Summary
Laserfangstmikrodissektion af oral submucøs fibrosevæv muliggør præcis ekstraktion af celler fra histologiske områder af interesse for analyse af multi-omics-data med morfologisk og rumlig information.
Abstract
Oral submucøs fibrose (OSF) er en almindelig type potentielt ondartet lidelse i mundhulen. Atrofi af epitel og fibrose af lamina propria og submucosa findes ofte på histopatologiske dias. Epiteldysplasi, epitelatrofi og senescerende fibroblaster er blevet foreslået at være forbundet med den ondartede transformation af OSF. På grund af heterogeniteten af potentielt maligne orale lidelser og oralt pladecellekarcinom er det imidlertid vanskeligt at identificere de specifikke molekylære mekanismer for malign transformation i OSF. Her præsenterer vi en metode til at opnå et lille antal epitel- eller mesenkymale celler, der bærer morfologiske data og rumlig information ved laserfangstmikrodissektion på formalinfikserede paraffinindlejrede vævsdias. Ved hjælp af et mikroskop kan vi præcist fange mikroskala (~ 500 celler) dysplastisk eller atrofisk epitelvæv og fibrotisk subepitelvæv. De ekstraherede celler kan evalueres ved genom- eller transkriptomsekventering for at erhverve genomiske og transkriptomiske data med morfologisk og rumlig information. Denne tilgang fjerner heterogeniteten af bulk OSF-vævsekventering og interferensen forårsaget af celler i ikke-læsionerede områder, hvilket muliggør præcis rumlig omics-analyse af OSF-væv.
Introduction
Oral submucøs fibrose (OSF) er en kronisk, lumsk sygdom, der hovedsageligt udvikler sig i bukkalslimhinden og resulterer i begrænset mundåbning1. Mens OSF er en multifaktoriel sygdom, er arecanødder eller betelnødder den vigtigste årsag til OSF 2,3. På grund af denne geografisk specifikke vane er OSF overvejende koncentreret i befolkninger i Sydøst- og Sydasien3. De almindelige histologiske træk ved OSF inkluderer unormal kollagenaflejring i bindevævet under mundslimhindepitelet, vaskulær stenose og okklusion1. OSF-epitelvæv kan forekomme med manifestationer af atrofi eller hyperplasi og endda dysplasi, når det er samtidig med oral leukoplaki 4,5.
OSF er defineret af Verdenssundhedsorganisationen som en almindelig oral potentielt malign lidelse (OPMD), der udviser potentialet til at udvikle sig til oralt pladecellekarcinom med en ondartet transformationshastighed på 4% -6% 6,7,8,9. Mekanismen bag den ondartede transformation af OSF er kompleks10. Unormal vækst af epitelet, herunder både dysplasi og atrofi, øger potentialet for carcinogenese, og senescerende fibroblaster i stroma kan være involveret i den ondartede progression af OSF ved at inducere epitel-mesenkymal overgang (EMT) gennem reaktive iltarter (ROS) og andre molekyler10.
Teknologier til rumlige-omiske analyser genererede multi-omiske data med morfologisk og rumlig information, der har givet indsigt i kræftmekanismer11,12,13. Her præsenterer vi en protokol til at fange morfologirelaterede cellepopulationer fra formalinfikseret paraffinindlejret OSF-væv ved lasermikrodissektion. Multi-omiske analyser af disse prøver kan overvinde udfordringer med intratissue heterogenitet og øge forståelsen af molekylær patologi og mekanismer for ondartet transformation i OSF14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev godkendt af det institutionelle bedømmelsesudvalg for Peking University School and Hospital. Der blev indhentet informeret samtykke fra patienterne. De vævsprøver, der blev anvendt i denne undersøgelse, blev afidentificeret. Studieordningen er vist i figur 1.
1. Forberedelse af prøver
- Skær formalinfikseret paraffinindlejret oralt submucøs fibrosevæv i kontinuerlige sektioner på 3 μm og 10 μm tykkelse på et mikrotom.
- Fold sektionerne ud i vand og fisk derefter ud på rutsjebanerne. Fastgør sektionerne 3 μM og 10 μm på henholdsvis vedhæftningsmikroskopglas (dias A) og PEN-membranglas (dias B).
- Objektglassene anbringes på en kogeplade ved 60 °C i 2 timer.
2. Hæmatoxylin-eosin farvning
- Placer dias A og B i xylen (FORSIGTIG) i 10 minutter, og gentag dette trin tre gange.
- Hydratglas A og B i klassificerede ethanolopløsninger i størrelsesordenen 100%, 100%, 90%, 80% og 70% i 1 min i hver koncentration.
- Placer dias A og B i ultrarent destilleret vand i 30 s
- Placer dias A og B i Harris hæmatoxylinfarvestofopløsning i 90 s.
- Placer dias A og B i ultrarent destilleret vand i 30 s og gentag dette trin tre gange.
- Placer dias A og B i div-hæmatoxylinopløsning (FORSIGTIG) i 2 s.
- Placer dias A og B i ultrarent destilleret vand i 30 s og gentag dette trin tre gange.
- Placer dias i A og B i 1% re-blue opløsning i 2 s.
- Placer dias A og B i ultrarent destilleret vand i 30 s og gentag dette trin tre gange.
- Placer dias i eosinopløsning i 2 s.
- Placer dias A og B i ultrarent destilleret vand i 30 s og gentag dette trin tre gange.
- Dehydrering af objektglas i klassificerede ethanolopløsninger i størrelsesordenen 70%, 80%, 90%, 100% og 100% i 2 s i hver koncentration.
- Placer slide A i xylen i 3 minutter, og gentag dette trin to gange.
- Tilføj en dråbe monteringsmedium (FORSIGTIG) til glide A og dæk det med et dækglas.
3. Observation af histologisk morfologi og laserindfangningsmikrodissektion
- Start lasermikrodissektionssystemet og softwaren (figur 2).
- Placer dias A på diasstadiet, og observer den histologiske morfologi for at identificere interesseområdet for lasermikrodissektion.
- Fjern slide A, og placer slide B omvendt på slidestadiet.
- Klik på knappen Aflæsning (figur 2) for at skubbe indsamlingsenheden ud. Indsæt et polymerasekædereaktionsrør (PCR) i opsamlingsanordningen, og sørg for, at røret holdes fast. Klik på knappen OK (Figur 3).
- Vælg en hætte ved at klikke på den tilsvarende røde cirkel, der markerer kollektorenheden: Rørhætter. Den valgte cirkel bliver grøn.
- Klik på knappen Tegn og knappen Tegn + klip , og brug musen til at skitsere interesseområdet.
- Klik på Start Cut knappen for at fange interesseområdet; den udtagne prøve indsamles af hætten (figur 4).
- Klik på knappen Nederste for at sikre, at den optagne prøve indsamles (figur 5).
- Klik på knappen Eksempel for at tage det næste eksempel.
- Klik på knappen Aflæsning for at aflæse PCR-røret med den optagne prøve.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved at udføre lasermikrodissektion af OSF-væv fangede vi prøver af dysplastisk epitel, stroma under dysplastisk epitel, atrofisk epitel og stroma under atrofisk epitelvæv (figur 1). Ved at udvinde DNA og helgenomsekventering med lav dybde var vi i stand til at analysere morfologirelaterede kopinummerændringer (CNA)15. CNA er en almindelig form for genomisk ustabilitet forbundet med en øget risiko for ondartet transformation i OPMD15,16. Vi opdagede forskellige CNA-mønstre blandt fire slags prøver. Som vist i figur 6 var CNA til stede i epitelprøver, men ikke i stromaprøver. Selvom prøverne stammede fra den samme patient, var CNA-mønsteret i det dysplastiske epitel ikke det samme som i det atrofiske epitel. CNA i kromosomerne 3 og 8 blev påvist i dysplastisk epitel, mens CNA blev påvist ved en lavere frekvens i kromosom 8 i atrofisk epitel.
Figur 1: Ordningen med laserindfangningsmikrodissektion af orale submucøse fibroseprøver. Vævene i epitel og stroma med forskellige mønstre fanges af laser under et mikroskop. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Software til lasermikrodissektion. Et skærmbillede af softwaren, der viser livepanelet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Vindue til samlerenhed. Et skærmbillede af softwaren, der viser vinduet med samlerenheden til valg af indsamlingsenhed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Registrering af stikprøven i det relevante område. Ved at klikke på knappen Start Cut kan du fange interesseområdet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Optaget prøve. Den fangede prøve kan ses i hætten på PCR-røret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Kopier nummerændringer. De repræsentative resultater af forskellige mønstre af ændringer i kopinummeret blandt forskellige prøver. Der er forskellige kopinummerændringer mellem dysplastisk epitel og atrofisk epitel. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol rapporterede en pipeline til at fange OSF-vævsprøver med morfologisk og rumlig information til yderligere rumlige analyser gennem lasermikrodissektion. Fra de repræsentative resultater identificerede vi forskellige CNA-mønstre blandt forskellige morfologirelaterede prøver.
OSF, en type OPMD, er en almindelig precancerøs tilstand af oral pladecellekarcinom6. Genomisk ustabilitet er rapporteret at være forbundet med udvikling og ondartet transformation af OPMD17,18. Flere undersøgelser har rapporteret kromosomændringer, differentiel genekspression og epigenetiske variationer forbundet med progression og ondartet transformation af OSF fra genomik, transkriptomik og proteomics data 19,20,21,22,23,24. De kræftfremkaldende komponenter i arecanødder, såsom arecolin, førte ikke kun til udviklingen af OSF, men den langsigtede stimulering inducerede også ældning af fibroblaster og EMT og kontinuerlig produktion af reaktive iltarter (ROS), hvilket resulterede i ondartet transformation ved at regulere immunmikromiljøet og signalveje såsom TGF-β- og NF-κB-signaler5, 10,21. Imidlertid er både unormale epitel- og stromale histologiske ændringer til stede i OSF-væv, og hvilke vævs- eller cellulære ændringer, der driver den ondartede transformation i OSF, forbliver uklar. Tidligere undersøgelser har for det meste brugt bulksekventeringsanalyser, hvor DNA eller RNA blev ekstraheret fra en vævsblok for yderligere at analysere det molekylære udtryk og involverede veje. Denne analyse manglede imidlertid en morfologisk korrelation med histologi og ignorerede intravævsheterogeniteten; Desuden kan denne tilgang ikke identificere, om der er differentielle molekylære ændringer i forskellige histologiske områder.
Nylige undersøgelser har rapporteret rumlig omics analyse i mange sygdomme11,13,25. Gennem præcis rumlig omics-analyse opdages et stigende antal molekyler og mål, og cellulære interaktioner og klyngedannelse belyses11,12,13. Der mangler dog stadig rumligt opløst omics-analyse af OSF. OSF-prøver blev normalt taget fra biopsier af mundslimhinde og blev fremstillet som små mængder formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver, hvilket gør det vanskeligt at udføre enkeltcelle rumlig omics-sekventering, som kræver store prøver. Derfor kan udviklingen af metoder med rumlig opløsning ved hjælp af formalinfikserede paraffinindlejrede prøver være en betydelig fordel. Vi forventer, at den nuværende protokol vil gavne forskere, der arbejder med OSF og andre typer OPMD og bidrage til at forstå mekanismerne for udvikling og ondartet transformation af OPMD.
Denne metode har nogle begrænsninger. For det første blev protokollen udført under anvendelse af formalinfikserede paraffinindlejrede prøver, hvilket gjorde det vanskeligt at ekstrahere RNA til sekventeringsanalyse; morfologirelateret RNA-sekventeringsanalyse kan imidlertid udføres ved anvendelse af krystallinsk violet farvning og opretholdelse af aseptisk praksis15,26. De aktuelt optagne prøver kunne ikke opfylde niveauet for enkeltcelleopløsning, fordi når antallet af celler er for lille, kan cellerne nedbrydes af laserstrålen, hvilket påvirker DNA-ekstraktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger fra National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
