi genellikle arzu edilir (örneğin, benzer bir uzunlukta başlar ve biter, benzer bir tepe kuvvetine ulaşır, ortalama EMG aktivitesine sahip olur, vb.). Seçilen bir adımdan elde edilen EMG / aktivasyon ve kuvvet verilerinin aynı denemedeki diğer adımları temsil edip etmediğini belirlemek, daha sonra hedef hayvanın kasını kullanarak tüm denemenin çalışma döngülerini (kuvvete karşı uzunluk) çizerek yapılabilecek "ayarlama" için yardımcı olabilir. İki ayaklı ve dört ayaklı hareket sırasında, en kısa uzunluktan en kısa uzunluğa kadar olan mesafe genellikle tüm bir adımı sınırlar (ayak parmağından ayak parmağına), ancak EMG aktivasyonu değişebilir. Bazı hayvanlarda ve kaslarda, EMG aktivasyonu, burada gösterilen sıçan MG gibi ayak teması ile yakından ilişkilidir22. Gine tavuğu lateral gastrocnemius gibi diğer hayvanlarda, EMG aktivasyonu genellikle bilinmeyen arazilerde daha fazla stabilite elde etmek için en uzun uzunlukta gerçekleşir25.

"Avatar" deneyleri yapmak için, ex vivo kuvvet verilerindeki gürültüyü en aza indirmek önemlidir. Kuvvet ölçümleri, ameliyat sırasında kasların yırtılması, ilmek-düğümler çok uzunsa dikişlerin uyumu, uzunluk girişlerinin ve sapmanın yanlış ölçeklenmesi ve kas yorgunluğu dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere çeşitli konulara duyarlıdır. Kasların yırtılması genellikle "cebi diseksiyon" (adım 2.2.3) ve ilmek düğümünü tendonun proksimal kısmının etrafına bağlarken (adım 2.2.4) meydana gelir. "Cebi diseksiyon" yaparken, diseksiyon makasını düz ve kasa yatay tutmak, uçların EDL'yi çentiklemesini önleyecektir. Ek olarak, künt diseksiyon sırasında diseksiyon makasını uzaklaştırmak ve distal olarak çekmek, diseksiyon makası ile EDL kasları arasındaki teması da sınırlayacaktır. Ek olarak, ameliyat hazırlığı sırasında ve teçhizatta kullanılırken kaslar Krebs-Henseliet solüsyonu ile nemli tutulmalıdır.

Uzunluk girişlerini düzgün bir şekilde ölçeklendirmek daha karmaşıktır. Başlangıç uzunluğu ve/veya sapma uygun şekilde ölçeklendirilmezse kas pasif ve aktif kuvveti etkilenebilir. Pasif gerilimdeki ex vivo artış, pasif gerilimdeki in vivo artışla eşleşmelidir (bkz. Şekil 1). Önceki deneylerde gözlemlenen bir ölçeklendirme sorunu, uzunluk sapmasının (başlangıç uzunluğundan en uzun uzunluğa) çok küçük veya çok büyük olması durumunda hem pasif hem de aktif gerilimin etkilenebilmesidir. Teorik olarak, kaslar optimal uzunluklarına (L 0) yakın tepe kuvvetine ulaşmalıdır.26, bu nedenle in vivo kuvvet üretimini doğru bir şekilde çoğaltmak için ex vivo "avatar" deneylerinde in vivo kas uzunluklarını ölçeklendirmek için optimal uzunluk (L0) kullanıyoruz. Kaslar arasındaki mimari farklılıklar, başlangıç uzunluğu ve uzunluk gezi parametrelerinin belirlenmesinde rol oynayacaktır. Supramaksimal olarak uyarılmış izotonik ve izometrik koşullar sırasında optimal uzunluk (L0) bulunmasına rağmen, "avatar" deneylerinde bir ölçeklendirme metriği olarak kullanılması, daha fazla araştırmaya ihtiyaç duyan döngüsel hareket sırasında kuvvet-uzunluk ve kuvvet-hız ilişkilerinin sınırlamalarını potansiyel olarak vurgulayabilir. Çoğu kararlı durum koşulunda, kasın anlık uzunluğu, hızı ve aktivasyonu (yani, kuvvet-uzunluk ve kuvvet-hız özellikleri), kuvvet ve iş çıktısını makul bir doğrulukla tahmin etmek için kullanılabilir 12,24,27. Değişken yüklemeli dinamik koşullar altında, kuvvethız 28'in bir fonksiyonu olarak artar ve gerinim ve aktivasyon29,30 ile karmaşık bir ilişkiye sahiptir. Bu, kasların izotonik kuvvet-hız ve izometrik kuvvet-uzunluk özellikleriyle çelişir28. Sıçan MG'de, gerinim ve hız geçişleri, ayak teması veya çevre ile etkileşim (yani, engebeli arazi, rüzgar, avlanmadan kaçınmak için ani yön değişikliği) gibi yüklemenin kanıtıdır (Şekil 9). Bu sıçan MG gerinim yörüngeleri, çoğu gerçekçi koşulda olduğu gibi, uygulanan yükte, kuvvet üretiminde ve iş çıktısında ani değişikliklere sahiptir 2,28. Bu deneysel yöntem, geleneksel kuvvet-uzunluk ve kuvvet-hız ilişkileri ile iyi açıklanamayan in vivo koşullar altında gerinim, hız ve aktivasyon dinamikleri arasındaki bu karmaşık etkileşimleri vurgulamayı amaçlamaktadır.

Kas başlangıç uzunluğu çok kısa veya uzun olduğunda başka sorunlar ortaya çıkabilir. Çok kısa bir başlangıç uzunluğu, pasif ve aktif esneme sırasında gerilimde daha düşük bir artış oranına neden olur (gösterilmemiştir), oysa çok uzun bir başlangıç uzunluğu, pasif gerilimde artan bir artış oranına neden olur (bkz. Şekil 1B). Aktif ve pasif gerginlik oranını kullanmak yardımcı olabilir. Örneğin, sıçan MG'de pasif gerilim (N) genellikle aktif gerilimin yarısı civarındadır (Şekil 2). Bir kas çok uzun bir uzunlukta başlarsa ve/veya çok uzun bir uzunluğa gerilirse, pasif gerginlik aktif gerginliğe göre çok yüksek olabilir (bkz. Şekil 1B) ve aşırı gerilme nedeniyle kuvvet hızla azalabilir. Ayrıca, çok uzun bir uzunluğa kadar esnemek potansiyel olarak kasa zarar verir ve kasın daha çabuk yorulmasına neden olabilir. Ek olarak, başlangıç uzunluğu çok kısaysa ve/veya kas yeterince uzun bir uzunluğa gerilmemişse, aktif gerginlik kaynaşmamış görünebilir.

L0'a göre başlangıç uzunluğunu ve sapmayı belirlemek için ön deneyler gereklidir. Kullanılan kasların aktivasyon dinamikleri farklıysa, stimülasyon süresini ayarlamak için ek ön deneylere ihtiyaç duyulabilir. Bu optimizasyonlara ihtiyaç vardır, çünkü in vivo ve ex vivo kasların lif tipi bileşimi ve/veya aktivasyon dinamikleri farklı olabilir. Temsili sonuçlarımızda (Şekil 4 ve Şekil 5), in vivo sıçan MG kuvvet üretimini çoğaltmak için ex vivo deneyler sırasında fare EDL'si için iki stimülasyon protokolü kullandık. Fare EDL'deki kuvvet üretimini en iyi şekilde optimize etmek için in vivo sıçan MG, stimülasyon süresi arttırıldı (Şekil 2 ve Şekil 3). Sıçan MG, fare EDL31,32,33'ten daha yavaş lif türlerinden oluşur. Bu, "avatar" deneylerinde belirgindi, çünkü ex vivo fare EDL kasları, uyarımdan sonra daha hızlı kuvvet üretti ve deaktivasyondan sonra kuvvet, in vivo olarak gözlemlenenden daha hızlı bir oranda azaldı sıçan MG15'te (Şekil 2), uyarma-kasılma gecikmesi farkları hesaba katıldıktan sonra bile in vivo ve ex vivo koşullar34. Ex vivo ve in vivo hedef kaslara bağlı olarak, diğer "avatar" deneylerinde de stimülasyonun optimizasyonuna ihtiyaç duyulabilir. Bu ex vivo çalışma döngüsü tekniğinde fare EDL veya soleus (SOL) kasları kullanılabilir. EDL, kas lifi tipi ve pennasyon yapısındaki benzerlikler nedeniyle sıçan MG için bir "avatar" olarak seçildi. Bazı kasların karmaşık bir yapıya sahip olması ve laboratuvar kemirgenlerinden elde edilen kasların "avatar" olarak kullanılmasıyla taklit edilememesi mümkündür.

"Avatar" deneyleri, in vivo kuvvet üretimini en iyi şekilde çoğaltmak için bazı manuel optimizasyonlara ihtiyaç duysa da, teknik çeşitli farklı hayvanlara ve lokomotor modlara uygulanabilir. "Avatar" tekniği, kasları ex vivo deneyler için çok büyük veya başka bir şekilde erişilemeyen hayvanlarda in vivo kuvvet üretimini anlamak için özellikle yararlı olabilir. Daha büyük hayvanlar üzerinde sadece ön çalışma yapılmış olsa da35, bu çalışma, bu tekniğin laboratuvar farelerini "avatar" olarak kullanarak hayvanlar, kaslar ve lokomotor yürüyüşler arasında uygulanabilirliği için potansiyel göstermiştir. "Avatar" deneylerinin kullanışlılığı, çeşitli omurgalı türlerinden farklı kasların in vivo mekaniğini anlamak için uygun, ucuz, hazır ve iyi karakterize edilmiş bir laboratuvar kemirgen modelinin (yani fare EDL'si) ne kadar doğru kullanılabileceğine bağlıdır. Burada (sıçan MG) ve başka yerlerde (gine tavuğu LG19) sunulan ön "avatar" deneylerinden elde edilen sonuçlar, bu tekniğin in vivo kuvvetleri doğru bir şekilde tahmin etmek için kullanılabileceğini ve diğer hayvanlara uygulanabileceğini düşündürmektedir. Bu yöntemin gelecekteki uygulamaları, ex vivo ve in vitro deneyler sırasında hem hedef hem de "avatar" olarak kullanılan kas ve hayvan türlerini genişletmelidir. "Avatar" deneyleri, kas yükü ve gerginliği aniden değiştiğinde in vivo hareket sırasında kas kuvvetini ve iş çıktısını etkileyen faktörleri incelememize olanak tanır 1,2,19. Spesifik olarak, "avatar" yöntemi, geleneksel kas modelleri veya sinüzoidal çalışma döngüsü deneyleri tarafından yakalanmayan gerinim ve hız geçişlerinin kas kuvveti üzerindeki etkilerini incelememizi sağlar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Tüm yazarlar herhangi bir çıkar çatışması olmadığını kabul eder.

Acknowledgments

Bu çalışmada kullanılan verileri sağladığı için Dr. Nicolai Konow'a teşekkür ederiz. NSF IOS-2016049 ve NSF DBI-2021832 tarafından finanse edilmektedir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Braided Non-Absorbable Silk Suture 4-0  Mersilk  734H
Calcium Chloride Dihydrate (CaCl2) Sigma-Aldrich 1086436 Krebs-Henseleit solution
Dextrose  Sigma-Aldrich D9434 Krebs-Henseleit solution
HEPES Sigma-Aldrich PHR1428 Krebs-Henseleit solution
Hydorchloric Acid (HCl)  Sigma-Aldrich 1.37055 Krebs-Henseleit solution
LabView Data Collection  Lab-View
Magnesium Sulfate (MgSO4) Sigma-Aldrich M7506 Krebs-Henseleit solution
Potassium Chloride (KCl)  Sigma-Aldrich P3911 Krebs-Henseleit solution
Potassium Phosphate Monobasic (KH2PO4) Sigma-Aldrich 5.43841 Krebs-Henseleit solution
S88 Stimulator Grass M643H05 Available for purchase on Ebay
Series 300B Lever System Aurora 1200A includes water-jacket tissue bath
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) Sigma-Aldrich S5761 Krebs-Henseleit solution
Sodium Chloride (NaCl)  Sigma-Aldrich S9888 Krebs-Henseleit solution
Sodium Hydroxide (NaOH) Sigma-Aldrich S5881 Krebs-Henseleit solution
Wild Type Mice Jackson Laboratory B6C3Fe a/a Ttn mdm/J

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Dickinson, M. H. How Animals move: an integrative view. Science. 288 (5463), 100-106 (2000).
  2. Sponberg, S., Abbott, E., Sawicki, G. S. Perturbing the muscle work loop paradigm to unravel the neuromechanics of unsteady locomotion. Journal of Experimental Biology. 226 (7), 243561 (2023).
  3. Daley, M. A., Biewener, A. A. Running over rough terrain reveals limb control for intrinsic stability. Proceedings of the National Academy of Sciences. 103 (42), 15681-15686 (2006).
  4. Daley, M. A., Usherwood, J. R., Felix, G., Biewener, A. A. Running over rough terrain: guinea fowl maintain dynamic stability despite a large unexpected change in substrate height. Journal of Experimental Biology. 209 (1), 171-187 (2006).
  5. Daley, M. A. Understanding the agility of running birds: Sensorimotor and mechanical factors in avian bipedal locomotion. Integrative and Comparative Biology. 58 (5), 884-893 (2018).
  6. Biewener, A. A. Animal locomotion. , Oxford University Press. Oxford New York. (2003).
  7. Robertson, B. D., Sawicki, G. S. Unconstrained muscle-tendon workloops indicate resonance tuning as a mechanism for elastic limb behavior during terrestrial locomotion. Proceedings of the National Academy of Sciences. 112 (43), E5891-E5898 (2015).
  8. Josephson, R. K. Mechanical power output from striated muscle during cyclic contraction. The Journal of Experimental Biology. 114, 493-512 (1985).
  9. Ahn, A. N. How muscles function - the work loop technique. Journal of Experimental Biology. 215 (7), 1051-1052 (2012).
  10. Sawicki, G. S., Robertson, B. D., Azizi, E., Roberts, T. J. Timing matters: tuning the mechanics of a muscle-tendon unit by adjusting stimulation phase during cyclic contractions. Journal of Experimental Biology. 218 (19), 3150-3159 (2015).
  11. Libby, T., Chukwueke, C., Sponberg, S. History-dependent perturbation response in limb muscle. Journal of Experimental Biology. 223 (1), (2020).
  12. Askew, G. N., Marsh, R. L., Ellington, C. P. The mechanical power output of the flight muscles of blue-breasted quail ( Coturnix chinensis ) during take-off. Journal of Experimental Biology. 204 (21), 3601-3619 (2001).
  13. Sponberg, S., Libby, T., Mullens, C. H., Full, R. J. Shifts in a single muscle's control potential of body dynamics are determined by mechanical feedback. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 366 (1570), 1606-1620 (2011).
  14. Loeb, G. E., Brown, I. E., Cheng, E. J. A hierarchical foundation for models of sensorimotor control. Experimental Brain Research. 126 (1), 1-18 (1999).
  15. Wakeling, J. M., Tijs, C., Konow, N., Biewener, A. A. Modeling muscle function using experimentally determined subject-specific muscle properties. Journal of Biomechanics. 117, 110242 (2021).
  16. The Mathworks. MATLAB:R2021a. The Mathworks. , (2021).
  17. Tenan, M. S., Tweedell, A. J., Haynes, C. A. Analysis of statistical and standard algorithms for detecting muscle onset with surface electromyography. PLOS ONE. 12 (5), 0177312 (2017).
  18. Roberts, T. J., Gabaldón, A. M. Interpreting muscle function from EMG: lessons learned from direct measurements of muscle force. Integrative and Comparative Biology. 48 (2), 312-320 (2008).
  19. Rice, N., Bemis, C. M., Daley, M. A., Nishikawa, K. Understanding muscle function during perturbed in vivo locomotion using a muscle avatar approach. Journal of Experimental Biology. 226 (13), 244721 (2023).
  20. Silva Cornachione, A., CaçãoOliveiraBenedini-Elias, P., Cristina Polizello , P., César Carvalho, L., CláudiaMattiello-Sverzut, A. Characterization of Fiber types in different muscles of the hindlimb in female weanling and adult wistar rats. Acta Histochemica Et Cytochemica. 44 (2), 43-50 (2011).
  21. Hämäläinen, N., Pette, D. The histochemical profiles of fast fiber types IIB, IID, and IIA in skeletal muscles of mouse, rat, and rabbit. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 41 (5), 733-743 (1993).
  22. Charles, J. P., Cappellari, O., Spence, A. J., Hutchinson, J. R., Wells, D. J. Musculoskeletal geometry, muscle architecture and functional specialisations of the mouse hindlimb. PLOS ONE. 11 (4), 0147669 (2016).
  23. Nishikawa, K. Titin: A Tunable spring in active muscle. Physiology (Bethesda, Md). 35 (3), 209-217 (2020).
  24. Dick, T. J. M., Biewener, A. A., Wakeling, J. M. Comparison of human gastrocnemius forces predicted by Hill-type muscle models and estimated from ultrasound images). The Journal of Experimental Biology. 220, 1643-1653 (2017).
  25. Daley, M. A., Biewener, A. A. Leg muscles that mediate stability: mechanics and control of two distal extensor muscles during obstacle negotiation in the guinea fowl. Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological Sciences. 366 (1570), 1580-1591 (2011).
  26. Seth, A., Sherman, M., Reinbolt, J. A., Delp, S. L. OpenSim: a musculoskeletal modeling and simulation framework for in silico investigations and exchange. Procedia IUTAM. 2, 212-232 (2011).
  27. Sandercock, T. G., Heckman, C. J. Doublet potentiation during eccentric and concentric contractions of cat soleus muscle. Journal of Applied Physiology. 82 (4), Bethesda, Md. 1219-1228 (1997).
  28. Marsh, R. L. How muscles deal with real-world loads: the influence of length trajectory on muscle performance. The Journal of Experimental Biology. 202, 3377-3385 (1999).
  29. Hessel, A. L., Monroy, J. A., Nishikawa, K. C. Non-cross bridge viscoelastic elements contribute to muscle force and work during stretch-shortening cycles: evidence from whole muscles and permeabilized fibers. Frontiers in Physiology. 12, 648019 (2021).
  30. Lindstedt, S., Nishikawa, K. Huxleys' missing filament: form and function of titin in vertebrate striated muscle. Annual Review of Physiology. 79, 145-166 (2017).
  31. Abbate, F., De Ruiter, C. J., Offringa, C., Sargeant, A. J., De Haan, A. In situ rat fast skeletal muscle is more efficient at submaximal than at maximal activation levels. Journal of Applied Physiology. 92 (5), 2089-2096 (2002).
  32. Eng, C. M., Smallwood, L. H., Rainiero, M. P., Lahey, M., Ward, S. R., Lieber, R. L. Scaling of muscle architecture and fiber types in the rat hindlimb. Journal of Experimental Biology. 211 (14), 2336-2345 (2008).
  33. Manuel, M., Chardon, M., Tysseling, V., Heckman, C. J. Scaling of motor output, from mouse to humans. Physiology (Bethesda, Md). 34 (1), 5-13 (2019).
  34. Zajac, F. E. Muscle and tendon: properties, models, scaling, and application to biomechanics and motor control. Critical Reviews in Biomedical Engineering. 17 (4), 359-411 (1989).
  35. Rice, N. Understanding muscle function during in vivo locomotion using a novel muscle avatar approach. ProQuest Dissertations and Theses. , https://libproxy.nau.edu/login?url=https://www.proquest.com/dissertationstheses/understanding-muscle-function-during-em-vivo/docview/2444890224/se-2?accountid=12706 (2020).

Tags

Avatar Ex Vivo İş Döngüsü Deneyleri In Vivo Zorlanma Aktivasyon Hareket Davranışları Kas Kuvveti Üretimi İş Çıktısı Sinirsel Ve Mekanik Sistemler Biyolojik Organizasyon Kontrol Hiyerarşisi Kas Modelleri In Vivo Kas Kuvveti In Vivo Kas Çalışması Kas Mekaniği Gerinim ve Yüklenme Koşulları İn Vivo Hareket Gerinim ve Hız Geçişleri Nöral Aktivasyon Kas-İskelet Kinematiği Ortam Yükleri Avatar Tekniği
"Avatar", <em>In</em> vivo Gerinim ve Aktivasyon Kullanılarak Değiştirilmiş Bir <em>Ex vivo</em> İş Döngüsü Deneyi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a … More

Bemis, C., Nishikawa, K. "Avatar", a Modified Ex vivo Work Loop Experiments Using In vivo Strain and Activation. J. Vis. Exp. (198), e65610, doi:10.3791/65610 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter