Summary
A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.
Abstract
A fibrose submucosa oral (FSO) é um tipo comum de doença potencialmente maligna na cavidade oral. A atrofia do epitélio e a fibrose da lâmina própria e da submucosa são frequentemente encontradas nas lâminas histopatológicas. Displasia epitelial, atrofia epitelial e fibroblastos senescentes têm sido propostos como associados à transformação maligna da FSO. No entanto, devido à heterogeneidade de doenças orais potencialmente malignas e carcinoma epidermóide oral, é difícil identificar os mecanismos moleculares específicos de transformação maligna em FSO. Apresentamos um método para obter um pequeno número de células epiteliais ou mesenquimais carregando dados morfológicos e informações espaciais por microdissecção por captura a laser em lâminas de tecido fixadas em formalina e emblocadas em parafina. Usando um microscópio, podemos capturar precisamente em microescala (~500 células) tecido epitelial displásico ou atrófico e tecido subepitelial fibrótico. As células extraídas podem ser avaliadas por sequenciamento genômico ou transcriptoma para aquisição de dados genômicos e transcriptômicos com informações morfológicas e espaciais. Essa abordagem elimina a heterogeneidade do sequenciamento tecidual de OSF em massa e a interferência causada por células em áreas não lesionadas, permitindo uma análise espacial-ômica precisa do tecido OSF.
Introduction
A fibrose submucosa oral (FSO) é uma doença crônica e insidiosa que se desenvolve principalmente na mucosa bucal e resulta em restrição da aberturabucal1. Enquanto a FSO é uma doença multifatorial, a mastigação da noz de areca ou noz de betel é a principal causa de FSO 2,3. Devido a esse hábito geograficamente específico, a FSO está predominantemente concentrada em populações do Sudeste e Sul da Ásia3. As características histológicas comuns da FSO incluem deposição anormal de colágeno no tecido conjuntivo abaixo do epitélio da mucosa oral, estenose vascular e oclusão1. O tecido epitelial da FSO pode apresentar manifestações de atrofia ou hiperplasia e até displasia quando concomitante à leucoplasiaoral4,5.
A FSO é definida pela Organização Mundial da Saúde como uma doença oral comum potencialmente maligna (DMOP) que apresenta potencial para evoluir para carcinoma epidermóide oral com taxa de transformação maligna de 4%-6%6,7,8,9. O mecanismo subjacente à transformação maligna da FSO é complexo10. O crescimento anormal do epitélio, incluindo tanto displasia quanto atrofia, aumenta o potencial de carcinogênese, e fibroblastos senescentes no estroma podem estar envolvidos na progressão maligna da FSO por induzir a transição epitélio-mesenquimal (TEM) através de espécies reativas de oxigênio (EROs) e outras moléculas10.
Tecnologias para análises espaço-ômicas geraram dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais que forneceram informações sobre os mecanismos do câncer11,12,13. Aqui, apresentamos um protocolo para capturar populações celulares relacionadas à morfologia de tecido OSF fixado em formalina e embebido em parafina por microdissecção a laser. Análises multi-ômicas dessas amostras podem superar desafios com heterogeneidade intratecidual e aumentar a compreensão da patologia molecular e dos mecanismos de transformação maligna em FSO14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Escola e Hospital da Universidade de Pequim. Os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. As amostras de tecido utilizadas neste estudo foram desidentificadas. O esquema do estudo é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da amostra
- Corte tecidos de fibrose oral submucosa fixados em formalina e fixados em parafina em cortes contínuos de 3 μm e 10 μm de espessura em micrótomo.
- Desdobre as seções na água e, em seguida, pesque nos escorregadores. Fixar os cortes de 3 μM e 10 μm nas lâminas do microscópio de adesão (lâmina A) e PEN-membrana (lâmina B), respectivamente.
- Coloque as lâminas numa placa quente a 60 °C durante 2 horas.
2. Coloração hematoxilina-eosina
- Coloque as lâminas A e B em xileno (CUIDADO) por 10 min e repita esta etapa três vezes.
- Hidratar as lâminas A e B em soluções graduadas de etanol da ordem de 100%, 100%, 90%, 80% e 70% por 1 min em cada concentração.
- Coloque as corrediças A e B em água destilada ultrapura por 30 s
- Colocar as lâminas A e B em solução corante de hematoxilina Harris por 90 s.
- Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
- Coloque as lâminas A e B em solução de div-hematoxilina (CUIDADO) por 2 s.
- Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
- Coloque as lâminas em A e B em solução reazul a 1% por 2 s.
- Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
- Coloque as lâminas em solução de eosina por 2 s.
- Coloque as lâminas A e B em água destilada ultrapura por 30 s e repita esta etapa três vezes.
- Desidratar as lâminas em soluções graduadas de etanol da ordem de 70%, 80%, 90%, 100% e 100% por 2 s em cada concentração.
- Coloque o slide A em xileno por 3 min e repita este passo duas vezes.
- Adicione uma gota de meio de montagem (CUIDADO) ao slide A e cubra com um vidro de cobertura.
3. Observação da morfologia histológica e microdissecção por captura a laser
- Iniciar o sistema de microdissecção a laser e o software (Figura 2).
- Coloque a lâmina A no palco da lâmina e observe a morfologia histológica para identificar a área de interesse para microdissecção a laser.
- Remova o slide A e coloque o slide B inversamente no palco do slide.
- Clique no botão Unload (Figura 2) para enviar o dispositivo de coleta. Insira um tubo de reação em cadeia da polimerase (PCR) no dispositivo de coleta e certifique-se de que o tubo seja mantido fixo. Clique no botão OK (Figura 3).
- Selecione uma tampa clicando no círculo vermelho correspondente marcando o Dispositivo coletor: tampas de tubo. O círculo selecionado ficará verde.
- Clique no botão Desenhar e no botão Desenhar + Recortar e use o mouse para esboçar a área de interesse.
- Clique no botão Iniciar Recorte para capturar a área de interesse; a amostra capturada será coletada pela tampa (Figura 4).
- Clique no botão Inferior para garantir que a amostra capturada seja coletada (Figura 5).
- Clique no botão Amostra para capturar a próxima amostra.
- Clique no botão Descarregar para descarregar o tubo de PCR com a amostra capturada.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Através da microdissecção a laser dos tecidos da OSF, foram capturadas amostras de epitélio displásico, estroma abaixo do epitélio displásico, epitélio atrófico e estroma abaixo do tecido epitelial atrófico (Figura 1). Através da extração de DNA e sequenciamento do genoma completo em baixa profundidade, pudemos analisar as alterações no número de cópias relacionadas à morfologia (CNA)15. O CNA é uma forma comum de instabilidade genômica associada a um risco aumentado de transformação maligna na DMOP15,16. Foram detectados diferentes padrões de CNA entre quatro tipos de amostras. Como mostrado na Figura 6, o CNA estava presente nas amostras epiteliais, mas não nas amostras do estroma. Embora as amostras tenham sido originadas do mesmo paciente, o padrão do CNA no epitélio displásico não foi o mesmo do epitélio atrófico. O CNA nos cromossomos 3 e 8 foi detectado no epitélio displásico, enquanto o CNA foi detectado em menor frequência no cromossomo 8 no epitélio atrófico.
Figura 1: Esquema de microdissecção por captura a laser de amostras de fibrose submucosa oral. Os tecidos de epitélio e estroma com diferentes padrões são captados a laser ao microscópio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Software de microdissecção a laser. Uma captura de tela do software mostrando o painel ao vivo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Janela do dispositivo do coletor. Uma captura de tela do software mostrando a janela do dispositivo coletor para selecionar o dispositivo de coleta. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Captura da amostra na área de interesse. Clicar no botão Start Cut permitirá capturar a área de interesse. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Amostra capturada. A amostra capturada pode ser vista na tampa do tubo de PCR. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: Alterações no número da cópia. Os resultados representativos de diferentes padrões de alterações no número de cópias entre várias amostras. Existem diferentes alterações no número de cópias entre o epitélio displásico e o epitélio atrófico. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Este protocolo relatou um pipeline para capturar amostras de tecido OSF com informações morfológicas e espaciais para análises espaço-ômicas adicionais através de microdissecção a laser. A partir dos resultados representativos, identificamos diferentes padrões de CNA entre várias amostras relacionadas à morfologia.
OSF, um tipo de DMOP, é uma condição pré-cancerosa comum do carcinoma epidermóide oral6. A instabilidade genômica tem sido relatada como associada ao desenvolvimento e transformação maligna da DMOP17,18. Múltiplos estudos têm relatado alterações cromossômicas, expressão gênica diferencial e variações epigenéticas associadas à progressão e transformação maligna da FSO a partir de dados genômicos, transcriptômicos e proteômicos19,20,21,22,23,24. Os componentes carcinogênicos da noz de areca, como a arecolina, não só levaram ao desenvolvimento da FSO, mas a estimulação a longo prazo também induziu a senescência de fibroblastos e EMT e a produção contínua de espécies reativas de oxigênio (EROs), resultando em transformação maligna pela regulação do microambiente imune e vias de sinalização como os sinais TGF-β e NF-κB5, 10,21. No entanto, alterações histológicas epiteliais e estromais anormais estão presentes nos tecidos da FSO, e quais alterações teciduais ou celulares conduzem a transformação maligna na FSO ainda não estão claras. Estudos anteriores utilizaram principalmente análises de sequenciamento em massa, nas quais o DNA ou RNA foi extraído de um bloco de tecido para analisar melhor a expressão molecular e as vias envolvidas. No entanto, essa análise não teve correlação morfológica com a histologia e ignorou a heterogeneidade intratecidual; Além disso, essa abordagem não pode identificar se há alterações moleculares diferenciais em diferentes áreas histológicas.
Estudos recentes têm relatado análise espacial-ômica em diversas doenças11,13,25. Através de análises espaço-ômicas precisas, um número crescente de moléculas e alvos está sendo descoberto e interações celulares e agrupamento estão sendo elucidados11,12,13. No entanto, ainda há uma falta de análise ômica espacialmente resolvida da OSF. As amostras de FSO foram geralmente retiradas de biópsias da mucosa oral e preparadas como pequenos volumes de amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina, dificultando a realização do sequenciamento espacial de célula única, que necessita de grandes amostras. Portanto, o desenvolvimento de métodos com resolução espacial utilizando amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina pode ser um benefício significativo. Esperamos que o protocolo atual beneficie os pesquisadores que trabalham com OSF e outros tipos de OPMD e contribua para a compreensão dos mecanismos de desenvolvimento e transformação maligna do OPMD.
Este método tem algumas limitações. Primeiramente, o protocolo foi realizado com amostras fixadas em formalina e incluídas em parafina, dificultando a extração de RNA para análise em sequenciamento; no entanto, a análise de sequenciamento de RNA relacionado à morfologia pode ser realizada quando se utiliza coloração violeta cristalina e manutenção de práticas assépticas15,26. As amostras atualmente capturadas não podem atingir o nível de resolução de célula única porque quando o número de células é muito pequeno, as células podem ser quebradas pelo feixe de laser, afetando a extração de DNA.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
