Summary
Laseropname van microdissectie van orale submuceuze fibroseweefsels maakt nauwkeurige extractie van cellen mogelijk uit histologische regio's die van belang zijn voor de analyse van multi-omics-gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie.
Abstract
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een veel voorkomende vorm van potentieel kwaadaardige aandoening in de mondholte. De atrofie van epitheel en fibrose van de lamina propria en de submucosa worden vaak aangetroffen op histopathologische objectglaasjes. Er werd voorgesteld dat epitheliale dysplasie, epitheliale atrofie en senescente fibroblasten geassocieerd zijn met de kwaadaardige transformatie van OSF. Vanwege de heterogeniteit van potentieel kwaadaardige orale aandoeningen en oraal plaveiselcelcarcinoom, is het echter moeilijk om de specifieke moleculaire mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF te identificeren. Hier presenteren we een methode om een klein aantal epitheel- of mesenchymale cellen te verkrijgen die morfologische gegevens en ruimtelijke informatie dragen door middel van microdissectie met laseropname op in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde weefselglaasjes. Met behulp van een microscoop kunnen we op microschaal (~500 cellen) dysplastisch of atrofisch epitheelweefsel en fibrotisch subepitheliaal weefsel nauwkeurig vastleggen. De geëxtraheerde cellen kunnen worden geëvalueerd door genoom- of transcriptoomsequencing om genomische en transcriptomische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie te verkrijgen. Deze aanpak elimineert de heterogeniteit van de sequentiebepaling van OSF-weefsel in bulk en de interferentie veroorzaakt door cellen in niet-laesionele gebieden, waardoor nauwkeurige spatial-omics-analyse van OSF-weefsel mogelijk wordt.
Introduction
Orale submuceuze fibrose (OSF) is een chronische, verraderlijke ziekte die zich voornamelijk in het mondslijmvlies ontwikkelt en resulteert in een beperkte mondopening. Hoewel OSF een multifactoriële ziekte is, is het kauwen van arecanoten of betelnoten de belangrijkste oorzaak van OSF 2,3. Vanwege deze geografisch specifieke gewoonte is OSF voornamelijk geconcentreerd in populaties in Zuidoost- en Zuid-Azië3. De gemeenschappelijke histologische kenmerken van OSF zijn onder meer abnormale collageenafzetting in het bindweefsel onder het mondslijmvliesepitheel, vasculaire stenose en occlusie1. OSF-epitheelweefsel kan manifestaties van atrofie of hyperplasie en zelfs dysplasie vertonen wanneer het gelijktijdig wordt behandeld met orale leukoplakie 4,5.
OSF wordt door de Wereldgezondheidsorganisatie gedefinieerd als een veel voorkomende orale potentieel kwaadaardige aandoening (OPMD) die het potentieel vertoont om zich te ontwikkelen tot oraal plaveiselcelcarcinoom met een kwaadaardige transformatiesnelheid van 4%-6%6,7,8,9. Het mechanisme dat ten grondslag ligt aan de kwaadaardige transformatie van OSF is complex10. Abnormale groei van het epitheel, waaronder zowel dysplasie als atrofie, verhoogt de kans op carcinogenese, en senescente fibroblasten in het stroma kunnen betrokken zijn bij de kwaadaardige progressie van OSF door epitheliale-mesenchymale overgang (EMT) te induceren via reactieve zuurstofsoorten (ROS) en andere moleculen10.
Technologieën voor ruimtelijk-omische analyses genereerden multi-omische gegevens met morfologische en ruimtelijke informatie die inzicht hebben verschaft in kankermechanismen11,12,13. Hier presenteren we een protocol om morfologie-gerelateerde celpopulaties vast te leggen uit formaline-gefixeerd paraffine-ingebed OSF-weefsel door middel van lasermicrodissectie. Multi-omische analyses van deze monsters kunnen uitdagingen met heterogeniteit binnen het weefsel overwinnen en het begrip van de moleculaire pathologie en mechanismen van kwaadaardige transformatie in OSF14 vergroten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Deze studie werd goedgekeurd door de institutionele beoordelingsraad van de Peking University School and Hospital. Geïnformeerde toestemming werd verkregen van de patiënten. De weefselmonsters die in dit onderzoek werden gebruikt, werden geanonimiseerd. Het onderzoeksschema is weergegeven in figuur 1.
1. Voorbereiding van het monster
- Snijd in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde orale submuceuze fibroseweefsels in continue secties van 3 μm en 10 μm dikte op een microtoom.
- Vouw de secties uit in het water en vis ze vervolgens uit op de glijbanen. Bevestig de secties van 3 μM en 10 μm op respectievelijk adhesiemicroscoopglaasjes (objectglaasjes A) en PEN-membraanglaasjes (objectglaasje B).
- Plaats de objectglaasjes gedurende 2 uur op een hete plaat van 60 °C.
2. Hematoxyline-eosine-kleuring
- Plaats objectglaasjes A en B gedurende 10 minuten in xyleen (LET OP) en herhaal deze stap driemaal.
- Hydrateer A en B in gesorteerde ethanoloplossingen in de orde van grootte van 100%, 100%, 90%, 80% en 70% gedurende 1 minuut in elke concentratie.
- Plaats objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrapuur gedestilleerd water
- Plaats objectglaasjes A en B gedurende 90 s in Harris hematoxyline-kleurstofoplossing.
- Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
- Plaats objectglaasjes A en B gedurende 2 s in div-hematoxyline-oplossing (VOORZICHTIG).
- Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
- Plaats de objectglaasjes in A en B in 1% re-blue oplossing gedurende 2 s.
- Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
- Plaats de objectglaasjes gedurende 2 s in eosine-oplossing.
- Leg de objectglaasjes A en B gedurende 30 seconden in ultrazuiver gedestilleerd water en herhaal deze stap driemaal.
- Dehydrateer de objectglaasjes in gesorteerde ethanoloplossingen in de orde van grootte van 70%, 80%, 90%, 100% en 100% gedurende 2 s in elke concentratie.
- Plaats dia A gedurende 3 minuten in xyleen en herhaal deze stap twee keer.
- Voeg een druppel montagemedium (LET OP) toe aan dia A en dek het af met een afdekglas.
3. Observatie van histologische morfologie en laseropname microdissectie
- Start het lasermicrodissectiesysteem en de software (Figuur 2).
- Plaats objectglaasje A op de objectglaasje en observeer de histologische morfologie om het interessegebied voor lasermicrodissectie te identificeren.
- Verwijder dia A en plaats dia B omgekeerd op de objectglaas.
- Klik op de knop Lossen (Figuur 2) om het opvangapparaat naar buiten te duwen. Steek een polymerasekettingreactie (PCR)-buis in het opvangapparaat en zorg ervoor dat de buis vast wordt gehouden. Klik op de knop OK (Figuur 3).
- Selecteer een dop door op de corresponderende rode cirkel te klikken die het verzamelapparaat markeert: buisdoppen. De geselecteerde cirkel wordt groen.
- Klik op de knop Tekenen en de knop Tekenen + knippen en gebruik de muis om het interessegebied te schetsen.
- Klik op de Start Cut knop om het interessegebied vast te leggen; het gevangen monster wordt opgevangen door de dop (Figuur 4).
- Klik op de knop Omlaag om ervoor te zorgen dat het gevangen monster wordt verzameld (Figuur 5).
- Klik op de knop Specimen om het volgende monster vast te leggen.
- Klik op de knop Lossen om de PCR-buis met het opgevangen monster te ontladen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Door lasermicrodissectie van OSF-weefsels uit te voeren, hebben we monsters genomen van dysplastisch epitheel, stroma onder het dysplastische epitheel, atrofisch epitheel en stroma onder atrofisch epitheelweefsel (Figuur 1). Door DNA te extraheren en sequencing van het hele genoom met een lage diepte, waren we in staat om morfologie-gerelateerde veranderingen in het aantal kopieën (CNA) te analyseren15. CNA is een veel voorkomende vorm van genomische instabiliteit die gepaard gaat met een verhoogd risico op kwaadaardige transformatie bij OPMD15,16. We ontdekten verschillende CNA-patronen tussen vier soorten monsters. Zoals te zien is in figuur 6, was CNA aanwezig in epitheelmonsters, maar niet in stromamonsters. Hoewel de monsters afkomstig waren van dezelfde patiënt, was het CNA-patroon in het dysplastische epitheel niet hetzelfde als dat in het atrofische epitheel. CNA in chromosomen 3 en 8 werd gedetecteerd in dysplastisch epitheel, terwijl CNA met een lagere frequentie werd gedetecteerd in chromosoom 8 in atrofisch epitheel.
Figuur 1: Het schema van laseropname microdissectie van orale submuceuze fibrosemonsters. De weefsels van epitheel en stroma met verschillende patronen worden met een laser onder een microscoop vastgelegd. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Software voor lasermicrodissectie. Een screenshot van de software met het live-paneel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Afbeelding 3: Venster van het verzamelapparaat. Een schermafbeelding van de software met het venster van het verzamelapparaat voor het selecteren van het verzamelapparaat. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Vastleggen van de steekproef in het interessegebied. Als u op de knop Start Cut klikt, kunt u het interessegebied vastleggen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gevangen monster. Het opgevangen monster is te zien in de dop van de PCR-buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Wijzigingen in het aantal kopieën. De representatieve resultaten van verschillende patronen van wijzigingen in het aantal kopieën tussen verschillende steekproeven. Er zijn verschillende veranderingen in het aantal kopieën tussen dysplastisch epitheel en atrofisch epitheel. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit protocol rapporteerde een pijplijn om OSF-weefselmonsters vast te leggen met morfologische en ruimtelijke informatie voor verdere ruimtelijk-omische analyses door middel van lasermicrodissectie. Op basis van de representatieve resultaten identificeerden we verschillende CNA-patronen tussen verschillende morfologiegerelateerde monsters.
OSF, een type OPMD, is een veel voorkomende precancereuze aandoening van oraal plaveiselcelcarcinoom6. Er is gemeld dat genomische instabiliteit geassocieerd is met de ontwikkeling en kwaadaardige transformatie van OPMD17,18. Meerdere onderzoeken hebben chromosoomveranderingen, differentiële genexpressie en epigenetische variaties gerapporteerd die verband houden met de progressie en kwaadaardige transformatie van OSF uit genomics-, transcriptomics- en proteomics-gegevens 19,20,21,22,23,24. De kankerverwekkende componenten van arecanoot, zoals arecoline, leidden niet alleen tot de ontwikkeling van OSF, maar de langdurige stimulatie induceerde ook de senescentie van fibroblasten en EMT en de continue productie van reactieve zuurstofsoorten (ROS), wat resulteerde in kwaadaardige transformatie door het reguleren van de immuunmicro-omgeving en signaalroutes zoals TGF-β- en NF-KB-signalen5, 10,21. Zowel abnormale epitheliale als stromale histologische veranderingen zijn echter aanwezig in OSF-weefsels, en welke weefsel- of cellulaire veranderingen de kwaadaardige transformatie in OSF veroorzaken, blijft onduidelijk. Eerdere studies hebben meestal gebruik gemaakt van bulksequencing-analyses, waarbij DNA of RNA uit een blok weefsel werd geëxtraheerd om de moleculaire expressie en betrokken routes verder te analyseren. Deze analyse miste echter een morfologische correlatie met histologie en negeerde de heterogeniteit binnen het weefsel; Bovendien kan met deze benadering niet worden vastgesteld of er differentiële moleculaire veranderingen zijn in verschillende histologische gebieden.
Recente studies hebben ruimtelijke-omics-analyse bij veel ziekten gerapporteerd11,13,25. Door middel van nauwkeurige spatial-omics-analyse worden steeds meer moleculen en doelwitten ontdekt en worden cellulaire interacties en clustering opgehelderd11,12,13. Er is echter nog steeds een gebrek aan ruimtelijk opgeloste omics-analyse van OSF. OSF-monsters werden meestal genomen uit biopsieën van mondslijmvlies en werden bereid als kleine hoeveelheden formaline-gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters, waardoor het moeilijk was om single-cell spatial omics-sequencing uit te voeren, waarvoor grote monsters nodig zijn. Daarom kan de ontwikkeling van methoden met ruimtelijke resolutie met behulp van in formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde monsters een aanzienlijk voordeel zijn. We verwachten dat het huidige protocol ten goede zal komen aan onderzoekers die werken aan OSF en andere vormen van OPMD en zal bijdragen aan het begrijpen van de mechanismen van de ontwikkeling en kwaadaardige transformatie van OPMD.
Deze methode heeft enkele beperkingen. Ten eerste werd het protocol uitgevoerd met behulp van in formaline gefixeerde paraffine-ingebedde monsters, waardoor het moeilijk was om RNA te extraheren voor sequencing-analyse; morfologiegerelateerde RNA-sequencinganalyse kan echter worden uitgevoerd bij gebruik van kristallijne violette kleuring en het handhaven van aseptische praktijken15,26. De momenteel vastgelegde monsters kunnen niet voldoen aan het niveau van de resolutie van één cel, omdat wanneer het aantal cellen te klein is, de cellen kunnen worden afgebroken door de laserstraal, wat de DNA-extractie beïnvloedt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen sprake is van belangenverstrengeling.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door onderzoekssubsidies van de National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates van het Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
