Summary
Лазерная микродиссекция субмукозных фиброзных тканей полости рта позволяет точно извлекать клетки из интересующих гистологических областей для анализа мультиомиксных данных с морфологической и пространственной информацией.
Abstract
Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) является распространенным типом потенциально злокачественного заболевания полости рта. Атрофия эпителия и фиброз собственной пластинки и подслизистой оболочки часто обнаруживаются на гистопатологических предметных стеклах. Было высказано предположение, что дисплазия эпителия, атрофия эпителия и стареющие фибробласты связаны со злокачественной трансформацией OSF. Однако из-за гетерогенности потенциально злокачественных заболеваний полости рта и плоскоклеточного рака полости рта трудно выявить специфические молекулярные механизмы злокачественной трансформации при ОСФ. В данной работе представлен метод получения небольшого количества эпителиальных или мезенхимальных клеток, несущих морфологические данные и пространственную информацию, методом микродиссекции с лазерным захватом на фиксированных формалином предметных стеклах, залитых парафином. С помощью микроскопа мы можем точно захватить микромасштабную (~500 клеток) диспластическую или атрофическую эпителиальную ткань и фиброзную субэпителиальную ткань. Извлеченные клетки могут быть оценены с помощью секвенирования генома или транскриптома для получения геномных и транскриптомных данных с морфологической и пространственной информацией. Этот подход устраняет гетерогенность массового секвенирования тканей OSF и интерференцию, вызванную клетками в непораженных областях, что позволяет проводить точный пространственно-омиксный анализ тканей OSF.
Introduction
Субмукозный фиброз полости рта (ОСФ) – это хроническое коварное заболевание, которое развивается преимущественно в слизистой оболочке щек и приводит к ограничению открывания рта1. В то время как OSF является многофакторным заболеванием, жевание ореха ареки или ореха бетеля является основной причиной OSF 2,3. Из-за этой географически специфической привычки OSF преимущественно концентрируется в популяциях в Юго-Восточной и Южной Азии3. Общие гистологические признаки OSF включают аномальное отложение коллагена в соединительной ткани под эпителием слизистой оболочки полости рта, стеноз сосудов и окклюзию1. Эпителиальная ткань OSF может проявляться атрофией или гиперплазией и даже дисплазией при одновременном применении с лейкоплакией полости рта 4,5.
OSF определяется Всемирной организацией здравоохранения как распространенное оральное потенциально злокачественное заболевание (OPMD), которое демонстрирует потенциал прогрессирования до плоскоклеточного рака полости рта со скоростью злокачественной трансформации 4%-6%6,7,8,9. Механизм, лежащий в основе злокачественной трансформации OSF, сложен10. Аномальный рост эпителия, включающий как дисплазию, так и атрофию, увеличивает потенциал канцерогенеза, а стареющие фибробласты в строме могут быть вовлечены в злокачественную прогрессию OSF путем индуцирования эпителиально-мезенхимального перехода (EMT) через активные формы кислорода (АФК) и другие молекулы10.
Технологии пространственно-омического анализа позволили получить мультиомные данные с морфологической и пространственной информацией, которые позволили получить представление о механизмах развития рака11,12,13. Здесь мы представляем протокол для захвата морфологических клеточных популяций из фиксированной формалином парафиносодержащей ткани OSF методом лазерной микродиссекции. Мультиомный анализ этих образцов может преодолеть проблемы, связанные с внутритканевой гетерогенностью, и улучшить понимание молекулярной патологии и механизмов злокачественной трансформации в OSF14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Это исследование было одобрено институциональным наблюдательным советом школы и больницы Пекинского университета. От пациентов было получено информированное согласие. Образцы тканей, использованные в этом исследовании, были обезличены. Схема исследования показана на рисунке 1.
1. Пробоподготовка
- Разрезать на микротоме ткани ротовой полости с парафином, залитые парафином, на непрерывные участки толщиной 3 мкм и 10 мкм.
- Разложите секции в воде, а затем выловите рыбу на горках. Зафиксируйте участки 3 мкМ и 10 мкм на предметных стеклах адгезионного микроскопа (слайд А) и PEN-мембранных предметных стеклах (слайд Б) соответственно.
- Поместите предметные стекла на плиту при температуре 60 °C на 2 часа.
2. Окрашивание гематоксилин-эозином
- Поместите слайды А и Б в ксилол (ОСТОРОЖНО) на 10 минут и повторите этот шаг трижды.
- Гидратируйте предметные стекла А и В в градуированных растворах этанола порядка 100%, 100%, 90%, 80% и 70% в течение 1 мин в каждой концентрации.
- Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с
- Поместите предметные стекла А и Б в раствор красителя гематоксилина Харриса на 90 с.
- Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
- Поместите слайды А и Б в раствор див-гематоксилина (ОСТОРОЖНО) на 2 с.
- Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
- Поместите предметные стекла в А и Б в 1%-ный раствор повторного синения на 2 с.
- Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
- Поместите предметные стекла в раствор эозина на 2 с.
- Поместите предметные стекла А и Б в сверхчистую дистиллированную воду на 30 с и повторите этот шаг трижды.
- Обезвоживают предметные стекла в градуированных растворах этанола порядка 70%, 80%, 90%, 100% и 100% в течение 2 с в каждой концентрации.
- Поместите предметное стекло А в ксилол на 3 минуты и повторите этот шаг дважды.
- Добавьте каплю монтажного носителя (ОСТОРОЖНО) на слайд A и накройте его покровным стеклом.
3. Наблюдение за гистологической морфологией и микродиссекция с помощью лазерного захвата
- Запустите систему лазерной микродиссекции и программное обеспечение (рис. 2).
- Поместите предметное стекло А на предметное стекло и понаблюдайте за гистологической морфологией, чтобы определить область интереса для лазерной микродиссекции.
- Снимите слайд А и поместите слайд Б обратно на предметный столик.
- Нажмите кнопку «Выгрузить » (рис. 2), чтобы вытолкнуть устройство сбора. Вставьте пробирку для полимеразной цепной реакции (ПЦР) в устройство для сбора и убедитесь, что пробирка зафиксирована. Нажмите кнопку OK (рисунок 3).
- Выберите колпачок, щелкнув по соответствующему красному кружку, обозначающему устройство сбора: Крышки для трубок. Выбранный круг станет зеленым.
- Нажмите кнопки Рисовать и Рисовать + Вырезать и используйте мышь, чтобы нарисовать интересующую область.
- Нажмите кнопку «Начать вырезание », чтобы захватить интересующую область; захваченный образец будет собран колпачком (рис. 4).
- Нажмите кнопку Lower , чтобы убедиться в том, что захваченный образец собран (рис. 5).
- Нажмите кнопку Образец , чтобы получить следующий образец.
- Нажмите кнопку «Выгрузить», чтобы выгрузить пробирку для ПЦР с захваченным образцом.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Выполняя лазерную микродиссекцию тканей OSF, мы получили образцы диспластического эпителия, стромы под диспластическим эпителием, атрофического эпителия и стромы под атрофической эпителиальной тканью (рис. 1). Благодаря выделению ДНК и низкоглубинному секвенированию всего генома мы смогли проанализировать связанные с морфологией изменения числа копий (CNA)15. CNA является распространенной формой геномной нестабильности, связанной с повышенным риском злокачественной трансформации в OPMD15,16. Мы обнаружили различные паттерны CNA среди четырех типов образцов. Как показано на рисунке 6, CNA присутствовал в эпителиальных образцах, но не присутствовал в образцах стромы. Несмотря на то, что образцы были взяты у одного и того же пациента, рисунок CNA в диспластическом эпителии не был таким же, как в атрофическом эпителии. CNA в хромосомах 3 и 8 был обнаружен в диспластическом эпителии, в то время как CNA был обнаружен с меньшей частотой в хромосоме 8 в атрофическом эпителии.
Рисунок 1: Схема лазерного захвата микродиссекции образцов субмукозного фиброза полости рта. Ткани эпителия и стромы с различным рисунком захватываются лазером под микроскопом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Программное обеспечение для лазерной микродиссекции. Снимок экрана программного обеспечения, показывающий живую панель. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Окно коллекторного устройства. Снимок экрана программного обеспечения, показывающий окно устройства сборщика для выбора устройства сбора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Захват образца в интересующей области. Нажатие на кнопку Start Cut позволит захватить интересующую область. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Захваченный образец. Взятый образец можно увидеть в крышке пробирки для ПЦР. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 6: Изменение числа копий. Репрезентативные результаты различных закономерностей изменения числа копий в различных выборках. Различаются изменения числа копий между диспластическим эпителием и атрофическим эпителием. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе сообщалось о конвейере для захвата образцов тканей OSF с морфологической и пространственной информацией для дальнейшего пространственно-омического анализа с помощью лазерной микродиссекции. Исходя из репрезентативных результатов, мы идентифицировали различные паттерны CNA среди различных образцов, связанных с морфологией.
OSF, тип OPMD, является распространенным предраковым состоянием плоскоклеточной карциномы полости рта6. Сообщалось, что геномная нестабильность связана с развитием и злокачественной трансформацией OPMD17,18. Многочисленные исследования сообщали об изменениях хромосом, дифференциальной экспрессии генов и эпигенетических вариациях, связанных с прогрессированием и злокачественной трансформацией OSF по данным геномики, транскриптомики и протеомики 19,20,21,22,23,24. Канцерогенные компоненты ореха арека, такие как ареколин, не только привели к развитию OSF, но и к длительной стимуляции также индуцировали старение фибробластов и EMT и непрерывную продукцию активных форм кислорода (АФК), что привело к злокачественной трансформации путем регуляции иммунного микроокружения и сигнальных путей, таких как сигналы TGF-β и NF-κB5, 10,21. Тем не менее, в тканях OSF присутствуют как аномальные эпителиальные, так и стромальные гистологические изменения, и остается неясным, какие тканевые или клеточные изменения приводят к злокачественной трансформации OSF. В предыдущих исследованиях в основном использовался анализ массового секвенирования, при котором ДНК или РНК извлекались из блока тканей для дальнейшего анализа молекулярной экспрессии и задействованных путей. Однако в этом анализе отсутствовала морфологическая корреляция с гистологией и игнорировалась внутритканевая гетерогенность; Кроме того, этот подход не позволяет определить, существуют ли дифференциальные молекулярные изменения в различных гистологических областях.
В недавних исследованиях сообщалось о пространственно-омиксном анализе при многих заболеваниях11,13,25. Благодаря точному пространственно-омиксному анализу обнаруживается все большее число молекул и мишеней, а также выясняются клеточные взаимодействия и кластеризация11,12,13. Тем не менее, до сих пор не хватает пространственно-разрешающего омиксного анализа OSF. Образцы OSF обычно брали из биопсии слизистой оболочки полости рта и готовили в виде небольших объемов фиксированных формалином и залитых парафином образцов, что затрудняло выполнение одноклеточного пространственного омиксного секвенирования, для которого требуются большие образцы. Таким образом, разработка методов с пространственным разрешением с использованием образцов, залитых парафином, зафиксированных формалином, может быть значительным преимуществом. Мы ожидаем, что текущий протокол принесет пользу исследователям, работающим над OSF и другими типами OPMD, и внесет свой вклад в понимание механизмов развития и злокачественной трансформации OPMD.
Этот метод имеет некоторые ограничения. Во-первых, протокол был выполнен с использованием образцов, залитых парафином, зафиксированных формалином, что затрудняло выделение РНК для секвенирования; тем не менее, анализ секвенирования РНК, связанный с морфологией, может быть выполнен при использовании окрашивания кристаллическим фиолетовым цветом и соблюдении асептических практик15,26. Отобранные в настоящее время образцы не могут соответствовать уровню разрешения одной клетки, потому что, когда количество клеток слишком мало, клетки могут быть разрушены лазерным лучом, что повлияет на экстракцию ДНК.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Acknowledgments
Работа выполнена при поддержке исследовательских грантов Национального фонда естественных наук Китая (81671006, 81300894), Инновационного фонда медицинских наук CAMS (2019-I2M-5-038), Национального проекта по построению ключевой клинической дисциплины (PKUSSNKP-202102), Инновационного фонда для выдающихся докторантов Центра медицинских наук Пекинского университета (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
