Summary
يسمح التشريح المجهري لالتقاط الليزر لأنسجة التليف تحت المخاطي عن طريق الفم بالاستخراج الدقيق للخلايا من المناطق النسيجية ذات الأهمية لتحليل البيانات متعددة الأوميكس بالمعلومات المورفولوجية والمكانية.
Abstract
التليف تحت المخاطي الفموي (OSF) هو نوع شائع من الاضطرابات الخبيثة المحتملة في تجويف الفم. غالبا ما يتم العثور على ضمور الظهارة والتليف في الصفيحة المخصوصة وتحت المخاطية على الشرائح النسيجية. تم اقتراح خلل التنسج الظهاري ، وضمور الظهارة ، والخلايا الليفية الهرمة لتكون مرتبطة بالتحول الخبيث ل OSF. ومع ذلك ، بسبب عدم تجانس اضطرابات الفم الخبيثة المحتملة وسرطان الخلايا الحرشفية الفموية ، من الصعب تحديد الآليات الجزيئية المحددة للتحول الخبيث في OSF. هنا ، نقدم طريقة للحصول على عدد صغير من الخلايا الظهارية أو الوسيطة التي تحمل البيانات المورفولوجية والمعلومات المكانية عن طريق التشريح المجهري لالتقاط الليزر على شرائح الأنسجة المضمنة في البارافين المثبتة بالفورمالين. باستخدام المجهر ، يمكننا التقاط الأنسجة الظهارية المخمورية أو الضامرة بدقة (~ 500 خلية) والأنسجة تحت الظهارية الليفية. يمكن تقييم الخلايا المستخرجة عن طريق تسلسل الجينوم أو النسخ للحصول على البيانات الجينومية والنسخ مع المعلومات المورفولوجية والمكانية. يزيل هذا النهج عدم تجانس تسلسل أنسجة OSF السائبة والتداخل الناجم عن الخلايا في المناطق غير المصابة ، مما يسمح بإجراء تحليل مكاني دقيق لأنسجة OSF.
Introduction
التليف تحت المخاطي للفم (OSF) هو مرض مزمن خبيث يتطور بشكل رئيسي في الغشاء المخاطي الشدقي ويؤدي إلى تقييد فتح الفم1. في حين أن OSF هو مرض متعدد العوامل ، فإن مضغ جوز الأريكا أو جوز التنبول هو السبب الرئيسي ل OSF 2,3. بسبب هذه العادة المحددة جغرافيا ، يتركز OSF في الغالب في السكان في جنوب شرق وجنوب آسيا3. تشمل السمات النسيجية الشائعة ل OSF ترسب الكولاجين غير الطبيعي في النسيج الضام تحت ظهارة الغشاء المخاطي للفم ، وتضيق الأوعية الدموية ، والانسداد1. يمكن أن يظهر النسيج الظهاري OSF مع مظاهر ضمور أو تضخم وحتى خلل التنسج عندما يصاحب ذلك الطلاوةالفموية 4,5.
تعرف منظمة الصحة العالمية OSF بأنه اضطراب شائع يحتمل أن يكون خبيثا عن طريق الفم (OPMD) يظهر إمكانية التقدم إلى سرطان الخلايا الحرشفية الفموي بمعدل تحول خبيث يبلغ 4٪ -6٪ 6،7،8،9. الآلية الكامنة وراء التحول الخبيث ل OSF معقدة10. النمو غير الطبيعي للظهارة ، بما في ذلك خلل التنسج والضمور ، يزيد من احتمال التسرطن ، وقد تشارك الخلايا الليفية الهرمة في السدى في التطور الخبيث ل OSF عن طريق إحداث الانتقال الظهاري الوسيطة (EMT) من خلال أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) والجزيئات الأخرى10.
ولدت تقنيات التحليلات المكانية الأوميك بيانات متعددة الأوميك مع المعلومات المورفولوجية والمكانية التي قدمت نظرة ثاقبة لآليات السرطان11،12،13. هنا ، نقدم بروتوكولا لالتقاط مجموعات الخلايا المرتبطة بالتشكل من أنسجة OSF المضمنة بالبارافين المثبتة بالفورمالين عن طريق التشريح المجهري بالليزر. يمكن للتحليلات متعددة الأوميك لهذه العينات التغلب على التحديات المتعلقة بعدم التجانس داخل الأنسجة وزيادة فهم علم الأمراض الجزيئي وآليات التحول الخبيث في OSF14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تمت الموافقة على هذه الدراسة من قبل مجلس المراجعة المؤسسية لكلية ومستشفى جامعة بكين. تم الحصول على موافقة مستنيرة من المرضى. تم تحديد عينات الأنسجة المستخدمة في هذه الدراسة. مخطط الدراسة موضح في الشكل 1.
1. إعداد العينة
- قطع أنسجة التليف تحت المخاطي الفموي المثبتة بالبارافين إلى أقسام مستمرة بسمك 3 ميكرومتر و 10 ميكرومتر على ميكروتوم.
- افتح الأقسام في الماء ثم اصطاد على الشرائح. قم بإصلاح أقسام 3 ميكرومتر و 10 ميكرومتر على شرائح مجهر الالتصاق (الشريحة أ) وشرائح غشاء القلم (الشريحة ب) ، على التوالي.
- ضع الشرائح على طبق ساخن عند 60 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
2. تلطيخ الهيماتوكسيلين يوزين
- ضع الشريحتين A و B في الزيلين (تنبيه) لمدة 10 دقائق وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- هيدرات الشرائح A و B في محاليل الإيثانول المتدرجة في حدود 100٪ و 100٪ و 90٪ و 80٪ و 70٪ لمدة 1 دقيقة في كل تركيز.
- ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية
- ضع الشريحتين A و B في محلول صبغة الهيماتوكسيلين هاريس لمدة 90 ثانية.
- ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- ضع الشرائح A و B في محلول div-hematoxylin (تنبيه) لمدة 2 ثانية.
- ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- ضع الشرائح في A و B في محلول إعادة اللون الأزرق بنسبة 1٪ لمدة 2 ثانية.
- ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- ضع الشرائح في محلول eosin لمدة 2 ثانية.
- ضع الشريحتين A و B في ماء مقطر عالي النقاء لمدة 30 ثانية وكرر هذه الخطوة ثلاث مرات.
- قم بتجفيف الشرائح في محاليل الإيثانول المتدرجة بترتيب 70٪ و 80٪ و 90٪ و 100٪ و 100٪ لمدة 2 ثانية في كل تركيز.
- ضع الشريحة A في الزيلين لمدة 3 دقائق وكرر هذه الخطوة مرتين.
- أضف قطرة من وسيط التثبيت (ALERT) إلى الشريحة A وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي.
3. مراقبة التشكل النسيجي والتشريح المجهري لالتقاط الليزر
- بدء تشغيل نظام وبرامج التشريح المجهري بالليزر (الشكل 2).
- ضع الشريحة A على مرحلة الشريحة ولاحظ التشكل النسيجي لتحديد مجال الاهتمام بالتشريح المجهري بالليزر.
- قم بإزالة الشريحة A ووضع الشريحة B عكسيا على مرحلة الشريحة.
- انقر فوق الزر "تفريغ " (الشكل 2) لدفع جهاز التجميع للخارج. أدخل أنبوب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) في جهاز التجميع وتأكد من تثبيت الأنبوب. انقر على OK زر (الشكل 3).
- حدد غطاء بالنقر فوق الدائرة الحمراء المقابلة التي تشير إلى جهاز التجميع: أغطية الأنبوب. ستتحول الدائرة المحددة إلى اللون الأخضر.
- انقر على رسم زر ورسم + قص زر واستخدم الماوس لرسم منطقة الاهتمام.
- انقر على ابدأ قص زر لالتقاط منطقة الاهتمام ؛ سيتم جمع العينة التي تم التقاطها بواسطة الغطاء (الشكل 4).
- انقر فوق الزر السفلي لضمان جمع العينة الملتقطة (الشكل 5).
- انقر فوق الزر عينة لالتقاط العينة التالية.
- انقر فوق الزر "تفريغ " لتفريغ أنبوب PCR بالعينة الملتقطة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
من خلال إجراء التشريح المجهري بالليزر لأنسجة OSF ، التقطنا عينات من ظهارة خلل التنسج ، وسدى تحت ظهارة خلل التنسج ، وظهارة ضامرة ، وسدى تحت الأنسجة الظهارية الضامرة (الشكل 1). من خلال استخراج الحمض النووي وتسلسل الجينوم الكامل منخفض العمق ، تمكنا من تحليل تعديلات رقم النسخ المتعلقة بالتشكل (CNA) 15. CNA هو شكل شائع من أشكال عدم الاستقرار الجيني المرتبط بزيادة خطر التحول الخبيث في OPMD15,16. اكتشفنا أنماط CNA مختلفة بين أربعة أنواع من العينات. كما هو موضح في الشكل 6 ، كان CNA موجودا في العينات الظهارية ولكن ليس في عينات السدى. على الرغم من أن العينات نشأت من نفس المريض ، إلا أن نمط CNA في ظهارة خلل التنسج لم يكن هو نفسه في ظهارة الضمور. تم الكشف عن CNA في الكروموسومات 3 و 8 في ظهارة خلل التنسج ، بينما تم الكشف عن CNA بتردد أقل في الكروموسوم 8 في ظهارة ضامرة.
الشكل 1: مخطط التشريح المجهري لالتقاط الليزر لعينات التليف تحت المخاطي الفموي. يتم التقاط أنسجة الظهارة والسدى بأنماط مختلفة بواسطة الليزر تحت المجهر. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: برنامج التشريح المجهري بالليزر. لقطة شاشة للبرنامج تظهر اللوحة الحية. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نافذة جهاز التجميع. لقطة شاشة للبرنامج تظهر نافذة جهاز التجميع لتحديد جهاز التجميع. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التقاط العينة في مجال الاهتمام. سيسمح النقر فوق الزر Start Cut بالتقاط منطقة الاهتمام. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: العينة الملتقطة. يمكن رؤية العينة الملتقطة في غطاء أنبوب PCR. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: تعديلات رقم النسخ. النتائج التمثيلية لأنماط مختلفة من تعديلات عدد النسخ بين العينات المختلفة. هناك تغييرات مختلفة في عدد النسخ بين ظهارة خلل التنسج والظهارة الضامرة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
أبلغ هذا البروتوكول عن خط أنابيب لالتقاط عينات أنسجة OSF مع المعلومات المورفولوجية والمكانية لمزيد من التحليلات المكانية من خلال التشريح المجهري بالليزر. من النتائج التمثيلية ، حددنا أنماط CNA المختلفة بين العينات المختلفة المتعلقة بالمورفولوجيا.
OSF ، وهو نوع من OPMD ، هو حالة سرطانية شائعة لسرطان الخلايا الحرشفيةالفموية 6. تم الإبلاغ عن عدم الاستقرار الجيني المرتبط بالتطور والتحول الخبيث ل OPMD17,18. أبلغت دراسات متعددة عن تغيرات في الكروموسومات ، والتعبير الجيني التفاضلي ، والاختلافات اللاجينية المرتبطة بالتقدم والتحول الخبيث ل OSF من بيانات علم الجينوم والنسخ والبروتينات19،20،21،22،23،24. لم تؤد المكونات المسببة للسرطان من جوز الأريكا ، مثل الأركولين ، إلى تطوير OSF فحسب ، بل أدى التحفيز طويل المدى أيضا إلى شيخوخة الخلايا الليفية و EMT والإنتاج المستمر لأنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) ، مما أدى إلى تحول خبيث من خلال تنظيم البيئة الدقيقة المناعية ومسارات الإشارة مثل إشارات TGF-β و NF-κB5 ، 10,21. ومع ذلك ، توجد كل من التغيرات النسيجية الظهارية واللحمية غير الطبيعية في أنسجة OSF ، ولا تزال الأنسجة أو التغيرات الخلوية التي تدفع التحول الخبيث في OSF غير واضحة. استخدمت الدراسات السابقة في الغالب تحليلات التسلسل السائبة ، حيث تم استخراج الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي من كتلة من الأنسجة لمزيد من تحليل التعبير الجزيئي والمسارات المعنية. ومع ذلك ، افتقر هذا التحليل إلى الارتباط المورفولوجي مع الأنسجة وتجاهل عدم التجانس داخل الأنسجة. علاوة على ذلك ، لا يمكن لهذا النهج تحديد ما إذا كانت هناك تغيرات جزيئية تفاضلية في مناطق نسيجية مختلفة.
أفادت الدراسات الحديثة عن تحليل أوميكس المكاني في العديد من الأمراض11،13،25. من خلال التحليل المكاني الدقيق ، يتم اكتشاف أعداد متزايدة من الجزيئات والأهداف ويتم توضيح التفاعلات الخلوية والتجميع11،12،13. ومع ذلك ، لا يزال هناك نقص في تحليل omics الذي تم حله مكانيا ل OSF. عادة ما يتم أخذ عينات OSF من خزعات الغشاء المخاطي للفم وتم تحضيرها ككميات صغيرة من العينات المثبتة بالفورمالين والمضمنة بالبارافين ، مما يجعل من الصعب إجراء تسلسل أوميكس المكاني أحادي الخلية ، والذي يحتاج إلى عينات كبيرة. لذلك ، قد يكون تطوير طرق ذات استبانة مكانية باستخدام عينات مدمجة بالبارافين مثبتة بالفورمالين فائدة كبيرة. نتوقع أن يفيد البروتوكول الحالي الباحثين العاملين على OSF وأنواع أخرى من OPMD ويساهم في فهم آليات التطور والتحول الخبيث ل OPMD.
هذه الطريقة لها بعض القيود. أولا ، تم تنفيذ البروتوكول باستخدام عينات مدمجة في البارافين مثبتة بالفورمالين ، مما يجعل من الصعب استخراج الحمض النووي الريبي لتحليل التسلسل. ومع ذلك ، يمكن إجراء تحليل تسلسل الحمض النووي الريبي المرتبط بالتشكل عند استخدام تلطيخ البنفسج البلوري والحفاظ على الممارسات المعقمة 15,26. لا يمكن للعينات الملتقطة حاليا تلبية مستوى دقة الخلية الواحدة لأنه عندما يكون عدد الخلايا صغيرا جدا ، قد يتم تكسير الخلايا بواسطة شعاع الليزر ، مما يؤثر على استخراج الحمض النووي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن أصحاب البلاغ عدم وجود تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا العمل من خلال منح بحثية من المؤسسة الوطنية لعلوم الطبيعة في الصين (81671006 ، 81300894) ، صندوق CAMS للابتكار للعلوم الطبية (2019-I2M-5-038) ، مشروع بناء الانضباط السريري الرئيسي الوطني (PKUSSNKP-202102) ، صندوق الابتكار لمرشحي الدكتوراه المتميزين في مركز العلوم الصحية بجامعة بكين (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
