Summary
मौखिक सबम्यूकस फाइब्रोसिस ऊतकों का लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन रूपात्मक और स्थानिक जानकारी के साथ बहु-ओमिक्स डेटा के विश्लेषण के लिए रुचि के हिस्टोलॉजिकल क्षेत्रों से कोशिकाओं के सटीक निष्कर्षण की अनुमति देता है।
Abstract
ओरल सबम्यूकस फाइब्रोसिस (ओएसएफ) मौखिक गुहा में संभावित घातक विकार का एक सामान्य प्रकार है। लैमिना प्रोप्रिया और सबम्यूकोसा के एपिथेलियम और फाइब्रोसिस के शोष अक्सर हिस्टोपैथोलॉजिकल स्लाइड पर पाए जाते हैं। एपिथेलियल डिस्प्लेसिया, एपिथेलियल एट्रोफी और सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट को ओएसएफ के घातक परिवर्तन से जुड़े होने का प्रस्ताव दिया गया है। हालांकि, संभावित घातक मौखिक विकारों और मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा की विविधता के कारण, ओएसएफ में घातक परिवर्तन के विशिष्ट आणविक तंत्र की पहचान करना मुश्किल है। यहां, हम फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ऊतक स्लाइड पर लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा रूपात्मक डेटा और स्थानिक जानकारी ले जाने वाले उपकला या मेसेनकाइमल कोशिकाओं की एक छोटी संख्या प्राप्त करने के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं। माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, हम माइक्रोस्केल (~ 500 कोशिकाओं) डिस्प्लास्टिक या एट्रोफिक उपकला ऊतक और फाइब्रोटिक उपकला ऊतक को ठीक से पकड़ सकते हैं। निकाले गए कोशिकाओं का मूल्यांकन जीनोम या ट्रांसस्क्रिप्टम अनुक्रमण द्वारा रूपात्मक और स्थानिक जानकारी के साथ जीनोमिक और ट्रांसक्रिप्टोमिक डेटा प्राप्त करने के लिए किया जा सकता है। यह दृष्टिकोण थोक ओएसएफ ऊतक अनुक्रमण की विषमता और गैर-घाव वाले क्षेत्रों में कोशिकाओं के कारण हस्तक्षेप को हटा देता है, जिससे ओएसएफ ऊतक के सटीक स्थानिक-ओमिक्स विश्लेषण की अनुमति मिलती है।
Introduction
ओरल सबम्यूकस फाइब्रोसिस (ओएसएफ) एक पुरानी, कपटी बीमारी है जो मुख्य रूप से म्यूकोसा म्यूकोसा में विकसित होती है और इसके परिणामस्वरूप प्रतिबंधितमुंह खुलता है। जबकि ओएसएफ एक बहुक्रियाशील बीमारी है, सुपारी या सुपारी चबाना ओएसएफ 2,3 का मुख्य कारण है। भौगोलिक रूप से विशिष्ट इस आदत के कारण, ओएसएफ मुख्य रूप से दक्षिण पूर्व औरदक्षिण एशिया में आबादी में केंद्रित है। ओएसएफ की सामान्य हिस्टोलॉजिकल विशेषताओं में मौखिक म्यूकोसल एपिथेलियम के नीचे संयोजी ऊतक में असामान्य कोलेजन जमाव, संवहनी स्टेनोसिस और रोड़ा1 शामिल हैं। ओएसएफ उपकला ऊतक मौखिक ल्यूकोप्लाकिया 4,5 के साथ सहवर्ती होने पर शोष या हाइपरप्लासिया और यहां तक कि डिस्प्लेसिया की अभिव्यक्तियों के साथ उपस्थित हो सकता है।
ओएसएफ को विश्व स्वास्थ्य संगठन द्वारा एक सामान्य मौखिक संभावित घातक विकार (ओपीएमडी) के रूप में परिभाषित किया गया है जो 4% -6% 6,7,8,9 की घातक परिवर्तन दर के साथ मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा में प्रगति की क्षमता प्रदर्शित करता है। ओएसएफ के घातक परिवर्तन को अंतर्निहित तंत्र जटिल10 है। एपिथेलियम की असामान्य वृद्धि, जिसमें डिस्प्लेसिया और शोष दोनों शामिल हैं, कार्सिनोजेनेसिस की क्षमता को बढ़ाता है, और स्ट्रोमा में सेनेसेंट फाइब्रोब्लास्ट प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) औरअन्य अणुओं के माध्यम से उपकला-मेसेनकाइमल संक्रमण (ईएमटी) को प्रेरित करके ओएसएफ की घातक प्रगति में शामिल हो सकते हैं।
स्थानिक-ओमिक विश्लेषण के लिए प्रौद्योगिकियों ने रूपात्मक और स्थानिक जानकारी के साथ बहु-ओमिक डेटा उत्पन्न किया है जिसने कैंसर तंत्र11,12,13 में अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यहां, हम लेजर माइक्रोडिसेक्शन द्वारा फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड ओएसएफ ऊतक से आकृति विज्ञान से संबंधित सेल आबादी को पकड़ने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। इन नमूनों के बहु-ओमिक विश्लेषण इंट्राटिशू विषमता के साथ चुनौतियों को दूर कर सकते हैं और ओएसएफ14 में आणविक विकृति और घातक परिवर्तन के तंत्र की समझ बढ़ा सकते हैं।
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Protocol
इस अध्ययन को पेकिंग यूनिवर्सिटी स्कूल और अस्पताल के संस्थागत समीक्षा बोर्ड द्वारा अनुमोदित किया गया था। रोगियों से सूचित सहमति प्राप्त की गई थी। इस अध्ययन में उपयोग किए गए ऊतक के नमूनों की पहचान नहीं की गई थी। अध्ययन योजना चित्र 1 में दिखाया गया है।
1. नमूना तैयार करना
- फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड मौखिक सबम्यूकस फाइब्रोसिस ऊतकों को माइक्रोटोम पर 3 μm और 10 μm मोटाई के निरंतर वर्गों में काटें।
- पानी में अनुभागों को उजागर करें और फिर स्लाइड्स पर मछली पकड़ें। आसंजन माइक्रोस्कोप स्लाइड (स्लाइड ए) और पेन-झिल्ली स्लाइड (स्लाइड बी) पर क्रमशः 3 μM और 10 μm अनुभाग ों को ठीक करें।
- स्लाइड्स को 2 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म प्लेट पर रखें।
2. हेमटोक्सिलिन-इओसिन धुंधला होना
- स्लाइड ए और बी को 10 मिनट के लिए जाइलीन (सावधानी) में रखें और इस चरण को तीन बार दोहराएं।
- प्रत्येक सांद्रता में 1 मिनट के लिए 100%, 100%, 90%, 80%, और 70% के क्रम में वर्गीकृत इथेनॉल समाधानों में हाइड्रेट स्लाइड ए और बी।
- स्लाइड ए और बी को अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड वाटर में 30 सेकंड के लिए रखें
- 90 सेकंड के लिए हैरिस हेमटोक्सीलिन डाई समाधान में स्लाइड ए और बी रखें।
- स्लाइड ए और बी को अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड वॉटर में 30 सेकंड के लिए रखें और इस चरण को तीन बार दोहराएं।
- स्लाइड ए और बी को 2 सेकंड के लिए डिव-हेमटोक्सीलिन समाधान (सावधानी) में रखें।
- स्लाइड ए और बी को अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड वॉटर में 30 सेकंड के लिए रखें और इस चरण को तीन बार दोहराएं।
- A और B में स्लाइड्स को 2 सेकंड के लिए 1% पुन: नीले घोल में रखें।
- स्लाइड ए और बी को अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड वॉटर में 30 सेकंड के लिए रखें और इस चरण को तीन बार दोहराएं।
- 2 सेकंड के लिए ईओसिन समाधान में स्लाइड रखें।
- स्लाइड ए और बी को अल्ट्राप्योर डिस्टिल्ड वॉटर में 30 सेकंड के लिए रखें और इस चरण को तीन बार दोहराएं।
- प्रत्येक एकाग्रता में 2 एस के लिए 70%, 80%, 90%, 100%, और 100% के क्रम में वर्गीकृत इथेनॉल समाधानों में स्लाइड को निर्जलित करें।
- स्लाइड ए को 3 मिनट के लिए जाइलीन में रखें और इस चरण को दो बार दोहराएं।
- स्लाइड ए के लिए माउंटिंग मीडियम (सावधानी) की एक बूंद जोड़ें और इसे कवर ग्लास के साथ कवर करें।
3. हिस्टोलॉजिकल आकृति विज्ञान और लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन का अवलोकन
- लेजर माइक्रोडिसेक्शन सिस्टम और सॉफ्टवेयर शुरू करें (चित्रा 2)।
- स्लाइड स्टेज पर स्लाइड ए रखें और लेजर माइक्रोडिसेक्शन के लिए रुचि के क्षेत्र की पहचान करने के लिए हिस्टोलॉजिकल आकृति विज्ञान का निरीक्षण करें।
- स्लाइड A को निकालें और स्लाइड B को स्लाइड स्टेज पर व्युत्क्रम में रखें।
- संग्रह डिवाइस को बाहर धकेलने के लिए अनलोड बटन (चित्रा 2) पर क्लिक करें। संग्रह डिवाइस में एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) ट्यूब डालें और सुनिश्चित करें कि ट्यूब को ठीक रखा गया है। ठीक बटन क्लिक करें (चित्रा 3).
- कलेक्टर डिवाइस: ट्यूब कैप्स को चिह्नित करने वाले संबंधित लाल सर्कल पर क्लिक करके कैप का चयन करें। चयनित वृत्त हरा हो जाएगा.
- ड्रा बटन और ड्रा + कट बटन पर क्लिक करें और रुचि के क्षेत्र को स्केच करने के लिए माउस का उपयोग करें।
- रुचि के क्षेत्र को पकड़ने के लिए स्टार्ट कट बटन पर क्लिक करें; कैप्चर किए गए नमूने को कैप द्वारा एकत्र किया जाएगा (चित्रा 4)।
- यह सुनिश्चित करने के लिए निचले बटन पर क्लिक करें कि कैप्चर किया गया नमूना एकत्र किया गया है (चित्रा 5)।
- अगला नमूना कैप्चर करने के लिए नमूना बटन क्लिक करें।
- कैप्चर किए गए नमूने के साथ पीसीआर ट्यूब को अनलोड करने के लिए अनलोड बटन पर क्लिक करें।
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Representative Results
ओएसएफ ऊतकों के लेजर माइक्रोडिसेक्शन करके, हमने डिस्प्लास्टिक एपिथेलियम, डिस्प्लास्टिक एपिथेलियम के नीचे स्ट्रोमा, एट्रोफिक एपिथेलियम और एट्रोफिक एपिथेलियल ऊतक के नीचे स्ट्रोमा के नमूने कैप्चर किए (चित्रा 1)। डीएनए और कम गहराई वाले पूरे जीनोम अनुक्रमण को निकालने के माध्यम से, हम आकृति विज्ञान से संबंधित कॉपी नंबर परिवर्तन (सीएनए) 15 का विश्लेषण करने में सक्षम थे। सीएनए जीनोमिक अस्थिरता का एक सामान्य रूप है जो ओपीएमडी15,16 में घातक परिवर्तन के बढ़ते जोखिम से जुड़ा है। हमने चार प्रकार के नमूनों के बीच विभिन्न सीएनए पैटर्न का पता लगाया। जैसा कि चित्रा 6 में दिखाया गया है, सीएनए उपकला नमूनों में मौजूद था लेकिन स्ट्रोमा नमूनों में नहीं। यद्यपि नमूने एक ही रोगी से उत्पन्न हुए थे, डिस्प्लास्टिक एपिथेलियम में सीएनए पैटर्न एट्रोफिक एपिथेलियम के समान नहीं था। क्रोमोसोम 3 और 8 में सीएनए डिस्प्लास्टिक एपिथेलियम में पाया गया था, जबकि सीएनए को एट्रोफिक एपिथेलियम में क्रोमोसोम 8 में कम आवृत्ति पर पाया गया था।
चित्रा 1: मौखिक सबम्यूकस फाइब्रोसिस नमूनों के लेजर कैप्चर माइक्रोडिसेक्शन की योजना। विभिन्न पैटर्न के साथ एपिथेलियम और स्ट्रोमा के ऊतकों को माइक्रोस्कोप के तहत लेजर द्वारा कैप्चर किया जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 2: लेजर माइक्रोडिसेक्शन सॉफ्टवेयर। लाइव पैनल दिखाने वाले सॉफ़्टवेयर का एक स्क्रीनशॉट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 3: कलेक्टर डिवाइस विंडो। संग्रह डिवाइस का चयन करने के लिए कलेक्टर डिवाइस विंडो दिखाने वाले सॉफ़्टवेयर का एक स्क्रीनशॉट. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्रा 4: रुचि के क्षेत्र में नमूना कैप्चर करना। स्टार्ट कट बटन पर क्लिक करने से रुचि के क्षेत्र को कैप्चर करने की अनुमति मिलेगी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 5: कैप्चर किया गया नमूना। कैप्चर किए गए नमूने को पीसीआर ट्यूब की टोपी में देखा जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
चित्र 6: प्रतिलिपि संख्या परिवर्तन. विभिन्न नमूनों के बीच कॉपी संख्या परिवर्तन के विभिन्न पैटर्न के प्रतिनिधि परिणाम। डिस्प्लास्टिक एपिथेलियम और एट्रोफिक एपिथेलियम के बीच अलग-अलग कॉपी नंबर परिवर्तन हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल ने लेजर माइक्रोडिसेक्शन के माध्यम से आगे स्थानिक-ओमिक विश्लेषण के लिए रूपात्मक और स्थानिक जानकारी के साथ ओएसएफ ऊतक के नमूनों को पकड़ने के लिए एक पाइपलाइन की सूचना दी। प्रतिनिधि परिणामों से, हमने विभिन्न आकृति विज्ञान से संबंधित नमूनों के बीच विभिन्न सीएनए पैटर्न की पहचान की।
ओएसएफ, ओपीएमडी का एक प्रकार, मौखिक स्क्वैमस सेल कार्सिनोमा6 की एक सामान्य प्रीकैंसरस स्थिति है। जीनोमिक अस्थिरता को ओपीएमडी17,18 के विकास और घातक परिवर्तन से जुड़ा बताया गया है। कई अध्ययनों ने जीनोमिक्स, ट्रांसस्क्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्सडेटा 19,20,21,22,23,24 से ओएसएफ की प्रगति और घातक परिवर्तन से जुड़े गुणसूत्र परिवर्तन, अंतर जीन अभिव्यक्ति और एपिजेनेटिक विविधताओं की सूचना दी है।. सुपारी के कार्सिनोजेनिक घटक, जैसे कि एरेकोलिन, ने न केवल ओएसएफ के विकास को जन्म दिया, बल्कि दीर्घकालिक उत्तेजना ने फाइब्रोब्लास्ट और ईएमटी के शिथिलता और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों (आरओएस) के निरंतर उत्पादन को भी प्रेरित किया, जिसके परिणामस्वरूप प्रतिरक्षा माइक्रोएन्वायरमेंट और सिग्नल मार्गों जैसे टीजीएफ -β और एनएफ-3बी सिग्नल5 को विनियमित करके घातक परिवर्तन हुआ। 10,21. हालांकि, ओएसएफ ऊतकों में असामान्य उपकला और स्ट्रोमल हिस्टोलॉजिकल परिवर्तन दोनों मौजूद हैं, और कौन से ऊतक या सेलुलर परिवर्तन ओएसएफ में घातक परिवर्तन को चलाते हैं, यह स्पष्ट नहीं है। पिछले अध्ययनों ने ज्यादातर थोक अनुक्रमण विश्लेषण का उपयोग किया है, जिसमें आणविक अभिव्यक्ति और शामिल मार्गों का विश्लेषण करने के लिए ऊतक के एक ब्लॉक से डीएनए या आरएनए निकाला गया था। हालांकि, इस विश्लेषण में हिस्टोलॉजी के साथ एक रूपात्मक सहसंबंध का अभाव था और इंट्राटिश्यू विषमता को नजरअंदाज कर दिया गया था; इसके अलावा, यह दृष्टिकोण यह पहचान नहीं कर सकता है कि विभिन्न हिस्टोलॉजिकल क्षेत्रों में अंतर आणविक परिवर्तन हैं या नहीं।
हाल के अध्ययनों ने कई बीमारियों में स्थानिक-ओमिक्स विश्लेषण की सूचना दी है11,13,25. सटीक स्थानिक-ओमिक्स विश्लेषण के माध्यम से, अणुओं और लक्ष्यों की बढ़ती संख्या की खोज की जा रही है और सेलुलर इंटरैक्शन और क्लस्टरिंगको स्पष्ट किया जा रहा है। हालांकि, अभी भी ओएसएफ के स्थानिक रूप से हल किए गए ओमिक्स विश्लेषण की कमी है। ओएसएफ नमूने आमतौर पर मौखिक म्यूकोसा की बायोप्सी से लिए गए थे और फॉर्मेलिन-फिक्स्ड, पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों की छोटी मात्रा के रूप में तैयार किए गए थे, जिससे एकल-सेल स्थानिक ओमिक्स अनुक्रमण करना मुश्किल हो जाता है, जिसके लिए बड़े नमूनों की आवश्यकता होती है। इसलिए, फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों का उपयोग करके स्थानिक संकल्प के साथ तरीकों का विकास एक महत्वपूर्ण लाभ हो सकता है। हम उम्मीद करते हैं कि वर्तमान प्रोटोकॉल ओएसएफ और अन्य प्रकार के ओपीएमडी पर काम करने वाले शोधकर्ताओं को लाभान्वित करेगा और ओपीएमडी के विकास और घातक परिवर्तन के तंत्र को समझने में योगदान देगा।
इस विधि की कुछ सीमाएँ हैं। सबसे पहले, प्रोटोकॉल फॉर्मेलिन-फिक्स्ड पैराफिन-एम्बेडेड नमूनों का उपयोग करके किया गया था, जिससे अनुक्रमण विश्लेषण के लिए आरएनए निकालना मुश्किल हो गया; हालांकि, क्रिस्टलीय बैंगनी धुंधला पन का उपयोग करते समय और सड़न रोकनेवाला प्रथाओं को बनाए रखनेके दौरान आकृति विज्ञान से संबंधित आरएनए अनुक्रमण विश्लेषण किया जा सकता है। वर्तमान में कैप्चर किए गए नमूने एकल-कोशिका संकल्प के स्तर को पूरा नहीं कर सकते हैं क्योंकि जब कोशिकाओं की संख्या बहुत कम होती है, तो कोशिकाएं लेजर बीम द्वारा टूट सकती हैं, जिससे डीएनए निष्कर्षण प्रभावित हो सकता है।
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Disclosures
लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।
Acknowledgments
इस काम को चीन के राष्ट्रीय प्रकृति विज्ञान फाउंडेशन (81671006, 81300894), चिकित्सा विज्ञान के लिए सीएएमएस इनोवेशन फंड (2019-आई2एम-5-038), राष्ट्रीय नैदानिक कुंजी अनुशासन निर्माण परियोजना (पीकेयूएसएएसएनकेपी -202102), पेकिंग विश्वविद्यालय स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र (BMU2022BSS001) के उत्कृष्ट डॉक्टरेट उम्मीदवारों के लिए नवाचार निधि से अनुसंधान अनुदान द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
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