Summary
Oral submukoz fibroz dokularının lazer yakalama mikrodiseksiyonu, morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik verilerin analizi için ilgilenilen histolojik bölgelerden hücrelerin hassas bir şekilde çıkarılmasına izin verir.
Abstract
Oral submukoz fibrozis (OSF), ağız boşluğunda yaygın olarak görülen potansiyel olarak malign bir bozukluk türüdür. Epitel atrofisi ve lamina propria ve submukoza fibrozisi sıklıkla histopatolojik slaytlarda bulunur. Epitelyal displazi, epitelyal atrofi ve yaşlanan fibroblastların OSF'nin malign transformasyonu ile ilişkili olduğu öne sürülmüştür. Bununla birlikte, potansiyel olarak malign oral bozuklukların ve oral skuamöz hücreli karsinomun heterojenliği nedeniyle, OSF'de malign transformasyonun spesifik moleküler mekanizmalarını tanımlamak zordur. Burada, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü doku preparatları üzerinde lazer yakalama mikrodiseksiyonu ile morfolojik veri ve uzamsal bilgi taşıyan az sayıda epitelyal veya mezenkimal hücre elde etmek için bir yöntem sunuyoruz. Mikroskop kullanarak, mikro ölçekli (~ 500 hücre) displastik veya atrofik epitel dokusunu ve fibrotik subepitel dokusunu hassas bir şekilde yakalayabiliriz. Ekstrakte edilen hücreler, morfolojik ve mekansal bilgilerle genomik ve transkriptomik veriler elde etmek için genom veya transkriptom dizilimi ile değerlendirilebilir. Bu yaklaşım, toplu OSF doku diziliminin heterojenliğini ve lezyonsuz alanlardaki hücrelerin neden olduğu girişimi ortadan kaldırarak, OSF dokusunun hassas uzamsal-omik analizine izin verir.
Introduction
Oral submükoz fibrozis (OSF), esas olarak bukkal mukozada gelişen ve ağız açıklığının kısıtlanması ile sonuçlanan kronik, sinsi bir hastalıktır1. OSF multifaktöriyel bir hastalık iken, areca fıstığı veya tembul fıstığı çiğneme OSF 2,3'ün ana nedenidir. Coğrafi olarak spesifik olan bu alışkanlık nedeniyle, OSF ağırlıklı olarak Güneydoğu ve Güney Asya'daki popülasyonlarda yoğunlaşmıştır3. OSF'nin yaygın histolojik özellikleri arasında oral mukozal epitelin altındaki bağ dokusunda anormal kollajen birikimi, vasküler stenoz ve oklüzyon1 yer alır. OSF epitel dokusu, oral lökoplaki ile birlikte olduğunda atrofi veya hiperplazi ve hatta displazi belirtileri ile ortaya çıkabilir 4,5.
OSF, Dünya Sağlık Örgütü tarafından %4-%6 malign dönüşüm oranı ile oral skuamöz hücreli karsinomlara ilerleme potansiyeli sergileyen yaygın bir oral potansiyel malign bozukluk (OPMD) olarak tanımlanmaktadır6,7,8,9. OSF'nin malign dönüşümünün altında yatan mekanizma kompleks10'dur. Hem displazi hem de atrofi dahil olmak üzere epitelin anormal büyümesi, karsinogenez potansiyelini arttırır ve stromadaki yaşlanan fibroblastlar, reaktif oksijen türleri (ROS) ve diğer moleküller yoluyla epitelyal-mezenkimal geçişi (EMT) indükleyerek OSF'nin malign ilerlemesinde rol oynayabilir10.
Mekansal-omik analizler için teknolojiler, kanser mekanizmaları hakkında içgörü sağlayan morfolojik ve mekansal bilgilerle multi-omik veriler üretti11,12,13. Burada, lazer mikrodiseksiyon ile formalinle sabitlenmiş parafine gömülü OSF dokusundan morfoloji ile ilişkili hücre popülasyonlarını yakalamak için bir protokol sunuyoruz. Bu örneklerin multi-omik analizleri, doku içi heterojenlik ile ilgili zorlukların üstesinden gelebilir ve OSF14'teki moleküler patolojinin ve malign transformasyon mekanizmalarının anlaşılmasını artırabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma, Pekin Üniversitesi Okul ve Hastanesi kurumsal inceleme kurulu tarafından onaylanmıştır. Hastalardan bilgilendirilmiş onam alındı. Bu çalışmada kullanılan doku örnekleri tanımlandı. Çalışma şeması Şekil 1'de gösterilmiştir.
1. Numune hazırlama
- Formalinle sabitlenmiş parafine gömülü oral submukoz fibroz dokularını bir mikrotom üzerinde 3 μm ve 10 μm kalınlığında sürekli bölümler halinde kesin.
- Bölümleri suda açın ve ardından kaydırakların üzerine balık tutun. 3 μM ve 10 μm'lik bölümleri sırasıyla yapışma mikroskobu slaytlarına (slayt A) ve PEN membran slaytlarına (slayt B) sabitleyin.
- Slaytları 2 saat boyunca 60 °C'de bir sıcak plaka üzerine yerleştirin.
2. Hematoksilen-eozin boyama
- A ve B slaytlarını 10 dakika boyunca ksilene (DİKKAT) yerleştirin ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Hidrat, derecelendirilmiş etanol çözeltilerinde A ve B'yi her konsantrasyonda 1 dakika boyunca %100, %100, %90, %80 ve %70 sırasına göre kaydırır.
- A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun
- A ve B slaytlarını 90 saniye boyunca Harris hematoksilen boya çözeltisine yerleştirin.
- A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
- A ve B slaytlarını 2 saniye boyunca div-hematoksilen çözeltisine (DİKKAT) yerleştirin.
- A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Slaytları A ve B'ye 2 saniye boyunca% 1 yeniden mavi çözelti içinde yerleştirin.
- A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Slaytları 2 saniye boyunca eozin çözeltisine yerleştirin.
- A ve B slaytlarını 30 saniye boyunca ultra saf damıtılmış suya koyun ve bu adımı üç kez tekrarlayın.
- Slaytları dereceli etanol çözeltilerinde her konsantrasyonda 2 saniye boyunca %70, %80, %90, %100 ve %100 sırasına göre kurutun.
- Slayt A'yı 3 dakika boyunca ksilene yerleştirin ve bu adımı iki kez tekrarlayın.
- A'yı kaydırmak için bir damla montaj ortamı (DİKKAT) ekleyin ve bir kapak camı ile örtün.
3. Histolojik morfolojinin gözlenmesi ve lazer yakalama mikrodiseksiyonu
- Lazer mikrodiseksiyon sistemini ve yazılımını başlatın (Şekil 2).
- Slayt A'yı slayt tablasına yerleştirin ve lazer mikrodiseksiyonu için ilgilenilen alanı belirlemek için histolojik morfolojiyi gözlemleyin.
- A slaytını çıkarın ve B slaytını slayt sahnesine ters olarak yerleştirin.
- Toplama cihazını dışarı itmek için Kaldır düğmesine (Şekil 2) tıklayın. Toplama cihazına bir polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpü yerleştirin ve tüpün sabit tutulduğundan emin olun. Tamam düğmesine tıklayın (Şekil 3).
- Toplayıcı Aygıt: Tüp Kapakları'nı işaretleyen ilgili kırmızı daireye tıklayarak bir kapak seçin. Seçilen daire yeşile dönecektir.
- Çiz düğmesini ve Çiz + Kes düğmesini tıklayın ve ilgilendiğiniz alanı çizmek için fareyi kullanın.
- Tıkla Kesimi Başlat İlgilenilen alanı yakalamak için düğmesine basın; yakalanan numune kapak tarafından toplanacaktır (Şekil 4).
- Yakalanan örneğin toplandığından emin olmak için Alt düğmeye tıklayın (Şekil 5).
- Bir sonraki örneği yakalamak için Numune düğmesine tıklayın.
- Tıkla Boşalt PCR tüpünü yakalanan sample ile boşaltmak için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
OSF dokularının lazer mikrodiseksiyonu ile displastik epitel, displastik epitel altında stroma, atrofik epitel ve atrofik epitel dokusu altında stroma örnekleri elde edildi (Şekil 1). DNA'nın çıkarılması ve düşük derinlikli tüm genom dizilimi yoluyla, morfolojiyle ilgili kopya sayısı değişikliklerini (CNA) analiz edebildik15. CNA, OPMD15,16'da artmış malign transformasyon riski ile ilişkili yaygın bir genomik instabilite şeklidir. Dört çeşit örnek arasında farklı CNA desenleri tespit ettik. Şekil 6'da gösterildiği gibi, CNA epitel örneklerinde mevcuttu, ancak stroma örneklerinde yoktu. Örnekler aynı hastadan alınmasına rağmen, displastik epiteldeki CNA paterni atrofik epiteldeki ile aynı değildi. Displastik epitelde kromozom 3 ve 8'de CNA saptanırken, atrofik epitelde kromozom 8'de daha düşük frekansta CNA saptandı.
Şekil 1: Oral submukoz fibrozis örneklerinin lazer yakalama mikrodiseksiyonunun şeması. Farklı desenlere sahip epitel ve stroma dokuları mikroskop altında lazerle yakalanır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Lazer mikrodiseksiyon yazılımı. Canlı paneli gösteren yazılımın ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Toplayıcı cihaz penceresi. Toplama cihazını seçmek için toplayıcı cihaz penceresini gösteren yazılımın ekran görüntüsü. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: İlgilenilen alandaki numunenin yakalanması. Kesmeyi Başlat düğmesine tıklamak, ilgilenilen alanın yakalanmasına izin verecektir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Yakalanan örnek. Yakalanan örnek, PCR tüpünün kapağında görülebilir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Kopya numarası değişiklikleri. Çeşitli örnekler arasında farklı kopya numarası değişikliklerinin temsili sonuçları. Displastik epitel ve atrofik epitel arasında farklı kopya sayısı değişiklikleri vardır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu protokol, lazer mikrodiseksiyon yoluyla daha fazla mekansal-omik analiz için morfolojik ve mekansal bilgilerle OSF doku örneklerini yakalamak için bir boru hattı bildirdi. Temsili sonuçlardan, morfoloji ile ilgili çeşitli örnekler arasında farklı CNA kalıpları belirledik.
OPMD'nin bir türü olan OSF, oral skuamöz hücreli karsinomun yaygın bir prekanseröz durumudur6. Genomik instabilitenin OPMD17,18'in gelişimi ve malign transformasyonu ile ilişkili olduğu bildirilmiştir. Çok sayıda çalışma, genomik, transkriptomik ve proteomik verilerden OSF'nin ilerlemesi ve malign dönüşümü ile ilişkili kromozom değişiklikleri, diferansiyel gen ekspresyonu ve epigenetik varyasyonlar bildirmiştir 19,20,21,22,23,24. Arekolin gibi areca fıstığının kanserojen bileşenleri sadece OSF'nin gelişmesine yol açmakla kalmadı, aynı zamanda uzun süreli stimülasyon aynı zamanda fibroblastların ve EMT'nin yaşlanmasını ve reaktif oksijen türlerinin (ROS) sürekli üretimini indükledi, böylece bağışıklık mikroçevresini ve TGF-β ve NF-κB sinyalleri gibi sinyal yollarını düzenleyerek malign dönüşüme neden oldu5, 10,21. Bununla birlikte, OSF dokularında hem anormal epitelyal hem de stromal histolojik değişiklikler mevcuttur ve OSF'de hangi doku veya hücresel değişikliklerin malign dönüşümü tetiklediği belirsizliğini korumaktadır. Önceki çalışmalar çoğunlukla, moleküler ekspresyon ve ilgili yolları daha fazla analiz etmek için DNA veya RNA'nın bir doku bloğundan ekstrakte edildiği toplu dizileme analizlerini kullanmıştır. Bununla birlikte, bu analiz histoloji ile morfolojik bir korelasyondan yoksundu ve doku içi heterojenliği göz ardı etti; Ayrıca, bu yaklaşım farklı histolojik alanlarda diferansiyel moleküler değişiklikler olup olmadığını belirleyemez.
Son yıllarda yapılan çalışmalarda birçok hastalıkta mekansal-omik analizler bildirilmiştir11,13,25. Hassas mekansal-omik analizler sayesinde, artan sayıda molekül ve hedef keşfedilmekte ve hücresel etkileşimler ve kümelenme aydınlatılmaktadır11,12,13. Bununla birlikte, OSF'nin uzamsal olarak çözülmüş omik analizinin hala eksikliği vardır. OSF örnekleri genellikle oral mukoza biyopsilerinden alındı ve küçük hacimlerde formalinle sabitlenmiş, parafine gömülü örnekler olarak hazırlandı, bu da büyük örneklere ihtiyaç duyan tek hücreli uzamsal omik dizilemenin gerçekleştirilmesini zorlaştırdı. Bu nedenle, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü numuneler kullanılarak uzamsal çözünürlüğe sahip yöntemlerin geliştirilmesi önemli bir fayda sağlayabilir. Mevcut protokolün OSF ve diğer OPMD türleri üzerinde çalışan araştırmacılara fayda sağlamasını ve OPMD'nin gelişim ve malign dönüşüm mekanizmalarının anlaşılmasına katkıda bulunmasını bekliyoruz.
Bu yöntemin bazı sınırlamaları vardır. İlk olarak, protokol, formalinle sabitlenmiş parafine gömülü numuneler kullanılarak gerçekleştirildi ve bu da dizileme analizi için RNA'nın çıkarılmasını zorlaştırdı; bununla birlikte, kristalin menekşe boyama kullanılırken ve aseptik uygulamalar sürdürülürken morfolojiye bağlı RNA dizileme analizi yapılabilir15,26. Şu anda yakalanan örnekler, tek hücre çözünürlüğü seviyesini karşılayamadı, çünkü hücre sayısı çok küçük olduğunda, hücreler lazer ışını tarafından parçalanabilir ve DNA ekstraksiyonunu etkileyebilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar herhangi bir çıkar çatışması beyan etmezler.
Acknowledgments
Bu çalışma, Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81671006, 81300894), CAMS Tıp Bilimleri İnovasyon Fonu (2019-I2M-5-038), Ulusal klinik anahtar disiplin inşaat projesi (PKUSSNKP-202102), Pekin Üniversitesi Sağlık Bilimleri Merkezi (BMU2022BSS001) Üstün Doktora Adayları için İnovasyon Fonu.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesion microscope slides | CITOTEST | REF.188105 | |
| Div-haematoxylin | YiLi | 20230326 | |
| Eosin solution | BASO | BA4098 | |
| Ethanol | PEKING REAGENT | No.32061 | |
| Harris hematoxylin dye solution | YiLi | 20230326 | |
| Hot plate | LEICA | HI1220 | |
| Laser capture microdissection system | LEICA | LMD7 | Machine |
| Laser microdissection microsystem | LEICA | 8.2.3.7603 | Software |
| Micromount mounting medium | LEICA | REF.3801731 | |
| Microscope cover glass | CITOTEST | REF.10212450C | |
| Microtome | LEICA | RM2235 | |
| PCR tubes | AXYGEN | 16421959 | |
| PEN-membrane slides | LEICA | No.11505158 | |
| Re-blue solution | YiLi | 20230326 | |
| Ultrapure distilled water | Invitrogen | REF.10977-015 | |
| Xylene | PEKING REAGENT | No.33535 |
References
- Cai, X., et al. Oral submucous fibrosis: A clinicopathological study of 674 cases in China. Journal of Oral Pathology & Medicine. 48 (4), 321-325 (2019).
- Cai, X., Huang, J. Clinicopathological factors associated with progression of oral submucous fibrosis: A population-based retrospective study. Oral Oncology. 130, 105949 (2022).
- Ray, J. G., Chatterjee, R., Chaudhuri, K. Oral submucous fibrosis: A global challenge. Rising incidence, risk factors, management, and research priorities. Periodontology 2000. 80 (1), 200-212 (2019).
- Shih, Y. H., Wang, T. H., Shieh, T. M., Tseng, Y. H. Oral submucous fibrosis: A Review on etiopathogenesis, diagnosis, and therapy. International Journal of Molecular Sciences. 20 (12), 2940 (2019).
- Cai, X., et al. The preliminary exploration of immune microenvironment in oral leukoplakia concomitant with oral submucosal fibrosis: A comparative immunohistochemical study. Journal of Oral Pathology & Medicine. , (2023).
- Warnakulasuriya, S., et al. Oral potentially malignant disorders: A consensus report from an international seminar on nomenclature and classification, convened by the WHO Collaborating Centre for Oral Cancer. Oral Diseases. 27 (8), 1862-1880 (2021).
- Cai, X., et al. Development and validation of a nomogram prediction model for malignant transformation of oral potentially malignant disorders. Oral Oncology. 123, 105619 (2021).
- Murthy, V., et al. Malignant transformation rate of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Journal of Clinical Medicine. 11 (7), 1793 (2022).
- Kujan, O., Mello, F. W., Warnakulasuriya, S. Malignant transformation of oral submucous fibrosis: A systematic review and meta-analysis. Oral Diseases. 27 (8), 1936-1946 (2020).
- Qin, X., Ning, Y., Zhou, L., Zhu, Y. Oral submucous fibrosis: Etiological mechanism, malignant transformation, therapeutic approaches and targets. International Journal of Molecular Sciences. 24 (5), 4992 (2023).
- Sun, L., et al. Single-cell and spatial dissection of precancerous lesions underlying the initiation process of oral squamous cell carcinoma. Cell Discovery. 9 (1), 28 (2023).
- Zhu, J., et al. Delineating the dynamic evolution from preneoplasia to invasive lung adenocarcinoma by integrating single-cell RNA sequencing and spatial transcriptomics. Experimental & Molecular Medicine. 54 (11), 2060-2076 (2022).
- Ji, A. L., et al. Multimodal analysis of composition and spatial architecture in human squamous cell carcinoma. Cell. 182 (2), 497-514 (2020).
- Van den Bossche, V., et al. Microenvironment-driven intratumoral heterogeneity in head and neck cancers: clinical challenges and opportunities for precision medicine. Drug Resistance Updates. 60, 100806 (2022).
- Li, X., et al. Improvement in the risk assessment of oral leukoplakia through morphology-related copy number analysis. Science China. Life sciences. 64 (9), 1379-1391 (2021).
- Watkins, T. B. K., et al. Pervasive chromosomal instability and karyotype order in tumour evolution. Nature. 587 (7832), 126-132 (2020).
- Odell, E. W. Aneuploidy and loss of heterozygosity as risk markers for malignant transformation in oral mucosa. Oral Diseases. 27 (8), 1993-2007 (2021).
- Wood, H. M., et al. The genomic road to invasion-examining the similarities and differences in the genomes of associated oral pre-cancer and cancer samples. Genome Medicine. 9 (1), 53 (2017).
- Venugopal, D. C., et al. Integrated proteomics based on 2D gel electrophoresis and mass spectrometry with validations: Identification of a biomarker compendium for oral submucous fibrosis-An indian study. Journal of Personalized Medicine. 12 (2), 208 (2022).
- Kundu, P., Pant, I., Jain, R., Rao, S. G., Kondaiah, P. Genome-wide DNA methylation changes in oral submucous fibrosis. Oral Diseases. 28 (4), 1094-1103 (2022).
- Cai, X., Zhang, H., Li, T. Multi-target pharmacological mechanisms of Salvia miltiorrhiza against oral submucous fibrosis: A network pharmacology approach. Archives of Oral Biology. 126, 105131 (2021).
- Xiao, X., Hu, Y., Li, C., Shi, L., Liu, W. DNA content abnormality in oral submucous fibrosis concomitant leukoplakia: A preliminary evaluation of the diagnostic and clinical implications. Diagnostic Cytopathology. 48 (11), 1111-1114 (2020).
- Zhou, S., et al. Long non-coding RNA expression profile associated with malignant progression of oral submucous fibrosis. Journal of Oncology. 2019, 6835176 (2019).
- Lunde, M. L., et al. Profiling of chromosomal changes in potentially malignant and malignant oral mucosal lesions from South and Southeast Asia using array-comparative genomic hybridization. Cancer Genomics & Proteomics. 11 (3), 127-140 (2014).
- Sun, C., et al. Spatially resolved metabolomics to discover tumor-associated metabolic alterations. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (1), 52-57 (2019).
- Ma, M., et al. Copy number alteration profiling facilitates differential diagnosis between ossifying fibroma and fibrous dysplasia of the jaws. International Journal of Oral Science. 13 (1), 21 (2021).
