Summary
구강 점막하 섬유증 조직의 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹스 데이터를 분석하기 위해 조직학적 관심 영역에서 세포를 정밀하게 추출할 수 있습니다.
Abstract
구강 점막하 섬유증(OSF)은 구강 내 악성 질환의 흔한 유형입니다. 상피의 위축과 lamina propria와 submucosa의 섬유화는 종종 조직 병리학적 슬라이드에서 발견됩니다. 상피 이형성증, 상피 위축 및 노화 섬유아세포는 OSF의 악성 변형과 관련이 있는 것으로 제안되었습니다. 그러나 악성종양 가능성이 있는 구강질환과 구강편평세포암의 이질성으로 인해 OSF에서 악성형질전환의 특정 분자 기전을 규명하는 것은 어려운 실정이다. 여기에서는 포르말린 고정 파라핀 포매 조직 슬라이드에서 레이저 캡처 미세해부를 통해 형태학적 데이터 및 공간 정보를 전달하는 소수의 상피 또는 중간엽 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 현미경을 사용하여 미세(~500개 세포) 이형성 또는 위축성 상피 조직과 섬유성 상피하 조직을 정밀하게 캡처할 수 있습니다. 추출된 세포는 게놈 또는 전사체 염기서열 분석으로 평가하여 형태학적 및 공간 정보가 포함된 게놈 및 전사체 데이터를 획득할 수 있습니다. 이 접근법은 벌크 OSF 조직 염기서열 분석의 이질성과 병변이 없는 영역의 세포에 의해 발생하는 간섭을 제거하여 OSF 조직의 정확한 공간 오믹스 분석을 가능하게 합니다.
Introduction
구강 점막하 섬유증(Oral submucous fibrosis, OSF)은 주로 협측 점막에서 발생하여 입 벌림이 제한되는 만성 잠복성 질환이다1. OSF는 다인자성 질병이지만, 아레카 너트 또는 빈랑 씹는 것이 OSF 2,3의 주요 원인입니다. 이러한 지리적인 특성으로 인해 OSF는 주로 동남아시아와 남아시아의 인구에 집중되어 있다3. OSF의 일반적인 조직학적 특징으로는 구강 점막 상피 아래 결합 조직의 비정상적인 콜라겐 침착, 혈관 협착증 및 폐색이 있다1. OSF 상피 조직은 구강 백반증과 병행될 경우 위축 또는 증식증 및 이형성증의 징후를 나타낼 수 있습니다 4,5.
OSF는 세계보건기구(WHO)에 의해 4%-6%의 악성 변형률로 구강 편평 세포 암종으로 진행될 가능성이 있는 일반적인 구강 잠재적 악성 질환(OPMD)으로 정의됩니다6,7,8,9. OSF의 악성 변형의 기저에 있는 메커니즘은 복잡합니다10. 이형성증과 위축을 포함한 상피의 비정상적인 성장은 발암 가능성을 증가시키며, 기질의 노화 섬유아세포는 활성산소종(ROS) 및 기타 분자를 통해 상피-중간엽 전이(EMT)를 유도하여 OSF의 악성 진행에 관여할 수 있다10.
공간-오믹 분석 기술은 암 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하는 형태학적 및 공간 정보가 포함된 다중 오믹 데이터를 생성했습니다11,12,13. 여기에서는 레이저 미세해부를 통해 포르말린 고정 파라핀이 포매된 OSF 조직에서 형태학 관련 세포 집단을 캡처하는 프로토콜을 제시합니다. 이러한 샘플의 다중 오믹 분석은 조직 내 이질성 문제를 극복하고 OSF14의 분자 병리학 및 악성 형질전환 메커니즘에 대한 이해를 높일 수 있습니다.
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Protocol
이 연구는 북경대학교 학교 및 병원의 기관 검토 위원회의 승인을 받았습니다. 환자들로부터 정보에 입각한 동의를 얻었다. 이 연구에 사용된 조직 샘플은 비식별화되었습니다. 연구 계획은 그림 1에 나와 있습니다.
1. 샘플 준비
- 포르말린 고정 파라핀이 포함된 구강 점막하 섬유증 조직을 마이크로톰에서 3μm 및 10μm 두께의 연속 절편으로 자릅니다.
- 물속에서 섹션을 펼친 다음 미끄럼틀 위로 낚시를 나갑니다. 접착 현미경 슬라이드(슬라이드 A)와 PEN 멤브레인 슬라이드(슬라이드 B)에 각각 3μM 및 10μm 섹션을 고정합니다.
- 슬라이드를 60°C의 열판에 2시간 동안 놓습니다.
2. 헤마톡실린-에오신 염색
- 슬라이드 A와 B를 크실렌(주의)에 10분 동안 놓고 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 등급이 매겨진 에탄올 용액에 각 농도에서 1분 동안 100%, 100%, 90%, 80% 및 70%의 순서로 슬라이드 A와 B를 수화합니다.
- 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣습니다.
- 슬라이드 A와 B를 Harris hematoxylin 염료 용액에 90초 동안 놓습니다.
- 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 슬라이드 A와 B를 div-hematoxylin 용액(주의)에 2초 동안 넣습니다.
- 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 슬라이드를 A와 B에 1% re-blue 용액에 2초 동안 넣습니다.
- 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 슬라이드를 에오신 용액에 2초 동안 놓습니다.
- 슬라이드 A와 B를 초순수 증류수에 30초 동안 넣고 이 단계를 세 번 반복합니다.
- 등급이 매겨진 에탄올 용액에서 슬라이드를 70, 80%, 90%, 100% 및 100%의 순서로 각 농도에서 2초 동안 탈수합니다.
- 슬라이드 A를 자일렌에 3분 동안 넣고 이 단계를 두 번 반복합니다.
- 장착 매체(CAUTION)를 한 방울 떨어뜨려 A를 밀고 덮개 유리로 덮습니다.
3. 조직학적 형태 관찰 및 레이저 포획 현미해부
- 레이저 미세해부 시스템 및 소프트웨어를 시작합니다(그림 2).
- 슬라이드 A를 슬라이드 스테이지에 놓고 조직학적 형태를 관찰하여 레이저 미세 해부의 관심 영역을 식별합니다.
- 슬라이드 A를 제거하고 슬라이드 B를 슬라이드 스테이지에 거꾸로 놓습니다.
- Unload(언로드) 단추(그림 2)를 클릭하여 수집 장치를 밀어냅니다. 중합효소연쇄반응(PCR) 튜브를 수집 장치에 삽입하고 튜브가 고정되어 있는지 확인합니다. 확인 단추를 클릭합니다(그림 3).
- Collector Device: Tube Caps를 표시한 해당 빨간색 원을 클릭하여 캡을 선택합니다. 선택한 원이 녹색으로 바뀝니다.
- 그리기 버튼과 그리기 + 잘라내기 버튼을 클릭하고 마우스를 사용하여 관심 영역을 스케치합니다.
- 클릭 자르기 시작 버튼을 눌러 관심 영역을 캡처합니다. 캡처된 샘플은 캡에 의해 수집됩니다(그림 4).
- 아래쪽 버튼을 클릭하여 캡처된 샘플이 수집되었는지 확인합니다(그림 5).
- Specimen 버튼을 클릭하여 다음 샘플을 캡처합니다.
- Unload 버튼을 클릭하여 캡처된 샘플이 있는 PCR 튜브를 언로드합니다.
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Representative Results
OSF 조직의 레이저 미세해부를 수행하여 이형성 상피, 이형성 상피 아래의 기질, 위축성 상피 및 위축성 상피 조직 아래의 기질 샘플을 캡처했습니다(그림 1). DNA 추출과 저심도 전체 게놈 염기서열 분석을 통해 형태학 관련 복제 수 변경(CNA)을 분석할 수 있었습니다15. CNA는 OPMD15,16에서 악성 형질전환의 위험 증가와 관련된 일반적인 형태의 게놈 불안정성입니다. 우리는 4가지 종류의 샘플에서 서로 다른 CNA 패턴을 감지했습니다. 그림 6에서 볼 수 있듯이 CNA는 상피 샘플에는 존재했지만 기질 샘플에는 존재하지 않았습니다. 샘플은 동일한 환자에서 유래했지만 이형성 상피의 CNA 패턴은 위축성 상피의 CNA 패턴과 동일하지 않았습니다. 3번 염색체와 8번 염색체의 CNA는 이형성 상피에서 검출된 반면, CNA는 위축성 상피의 8번 염색체에서 더 낮은 빈도로 검출되었습니다.
그림 1: 구강 점막하 섬유증 샘플의 레이저 캡처 미세해부 계획. 서로 다른 패턴을 가진 상피와 기질의 조직은 현미경으로 레이저로 캡처됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 레이저 현미해부 소프트웨어. 라이브 패널을 보여주는 소프트웨어의 스크린샷. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 수집기 장치 창 수집 장치를 선택하기 위한 수집기 장치 창을 보여주는 소프트웨어의 스크린샷입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 관심 영역에서 시료 캡처. Start Cut 버튼을 클릭하면 관심 영역을 캡처할 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 캡처된 샘플. 포획된 샘플은 PCR 튜브의 캡에서 볼 수 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 번호 변경 복사 다양한 샘플 간의 다양한 복제 수 변경 패턴의 대표적인 결과입니다. 이형성 상피와 위축성 상피 사이에는 서로 다른 복제 수 변경이 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 프로토콜은 레이저 미세해부를 통한 추가 공간 오믹 분석을 위해 형태학적 및 공간 정보가 포함된 OSF 조직 샘플을 캡처하는 파이프라인을 보고했습니다. 대표 결과에서 다양한 형태학 관련 샘플에서 서로 다른 CNA 패턴을 확인했습니다.
OPMD의 일종인 OSF는 구강 편평 세포 암종의 흔한 전암성 상태이다6. 게놈 불안정성은 OPMD17,18의 발달 및 악성 형질전환과 관련이 있는 것으로 보고되었습니다. 여러 연구에서 유전체학, 전사체학 및 단백질체학 데이터에서 OSF의 진행 및 악성 형질전환과 관련된 염색체 변경, 차등 유전자 발현 및 후성유전학적 변이가 보고되었습니다 19,20,21,22,23,24. 아레콜린과 같은 아레카너트의 발암성분은 OSF의 발생을 유도하였을 뿐만 아니라, 장기간의 자극은 섬유아세포와 EMT의 노화와 활성산소종(ROS)의 지속적인 생성을 유도하여 TGF-β, NF-κB 신호와 같은 면역미세환경 및 신호경로를 조절하여 악성전환을 초래하였다5, 10,21. 그러나 OSF 조직에는 비정상적인 상피 및 기질 조직학적 변화가 모두 존재하며, OSF의 악성 변형을 유발하는 조직 또는 세포 변형은 아직 불분명합니다. 이전 연구에서는 분자 발현 및 관련 경로를 추가로 분석하기 위해 조직 블록에서 DNA 또는 RNA를 추출하는 대량 시퀀싱 분석을 주로 사용했습니다. 그러나 이 분석은 조직학과의 형태학적 상관관계가 부족하고 조직 내 이질성을 무시했습니다. 또한, 이 접근법은 서로 다른 조직학적 영역에서 차등적인 분자 변화가 있는지 여부를 식별할 수 없습니다.
최근 연구에서는 많은 질병에서 공간-오믹스 분석을 보고하고있다 11,13,25. 정밀한 공간 오믹스 분석을 통해 점점 더 많은 수의 분자와 표적이 발견되고 세포 상호 작용 및 클러스터링이 해명되고있습니다 11,12,13. 그러나 OSF의 공간적으로 해석된 오믹스 분석은 여전히 부족합니다. OSF 샘플은 일반적으로 구강 점막의 생검에서 채취되었으며 소량의 포르말린 고정, 파라핀 포매 샘플로 준비되었기 때문에 큰 샘플이 필요한 단일 세포 공간 오믹스 시퀀싱을 수행하기가 어려웠습니다. 따라서 포르말린 고정 파라핀 포매 샘플을 사용하여 공간 분해능을 갖는 분석법을 개발하는 것은 상당한 이점이 될 수 있습니다. 우리는 현재 프로토콜이 OSF 및 기타 유형의 OPMD를 연구하는 연구자들에게 도움이 되고 OPMD의 개발 및 악성 변형 메커니즘을 이해하는 데 기여할 것으로 기대합니다.
이 방법에는 몇 가지 제한 사항이 있습니다. 첫째, 프로토콜은 포르말린 고정 파라핀 포매 샘플을 사용하여 수행되었으며, 이는 시퀀싱 분석을 위해 RNA를 추출하기 어렵게 만들었습니다. 그러나, 형태학 관련 RNA 염기서열분석 분석은 결정질 바이올렛 염색을 사용하고 무균 관행을 유지할 때 수행될 수 있다15,26. 현재 캡처된 샘플은 세포 수가 너무 적으면 레이저 빔에 의해 세포가 분해되어 DNA 추출에 영향을 미칠 수 있기 때문에 단일 세포 분해능 수준을 충족할 수 없습니다.
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Disclosures
저자는 이해 상충이 없음을 선언합니다.
Acknowledgments
이 연구는 중국 국립 자연 과학 재단 (81671006, 81300894), CAMS 의학 혁신 기금 (2019-I2M-5-038), 국가 임상 핵심 분야 구축 프로젝트 (PKUSSNKP-202102), 베이징 대학 건강 과학 센터 우수 박사 후보자 혁신 기금 (BMU2022BSS001)의 연구 보조금으로 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
