A microdissecção por captura a laser de tecidos de fibrose submucosa oral permite a extração precisa de células de regiões histológicas de interesse para a análise de dados multi-ômicos com informações morfológicas e espaciais.
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Artigo de método
Isolamento de Células com Informações Morfológicas e Espaciais de Amostras de Fibrose Submucosa Oral por Microdissecção por Captura a Laser
Neste artigo
Resumo
Resumo
A fibrose submucosa oral (FSO) é um tipo comum de doença potencialmente maligna na cavidade oral. A atrofia do epitélio e a fibrose da lâmina própria e da submucosa são frequentemente encontradas nas lâminas histopatológicas. Displasia epitelial, atrofia epitelial e fibroblastos senescentes têm sido propostos como associados à transformação maligna da FSO. No entanto, devido à heterogeneidade de doenças orais potencialmente malignas e carcinoma epidermóide oral, é difícil identificar os mecanismos moleculares específicos de transformação maligna em FSO. Apresentamos um método para obter um pequeno número de células epiteliais ou mesenquimais carregando dados morfológicos e informações espaciais por microdissecção por captura a laser em lâminas de tecido fixadas em formalina e emblocadas em parafina. Usando um microscópio, podemos capturar precisamente em microescala (~500 células) tecido epitelial displásico ou atrófico e tecido subepitelial fibrótico. As células extraídas podem ser avaliadas por sequenciamento genômico ou transcriptoma para aquisição de dados genômicos e transcriptômicos com informações morfológicas e espaciais. Essa abordagem elimina a heterogeneidade do sequenciamento tecidual de OSF em massa e a interferência causada por células em áreas não lesionadas, permitindo uma análise espacial-ômica precisa do tecido OSF.
Introdução
A fibrose submucosa oral (FSO) é uma doença crônica e insidiosa que se desenvolve principalmente na mucosa bucal e resulta em restrição da aberturabucal1. Enquanto a FSO é uma doença multifatorial, a mastigação da noz de areca ou noz de betel é a principal causa de FSO 2,3. Devido a esse hábito geograficamente específico, a FSO está predominantemente concentrada em populações do Sudeste e Sul da Ásia3. As características histológicas comuns da FSO incluem deposição anormal de colágeno no tecido conjuntivo abaixo do epitélio da mucosa oral, estenose vascular e ocl....
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Protocolo
Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa da Escola e Hospital da Universidade de Pequim. Os pacientes assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido. As amostras de tecido utilizadas neste estudo foram desidentificadas. O esquema do estudo é mostrado na Figura 1.
1. Preparação da amostra
- Corte tecidos de fibrose oral submucosa fixados em formalina e fixados em parafina em cortes contínuos de 3 μm e 10 μm de espessura em micrótomo.
- Desdobre as seções na água e, em seguida, pesque nos escorregadores. Fixar os cortes de 3 μM e 10 μm nas lâminas do micro....
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Resultados
Através da microdissecção a laser dos tecidos da OSF, foram capturadas amostras de epitélio displásico, estroma abaixo do epitélio displásico, epitélio atrófico e estroma abaixo do tecido epitelial atrófico (Figura 1). Através da extração de DNA e sequenciamento do genoma completo em baixa profundidade, pudemos analisar as alterações no número de cópias relacionadas à morfologia (CNA)15. O CNA é uma forma comum de instabilidade genômica associada a um risco aumentado .......
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Discussão
Este protocolo relatou um pipeline para capturar amostras de tecido OSF com informações morfológicas e espaciais para análises espaço-ômicas adicionais através de microdissecção a laser. A partir dos resultados representativos, identificamos diferentes padrões de CNA entre várias amostras relacionadas à morfologia.
OSF, um tipo de DMOP, é uma condição pré-cancerosa comum do carcinoma epidermóide oral6. A instabilidade genômica tem sido relatada como associada ao desenvo.......
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Divulgações
Os autores declaram a inexistência de conflitos de interesse.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por bolsas de pesquisa da National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Lâminas de microscópio de adesão | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-hematoxilina | YiLi | 20230326 | |
| Solução de eosina | BASO | BA4098 | |
| Etanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Solução de corante de hematoxilina Harris | YiLi | 20230326 | |
| Placa quente | LEICA | HI1220 | |
| Sistema de microdissecação por captura a laser | LEICA | LMD7 | Máquina |
| Microssistema de microdissecção a laser | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Meio de montagem Micromount | LEICA | REF.3801731 | |
| Vidro de cobertura para microscópio | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Micrótomo | LEICA | RM2235 | |
| Tubos de PCR | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrana corrediças | LEICA | No.11505158 | |
| Solução Re-blue | YiLi | 20230326 | |
| Água destilada ultrapura | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xileno | PEKING REAGENTE | No.33535 |
Referências
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicop....
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Reimpressões e permissões
