Summary
La microdisección por captura láser de tejidos de fibrosis submucosa oral permite la extracción precisa de células de regiones histológicas de interés para el análisis de datos multiómicos con información morfológica y espacial.
Abstract
La fibrosis submucosa oral (FSO) es un tipo común de trastorno potencialmente maligno en la cavidad oral. La atrofia del epitelio y la fibrosis de la lámina propia y la submucosa se encuentran a menudo en los portaobjetos histopatológicos. Se ha propuesto que la displasia epitelial, la atrofia epitelial y los fibroblastos senescentes se asocian con la transformación maligna de la FSO. Sin embargo, debido a la heterogeneidad de los trastornos orales potencialmente malignos y del carcinoma oral de células escamosas, es difícil identificar los mecanismos moleculares específicos de la transformación maligna en la FSO. Aquí, presentamos un método para obtener un pequeño número de células epiteliales o mesenquimales portadoras de datos morfológicos e información espacial mediante microdisección por captura láser en portaobjetos de tejido fijados en formol e incluidos en parafina. Usando un microscopio, podemos capturar con precisión tejido epitelial displásico o atrófico a microescala (~500 células) y tejido subepitelial fibrótico. Las células extraídas pueden ser evaluadas mediante secuenciación genómica o transcriptómica para adquirir datos genómicos y transcriptómicos con información morfológica y espacial. Este enfoque elimina la heterogeneidad de la secuenciación de tejido OSF a granel y la interferencia causada por las células en áreas no lesionadas, lo que permite un análisis espacio-ómico preciso del tejido OSF.
Introduction
La fibrosis submucosa oral (FSO) es una enfermedad crónica e insidiosa que se desarrolla principalmente en la mucosa bucal y provoca una apertura bucal restringida1. Si bien la OSF es una enfermedad multifactorial, la masticación de la nuez de areca o la nuez de betel es la principal causa de la OSF 2,3. Debido a este hábito geográficamente específico, la PPO se concentra predominantemente en poblaciones del sudeste y sur de Asia3. Las características histológicas comunes de la OSF incluyen la deposición anormal de colágeno en el tejido conectivo debajo del epitelio de la mucosa oral, la estenosis vascular y la oclusión1. El tejido epitelial de la FSO puede presentar manifestaciones de atrofia o hiperplasia e incluso displasia cuando es concomitante con leucoplasia oral 4,5.
La Organización Mundial de la Salud define la OSF como un trastorno oral potencialmente maligno (OPMD, por sus siglas en inglés) común que exhibe el potencial de progresar a carcinoma oral de células escamosas con una tasa de transformación maligna del 4% al 6%6%6,7,8,9. El mecanismo que subyace a la transformación maligna de la FSO es complejo10. El crecimiento anormal del epitelio, incluyendo tanto la displasia como la atrofia, aumenta el potencial de carcinogénesis, y los fibroblastos senescentes en el estroma pueden estar involucrados en la progresión maligna de la OSF al inducir la transición epitelio-mesenquimal (EMT) a través de especies reactivas de oxígeno (ROS) y otras moléculas10.
Las tecnologías para el análisis espacio-ómico generaron datos multiómicos con información morfológica y espacial que han proporcionado información sobre los mecanismos del cáncer11,12,13. Aquí, presentamos un protocolo para capturar poblaciones celulares relacionadas con la morfología a partir de tejido OSF fijado en formol e incluido en parafina mediante microdisección láser. Los análisis multiómicos de estas muestras pueden superar los desafíos de la heterogeneidad intratisular y aumentar la comprensión de la patología molecular y los mecanismos de transformación maligna en OSF14.
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Protocol
Este estudio fue aprobado por la junta de revisión institucional de la Escuela y Hospital de la Universidad de Pekín. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes. Las muestras de tejido utilizadas en este estudio fueron desidentificadas. El esquema de estudio se muestra en la Figura 1.
1. Preparación de la muestra
- Corte tejidos de fibrosis submucosa oral fijados en formol e incluidos en parafina en secciones continuas de 3 μm y 10 μm de espesor en un micrótomo.
- Despliega las secciones en el agua y luego pesca en los toboganes. Fije las secciones de 3 μM y 10 μm en los portaobjetos del microscopio de adhesión (portaobjetos A) y en los portaobjetos de membrana PEN (portaobjetos B), respectivamente.
- Coloque los portaobjetos en una placa calefactora a 60 °C durante 2 h.
2. Tinción de hematoxilina-eosina
- Coloque los portaobjetos A y B en xileno (PRECAUCIÓN) durante 10 minutos y repita este paso tres veces.
- Hidratar los portaobjetos A y B en soluciones de etanol graduadas del orden de 100%, 100%, 90%, 80% y 70% durante 1 min en cada concentración.
- Coloque los portaobjetos A y B en agua destilada ultrapura durante 30 s
- Coloque los portaobjetos A y B en la solución de colorante de hematoxilina Harris durante 90 s.
- Coloque los portaobjetos A y B en agua destilada ultrapura durante 30 s y repita este paso tres veces.
- Coloque los portaobjetos A y B en una solución de div-hematoxilina (PRECAUCIÓN) durante 2 s.
- Coloque los portaobjetos A y B en agua destilada ultrapura durante 30 s y repita este paso tres veces.
- Coloque los portaobjetos en A y B en una solución re-azul al 1% durante 2 s.
- Coloque los portaobjetos A y B en agua destilada ultrapura durante 30 s y repita este paso tres veces.
- Coloque los portaobjetos en una solución de eosina durante 2 s.
- Coloque los portaobjetos A y B en agua destilada ultrapura durante 30 s y repita este paso tres veces.
- Deshidratar los portaobjetos en soluciones de etanol graduadas del orden de 70%, 80%, 90%, 100% y 100% durante 2 s en cada concentración.
- Coloque el portaobjetos A en xileno durante 3 minutos y repita este paso dos veces.
- Agregue una gota de medio de montaje (PRECAUCIÓN) para deslizar A y cúbralo con un cubreobjetos.
3. Observación de la morfología histológica y microdisección por captura láser
- Inicie el sistema y el software de microdisección láser (Figura 2).
- Coloque el portaobjetos A en la platina del portaobjetos y observe la morfología histológica para identificar el área de interés para la microdisección láser.
- Retire la diapositiva A y coloque la diapositiva B inversamente en la platina de la diapositiva.
- Haga clic en el botón Descargar (Figura 2) para enviar el dispositivo de recolección. Inserte un tubo de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) en el dispositivo de recolección y asegúrese de que el tubo se mantenga fijo. Haga clic en el botón Aceptar (Figura 3).
- Seleccione una tapa haciendo clic en el círculo rojo correspondiente que marca el dispositivo colector: Tapas de tubo. El círculo seleccionado se volverá verde.
- Haga clic en el botón Dibujar y en el botón Dibujar + Cortar y utilice el ratón para dibujar el área de interés.
- Haga clic en el botón Iniciar corte para capturar el área de interés; la muestra capturada será recogida por el tapón (Figura 4).
- Haga clic en el botón Inferior para asegurarse de que se recopila la muestra capturada (Figura 5).
- Haga clic en el botón Espécimen para capturar la siguiente muestra.
- Haga clic en el botón Descargar para descargar el tubo de PCR con la muestra capturada.
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Representative Results
Al realizar la microdisección láser de los tejidos OSF, capturamos muestras de epitelio displásico, estroma debajo del epitelio displásico, epitelio atrófico y estroma debajo del tejido epitelial atrófico (Figura 1). A través de la extracción de ADN y la secuenciación del genoma completo en baja profundidad, pudimos analizar las alteraciones en el número de copias (CNA) relacionadas con la morfología15. El CNA es una forma común de inestabilidad genómica asociada a un mayor riesgo de transformación maligna en la OPMD15,16. Se detectaron diferentes patrones de CNA entre cuatro tipos de muestras. Como se muestra en la Figura 6, el CNA estaba presente en las muestras epiteliales, pero no en las muestras de estroma. Aunque las muestras procedían del mismo paciente, el patrón de CNA en el epitelio displásico no era el mismo que en el epitelio atrófico. El CNA en los cromosomas 3 y 8 se detectó en el epitelio displásico, mientras que el CNA se detectó con menor frecuencia en el cromosoma 8 en el epitelio atrófico.
Figura 1: Esquema de microdisección por captura láser de muestras de fibrosis submucosa oral. Los tejidos del epitelio y el estroma con diferentes patrones se capturan con láser bajo un microscopio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Software de microdisección láser. Una captura de pantalla del software que muestra el panel en vivo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Ventana del dispositivo recopilador. Captura de pantalla del software que muestra la ventana del dispositivo colector para seleccionar el dispositivo de recolección. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Captura de la muestra en el área de interés. Al hacer clic en el botón Iniciar corte , se podrá capturar el área de interés. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Muestra capturada. La muestra capturada se puede ver en la tapa del tubo de PCR. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Alteraciones en el número de copias. Los resultados representativos de diferentes patrones de alteraciones en el número de copias entre varias muestras. Existen diferentes alteraciones en el número de copias entre el epitelio displásico y el epitelio atrófico. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Este protocolo reportó una tubería para capturar muestras de tejido OSF con información morfológica y espacial para posteriores análisis espaciales-ómicos a través de microdisección láser. A partir de los resultados representativos, se identificaron diferentes patrones de CNA entre varias muestras relacionadas con la morfología.
La OSF, un tipo de OPMD, es una afección precancerosa común del carcinoma oral de células escamosas6. Se ha descrito que la inestabilidad genómica está asociada con el desarrollo y la transformación maligna de la OPMD17,18. Múltiples estudios han reportado alteraciones cromosómicas, expresión génica diferencial y variaciones epigenéticas asociadas con la progresión y transformación maligna de la OSF a partir de datos genómicos, transcriptómicos y proteómicos 19,20,21,22,23,24. Los componentes cancerígenos de la nuez de areca, como la arecolina, no solo condujeron al desarrollo de OSF, sino que la estimulación a largo plazo también indujo la senescencia de fibroblastos y EMT y la producción continua de especies reactivas de oxígeno (ROS), lo que resultó en una transformación maligna mediante la regulación del microambiente inmunológico y las vías de señalización, como las señales de TGF-β y NF-κB5, 10,21. Sin embargo, tanto los cambios histológicos epiteliales como los estromales anormales están presentes en los tejidos de la OSF, y no está claro qué alteraciones tisulares o celulares impulsan la transformación maligna en la OSF. Los estudios anteriores han utilizado principalmente análisis de secuenciación masiva, en los que se extrajo ADN o ARN de un bloque de tejido para analizar más a fondo la expresión molecular y las vías implicadas. Sin embargo, este análisis careció de una correlación morfológica con la histología e ignoró la heterogeneidad intratisular; Además, este enfoque no puede identificar si existen alteraciones moleculares diferenciales en diferentes áreas histológicas.
Estudios recientes han reportado análisis espacial-ómicos en muchas enfermedades11,13,25. A través de análisis espacio-ómicos precisos, se está descubriendo un número cada vez mayor de moléculas y dianas y se están dilucidando las interacciones celulares y el agrupamiento11,12,13. Sin embargo, todavía hay una falta de análisis ómico espacialmente resuelto de OSF. Por lo general, las muestras de OSF se tomaban de biopsias de mucosa oral y se preparaban como pequeños volúmenes de muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, lo que dificultaba la realización de la secuenciación ómica espacial de una sola célula, que necesita muestras grandes. Por lo tanto, el desarrollo de métodos con resolución espacial utilizando muestras fijadas en formol e incluidas en parafina podría ser un beneficio significativo. Esperamos que el protocolo actual beneficie a los investigadores que trabajan en OSF y otros tipos de OPMD y contribuya a comprender los mecanismos del desarrollo y la transformación maligna de la OPMD.
Este método tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el protocolo se realizó utilizando muestras fijadas en formol e incluidas en parafina, lo que dificultó la extracción de ARN para el análisis de secuenciación; sin embargo, el análisis de secuenciación de ARN relacionado con la morfología se puede realizar cuando se utiliza la tinción de violeta cristalino y se mantienen prácticas asépticas15,26. Las muestras capturadas actualmente no podrían cumplir con el nivel de resolución de una sola célula porque cuando el número de células es demasiado pequeño, las células podrían ser descompuestas por el rayo láser, lo que afectaría la extracción de ADN.
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Disclosures
Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses.
Acknowledgments
Este trabajo fue apoyado por becas de investigación de la Fundación Nacional de Ciencias de la Naturaleza de China (81671006, 81300894), el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-038), el Proyecto Nacional de Construcción de Disciplinas Clínicas Clave (PKUSSNKP-202102), el Fondo de Innovación para Candidatos Sobresalientes a Doctorado del Centro de Ciencias de la Salud de la Universidad de Pekín (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
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