בידוד תאים עם מידע מורפולוגי ומרחבי מדגימות פיברוזיס תת-רירית דרך הפה באמצעות מיקרודיסקציה לכידת לייזר

Summary

לכידת לייזר microdissection של רקמות פיברוזיס submucous הפה מאפשר מיצוי מדויק של תאים מאזורים היסטולוגיים של עניין לניתוח של נתונים multi-omics עם מידע מורפולוגי ומרחבי.

Abstract

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא סוג נפוץ של הפרעה שעלולה להיות ממאירה בחלל הפה. ניוון אפיתל ופיברוזיס של lamina propria ואת submucosa נמצאים לעתים קרובות על שקופיות היסטופתולוגיות. דיספלסיה אפיתליאלית, ניוון אפיתל ופיברובלסטים מזדקנים הוצעו כקשורים לשינוי ממאיר של OSF. עם זאת, בגלל ההטרוגניות של הפרעות אוראליות שעלולות להיות ממאירות וקרצינומה של תאי קשקש אוראליים, קשה לזהות את המנגנונים המולקולריים הספציפיים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF. כאן, אנו מציגים שיטה להשגת מספר קטן של תאים אפיתליאליים או מזנכימליים הנושאים נתונים מורפולוגיים ומידע מרחבי על ידי לכידת לייזר microdissection על שקופיות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין. באמצעות מיקרוסקופ, אנו יכולים ללכוד במדויק מיקרוסקאלה (~ 500 תאים) רקמת אפיתל דיספלסטית או אטרופית ורקמה תת-אפיתל פיברוטית. ניתן להעריך את התאים שחולצו על ידי ריצוף גנום או שעתוק כדי להשיג נתונים גנומיים ושעתוק עם מידע מורפולוגי ומרחבי. גישה זו מסירה את ההטרוגניות של ריצוף רקמות OSF בתפזורת ואת ההפרעה הנגרמת על ידי תאים באזורים שאינם נגועים, ומאפשרת ניתוח מרחבי מדויק של רקמת OSF.

Introduction

פיברוזיס תת-רירית אוראלית (OSF) היא מחלה כרונית וחתרנית המתפתחת בעיקר ברירית הבוקאלית וגורמת לפתיחת פה מוגבלת¹. בעוד OSF היא מחלה multifactorial, אגוז ארקה או אגוז betel לעיסה היא הגורם העיקרי של OSF ^2,3. בגלל הרגל גיאוגרפי ספציפי זה, OSF מרוכז בעיקר באוכלוסיות בדרום מזרח ודרום אסיה³. המאפיינים ההיסטולוגיים הנפוצים של OSF כוללים שקיעת קולגן חריגה ברקמת החיבור מתחת לאפיתל רירית הפה, היצרות כלי הדם וחסימה¹. רקמת אפיתל OSF יכולה להציג עם ביטויים של ניוון או hyperplasia ואפילו דיספלסיה כאשר במקביל leukoplakia אוראלי ^4,5.

OSF מוגדר על ידי ארגון הבריאות העולמי כהפרעה פומית פוטנציאלית ממאירה נפוצה (OPMD) המציגה את הפוטנציאל להתקדם לקרצינומה של תאי קשקש אוראליים עם שיעור טרנספורמציה ממאירה של 4%-6%6,7,8,9. המנגנון העומד בבסיס הטרנספורמציה הממאירה של OSF הוא מורכב¹⁰. גדילה חריגה של האפיתל, כולל דיספלזיה וניוון, מגבירה את הפוטנציאל לקרצינוגנזה, ופיברובלסטים מזדקנים בסטרומה עשויים להיות מעורבים בהתקדמות הממאירה של OSF על ידי גרימת מעבר אפיתל-מזנכימלי (EMT) דרך מיני חמצן תגובתי (ROS) ומולקולות אחרות¹⁰.

טכנולוגיות לניתוחים מרחביים-אומיים הפיקו נתונים רב-אומיים עם מידע מורפולוגי ומרחבי שסיפקו תובנות לגבי מנגנוני סרטן^11,12,13. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ללכידת אוכלוסיות תאים הקשורות למורפולוגיה מרקמת OSF משובצת פרפין קבועה פורמלין על ידי מיקרודיסקציה בלייזר. ניתוחים רב-אומיים של דגימות אלה יכולים להתגבר על אתגרים עם הטרוגניות תוך רקמתית ולהגביר את ההבנה של הפתולוגיה המולקולרית והמנגנונים של טרנספורמציה ממאירה ב- OSF¹⁴.

Protocol

מחקר זה אושר על ידי ועדת הביקורת המוסדית של בית הספר ובית החולים של אוניברסיטת פקין. התקבלה הסכמה מדעת מהמטופלים. דגימות הרקמה ששימשו במחקר זה לא זוהו. סכמת המחקר מוצגת באיור 1.

1. הכנת מדגם

1. חתכו רקמות פיברוזיס תת-ריריות אוראליות משובצות פרפין קבועות פורמלין למקטעים רציפים בעובי 3 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר על מיקרוטום.
2. פרשו את המקטעים במים ואז דגו החוצה אל המגלשות. תקן את המקטעים של 3 מיקרומטר ו- 10 מיקרומטר בשקופיות מיקרוסקופ הדבקה (שקופית A) ושקופיות קרום PEN (שקופית B), בהתאמה.
3. הניחו את המגלשות על פלטה חמה בטמפרטורה של 60°C למשך שעתיים.

2. צביעת Hematoxylin-eosin

1. מקם שקופיות A ו- B בקסילן (זהירות) למשך 10 דקות וחזור על שלב זה שלוש פעמים.
2. לחות שקופיות A ו- B בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 100%, 100%, 90%, 80% ו- 70% למשך דקה אחת בכל ריכוז.
3. הניחו מגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות
4. מניחים שקופיות A ו- B בתמיסת צבע המטוקסילין של האריס למשך 90 שניות.
5. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
6. מקם שקופיות A ו- B בתמיסת div-hematoxylin (זהירות) למשך 2 שניות.
7. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
8. מקם שקופיות ב- A ו- B בתמיסת 1% כחול מחדש למשך 2 שניות.
9. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
10. מניחים שקופיות בתמיסת eosin למשך 2 שניות.
11. הניחו את המגלשות A ו-B במים מזוקקים טהורים במיוחד למשך 30 שניות וחזרו על שלב זה שלוש פעמים.
12. יש לייבש את השקופיות בתמיסות אתנול מדורגות בסדר גודל של 70%, 80%, 90%, 100% ו-100% עבור 2 שניות בכל ריכוז.
13. הניחו את שקופית A בקסילן למשך 3 דקות וחזרו על שלב זה פעמיים.
14. הוסף טיפה של אמצעי הרכבה (זהירות) כדי להחליק A ולכסות אותו בזכוכית כיסוי.

3. תצפית על מורפולוגיה היסטולוגית ומיקרודיסקציה לכידת לייזר

1. הפעל את מערכת המיקרודיסקציה של הלייזר ואת התוכנה (איור 2).
2. מקם את שקופית A על במת השקופיות והתבונן במורפולוגיה ההיסטולוגית כדי לזהות את אזור העניין למיקרודיסקציה בלייזר.
3. הסר את שקופית א' ומקם את שקופית ב' הפוך על במת השקופים.
4. לחצו על הלחצן Unload (איור 2) כדי לדחוף החוצה את התקן האיסוף. הכנס צינור תגובת שרשרת פולימראז (PCR) להתקן האיסוף וודא שהצינור מוחזק קבוע. לחצו על הלחצן OK (איור 3).
5. בחר מכסה על-ידי לחיצה על העיגול האדום המתאים המסמן את התקן האספן: מכסי צינורות. העיגול שנבחר יהפוך לירוק.
6. לחץ על לחצן צייר וצייר + גזור כפתור והשתמש בעכבר כדי לשרטט את תחום העניין.
7. לחץ על התחל גזירה כפתור כדי ללכוד את אזור העניין; הדגימה שתילכד תיאסף על-ידי הכובע (איור 4).
8. לחץ על הלחצן התחתון כדי לוודא שהדגימה שנלכדה נאספת (איור 5).
9. לחץ על לחצן הדגימה כדי ללכוד את הדגימה הבאה.
10. לחץ על Unload כפתור לפריקת צינור ה- PCR עם הדגימה שנתפסה.

Representative Results

על-ידי ביצוע מיקרודיסקציה בלייזר של רקמות OSF, לכדנו דגימות של אפיתל דיספלסטי, סטרומה מתחת לאפיתל דיספלסטי, אפיתל אטרופי וסטרומה מתחת לרקמת אפיתל אטרופית (איור 1). באמצעות חילוץ דנ"א וריצוף גנום שלם בעומק נמוך, הצלחנו לנתח שינויים הקשורים למורפולוגיה של מספרי העתקים (CNA)¹⁵. CNA היא צורה נפוצה של חוסר יציבות גנומית הקשורה לסיכון מוגבר לשינוי ממאיר ב- OPMD^15,16. זיהינו דפוסי CNA שונים בין ארבעה סוגים של דגימות. כפי שניתן לראות באיור 6, CNA היה נוכח בדגימות אפיתל אך לא בדגימות סטרומה. למרות שהדגימות הגיעו מאותו חולה, דפוס CNA באפיתל הדיפלסטי לא היה זהה לזה שבאפיתל האטרופי. CNA בכרומוזומים 3 ו-8 זוהה באפיתל דיספלסטי, ואילו CNA זוהה בתדירות נמוכה יותר בכרומוזום 8 באפיתל אטרופי.

איור 1: סכימת לכידת לייזר של מיקרודיסקציה של דגימות פיברוזיס תת-ריריות דרך הפה. רקמות אפיתל וסטרומה עם דפוסים שונים נלכדים על ידי לייזר תחת מיקרוסקופ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: תוכנת מיקרודיסקציה בלייזר. צילום מסך של התוכנה המציג את הפאנל החי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: חלון התקן אספן. צילום מסך של התוכנה המציג את חלון התקן האספן לבחירת התקן האיסוף. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: לכידת הדגימה בתחום העניין. לחיצה על כפתור התחל גזירה תאפשר לכידת תחום העניין. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 5: מדגם שנלכד. ניתן לראות את הדגימה שנלכדה במכסה של צינור ה- PCR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 6: העתקת שינויים במספר. התוצאות המייצגות של דפוסים שונים של שינויים במספר העותקים בין מדגמים שונים. ישנם שינויים שונים במספר ההעתקה בין אפיתל דיספלסטי לבין אפיתל אטרופי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Discussion

פרוטוקול זה דיווח על צינור ללכידת דגימות רקמת OSF עם מידע מורפולוגי ומרחבי לניתוחים מרחביים-אומיים נוספים באמצעות מיקרודיסקציה בלייזר. מהתוצאות המייצגות, זיהינו דפוסי CNA שונים בקרב דגימות שונות הקשורות למורפולוגיה.

OSF, סוג של OPMD, הוא מצב טרום סרטני נפוץ של קרצינומה של תאי קשקש אוראליים⁶. דווח כי חוסר יציבות גנומית קשורה להתפתחות וטרנספורמציה ממאירה של OPMD^17,18. מחקרים רבים דיווחו על שינויים בכרומוזומים, ביטוי גנים דיפרנציאלי ושינויים אפיגנטיים הקשורים להתקדמות וטרנספורמציה ממאירה של OSF מנתוני גנומיקה, שעתוק ופרוטאומיקה 19,20,21,22,23,24. המרכיבים המסרטנים של אגוז ארקה, כגון ארקולין, לא רק הובילו לפיתוח OSF, אלא שהגירוי ארוך הטווח גם גרם להזדקנות של פיברובלסטים ו- EMT וייצור מתמשך של מיני חמצן תגובתי (ROS), ובכך הביא לשינוי ממאיר על ידי ויסות המיקרו-סביבה החיסונית ומסלולי אותות כגון TGF-β ואותות NF-κB^{5, 10,21}. עם זאת, הן שינויים אפיתליאליים חריגים והן שינויים היסטולוגיים סטרומליים קיימים ברקמות OSF, ואילו שינויים רקמתיים או תאיים מניעים את השינוי הממאיר ב- OSF נותר לא ברור. מחקרים קודמים השתמשו בעיקר בניתוחי ריצוף בתפזורת, שבהם DNA או RNA הופק מגוש רקמה כדי לנתח עוד יותר את הביטוי המולקולרי ואת המסלולים המעורבים. עם זאת, ניתוח זה היה חסר מתאם מורפולוגי עם היסטולוגיה והתעלם מההטרוגניות התוך-רקמתית; יתר על כן, גישה זו אינה יכולה לזהות אם קיימים שינויים מולקולריים דיפרנציאליים באזורים היסטולוגיים שונים.

מחקרים אחרונים דיווחו על ניתוח מרחבי-אומי במחלות רבות^11,13,25. באמצעות ניתוח מרחבי-אומי מדויק, מתגלים מספר גדל והולך של מולקולות ומטרות, ואינטראקציות תאיות ואשכולות מתבררים^11,12,13. עם זאת, עדיין חסר ניתוח אומיקס פתור מרחבית של OSF. דגימות OSF נלקחו בדרך כלל מביופסיות של רירית הפה והוכנו ככמויות קטנות של דגימות קבועות פורמלין, משובצות פרפין, מה שמקשה על ביצוע ריצוף אומיקס מרחבי חד-תאי, המצריך דגימות גדולות. לכן, פיתוח שיטות ברזולוציה מרחבית באמצעות דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין עשוי להיות יתרון משמעותי. אנו מצפים שהפרוטוקול הנוכחי יועיל לחוקרים העובדים על OSF וסוגים אחרים של OPMD ויתרום להבנת מנגנוני הפיתוח והטרנספורמציה הממאירה של OPMD.

לשיטה זו יש כמה מגבלות. ראשית, הפרוטוקול בוצע באמצעות דגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין, מה שהקשה על חילוץ RNA לניתוח ריצוף; עם זאת, ניתן לבצע ניתוח ריצוף RNA הקשור למורפולוגיה בעת שימוש בצביעה סגולה גבישית ושמירה על פרקטיקות אספטיות ^15,26. הדגימות שנלכדו כעת לא יכלו לעמוד ברמת הרזולוציה של תא בודד מכיוון שכאשר מספר התאים קטן מדי, התאים עלולים להתפרק על ידי קרן הלייזר, מה שמשפיע על מיצוי ה- DNA.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adhesion microscope slides	CITOTEST	REF.188105
Div-haematoxylin	YiLi	20230326
Eosin solution	BASO	BA4098
Ethanol	PEKING REAGENT	No.32061
Harris hematoxylin dye solution	YiLi	20230326
Hot plate	LEICA	HI1220
Laser capture microdissection system	LEICA	LMD7	Machine
Laser microdissection microsystem	LEICA	8.2.3.7603	Software
Micromount mounting medium	LEICA	REF.3801731
Microscope cover glass	CITOTEST	REF.10212450C
Microtome	LEICA	RM2235
PCR tubes	AXYGEN	16421959
PEN-membrane slides	LEICA	No.11505158
Re-blue solution	YiLi	20230326
Ultrapure distilled water	Invitrogen	REF.10977-015
Xylene	PEKING REAGENT	No.33535