Summary
Denne artikkelen tar sikte på å presentere en optimalisert metode for å vurdere venøs trombose i en musekreftmodell, ved hjelp av vaskulære klipp for å oppnå venøs ligering. Optimalisering minimerer variasjonen i tromboserelaterte målinger og øker relevansen for human kreftassosiert venetrombose.
Abstract
Denne metodeartikkelen fremhever de kirurgiske nyansene til en gnagermodell av venøs trombose, spesielt i sammenheng med kreftassosiert trombose (CAT). Dyp venøs trombose er en vanlig komplikasjon hos kreftoverlevende og kan være potensielt dødelig. De nåværende murine venøse trombosemodellene involverer vanligvis en fullstendig eller delvis mekanisk okklusjon av den dårligere vena cava (IVC) ved hjelp av en sutur. Denne prosedyren induserer en total eller delvis stasis av blod og endotelskader, som utløser trombogenese. De nåværende modellene har begrensninger som høyere variasjon i koagulasjonsvekter, signifikant dødelighet og langvarig læringskurve. Denne rapporten introduserer kirurgiske forbedringer ved hjelp av vaskulære klips for å løse noen av disse begrensningene. Ved hjelp av en syngen kolonkreft xenograft musemodell, benyttet vi tilpassede vaskulære klipp for å ligere den infrarenale vena cava. Disse klipsene tillater gjenværende leppeplass som ligner på en 5-0 polypropylen sutur etter IVC-ligeringer. Mus med suturmetoden fungerte som kontroller. Den vaskulære klipsmetoden resulterte i en konsistent reproduserbar partiell vaskulær okklusjon og større koagulasjonsvekter med mindre variabilitet enn suturmetoden. De større koagulasjonsvektene, større koagulasjonsmasse og koagulering til IVC-luminaloverflaten var forventet på grunn av den høyere trykkprofilen til vaskulære klemmer sammenlignet med en 6-0 polypropylensutur. Tilnærmingen ble validert med gråskala ultralyd, som viste gjennomgående større koagulasjonsmasse i infrarenal vena cava med vaskulære klips sammenlignet med suturmetoden. Disse observasjonene ble ytterligere underbygget med immunfluorescensfargingen. Denne studien gir en forbedret metode for å generere en venøs trombosemodell hos mus, som kan brukes til å utdype den mekanistiske forståelsen av CAT og i translasjonsforskning som narkotikaforskning.
Introduction
Kreftassosiert venøs tromboembolisme (VTE)
Venøs tromboembolisme (VTE) risiko er 4 til 7 ganger høyere hos kreftoverlevende sammenlignet med den generelle befolkningen 1,2,3. Denne tilstanden viser seg å være dødelig hos en av syv pasienter med kreft. Forekomsten av VTE varierer avhengig av type kreft og tumorbyrde og er høyest blant pasienter med kreft i bukspyttkjertelen og mage4.
Kreftassosiert VTE hos kreftpasienter har prognostisk betydning. Det er forbundet med ugunstig total overlevelse i det første året etter en kreftdiagnose, selv etter justering for alder, rase og stadium av underliggende kreft5. Disse funnene fremhever viktigheten av å undersøke kreftassosiert VTE og behovet for å undersøke mekanismen ved hjelp av en dyremodell. Den translasjonelle relevansen av dette området understrekes ytterligere av det faktum at VTE hos kreftpasienter kan forebygges og behandles med tromboseprofylakse og antitrombotisk behandling6.
Dyremodeller av kreft og venøs trombose
Kreftmodeller kalles konvensjonelt xenotransplantater, som innebærer injeksjon av kreftceller i mus. Injeksjonen av kreftceller på et sted som opprinnelsen blir referert til som en ortotopisk modell, mens på et annet sted (subkutant plan over flanken) er kjent som en heterotopisk modell. Kreftcellenes opprinnelsesart bestemmer dem som en allogen modell, slik som HT-29-cellelinjen (human tykktarmskreft)7,8,9. Tvert imot bruker syngene modeller murine kreftcellelinjer, inkludert RenCa og MC-38 cellelinjer 3,10.
Litteraturen har beskrevet arterielle, venøse og kapillære trombosemodeller hos gnagere. Venøs trombose induseres i den dårligere vena cava (IVC) ved mekanisk skade (ledetråd) eller fullstendig IVC-ligering, kjemisk (jernklorid) eller elektrolytisk skade. Jernkloridindusert trombose eller IVC-ligering representerer komplette okklusjonsmodeller. Sistnevnte resulterer i stasis av blod og inflammatoriske infiltrater i venene11,12,13. Den komplette ligeringsmodellen resulterer i en høy grad av trombosedannelse hos 95% til 100% av musene. Den partielle IVC-ligeringsmodellen kan inkludere avbrudd av laterale iliolumbargrener, og venøs retur oppheves ved å anvende suturligasjoner i de distale målpunktene til IVC12. Noen ganger brukes en plassholder til å avbryte venøs retur delvis. Imidlertid er trombusvekten inkonsekvent i den nåværende partielle okklusjonsmodellen, noe som resulterer i høy variasjon i koagulasjonsvekter og høyder12,14.
Begge disse store venemekaniske modellene (delvis og fullstendig) har begrensninger. For det første resulterer IVC-ligering (stasemodell) ofte i hypotensjon. Blodet blir shunted gjennom vertebrale vener. Selv om det er i erfarne hender, varierer dødeligheten med denne modellen fra 5% -30%, med den høyere frekvensen forventet under læringskurven. Det er viktig at den komplette okklusjonsmodellen ikke reproduserer dyp venetrombose (DVT) hos mennesker, hvor en trombose vanligvis ikke er okklusiv. Fullstendig okklusjon vil sannsynligvis endre hemoreologiske faktorer og farmakodynamiske parametere, og endre biotilgjengeligheten av forbindelser på det lokale stedet. På grunn av disse begrensningene kan det hende at komplette okklusjonsmodeller ikke er optimale for testing av nye kjemiske forbindelser for terapeutiske formål og narkotikafunn12.
Det skal bemerkes at for å gi en mer klinisk relevant murine modell av venøs trombose med redusert strømning med endotelskade, er det innført en venøs trombosemodell, hvor DVT utløses av begrensning av blodstrømmen i fravær av endotelforstyrrelser. Modellen ble validert ved skanning elektronmikroskopi15. En foretrukket klinisk relevant trombosemodell er en med nesten fullstendig trombose som muliggjør legemiddelfunn. Koagulasjonsdannelsen i dagens partielle okklusjonsmodeller er inkonsistent, noe som resulterer i høy variasjon i koagulasjonsvekt og -høyder12,16. Videre er koagulasjonsvekten variabel med de konvensjonelle metodene, og krever flere mus per studie12.
Tidligere kreftassosierte trombosemodeller fokuserte på tykktarms-, bukspyttkjertel- og lungekreft og var alle komplette okklusjonsmodeller17,18,19. Dette manuskriptet modifiserer modellen for partiell okklusjon trombose for å gi blodpropper med lavere variabilitet og musemortalitet (figur 1). Tidligere studier brukte allogene kreftcellelinjer på immunkompromitterte atymiske mus bakgrunn 19,20,21. Dette manuskriptet bruker et MC-38-cellesyngent xenograft i C57Bl6/J-mus, som tillater bruk av immunkompetente mus og undersøkelse av immunkomponenter mot trombogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
For denne studien ble 16 kvinnelige C57Bl6 / J-mus, 8-12 uker i alderen og en kroppsvekt på 20 til 25 g brukt. Musene ble plassert under vanlige forhold og ble matet med chow og vann ad libitum. Denne studien ble utført med godkjenning av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston University. De åpne prosedyrene som er beskrevet her, ble utført i steril tilstand.
1. Xenograft-modellen
- Cellekultur
- Før heterotopisk subkutan implantasjon, vokse MC-38 celler som et monolag til 80% konfluens.
- Etter trypsinisering og resuspensjon i 10 % FBS-inneholdende medier, sentrifugeceller ved 277 x g, 4 °C i 5 minutter. Deretter resuspenderes cellene i serumfrie medier til en konsentrasjon på 1 x 104 MC-38 celler / μL serumfrie medier.
- For trypsinisering, dyrk MC-38-cellene til de når en ønsket sammenløp (vanligvis rundt 70% -80%) og aspirer deretter kulturmediet fra petriskålen.
- Tilsett 1 ml trypsin-EDTA-oppløsning og inkuber cellene med trypsin i 1 min ved 37 °C for å tillate løsrivelse. Trykk eller rist petriskålen forsiktig for å sikre jevn løsrivelse.
- Legg til et kulturmedium som inneholder serum eller en trypsininhibitor for å nøytralisere aktiviteten og forhindre ytterligere celledissosiasjon. Samle de frittliggende cellene sammen med den nøytraliserte trypsinløsningen.
- For resuspensjon, når cellene er løsrevet gjennom trypsinisering, forberede dem for transplantasjon eller videre eksperimenter. Sentrifuge den oppsamlede cellesuspensjonen ved 277 x g for å pelletere cellene.
- Fjern forsiktig supernatanten (væske over cellepelleten). Tilsett 9 ml kulturmedium, buffer eller oppløsning til cellepelleten for å oppnå ønsket cellekonsentrasjon for transplantasjon eller eksperimentering.
- Forsiktig resuspendere cellene ved å pipettere opp og ned eller bruke en kultur kolbe shaker. Unngå kraftig pipettering som kan skade cellene.
MERK: Avhengig av varianten eller cellelinjen som brukes, kan celler resuspenderes i et 1: 1-forhold mellom solubilisert kjellermembranmatrise og serumfrie medier for å bremse svært aggressiv musecellevekst og spredning etter implantasjon. Alle cellekulturtrinn skal utføres i en komplett aseptisk hette i en cellekultur som er spesifikt tildelt plass, og ble regelmessig testet for mykoplasma.
- Tell cellene med en automatisert celleteller i henhold til den medfølgende manuelle protokollen.
- Celleimplantasjon
- Tilfeldig tilordne åtte mus til eksperimentell gruppe, og åtte mus til kontrollgruppen som følger. I kontrollgruppen, bruk mus med MC38 xenograft og utfør IVC-ligering med en polypropylen 5-0 sutur. I eksperimentgruppen, bruk mus med MC38 xenograft og utfør IVC-ligering med et tilpasset vaskulært klipp.
- Plasser musen i venstre lateral liggende og barber høyre side mellom forbenene og baklemmene. Påfør alkohol og jod langs det dorsale lumbalområdet for aseptisk å klargjøre området for injeksjon.
- Injiser 2 x 106 MC-38 celler fremstilt i 200 μL medium subkutant i flanken, halvveis mellom dyrets mest distale ribbe og bekkeneminens ved hjelp av en 27G nål mens du holder dyret forsiktig i den ikke-dominerende hånden.
- Etter injeksjonen, inspiser dyrene nøye og legg dem tilbake i buret. Dyrene bør inspiseres for følgende; 1. Endringer i atferd, aktivitetsnivå og generell mobilitet hos musene. Eventuelle vesentlige endringer kan indikere ubehag eller helseproblemer. 2. Den generelle fysiske tilstanden til musene, inkludert pelskvalitet, pleievaner og eventuelle synlige tegn på nød eller abnormiteter 3. Gå tilbake til matforbruk og vanninntak 4. Eventuelle endringer i aktivitetsnivå, holdning eller interaksjoner med burkamerater. Sløvhet eller økt aggresjon kan være tegn på nød.
2. Oppfølging av tumorvekst
- Overvåk dyrene annenhver uke for tumorveksttrender i 3-4 uker. Mål svulstene med en tykkelse og registrer tumordimensjonene.
- Mål svulstene langs deres lengste akse (L) og aksen vinkelrett på den lange aksen (W). Beregn tumorvolumet (V) ved hjelp av ligningen L x (W2) = V. Hvis svulststørrelsen overstiger 20 mm i hver dimensjon og eller svulsten har tegn på sårdannelse, avlive dyrene før forsøket avsluttes.
- Når tumorvolumet når 400 mm3, planlegger du å bruke musene til IVC-ligering.
3. Anestesi og forberedelse
- Bedøv musen i et isofluran kammer og injiser det smertestillende subkutant: Hold dyret fra bunnen av halen. Hold dyret på dorsumoverflaten av den ikke-dominerende hånden.
- Overfør dyret til induksjonskammeret for kontinuerlig bedøvelse fylt med 3%-4% isofluran. Bekreft tilstrekkelig generell anestesi med fravær av en tå-klemme refleks. Bruk en vedlikeholdsdose på 1-3% isofluran. Påfør veterinærsalve på begge øynene.
- Subkutan injeksjon med buprenorfin (opioid for å lindre smerte): Løs opp buprenorfinlageret i en konsentrasjon på 0,3 mg/ml i 0,9 % natriumklorid (NaCl) for å oppnå en konsentrasjon på 0,03 mg/ml.
- Injiser en dose på 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfin sammen med 500 μl steril 0,9% NaCl subkutant før kirurgi. I en 20 g musmengde på 2 μg eller 66 μL 0,03 mg/ml buprenorfin er nødvendig.
- Hudforberedelse: Plasser den fullt bedøvede musen i liggende stilling over varmeteppet. Desinfiser det fremre bukområdet med 0,5% klorhexidintinktur, 2x. Kontroller ofte temperaturen på varmeteppet under prosedyren og sørg for at temperaturen ikke faller.
4. IVC ligering
- Midline laparotomi
- Snitt bukhuden med fin saks fra xiphoidal eminens til blæren. Klem bukhinnen halvveis langs hudsnittet med atraumatiske tang. Sørg for tilstrekkelig avstand mellom snittet og de overliggende tarmene (figur 2A).
- Åpne bukhinnen på en langsgående måte sammen med avaskulær linea alba.
- Eksteriorisering av tarmene til høyre bukside
- Trekk tarmene med våte bomullstips. Dekk tarmene i en helt fuktig steril gasbind. Sørg for at de dekkede tarmene er i en trekkraftfri retning uten overdreven trekkraft på de mesenteriske karene.
- Full eksponering av IVC og grener, inkludert sammenløp av venstre nyrevene til IVC (figur 2B).
- Slipp 200-300 μL vanlig saltvann. Utforsk ureters, IVC, Aorta og nyrevener (figur 2).
- Avaskulært plan ved konfluenspunktet til infrarenal IVC og venstre nyrevenekonfluens.
- Pass polypropylen 6-0 suturen gjennom det avaskulære planet forsiktig 2x-3x med kaudale til cephalad bevegelser med den lukkede spissen atraumatiske tang.
- Sørg for at minimal osing kontrolleres med et forsiktig trykk forsynt med en bomullstopptamponade. Utvid det medfølgende flyet ved å passere 6-0 polypropylen sutur med milde kaudale til kraniale bevegelser.
- Cauterizing gonadal og lumbale grener (figur 2D)
- Opptil 4 bakre eller lumbale grener kan være til stede. For å unngå potensielle komplikasjoner av spinal iskemi og claudicatio, la lumbale grener intakt i gjeldende protokoll.
- Kontroller at 2 til 3 sidegrener, inkludert bilateral livmorhornarteriell forsyning og hypogastriske kar er tilstede. Sikre konsekvent forstyrrelse av de første bilateralt tilstedeværende grenene. Cauterize de bilaterale grenene bare distalt for sammenløpet av venstre nyrevene og IVC (infra-renal IVC). Sørg for at de venøse dreneringskarene i livmorhornet ikke forstyrres.
MERK: Sidegren cauterization er valgt fordi denne metoden gir en jevn og uavbrutt overflate, noe som reduserer potensialet for ukontrollert blødning. Videre er cauterization raskere og mer gjennomførbart enn suturligering med 10-0 suturer. Derfor vil dyrene bli utsatt for en kortere og sikrere prosedyre.
- Dobbeltsjekk urinledernes forløp og vaskulaturen for å sikre at det ikke oser eller utilsiktet cauterizing (figur 2C).
- IVC-ligering med vaskulære klemmer i eksperimentgruppen
- Tilpass vaskulære klipp med en bredde på 2-0 nylon sutur med atraumatiske tang. Påfør de tilpassede vaskulære klemmene i eksperimentgruppen rundt infrarenal IVC.
- Påfør de vaskulære klemmene over suturen. Den primære suturpassasjen gir et tilstrekkelig avvaskulært plan med to til tre nitide kaudale til kraniale bevegelser (figur 2E-F).
- Videre passere de vaskulære klippene gjennom det forberedte planet. Forbered planet ved sammenløpet av venstre nyrevene og IVC bredt nok til å tillate en begivenhetsløs klipppassasje (figur 2E).
- Plasser det tilpassede vaskulære klippet horisontalt, vinkelrett på IVC-kurset, gjennom det forberedte planet. Plasser vaskulære klemmer over 5-0 polypropylen sutur for å sikre tilstrekkelig gjenværende plass (figur 2G).
- Forsikre deg om at trinnene ovenfor utføres forsiktig for å forhindre skade på fartøyet eller blødning på stedet for vaskulære klemmer. Observer det kirurgiske feltet for potensiell oser. Påfør forsiktig trykk med bomullsspissen til det kirurgiske feltet i tilfelle oser.
- IVC Ligering med sutur i kontrollgruppen
- Suturligering med 6-0 polypropylen sutur. Lag en kirurgisk firkantet knute sutur rundt infra-renal IVC i det forberedte planet over en 5-0 silke sutur.
- Når suturen er fullført, fjern forsiktig silkesuturen for å sikre tilstrekkelig restplass.
- Utfør subkutan injeksjon av 200 μL vanlig saltvann.
MERK: For å gi en sammenlignbar teknikk for delvis IVC-okklusjon med klemmepåføring, er det vaskulære klippet tilpasset i den nåværende studien for å gi plass mellom leppene. Det vaskulære klippet plasseres deretter i det fremstilte avvaskulære planet i sammenløpet av venstre nyrevene og IVC. - Lukk laparotomien med kontinuerlig løping 4-0 vicryl sutur.
5. Oppfølging etter indeksoperasjonen
- Overvåk dyret kontinuerlig etter operasjon i 1 time eller til balanse og rettingsevne er gjenvunnet, uansett hva som kommer først i et isolert rent bur til det er fullstendig restituert.
- Overvåk dyret daglig i 2 dager. Hvis dyret ser bekymret ut, må du overvåke det to ganger om dagen i 2 dager. Administrer postoperativ analgesi og væsker i henhold til protokoll.
- Løs opp buprenorfinbestanden med en konsentrasjon på 0,3 mg/ml i 0,9 % natriumklorid (NaCl) for å oppnå en konsentrasjon på 0,03 mg/ml.
- Injiser en dose på 0,05-0,1 mg/kg på 0,03 mg/ml buprenorfin subkutant sammen med 500 mikroliter steril 0,9 % NaCl, hver 8. til 12. time i løpet av de første 48 timene etter indeksoperasjonen. I en 20 g mus vil det være behov for 2 μg eller 66 μL 0,03 mg/ml buprenorfin.
6. Eutanasi og høsting av IVC som inneholder blodproppen
- Bedøv musen i et isofluran kammer, hold dyret fra bunnen av halen og hold dyret på dorsumoverflaten av hånden.
- Overfør dyret til induksjonskammeret for kontinuerlig bedøvelse fylt med 3%-4% isofluran. Plasser dyret i den bakre posisjonen.
- Utfør en lang midtlinje laparotomi fra xiphoid til blæren som beskrevet.
- Eksterioriser tarmen til høyre side av abdomen og høst den fastklemte IVC distalt for iliaca bifurkasjonen i grad av infrarenal IVC (figur 2G).
- Etter koagulasjon og tumorhøsting, euthanize dyret med cervical dislokasjon.
7. Statistisk analyse
- Presentere statistisk analyse som gjennomsnitt, median og standardavvik (SD) eller standardfeil for gjennomsnittet (SEM), 25. eller 75. persentil, eller hele verdiområdet, inkludert minimums- og maksimumsverdier, etter behov. Utfør en Student t-test, og F-testen etter behov. Vurder statistisk signifikans på p <0,05 nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En gruppe kvinnelige C57Bl6/J-mus, 8-12 ukers alder, ble injisert med MC-38-celler i den logaritmiske fasen av celleveksten. Xenotransplantatene vokste raskt mellom tredje og fjerde uke etter injeksjon18. Når svulstene nådde et gjennomsnittlig volum på 400 mm3, ble mus randomisert til kontroll- og eksperimentgruppene. Kontrollgruppen gjennomgikk IVC-ligering med sutur, mens de eksperimentelle musene ble utsatt for IVC-ligering med vaskulær klipsapplikasjon. Tumorvolumene i kontroll- og eksperimentgruppene var sammenlignbare uten signifikante forskjeller (353 ± 100 mm 3 vs. 367 ± 46,2 mm3, p = 0,445). Infrarenal IVC til iliaca venenes bifurkasjonspunkt som inneholdt blodproppen ble høstet etter 48 timer, og koagulasjonsvektene fungerte som biologisk avlesning av venøs trombogenisitet. Det postoperative forløpet hos alle dyr i kontroll- og eksperimentgrupper var begivenhetsløst, uten tegn på misfarging av livmorhorn, muskel- og skjelettiskemi eller claudicatio-problemer i underekstremiteten. Under den andre laparotomien ble det ikke observert vaskulær klipsforskyvning. Ingen dødelighet ble observert før forsøkene ble avsluttet.
Koagulasjonsvekt til normalisert kroppsvektforhold
Da mus med xenograft sannsynligvis vil gå ned i kroppsvekt, ble blodproppvekter (i mg) normalisert til total kroppsvekt ved høsting (begge i mg). Nær en 1,5 ganger økning i normalisert koagulasjons-til-kroppsvekt ble observert hos mus i eksperimentgruppen (gjennomsnittlig ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) sammenlignet med kontrollmus (0,001453 ± 0,002666, P-verdi: 0,0019; Figur 3).
Immunfluorescensanalyse
Den histopatologiske evalueringen ble brukt til å undersøke IVC og blodpropper. De parafin-innebygde seksjonene fra infrarenal vena cava ble farget med anti-CD31 (en markør for endotelceller)20 og antifibrin, og DAPI (figur 4A).
Den infrarenale vena cava fra kontrollmus viste intakt CD31-farging og fibrin som delvis okkuperte karets lumen. I eksperimentgruppen var CD31-ekspresjon ikke intakt, noe som tyder på endotelcelleskade og en stor blodpropp med fremtredende fibrinuttrykk. Åreveggen uttrykte også fibrinfarging (figur 4A).
For immunfluorescens ble monoklonalt antistoff fra fibrinmus brukt ved 1:1000 fortynning og inkubert over natten ved 4 °C. For CD31 ble det brukt et kaninpolyklonalt anti-CD31-antistoff validert for immunblott og IF (1:1000 og 1:100 over natten ved 4 °C). Dette antistoffet er kjent for å reagere mot mus, menneske og gris CD31. For IF besto de sekundære antistoffene av Alex Fluor 488, 594 og 647 ved 1:250 fortynning i 45 minutter ved romtemperatur.
For bildekvantifisering ble hele lysbildet skannet av et motorisert scenesystem. Bildene ble behandlet i ImageJ, hvor signalet ble konvertert til gråtoner, og antallet og intensiteten til piksler ble analysert som integrert tetthet. Området av venen ble merket som interesseområdet. Den integrerte tettheten av alle bildene ble normalisert til sitt område18.
Disse er vist å være oppregulert i modeller av kreftassosiert dyp venetrombose. Kvantifiseringen av flere bilder ble utført ved hjelp av integrert tetthetsanalyse, som tidligere gjort ved hjelp av bilde J18. Kontrollgruppen hadde signifikant lavere fibrinuttrykk sammenlignet med eksperimentgruppen (p:0.0080; Figur 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 gjennomsnitt ± SD). Spesielt var variansene i fibrinuttrykkene lavere i eksperimentelle sammenlignet med kontrollgruppen (F-statistikk, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
Ultralyd i gråtoner
Etter 2 dagers operasjon og like før koagulasjonshøsten gjennomgikk mus ultralyd i gråtoner. Mus i begge gruppene viste blodpropp i infrarenal vena cava. Blodproppene var imidlertid større hos musene med vaskulær klips. Representative ultralydbilder er vist i figur 5. En anechoic region av fartøyet antyder et patent lumen og en hyperechoic tetthet i fartøyet er indikativ for en organisert blodpropp. Den ligerte infrarenale vena cava av en mus fra kontrollgruppen viser en delvis blodpropp avgrenset av to gule pilspisser i figur 5A. I kontrast viser figur 5B en stor blodpropp som nesten okkluderer den infrarenale vena cava generert med en vaskulær klipsmodell (avbildet med to gule pilspisser og markert med hvite stjerner). Merk at den infrarenale vena cava kollapset i kontrollgruppen mens den ble forstørret i eksperimentgruppen, i samsvar med den større koagulasjonsbyrden i sistnevnte gruppe.
Begge analysene (ultralyd og IF) tyder på at eksperimentgruppen gjennomgående hadde større blodpropper enn kontrollgruppen.
Figur 1 Skjematisk fremstilling av IVC-Aorta og påføring av klippet over konfluens i venstre nyrevene (LRV)-IVC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Intraoperativ IVC-trombosemodell med klipsapplikasjon . (A) Midtlinje laparotomi. (B) Full eksponering av IVC, inkludert sammenløp av venstre nyrevene til IVC. (C) Demonstrere ureterforløpet og unngå iatrogene traumer til venstre ureter. (D) Cauterizing de gonadale grenene. (E) Disseksjon av IVC til venstre nyrevenekonfluenspunkt. (F) Passerer 5-0 polypropylen suturen gjennom dissekert plan for å utvide flyet for å passere suturen. (G) Passerer en vaskulær klemme gjennom det forberedte planet. (H) Koagulasjonsdannelse 48 timer etter IVC-klemmingen. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Gruppen mus med vaskulære klips IVC-ligering, hadde høyere normalisert koagulasjons-til-kroppsvektforhold. Gjennomsnittlig normalisert koagulasjons-til-kroppsvektforhold. Enheten av begge verdiene uttrykt i milligram. Feilfelt = SD. Student t-test ble brukt. P <0.0001 Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Økt fibrin og CD 31-uttrykk i gruppen mus med vaskulære klips IVC-ligering. De representative immunfluorescensbildene oppnådd ved 100x forstørrelse fra kontrollgruppen med IVC-ligering med sutur og fra eksperimentgruppen med IVC-ligering med vaskulære klips. Vist er tilfeldig valgte bilder per mus (N = 4 mus / gruppe). (A) Fibrin og CD31-uttrykk i kontroll- og eksperimentgruppene. To gule pilspisser markert med hvite stjerner skildrer den store blodproppen som nesten okkluderer IVC, som innebærer den delvis okkluderte IVC. (B) Den integrerte tettheten til Fibrin: Linjen representerer medianverdien. Studentens T-test ble utført. p-verdi = 0,0080. IF-farging av representative infrarenale vena cava-bilder, inkludert blodpropper i kontroll- og eksperimentgruppene og farget med anti-CD31 og Alexa Fluro sekundære antistoffer. 400x forstørrelse vises. Skalastenger = 100 μm. Feilfelt refererer til SEM. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Økt koagulasjonsoverflate innenfor delvis klemt IVC i gruppe mus med vaskulære klips IVC-ligering. De representative sonografibildene i gråtoner av kontroll- og eksperimentgruppen. (A) Representativt gråtonedopplerbilde av kontrollgruppen: En region av IVC viser en ekkoisk region som tyder på patentlumen, og den andre delen viser en hyperekkoisk region som indikerer blodproppen. (B) Representativt gråtonedopplerbilde av eksperimentgruppen: Den organiserte klumpen (hvit stjerne) innenfor IVC, som avbildet med gule pilspisser, var mer fremtredende i eksperimentgruppen. Videre dukket blodproppen opp på to forskjellige måter i sagittalseksjonen. En blodpropp som okkluderte det signifikante tverrsnittet av lumen ble også avgrenset på den andre siden av IVC. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I en syngen xenograft kolonkreftmodell observerer vi høyere trombogenisitet og uttrykk av koagulasjonsmarkører i eksperimentgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Det er viktig at variansen i alle disse parametrene var lavere i eksperimentgruppen sammenlignet med kontrollgruppen. Modifikasjonen innebar å introdusere en vaskulær klips med en spesifikk trykkprofil ved konfluenspunktet til IVC og venstre nyrevene. Klippet ble plassert over et avstandsstykke, som var en 5-0 polypropylen sutur. Denne modifikasjonen reduserer variasjonen i koagulasjonsstørrelse og trombosemarkører. Alle mus opplevde 100% overlevelse.
Tekniske nyanser
Prosedyren innebar spesiell oppmerksomhet på flere trinn. Etter laparotomi ble begge urinlederne grundig inspisert for å forhindre utilsiktet skade. For å oppnå optimal eksponering ble tarmene dekket av fuktig gasbind og holdt i høyre øvre kvadrant uten overdreven trekkraft. Deretter ble IVC-sidegrenene cauterized 2 til 3 mm vekk fra urinlederne, IVC og aorta for å forhindre skade på venene. Etter å ha sikret fullstendig hemostase ble flyet for IVC-ligering fremstilt. Det er viktig å merke seg at aorta og IVC hos mus er nært forbundet langs kurset, og forsøk på å dissekere dem kan føre til blødning og tap av dyret. Det eneste unntaket er venstre nyrevene og aorta-konfluenspunkt21. En suturpassasje ble deretter forberedt ved hjelp av ikke mer enn tre grundige, skarpe divergerende bevegelser med tang.
IVC-diameteren til en 8 til 12 uker gammel mus er rapportert å være i området ca. 0,3 til 0,5 mm. Den delvise IVC-ligeringsprosedyren skal sikre plass til å skille fra fullstendig ligering. I den aktuelle studien vurderte vi et 5-0 suturkaliber, tilsvarende 0,10 til 0,15 mm for avstandsstykket. Derfor ble leppeplassen for vaskulære klemmer justert for en 2-0 sutur for å gi tilstrekkelig plass til en 0,3 mm IVC og en 0,1 mm plass.
Polypropylensuturen ga en blodløs guide, slik at flyet kunne utvides med repeterende caudal til kraniebevegelsen for ytterligere 1 til 2 mm for å imøtekomme anvendelsen av vaskulære klemmer. Til slutt ble de tilpassede vaskulære klipsene med en gjenværende leppeplass som var kompatibel med en 5-0 polypropylen sutur plassert.
Valget for edle metallklemmer, som platina, for blodkarlukking, er drevet av det faktum at slikt materiale er relativt inert og reduserer materialindusert betennelse sammenlignet med spesifikke absorberbare og forsinkede absorberbare suturer22,23,24. Disse metallklemmene er motstandsdyktige mot kjemiske reaksjoner, noe som gjør dem stabile. Dette fører til et tryggere og mer effektivt alternativ med lavere risiko for betennelse sammenlignet med bruk av suturmaterialer.
Translasjonell relevans av modellen
Murine venøse trombosemodellene er fundamentalt forskjellige fra dyp venetrombose hos mennesker. For det første, i gnagermodeller, observeres koagulasjonsdannelsen i oppstrømsretningen. Imidlertid dannes kliniske VTer nedstrøms fra en nidus25,26. For det andre er årsakssammenhengene forskjellige mellom mennesker og musemodeller. Hos mennesker er koagulasjonsdannelse indekshendelsen etterfulgt av blodstrømsobstruksjon. Et unntak er May-Thurners syndrom. May-Thurner syndrom refererer til en medisinsk tilstand der økt eksternt trykk på venstre iliac vene, som ligger mellom ryggraden og høyre iliac arterie, øker risikoen for venstre iliac venetrombose, eller en blodpropp i venstre iliac vene. I musemodeller er hindringen for venøs strømning den primære hendelsen, noe som resulterer i svak blodstrøm og trombusdannelse25.
Sammenlignet med andre modeller, for eksempel lårbenselektrolytskademodellen12, gir IVC-stase en klar fordel. Det tillater undersøkelse av lokale terapeutiske tiltak, for eksempel IVC-filtre, kateterrettet trombolyse og endoluminal rekanalisering med å gi et miljø for koagulasjonsdannelse i nærvær av blodstrøm. Dermed undersøkes to armer av endotelskaden og stasen i denne modellen. Blodpropp i IVC er også forbundet med høyere forekomst av komplikasjoner, som lungeemboli. En begrensning er at IVC er et mindre vanlig sted for DVT hos mennesker.
3R-rammeverk (Reduction-Refinement-Replacement (3R)
Det er viktig å integrere 3Rs-rammeverket i dyremodeller. Integreringen av 3R-rammeverket begrenser dyrs lidelse og fremmer etisk og ansvarlig dyreforskningspraksis. 3R-ene gjelder for vårt nåværende funn siden vi ikke observerte dødelighet hos mus. Det er også mulig å bruke færre dyr i studier. Dermed kan antall mus og kostnadene reduseres.
Begrensninger ved studien
En mulig begrensning av klipsmetoden inkluderer et relativt smalt trykkprofilområde for de testede vaskulære klippene. Følgelig kan videre studier med et bredt spekter av trykkprofiler utformes. Tidligere studier har vist at immunkompromitterte stammemus er mer utsatt for koagulasjonsdannelse, og koagulasjonsvektene kan variere hos immunkompetente mus12. Fremtidige studier oppfordres til å undersøke omfanget av konsistens av koagulasjonsvekter i forskjellige musestammebakgrunner.
Konklusjon
Dagens metode gir et mer konsistent mål for venøs trombosestudie via en partiell IVC-ligeringsmodell. Vi håper at denne modifikasjonen vil gjøre det mulig å generere robuste og pålitelige murinmodeller for å undersøke konsekvensene av kreftassosiert trombose ved hjelp av forskjellige kreftmodeller med relevans for menneskelig sykdom.
Mens det nåværende arbeidet spesielt fokuserte på kreftassosiert trombose, vil det fremtidige arbeidet innebære å utføre en omfattende analyse av musemodeller av forskjellige comorbiditeter (som fedme, kronisk nyresvikt) og normale mus som øker risikoen for trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY og SL) og R01HL166608 (KR og VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
