Summary
口腔粘膜下線維症組織のレーザーキャプチャーマイクロダイセクションは、形態学的および空間的情報を含むマルチオミクスデータの解析のために、関心のある組織学的領域から細胞を正確に抽出することを可能にします。
Abstract
口腔粘膜下線維症(OSF)は、口腔内の悪性の可能性のある疾患の一般的なタイプです。上皮の萎縮および固有層および粘膜下層の線維症は、病理組織学的スライドにしばしば見られる。上皮異形成、上皮萎縮、および老化線維芽細胞は、OSFの悪性形質転換に関連していることが提案されています。しかし、潜在的に悪性の口腔疾患と口腔扁平上皮癌の不均一性のため、OSFにおける悪性形質転換の特定の分子機構を特定することは困難です。本研究では、ホルマリン固定パラフィン包埋組織スライド上にレーザー捕捉マイクロダイセクションにより、形態学的データや空間情報を有する少数の上皮細胞または間葉系細胞を得る方法を紹介します。顕微鏡を用いることで、マイクロスケール(~500細胞)の異形成性または萎縮性上皮組織や線維性上皮下組織を正確に捕捉することができます。抽出された細胞は、ゲノムまたはトランスクリプトームシーケンシングによって評価され、形態学的および空間的情報を含むゲノムおよびトランスクリプトームデータを取得できます。このアプローチにより、バルクOSF組織シーケンシングの不均一性や、非病変領域の細胞によって引き起こされる干渉が除去され、OSF組織の正確な空間オミクス解析が可能になります。
Introduction
口腔粘膜下線維症(OSF)は、主に頬粘膜に発症し、口の開きが制限される慢性の潜行性疾患です1。OSFは多因子性疾患ですが、ビンロウの実やビンロウの咀嚼がOSF 2,3の主な原因です。この地理的に特異的な習性のため、OSFは主に東南アジアと南アジアの集団に集中しています3。OSFの一般的な組織学的特徴には、口腔粘膜上皮下の結合組織における異常なコラーゲン沈着、血管狭窄、および閉塞が含まれます1。OSF上皮組織は、口腔白板症を併発すると、萎縮または過形成、さらには異形成の症状を呈することがあります4,5。
OSFは、世界保健機関によって、悪性形質転換率が4%〜6%の口腔扁平上皮癌に進行する可能性のある一般的な口腔悪性疾患(OPMD)として定義されています6,7,8,9。OSFの悪性形質転換の根底にあるメカニズムは複雑である10。異形成と萎縮の両方を含む上皮の異常な増殖は発がんの可能性を高め、間質の老化線維芽細胞は、活性酸素種(ROS)やその他の分子を介して上皮間葉転換(EMT)を誘導することにより、OSFの悪性進行に関与している可能性があります10。
空間オミクス解析技術は、形態学的および空間的情報を含むマルチオミクスデータを生成し、がんのメカニズムに関する洞察を提供しました11,12,13。ここでは、レーザーマイクロダイセクションによってホルマリン固定パラフィン包埋OSF組織から形態関連細胞集団を捕捉するプロトコルを提示します。これらのサンプルのマルチオミクス解析は、組織内の不均一性に関する課題を克服し、OSF14における分子病理学と悪性形質転換のメカニズムの理解を深めることができます。
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Protocol
この研究は、北京大学学院病院の治験審査委員会によって承認されました。インフォームドコンセントは患者から得られました。この研究で使用された組織サンプルは匿名化されました。研究スキームを 図1に示します。
1. サンプル調製
- ホルマリン固定パラフィン包埋口粘膜下線維症組織を、ミクロトーム上で厚さ3μmおよび10μmの連続切片に切断します。
- セクションを水中で広げてから、スライドに釣ります。3 μMと10 μmの切片を、それぞれ接着顕微鏡スライド(スライドA)とPENメンブレンスライド(スライドB)に固定します。
- スライドを60°Cのホットプレートに2時間置きます。
2. ヘマトキシリン-エオシン染色
- スライドAとBをキシレン(注意)に10分間入れ、この手順を3回繰り返します。
- 水和物AおよびBを100%、100%、90%、80%、70%の順に段階的エタノール溶液中で各濃度で1分間スライドさせる。
- スライドAとBを超高純度蒸留水に30秒間入れます
- スライドAとBをハリスヘマトキシリン染料溶液に90秒間入れます。
- スライドAとBを超高純度蒸留水に30秒間入れ、このステップを3回繰り返します。
- スライドAとBをdiv-ヘマトキシリン溶液(CAUTION)に2秒間入れます。
- スライドAとBを超高純度蒸留水に30秒間入れ、このステップを3回繰り返します。
- スライドをAとBに入れ、1%の青色溶液に2秒間入れます。
- スライドAとBを超高純度蒸留水に30秒間入れ、このステップを3回繰り返します。
- スライドをエオシン溶液に2秒間入れます。
- スライドAとBを超高純度蒸留水に30秒間入れ、このステップを3回繰り返します。
- スライドを段階的エタノール溶液中で、70%、80%、90%、100%、100%の順に各濃度で2秒間脱水します。
- スライドAをキシレンに3分間入れ、このステップを2回繰り返します。
- スライドAに封入剤(注意)を一滴加え、カバーガラスで覆います。
3. 組織形態の観察とレーザー捕捉顕微解剖
- レーザーマイクロダイセクションシステムとソフトウェアを起動します(図2)。
- スライドAをスライドステージに置き、組織学的形態を観察して、レーザーマイクロダイセクションの対象領域を特定します。
- スライドAを取り外し、スライドBをスライドステージに逆向きに置きます。
- [Unload](アンロード)ボタン(図2)をクリックして、収集デバイスを押し出します。ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)チューブを採取装置に挿入し、チューブが固定されていることを確認します。[OK]ボタンをクリックします(図3)。
- Collector Device: Tube Caps(コレクターデバイス:チューブキャップ)とマークされた対応する赤い円をクリックして、キャップを選択します。選択した円が緑色に変わります。
- [ 描画 ] ボタンと [描画 + 切り取り ] ボタンをクリックし、マウスを使用して対象領域をスケッチします。
- [ カットの開始 ]ボタンをクリックして、対象領域をキャプチャします。捕捉されたサンプルはキャップによって収集されます(図4)。
- 下ボタンをクリックして、キャプチャしたサンプルが確実に収集されるようにします(図5)。
- [ 検体 ]ボタンをクリックして、次のサンプルをキャプチャします。
- [アンロード]ボタンをクリックして、キャプチャしたサンプルを含むPCRチューブをアン ロード します。
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Representative Results
OSF組織のレーザー微小解剖を行うことにより、異形成上皮、異形成上皮の下質、萎縮上皮、萎縮上皮組織下間質のサンプルを採取しました(図1)。DNAの抽出と低深度の全ゲノムシークエンシングにより、形態に関連したコピー数変化(CNA)を解析することができました15。CNAは、OPMDにおける悪性形質転換のリスクの増加に関連するゲノム不安定性の一般的な形態です15,16。4種類のサンプルから異なるCNAパターンを検出しました。図6に示すように、CNAは上皮サンプルには存在しましたが、間質サンプルには存在しませんでした。サンプルは同じ患者に由来しましたが、異形成上皮のCNAパターンは萎縮性上皮のパターンと同じではありませんでした。3番染色体と8番染色体のCNAは異形成上皮で検出され、CNAは萎縮性上皮の8番染色体でより低い頻度で検出されました。
図1:口腔粘膜下線維症サンプルのレーザーキャプチャマイクロダイセクションのスキーム。 異なるパターンを持つ上皮と間質の組織を顕微鏡下でレーザーで捉えます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:レーザー顕微解剖ソフトウェア。 ライブパネルを示すソフトウェアのスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:コレクターデバイスウィンドウ。 収集デバイスを選択するためのコレクター デバイス ウィンドウを示すソフトウェアのスクリーンショット。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:対象領域でのサンプルの捕捉。 [ カットの開始 ]ボタンをクリックすると、関心のある領域をキャプチャできます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図5:キャプチャしたサンプル。 捕捉されたサンプルは、PCRチューブのキャップで見ることができます。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図6:コピー数の変更。 さまざまなサンプル間のコピー数変化のさまざまなパターンの代表的な結果。異形成上皮と萎縮性上皮の間には異なるコピー数の変化があります。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、レーザーマイクロダイセクションによるさらなる空間オミクス分析のために、形態学的および空間的情報を含むOSF組織サンプルを捕捉するパイプラインを報告しました。代表的な結果から、形態に関連するさまざまなサンプル間で異なるCNAパターンを特定しました。
OPMDの一種であるOSFは、口腔扁平上皮がんの一般的な前がん状態です6。ゲノムの不安定性は、OPMDの発症と悪性形質転換に関連していることが報告されています17,18。ゲノミクス、トランスクリプトミクス、プロテオミクスのデータから、OSFの進行と悪性形質転換に関連する染色体の変化、遺伝子発現の違い、エピジェネティックな変異が複数の研究で報告されています19,20,21,22,23,24 .アレコリンなどのビンロウの発がん性成分は、OSFの発症をもたらしただけでなく、長期的な刺激により、線維芽細胞とEMTの老化と活性酸素種(ROS)の連続産生も誘発され、免疫微小環境とTGF-βやNF-κBシグナルなどのシグナル経路を調節することにより、悪性形質転換を引き起こします5。10,21。しかし、異常な上皮性および間質組織学的変化の両方がOSF組織に存在し、どの組織または細胞の変化がOSFの悪性形質転換を促進するかは不明のままです。これまでの研究では、組織のブロックからDNAまたはRNAを抽出して分子発現と関与する経路をさらに解析するバルクシーケンシング解析が主に使用されていました。しかし、この分析は組織学との形態学的相関を欠いており、組織内の不均一性を無視していました。さらに、このアプローチでは、異なる組織学的領域に異なる分子変化があるかどうかを特定することはできません。
最近の研究では、多くの疾患における空間オミクス解析が報告されています11,13,25。精密な空間オミクス解析により、ますます多くの分子や標的が発見され、細胞間相互作用やクラスタリングが解明されています11,12,13。しかし、OSFの空間分解オミクス解析はまだ行われていません。OSFサンプルは通常、口腔粘膜の生検から採取され、少量のホルマリン固定パラフィン包埋サンプルとして調製されていたため、大量のサンプルを必要とする単一細胞空間オミクスシーケンシングの実行は困難でした。したがって、ホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを用いた空間分解能を有する分析法の開発は、大きな利益となる可能性があります。現在のプロトコルは、OSFやその他のタイプのOPMDに取り組んでいる研究者に利益をもたらし、OPMDの発生と悪性形質転換のメカニズムの理解に貢献することを期待しています。
この方法にはいくつかの制限があります。まず、プロトコルはホルマリン固定パラフィン包埋サンプルを使用して実施されたため、シーケンシング分析用のRNAの抽出が困難でした。ただし、形態学関連のRNAシーケンシング分析は、結晶性紫色染色を使用し、無菌分析法を維持する場合に実行できます15,26。現在採取されているサンプルは、細胞数が少なすぎるとレーザー光線で細胞が分解され、DNA抽出に影響を与える可能性があるため、単一細胞の分解能のレベルを満たすことができませんでした。
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Disclosures
著者らは、利益相反がないことを宣言します。
Acknowledgments
この研究は、中国国家自然科学基金会(81671006、81300894)、CAMS Innovation Fund for Medical Sciences(2019-I2M-5-038)、National clinical key discipline construction project(PKUSSNKP-202102)、Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center(BMU2022BSS001)の研究助成金の支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
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