Summary
La microdissection par capture laser des tissus de fibrose sous-muqueuse buccale permet d’extraire avec précision des cellules des régions histologiques d’intérêt pour l’analyse de données multi-omiques avec des informations morphologiques et spatiales.
Abstract
La fibrose sous-muqueuse buccale (OSF) est un type courant de trouble potentiellement malin dans la cavité buccale. L’atrophie de l’épithélium et la fibrose de la lamina propria et de la sous-muqueuse sont souvent retrouvées sur les lames histopathologiques. Il a été proposé que la dysplasie épithéliale, l’atrophie épithéliale et les fibroblastes sénescents soient associés à la transformation maligne de l’OSF. Cependant, en raison de l’hétérogénéité des maladies buccales potentiellement malignes et du carcinome épidermoïde buccal, il est difficile d’identifier les mécanismes moléculaires spécifiques de la transformation maligne dans l’OSF. Nous présentons ici une méthode permettant d’obtenir un petit nombre de cellules épithéliales ou mésenchymateuses portant des données morphologiques et des informations spatiales par microdissection à capture laser sur des lames de tissus enrobés de paraffine fixées au formol. À l’aide d’un microscope, nous pouvons capturer avec précision le tissu épithélial dysplasique ou atrophique à l’échelle microscopique (~500 cellules) et le tissu sous-épithélial fibrotique. Les cellules extraites peuvent être évaluées par séquençage du génome ou du transcriptome afin d’acquérir des données génomiques et transcriptomiques avec des informations morphologiques et spatiales. Cette approche élimine l’hétérogénéité du séquençage tissulaire OSF en vrac et l’interférence causée par les cellules dans les zones non lésionnelées, ce qui permet une analyse spatio-omique précise des tissus OSF.
Introduction
La fibrose sous-muqueuse buccale (OSF) est une maladie chronique et insidieuse qui se développe principalement dans la muqueuse buccale et entraîne une ouverture de la bouche restreinte1. Alors que l’OSF est une maladie multifactorielle, la mastication de la noix d’arec ou de la noix de bétel est la principale cause d’OSF 2,3. En raison de cette habitude géographiquement spécifique, l’OSF est principalement concentrée dans les populations d’Asie du Sud-Est et d’Asie du Sud3. Les caractéristiques histologiques communes de l’OSF comprennent un dépôt anormal de collagène dans le tissu conjonctif sous l’épithélium de la muqueuse buccale, une sténose vasculaire et une occlusion1. Le tissu épithélial OSF peut présenter des manifestations d’atrophie ou d’hyperplasie et même de dysplasie lorsqu’il est concomitant avec une leucoplasie buccale 4,5.
L’OSF est définie par l’Organisation mondiale de la santé comme une maladie buccale potentiellement maligne (MPPO) courante qui présente le potentiel d’évoluer vers un carcinome épidermoïde de la bouche avec un taux de transformation maligne de 4 % à 6 %6,7,8,9. Le mécanisme sous-jacent à la transformation maligne de l’OSF est complexe10. Une croissance anormale de l’épithélium, y compris la dysplasie et l’atrophie, augmente le potentiel de cancérogenèse, et les fibroblastes sénescents du stroma peuvent être impliqués dans la progression maligne de l’OSF en induisant une transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) par l’intermédiaire d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et d’autres molécules10.
Les technologies d’analyse spatio-omique ont généré des données multi-omiques avec des informations morphologiques et spatiales qui ont permis de mieux comprendre les mécanismes du cancer11,12,13. Ici, nous présentons un protocole pour capturer des populations cellulaires liées à la morphologie à partir de tissus OSF fixés au formol et enrobés de paraffine par microdissection laser. Les analyses multi-omiques de ces échantillons peuvent surmonter les défis liés à l’hétérogénéité intratissulaire et améliorer la compréhension de la pathologie moléculaire et des mécanismes de la transformation maligne dans l’OSF14.
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Protocol
Cette étude a été approuvée par le comité d’examen institutionnel de l’école et de l’hôpital de l’Université de Pékin. Le consentement éclairé des patients a été obtenu. Les échantillons de tissus utilisés dans cette étude ont été anonymisés. Le schéma d’étude est illustré à la figure 1.
1. Préparation de l’échantillon
- Couper des tissus de fibrose sous-muqueuse buccale enrobés de paraffine fixés au formol en sections continues de 3 μm et 10 μm d’épaisseur sur un microtome.
- Dépliez les sections dans l’eau, puis pêchez sur les toboggans. Fixez les sections de 3 μM et 10 μm sur les lames de microscope à adhérence (diapositive A) et les lames à membrane PEN (diapositive B), respectivement.
- Placez les lames sur une plaque chauffante à 60 °C pendant 2 h.
2. Coloration à l’hématoxyline-éosine
- Placer les lames A et B dans du xylène (ATTENTION) pendant 10 min et répéter cette étape trois fois.
- Hydrater les lames A et B dans des solutions d’éthanol graduées de l’ordre de 100 %, 100 %, 90 %, 80 % et 70 % pendant 1 min à chaque concentration.
- Placer les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s
- Placer les lames A et B dans la solution de colorant à l’hématoxyline Harris pendant 90 s.
- Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
- Placer les lames A et B dans une solution de div-hématoxyline (ATTENTION) pendant 2 s.
- Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
- Placer les lames dans A et B dans une solution rebleue à 1 % pendant 2 s.
- Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
- Placer les lames dans une solution d’éosine pendant 2 s.
- Placez les lames A et B dans de l’eau distillée ultra-pure pendant 30 s et répétez cette étape trois fois.
- Déshydrater les lames dans des solutions d’éthanol graduées de l’ordre de 70 %, 80 %, 90 %, 100 % et 100 % pendant 2 s à chaque concentration.
- Placez la lame A dans le xylène pendant 3 min et répétez cette étape deux fois.
- Ajoutez une goutte de support de montage (ATTENTION) sur la glissière A et couvrez-la d’une vitre de protection.
3. Observation de la morphologie histologique et microdissection par capture laser
- Lancez le système et le logiciel de microdissection laser (Figure 2).
- Placez la lame A sur la platine de la lame et observez la morphologie histologique pour identifier la zone d’intérêt pour la microdissection laser.
- Retirez la diapositive A et placez la diapositive B à l’envers sur la platine de la diapositive.
- Cliquez sur le bouton Décharger (Figure 2) pour sortir le dispositif de collecte. Insérez un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) dans le dispositif de collecte et assurez-vous que le tube est maintenu fixe. Cliquez sur le bouton OK (Figure 3).
- Sélectionnez un bouchon en cliquant sur le cercle rouge correspondant à l’icône Dispositif collecteur : Bouchons de tubes. Le cercle sélectionné deviendra vert.
- Cliquez sur le bouton Dessiner et sur le bouton Dessiner + Couper et utilisez la souris pour esquisser la zone d’intérêt.
- Cliquez sur le bouton Start Cut (Démarrer la coupe ) pour capturer la zone d’intérêt ; l’échantillon prélevé sera prélevé par le bouchon (figure 4).
- Cliquez sur le bouton Lower (Inférieur ) pour vous assurer que l’échantillon capturé est prélevé (Figure 5).
- Cliquez sur le bouton Specimen (Échantillon ) pour capturer l’échantillon suivant.
- Cliquez sur le bouton Décharger pour décharger le tube PCR contenant l’échantillon capturé.
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Representative Results
En effectuant une microdissection laser des tissus OSF, nous avons capturé des échantillons d’épithélium dysplasique, de stroma sous l’épithélium dysplasique, d’épithélium atrophique et de stroma sous le tissu épithélial atrophique (Figure 1). Grâce à l’extraction de l’ADN et au séquençage du génome entier à faible profondeur, nous avons pu analyser les altérations du nombre de copies (CNA) liées à la morphologie15. L’AIC est une forme courante d’instabilité génomique associée à un risque accru de transformation maligne dans l’OPMD15,16. Nous avons détecté différents profils d’AIIC parmi quatre types d’échantillons. Comme le montre la figure 6, le CNA était présent dans les échantillons épithéliaux, mais pas dans les échantillons de stroma. Bien que les échantillons proviennent du même patient, le profil de l’AIIC dans l’épithélium dysplasique n’était pas le même que celui de l’épithélium atrophique. Le CNA dans les chromosomes 3 et 8 a été détecté dans l’épithélium dysplasique, tandis que le CNA a été détecté à une fréquence plus faible dans le chromosome 8 dans l’épithélium atrophique.
Figure 1 : Schéma de microdissection par capture laser d’échantillons de fibrose sous-muqueuse buccale. Les tissus de l’épithélium et du stroma avec des motifs différents sont capturés au laser au microscope. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Logiciel de microdissection laser. Une capture d’écran du logiciel montrant le panneau en direct. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : fenêtre du périphérique collecteur. Une capture d’écran du logiciel montrant la fenêtre du périphérique collecteur pour sélectionner le périphérique collecteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : Capture de l’échantillon dans la zone d’intérêt. Cliquer sur le bouton Démarrer la coupe permettra de capturer la zone d’intérêt. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : Échantillon capturé. L’échantillon capturé peut être vu dans le bouchon du tube PCR. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
Figure 6 : Modifications du nombre de copies. Les résultats représentatifs des différents modèles d’altération du nombre de copies parmi divers échantillons. Il existe différentes altérations du nombre de copies entre l’épithélium dysplasique et l’épithélium atrophique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ce protocole prévoyait la mise en place d’un pipeline permettant de capturer des échantillons de tissus OSF avec des informations morphologiques et spatiales pour d’autres analyses spatio-omiques par microdissection laser. À partir des résultats représentatifs, nous avons identifié différents modèles d’AIIC parmi divers échantillons liés à la morphologie.
L’OSF, un type d’OPMD, est une affection précancéreuse courante du carcinome épidermoïde buccal6. L’instabilité génomique a été associée au développement et à la transformation maligne de l’OPMD17,18. De nombreuses études ont rapporté des altérations chromosomiques, une expression génique différentielle et des variations épigénétiques associées à la progression et à la transformation maligne de l’OSF à partir de données génomiques, transcriptomiques et protéomiques 19,20,21,22,23,24. Les composants cancérigènes de la noix d’arec, tels que l’arécoline, ont non seulement conduit au développement de l’OSF, mais la stimulation à long terme a également induit la sénescence des fibroblastes et de l’EMT et la production continue d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), entraînant ainsi une transformation maligne en régulant le microenvironnement immunitaire et les voies de signalisation telles que les signaux TGF-β et NF-κB5, Débloquer le numéro 10 et 21. Cependant, des changements histologiques épithéliaux et stromaux anormaux sont présents dans les tissus OSF, et les altérations tissulaires ou cellulaires à l’origine de la transformation maligne de l’OSF restent incertaines. Les études précédentes ont principalement utilisé des analyses de séquençage en vrac, dans lesquelles l’ADN ou l’ARN a été extrait d’un bloc de tissu pour analyser plus en détail l’expression moléculaire et les voies impliquées. Cependant, cette analyse manquait de corrélation morphologique avec l’histologie et ignorait l’hétérogénéité intratissulaire ; De plus, cette approche ne permet pas d’identifier s’il existe des altérations moléculaires différentielles dans différentes zones histologiques.
Des études récentes ont fait état d’une analyse spatio-omique dans de nombreuses maladies11,13,25. Grâce à une analyse spatio-omique précise, un nombre croissant de molécules et de cibles sont découvertes et les interactions cellulaires et les clusters sont élucidés11,12,13. Cependant, il y a encore un manque d’analyse omique résolue spatialement de l’OSF. Les échantillons OSF étaient généralement prélevés à partir de biopsies de muqueuse buccale et étaient préparés sous forme de petits volumes d’échantillons fixés au formol et enrobés de paraffine, ce qui rendait difficile le séquençage spatial omique d’une seule cellule, qui nécessite de grands échantillons. Par conséquent, la mise au point de méthodes à résolution spatiale utilisant des échantillons fixés au formol et enrobés de paraffine pourrait être un avantage significatif. Nous nous attendons à ce que le protocole actuel profite aux chercheurs travaillant sur l’OSF et d’autres types d’OPMD et contribue à la compréhension des mécanismes du développement et de la transformation maligne de l’OPMD.
Cette méthode présente certaines limites. Tout d’abord, le protocole a été réalisé à l’aide d’échantillons fixés au formol et enrobés de paraffine, ce qui rend difficile l’extraction de l’ARN pour l’analyse de séquençage ; cependant, l’analyse du séquençage de l’ARN liée à la morphologie peut être effectuée lors de l’utilisation de la coloration au violet cristallin et du maintien de pratiques aseptiques15,26. Les échantillons actuellement capturés ne pouvaient pas atteindre le niveau de résolution d’une seule cellule, car lorsque le nombre de cellules est trop faible, les cellules peuvent être décomposées par le faisceau laser, ce qui affecte l’extraction de l’ADN.
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Disclosures
Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.
Acknowledgments
Ces travaux ont été soutenus par des subventions de recherche de la Fondation nationale des sciences de la nature de Chine (81671006, 81300894), du Fonds d’innovation CAMS pour les sciences médicales (2019-I2M-5-038), du projet national de construction de disciplines cliniques clés (PKUSSNKP-202102), du Fonds d’innovation pour les doctorants exceptionnels du Centre des sciences de la santé de l’Université de Pékin (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
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