Summary
Laserfangstmikrodisseksjon av oralt submukøs fibrosevev muliggjør presis ekstraksjon av celler fra histologiske regioner av interesse for analyse av multi-omics data med morfologisk og romlig informasjon.
Abstract
Oral submukøs fibrose (OSF) er en vanlig type potensielt ondartet lidelse i munnhulen. Atrofi av epitel og fibrose av lamina propria og submukosa finnes ofte på histopatologiske lysbilder. Epitelial dysplasi, epitelial atrofi og senescent fibroblaster har blitt foreslått å være assosiert med ondartet transformasjon av OSF. På grunn av heterogeniteten til potensielt ondartede orale lidelser og oralt plateepitelkarsinom, er det imidlertid vanskelig å identifisere de spesifikke molekylære mekanismene for ondartet transformasjon i OSF. Her presenterer vi en metode for å oppnå et lite antall epitel- eller mesenkymale celler som bærer morfologiske data og romlig informasjon ved laserfangstmikrodisseksjon på formalinfikserte parafininnebygde vevslysbilder. Ved hjelp av et mikroskop kan vi nøyaktig fange mikroskala (~ 500 celler) dysplastisk eller atrofisk epitelvev og fibrotisk subepitelvev. De ekstraherte cellene kan evalueres ved genom- eller transkriptomsekvensering for å skaffe genomiske og transkriptomiske data med morfologisk og romlig informasjon. Denne tilnærmingen fjerner heterogeniteten til bulk OSF-vevssekvensering og interferensen forårsaket av celler i ikke-lesjonerte områder, noe som muliggjør presis romlig omics-analyse av OSF-vev.
Introduction
Oral submukøs fibrose (OSF) er en kronisk, lumsk sykdom som utvikler seg hovedsakelig i bukkalslimhinnen og resulterer i begrenset munnåpning1. Mens OSF er en multifaktoriell sykdom, er areca-mutter eller betelnøtttygge hovedårsaken til OSF 2,3. På grunn av denne geografisk spesifikke vanen er OSF hovedsakelig konsentrert i populasjoner i Sørøst- og Sør-Asia3. De vanlige histologiske egenskapene til OSF inkluderer unormal kollagenavsetning i bindevevet under munnslimhinneepitelet, vaskulær stenose og okklusjon1. OSF-epitelvev kan presentere manifestasjoner av atrofi eller hyperplasi og til og med dysplasi når det er samtidig med oral leukoplaki 4,5.
OSF er definert av Verdens helseorganisasjon som en vanlig oral potensielt ondartet lidelse (OPMD) som viser potensial til å utvikle seg til oralt plateepitelkarsinom med en ondartet transformasjonsrate på 4%-6%6,7,8,9. Mekanismen bak den ondartede transformasjonen av OSF er kompleks10. Unormal vekst av epitelet, inkludert både dysplasi og atrofi, øker potensialet for karsinogenese, og senescent fibroblaster i stroma kan være involvert i den ondartede progresjonen av OSF ved å indusere epithelial-mesenkymal overgang (EMT) gjennom reaktive oksygenarter (ROS) og andre molekyler10.
Teknologier for romlig-omiske analyser genererte multi-omiske data med morfologisk og romlig informasjon som har gitt innsikt i kreftmekanismer11,12,13. Her presenterer vi en protokoll for å fange morfologirelaterte cellepopulasjoner fra formalinfiksert parafininnebygd OSF-vev ved lasermikrodisseksjon. Multi-omiske analyser av disse prøvene kan overvinne utfordringer med intravevsheterogenitet og øke forståelsen av molekylær patologi og mekanismer for ondartet transformasjon i OSF14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne studien ble godkjent av det institusjonelle gjennomgangsstyret ved Peking University School and Hospital. Det ble innhentet informert samtykke fra pasientene. Vevsprøvene som ble brukt i denne studien ble avidentifisert. Studieskjemaet er vist i figur 1.
1. Forberedelse av prøver
- Skjær formalinfiksert parafininnebygd oralt submukøs fibrosevev i kontinuerlige seksjoner på 3 μm og 10 μm tykkelse på en mikrotom.
- Brett ut seksjonene i vann og fisk deretter ut på skliene. Fest seksjonene på 3 μM og 10 μm på henholdsvis adhesjonsmikroskoplysbilder (lysbilde A) og PEN-membran (lysbilde B).
- Legg lysbildene på en kokeplate ved 60 °C i 2 timer.
2. Farging av hematoksylin-eosin
- Plasser lysbilde A og B i xylen (FORSIKTIG) i 10 minutter, og gjenta dette trinnet tre ganger.
- Hydrat lyser A og B i graderte etanolløsninger i størrelsesorden 100%, 100%, 90%, 80% og 70% i 1 min i hver konsentrasjon.
- Plasser lysbildene A og B i ultrarent destillert vann i 30 s
- Plasser lysbildene A og B i Harris hematoksylinfargestoffløsning i 90 s.
- Plasser lysbildene A og B i ultrarent destillert vann i 30 s og gjenta dette trinnet tre ganger.
- Plasser lysbildene A og B i div-hematoksylinoppløsning (FORSIKTIG) i 2 s.
- Plasser lysbildene A og B i ultrarent destillert vann i 30 s og gjenta dette trinnet tre ganger.
- Plasser lysbilder i A og B i 1% re-blå løsning i 2 s.
- Plasser lysbildene A og B i ultrarent destillert vann i 30 s og gjenta dette trinnet tre ganger.
- Plasser lysbilder i eosinløsning i 2 s.
- Plasser lysbildene A og B i ultrarent destillert vann i 30 s og gjenta dette trinnet tre ganger.
- Dehydrer lysbildene i graderte etanolløsninger i størrelsesorden 70%, 80%, 90%, 100% og 100% i 2 s i hver konsentrasjon.
- Plasser lysbilde A i xylen i 3 minutter og gjenta dette trinnet to ganger.
- Legg til en dråpe monteringsmedium (FORSIKTIG) for å skyve A og dekk den med et dekselglass.
3. Observasjon av histologisk morfologi og laserfangstmikrodisseksjon
- Start lasermikrodisseksjonssystemet og programvaren (figur 2).
- Plasser lysbilde A på lysbildetrinnet og observer den histologiske morfologien for å identifisere interesseområdet for lasermikrodisseksjon.
- Fjern lysbilde A og plasser lysbilde B omvendt på lysbildestadiet.
- Klikk på Loss-knappen (figur 2) for å skyve ut innsamlingsenheten. Sett inn et polymerasekjedereaksjonsrør (PCR) i oppsamlingsanordningen og sørg for at røret holdes fast. Klikk på OK-knappen (figur 3).
- Velg en hette ved å klikke på den tilsvarende røde sirkelen som markerer Collector Device: Tube Caps. Den valgte sirkelen blir grønn.
- Klikk på Tegne-knappen og Tegn + Klipp-knappen og bruk musen til å skissere interesseområdet.
- Klikk på start kutt knappen for å fange interesseområdet; den fangede prøven vil bli samlet inn av hetten (figur 4).
- Klikk på Neder-knappen for å sikre at den fangede prøven samles inn (figur 5).
- Klikk på Prøve-knappen for å ta neste prøve.
- Klikk på Loss-knappen for å laste ut PCR-røret med den fangede prøven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved å utføre lasermikrodisseksjon av OSF-vev fanget vi prøver av dysplastisk epitel, stroma under dysplastisk epitel, atrofisk epitel og stroma under atrofisk epitelvev (figur 1). Gjennom ekstrahering av DNA og lavdybde helgenomsekvensering var vi i stand til å analysere morfologirelaterte kopinummerendringer (CNA) 15. CNA er en vanlig form for genomisk instabilitet assosiert med økt risiko for malign transformasjon i OPMD15,16. Vi oppdaget forskjellige CNA-mønstre blant fire typer prøver. Som vist i figur 6 var CNA til stede i epitelprøver, men ikke i stromaprøver. Selv om prøvene stammet fra samme pasient, var CNA-mønsteret i det dysplastiske epitelet ikke det samme som i det atrofiske epitelet. CNA i kromosom 3 og 8 ble påvist i dysplastisk epitel, mens CNA ble påvist med lavere frekvens i kromosom 8 i atrofisk epitel.
Figur 1: Skjemaet for laserfangstmikrodisseksjon av orale submukøse fibroseprøver. Vevene av epitel og stroma med forskjellige mønstre fanges av laser under et mikroskop. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Programvare for lasermikrodisseksjon. Et skjermbilde av programvaren som viser live-panelet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Vinduet for samlerenhet. Et skjermbilde av programvaren som viser kollektorenhetsvinduet for valg av innsamlingsenhet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Fange prøven i interesseområdet. Ved å klikke på Start Cut-knappen kan du fange interesseområdet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Fanget prøve. Den fangede prøven kan ses i hetten på PCR-røret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Kopier nummerendringer. De representative resultatene av forskjellige mønstre av kopinummerendringer blant ulike prøver. Det er forskjellige kopinummerendringer mellom dysplastisk epitel og atrofisk epitel. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokollen rapporterte en rørledning for å fange OSF-vevsprøver med morfologisk og romlig informasjon for videre romlig-omiske analyser gjennom lasermikrodisseksjon. Fra de representative resultatene identifiserte vi forskjellige CNA-mønstre blant ulike morfologirelaterte prøver.
OSF, en type OPMD, er en vanlig forstadier tilstand av oral plateepitelkarsinom6. Genomisk ustabilitet er rapportert å være assosiert med utvikling og ondartet transformasjon av OPMD17,18. Flere studier har rapportert kromosomendringer, differensielt genuttrykk og epigenetiske variasjoner assosiert med progresjon og ondartet transformasjon av OSF fra genomikk, transkriptomikk og proteomikkdata 19,20,21,22,23,24. De kreftfremkallende komponentene i areca-mutteren, som arekolin, førte ikke bare til utviklingen av OSF, men den langsiktige stimuleringen induserte også senescens av fibroblaster og EMT og kontinuerlig produksjon av reaktive oksygenarter (ROS), noe som resulterte i ondartet transformasjon ved å regulere immunmikromiljøet og signalveiene som TGF-β og NF-κB-signaler5, 10,21. Imidlertid er både unormale epitel- og stromale histologiske forandringer tilstede i OSF-vev, og hvilke vevs- eller cellulære endringer som driver den ondartede transformasjonen i OSF er fortsatt uklart. Tidligere studier har for det meste brukt bulksekvenseringsanalyser, hvor DNA eller RNA ble ekstrahert fra en blokk av vev for å analysere det molekylære uttrykket og involverte veier ytterligere. Denne analysen manglet imidlertid en morfologisk korrelasjon med histologi og ignorerte intravevsheterogeniteten; Videre kan denne tilnærmingen ikke identifisere om det er differensielle molekylære endringer i forskjellige histologiske områder.
Nylige studier har rapportert romlig omics-analyse i mange sykdommer11,13,25. Gjennom presis romlig omics-analyse blir stadig flere molekyler og mål oppdaget, og cellulære interaksjoner og klynger blir belyst11,12,13. Imidlertid mangler det fortsatt romlig løst omics-analyse av OSF. OSF-prøver ble vanligvis tatt fra biopsier av munnslimhinner og ble fremstilt som små volumer av formalinfikserte, parafin-innebygde prøver, noe som gjør det vanskelig å utføre enkeltcelle romlig omikksekvensering, som trenger store prøver. Derfor kan utvikling av metoder med romlig oppløsning ved bruk av formalinfaste parafininnebygde prøver være en betydelig fordel. Vi forventer at den nåværende protokollen vil være til nytte for forskere som arbeider med OSF og andre typer OPMD og bidra til å forstå mekanismene for utvikling og ondartet transformasjon av OPMD.
Denne metoden har noen begrensninger. For det første ble protokollen utført ved hjelp av formalinfaste parafin-innebygde prøver, noe som gjorde det vanskelig å ekstrahere RNA for sekvenseringsanalyse; Imidlertid kan morfologirelatert RNA-sekvenseringsanalyse utføres ved bruk av krystallinsk fiolett farging og opprettholdelse av aseptisk praksis15,26. De for tiden fangede prøvene kunne ikke oppfylle nivået av enkeltcelleoppløsning fordi når antall celler er for lite, kan cellene brytes ned av laserstrålen, noe som påvirker DNA-ekstraksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne oppgir ingen interessekonflikt.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av forskningsbidrag fra National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovasjonsfond for fremragende doktorgradskandidater ved Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
