Summary
Laserinfångande mikrodissektion av orala submukösa fibrosvävnader möjliggör exakt extraktion av celler från histologiska regioner av intresse för analys av multi-omics-data med morfologisk och rumslig information.
Abstract
Oral submukös fibros (OSF) är en vanlig typ av potentiellt malign sjukdom i munhålan. Atrofi av epitel och fibros av lamina propria och submucosa finns ofta på histopatologiska objektglas. Epitelial dysplasi, epitelial atrofi och senescenta fibroblaster har föreslagits vara associerade med den maligna omvandlingen av OSF. På grund av heterogeniteten hos potentiellt maligna orala sjukdomar och orala skivepitelcancer är det dock svårt att identifiera de specifika molekylära mekanismerna för malign transformation vid OSF. Här presenterar vi en metod för att erhålla ett litet antal epitelceller eller mesenkymala celler som bär morfologiska data och rumslig information genom laserinfångning av mikrodissektion på formalinfixerade paraffininbäddade vävnadsglas. Med hjälp av ett mikroskop kan vi exakt fånga dysplastisk eller atrofisk epitelvävnad i mikroskala (~500 celler) och fibrotisk subepitelvävnad. De extraherade cellerna kan utvärderas genom genom- eller transkriptomsekvensering för att samla in genomiska och transkriptomiska data med morfologisk och rumslig information. Detta tillvägagångssätt tar bort heterogeniteten hos bulksekvensering av OSF-vävnad och den interferens som orsakas av celler i icke-lesionerade områden, vilket möjliggör exakt rumslig omics-analys av OSF-vävnad.
Introduction
Oral submukös fibros (OSF) är en kronisk, lömsk sjukdom som utvecklas främst i munslemhinnan och resulterar i begränsad munöppning1. Medan OSF är en multifaktoriell sjukdom, är tuggning av arekanötter eller betelnötter den främsta orsaken till OSF 2,3. På grund av denna geografiskt specifika vana är OSF främst koncentrerad till populationer iSydost- och Sydasien3. De vanliga histologiska kännetecknen för OSF inkluderar onormal kollagenavlagring i bindväven under munslemhinneepitelet, vaskulär stenos och ocklusion1. OSF-epitelvävnad kan uppvisa manifestationer av atrofi eller hyperplasi och till och med dysplasi vid samtidig behandling med oral leukoplaki 4,5.
OSF definieras av Världshälsoorganisationen som en vanlig oral potentiellt malign sjukdom (OPMD) som uppvisar potential att utvecklas till oral skivepitelcancer med en malign transformationshastighet på 4%-6%6%6,7,8,9. Mekanismen bakom den maligna omvandlingen av OSF är komplex10. Onormal tillväxt av epitelet, inklusive både dysplasi och atrofi, ökar risken för karcinogenes, och senescenta fibroblaster i stromat kan vara involverade i den maligna progressionen av OSF genom att inducera epitelial-mesenkymal övergång (EMT) genom reaktiva syrearter (ROS) och andra molekyler10.
Tekniker för rumsliga analyser genererade multi-omiska data med morfologisk och rumslig information som har gett insikter i cancermekanismer11,12,13. Här presenterar vi ett protokoll för att fånga morfologirelaterade cellpopulationer från formalinfixerad paraffininbäddad OSF-vävnad genom lasermikrodissektion. Multi-omiska analyser av dessa prover kan övervinna utmaningar med intravävnadsheterogenitet och öka förståelsen för den molekylära patologin och mekanismerna för malign transformation i OSF14.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denna studie godkändes av den institutionella granskningsnämnden vid Peking University School and Hospital. Informerat samtycke inhämtades från patienterna. Vävnadsproverna som användes i denna studie avidentifierades. Studieschemat visas i figur 1.
1. Beredning av prover
- Skär formalinfixerade paraffininbäddade orala submukösa fibrosvävnader i kontinuerliga sektioner med en tjocklek på 3 μm och 10 μm på en mikrotom.
- Vik ut sektionerna i vatten och fiska sedan ut på rutschkanorna. Fäst sektionerna på 3 μM och 10 μm på adhesionsglasen (bild A) respektive PEN-membranglasen (bild B).
- Lägg objektglasen på en värmeplatta vid 60 °C i 2 timmar.
2. Färgning av hematoxylin-eosin
- Placera objektglasen A och B i xylen (VARNING) i 10 minuter och upprepa detta steg tre gånger.
- Hydratglas A och B i graderade etanollösningar i storleksordningen 100 %, 100 %, 90 %, 80 % och 70 % i 1 minut i varje koncentration.
- Placera objektglasen A och B i ultrarent destillerat vatten i 30 s
- Placera objektglas A och B i Harris hematoxylinfärgämneslösning i 90 s.
- Placera objektglasen A och B i ultrarent destillerat vatten i 30 s och upprepa detta steg tre gånger.
- Placera objektglasen A och B i div-hematoxylinlösning (VARNING) i 2 s.
- Placera objektglasen A och B i ultrarent destillerat vatten i 30 s och upprepa detta steg tre gånger.
- Placera objektglasen i A och B i 1 % re-blue lösning i 2 s.
- Placera objektglasen A och B i ultrarent destillerat vatten i 30 s och upprepa detta steg tre gånger.
- Placera objektglasen i eosinlösning i 2 s.
- Placera objektglasen A och B i ultrarent destillerat vatten i 30 s och upprepa detta steg tre gånger.
- Torka objektglasen i graderade etanollösningar i storleksordningen 70 %, 80 %, 90 %, 100 % och 100 % i 2 s i varje koncentration.
- Placera objektglas A i xylen i 3 minuter och upprepa detta steg två gånger.
- Tillsätt en droppe monteringsmedium (VARNING) för att skjuta A och täck det med ett täckglas.
3. Observation av histologisk morfologi och laserfångstmikrodissektion
- Starta lasermikrodissektionssystemet och programvaran (Figur 2).
- Placera objektglas A på objektglaset stage och observera den histologiska morfologin för att identifiera intresseområdet för lasermikrodissektion.
- Ta bort bild A och placera bild B omvänt på bildscenen.
- Klicka på knappen Ta bort (bild 2) för att trycka ut uppsamlingsenheten. Sätt in ett polymeraskedjereaktionsrör (PCR) i uppsamlingsanordningen och se till att röret hålls fast. Klicka på OK-knappen (bild 3).
- Välj ett lock genom att klicka på motsvarande röda cirkel som markerar Collector Device: Tube Caps. Den valda cirkeln blir grön.
- Klicka på Rita knappen och Rita + Klipp ut knappen och använd musen för att skissa intresseområdet.
- Klicka på Start Cut för att fånga intresseområdet; Det insamlade provet kommer att samlas in av locket (figur 4).
- Klicka på knappen Nedre för att se till att det tagna provet samlas in (Figur 5).
- Klicka på knappen Prov för att ta nästa exempel.
- Klicka på knappen Lossa för att lossa PCR-röret med det tagna sample.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genom att utföra lasermikrodissektion av OSF-vävnader tog vi prover av dysplastiskt epitel, stroma under det dysplastiska epitelet, atrofiskt epitel och stroma under atrofisk epitelvävnad (Figur 1). Genom att extrahera DNA och helgenomsekvensering på ett lågt djup kunde vi analysera morfologirelaterade kopienummerförändringar (CNA)15. CNA är en vanlig form av genomisk instabilitet som är förknippad med en ökad risk för malign transformation vid OPMD15,16. Vi upptäckte olika CNA-mönster bland fyra typer av prover. Som framgår av figur 6 förekom CNA i epitelprover men inte i stromaprover. Även om proverna härrörde från samma patient, var CNA-mönstret i det dysplastiska epitelet inte detsamma som i det atrofiska epitelet. CNA i kromosom 3 och 8 detekterades i dysplastiskt epitel, medan CNA detekterades med en lägre frekvens i kromosom 8 i atrofiskt epitel.
Figur 1: Schemat för laserfångst av mikrodissektion av orala submukösa fibrosprover. Vävnaderna av epitel och stroma med olika mönster fångas med laser under ett mikroskop. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Programvara för lasermikrodissektion. En skärmdump av programvaran som visar livepanelen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 3: Fönstret Samlarenhet. En skärmdump av programvaran som visar fönstret för insamlingsenheten för att välja insamlingsenhet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 4: Fånga provet i det intressanta området. Genom att klicka på Start Cut-knappen kan du fånga intresseområdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 5: Taget prov. Det fångade provet kan ses i locket på PCR-röret. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Bild 6: Ändringar av kopieringsnummer. Representativa resultat av olika mönster för kopienummerförändringar bland olika prover. Det finns olika kopienummerförändringar mellan dysplastiskt epitel och atrofiskt epitel. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Detta protokoll rapporterade en pipeline för att fånga OSF-vävnadsprover med morfologisk och rumslig information för ytterligare rumsliga analyser genom lasermikrodissektion. Från de representativa resultaten identifierade vi olika CNA-mönster bland olika morfologirelaterade prover.
OSF, en typ av OPMD, är ett vanligt precanceröst tillstånd av oral skivepitelcancer6. Genomisk instabilitet har rapporterats vara associerad med utveckling och malign transformation av OPMD17,18. Flera studier har rapporterat kromosomförändringar, differentiellt genuttryck och epigenetiska variationer associerade med progression och malign transformation av OSF från genomik-, transkriptomik- och proteomikdata 19,20,21,22,23,24. De cancerframkallande komponenterna i arekanöt, såsom arekolin, ledde inte bara till utvecklingen av OSF, utan den långsiktiga stimuleringen inducerade också åldrandet av fibroblaster och EMT och kontinuerlig produktion av reaktiva syrearter (ROS), vilket resulterade i malign transformation genom att reglera immunmikromiljön och signalvägar såsom TGF-β och NF-κB-signaler5, 10,21. Både onormala epitel- och stromala histologiska förändringar finns dock i OSF-vävnader, och vilka vävnads- eller cellförändringar som driver den maligna omvandlingen i OSF är fortfarande oklart. Tidigare studier har mestadels använt sig av bulksekvenseringsanalyser, där DNA eller RNA extraherades från ett vävnadsblock för att ytterligare analysera det molekylära uttrycket och de involverade vägarna. Denna analys saknade dock en morfologisk korrelation med histologi och ignorerade heterogeniteten inom vävnaden; Dessutom kan detta tillvägagångssätt inte identifiera om det finns differentiella molekylära förändringar i olika histologiska områden.
Nyligen genomförda studier har rapporterat spatial-omics-analys i många sjukdomar11,13,25. Genom exakt spatial-omics-analys upptäcks ett ökande antal molekyler och mål och cellulära interaktioner och kluster klarläggs11,12,13. Det saknas dock fortfarande en rumsligt upplöst omics-analys av OSF. OSF-prover togs vanligtvis från biopsier av munslemhinnor och bereddes som små volymer av formalinfixerade, paraffininbäddade prover, vilket gör det svårt att utföra encellssekvensering av rumslig omics, vilket kräver stora prover. Därför kan utvecklingen av metoder med rumslig upplösning med hjälp av formalinfixerade paraffininbäddade prover vara en betydande fördel. Vi förväntar oss att det nuvarande protokollet kommer att gynna forskare som arbetar med OSF och andra typer av OPMD och bidra till att förstå mekanismerna för utveckling och malign omvandling av OPMD.
Den här metoden har vissa begränsningar. Först utfördes protokollet med hjälp av formalinfixerade paraffininbäddade prover, vilket gjorde det svårt att extrahera RNA för sekvenseringsanalys; Morfologirelaterad RNA-sekvenseringsanalys kan dock utföras vid användning av kristallin violett färgning och upprätthållande av aseptiska metoder15,26. De för närvarande infångade proverna kunde inte uppfylla nivån för encellsupplösning eftersom när antalet celler är för litet kan cellerna brytas ner av laserstrålen, vilket påverkar DNA-extraktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna deklarerar att det inte föreligger någon intressekonflikt.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av forskningsanslag från National Nature Science Foundation of China (81671006, 81300894), CAMS Innovation Fund for Medical Sciences (2019-I2M-5-038), National clinical key discipline construction project (PKUSSNKP-202102), Innovation Fund for Outstanding Doctoral Candidates of Peking University Health Science Center (BMU2022BSS001).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
