Summary
Denne artikel har til formål at præsentere en optimeret metode til vurdering af venøs trombose i en musekræftmodel ved hjælp af vaskulære klip for at opnå venøs ligering. Optimering minimerer variabilitet i tromboserelaterede målinger og øger relevansen for human kræftassocieret venøs trombose.
Abstract
Dette metodepapir fremhæver de kirurgiske nuancer af en gnavermodel af venøs trombose, specifikt i forbindelse med kræftassocieret trombose (CAT). Dyb venøs trombose er en almindelig komplikation hos kræftoverlevende og kan være potentielt dødelig. De nuværende murin venøse trombose modeller involverer typisk en fuldstændig eller delvis mekanisk okklusion af den ringere vena cava (IVC) ved hjælp af en sutur. Denne procedure inducerer en total eller delvis stasis af blod og endotelskader, der udløser trombogenese. De nuværende modeller har begrænsninger såsom højere variation i koagulationsvægte, betydelig dødelighed og forlænget indlæringskurve. Denne rapport introducerer kirurgiske forbedringer ved hjælp af vaskulære klip for at løse nogle af disse begrænsninger. Ved hjælp af en syngeneisk xenograft musemodel for tyktarmskræft anvendte vi tilpassede vaskulære klip til at ligere den infrarenale vena cava. Disse klip tillader resterende læbeplads svarende til en 5-0 polypropylensutur efter IVC-ligationer. Mus med suturmetoden tjente som kontrol. Den vaskulære klipmetode resulterede i en konsistent reproducerbar partiel vaskulær okklusion og større koagulationsvægte med mindre variabilitet end suturmetoden. De større koagulationsvægte, større koagulationsmasse og blodprop til IVC-luminaloverfladearealet forventedes på grund af den højere trykprofil af de vaskulære klip sammenlignet med en 6-0 polypropylensutur. Fremgangsmåden blev valideret ved gråskala ultralyd, som afslørede konsekvent større koagulationsmasse i den infrarenale vena cava med vaskulære klip sammenlignet med suturmetoden. Disse observationer blev yderligere underbygget med immunofluorescensfarvningen. Denne undersøgelse tilbyder en forbedret metode til at generere en venøs trombosemodel hos mus, som kan anvendes til at uddybe den mekanistiske forståelse af CAT og i translationel forskning såsom lægemiddelopdagelse.
Introduction
Kræftassocieret venøs tromboemboli (VTE)
Venøs tromboemboli (VTE) risiko er 4 til 7 gange højere hos kræftoverlevende sammenlignet med den generelle befolkning 1,2,3. Denne tilstand viser sig dødelig hos en ud af syv patienter med kræft. Forekomsten af VTE varierer afhængigt af kræfttypen og tumorbyrden og er højest blandt patienter med kræft i bugspytkirtlen og i maven4.
Kræftassocieret VTE hos kræftpatienter har prognostisk betydning. Det er forbundet med ugunstig samlet overlevelse i det første år efter en kræftdiagnose, selv efter justering for alder, race og stadium af underliggende kræft5. Disse resultater understreger vigtigheden af at undersøge kræftrelateret VTE og behovet for at undersøge dens mekanisme ved hjælp af en dyremodel. Den translationelle relevans af dette område understreges yderligere af, at VTE hos kræftpatienter kan forebygges og behandles med tromboprofylakse og antitrombotisk behandling6.
Dyremodeller af kræft og venøs trombose
Kræftmodeller kaldes traditionelt xenotransplantater, som indebærer injektion af kræftceller i mus. Injektion af kræftceller på et sted som dets oprindelse kaldes en ortopisk model, mens det på et andet sted (subkutant plan over flanken) er kendt som en heterotopisk model. Kræftcellernes oprindelsesart bestemmer dem som en allogen model, såsom HT-29-cellelinjen (human tyktarmskræft)7,8,9. Tværtimod bruger syngeneiske modeller murine cancercellelinjerne, herunder RenCa- og MC-38-cellelinjer 3,10.
Litteraturen har beskrevet arterielle, venøse og kapillære trombosemodeller hos gnavere. Venøs trombose induceres i den ringere vena cava (IVC) ved mekanisk skade (styretråd) eller fuldstændig IVC-ligering, kemisk (jernchlorid) eller elektrolytisk skade. Ferrichlorid-induceret trombose eller IVC-ligering repræsenterer komplette okklusionsmodeller. Sidstnævnte resulterer i stasis af blod og inflammatoriske infiltrater i vener11,12,13. Den komplette ligeringsmodel resulterer i en høj trombosedannelse hos 95% til 100% af musene. Den partielle IVC-ligeringsmodel kan omfatte afbrydelse af laterale iliolumbale grene, og den venøse tilbagevenden ophæves ved at anvende suturligationer i de distale målpunkter for IVC12. Nogle gange bruges en rumholder til at afbryde den venøse tilbagevenden delvist. Trombosevægten er imidlertid inkonsekvent i den nuværende partielle okklusionsmodel, hvilket resulterer i høj variation i koagulationsvægte og højder12,14.
Begge disse store venemekaniske modeller (delvis og komplet) har begrænsninger. For det første resulterer IVC-ligering (stasismodel) ofte i hypotension. Blodet bliver shunted gennem hvirveldyr. Selvom den er i erfarne hænder, varierer dødeligheden med denne model fra 5% -30%, med den højere sats, der forventes under læringskurven. Det er vigtigt, at den komplette okklusionsmodel ikke reproducerer dyb venetrombose (DVT) hos mennesker, hvor en trombose typisk er nonocclusive. Fuldstændig okklusion vil sandsynligvis ændre hæmorheologiske faktorer og farmakodynamiske parametre, hvilket ændrer biotilgængeligheden af forbindelser på det lokale sted. På grund af disse begrænsninger er komplette okklusionsmodeller muligvis ikke optimale til test af nye kemiske forbindelser til terapeutiske formål og lægemiddelopdagelser12.
Det skal bemærkes, at for at tilvejebringe en mere klinisk relevant murine model af venøs trombose med nedsat flow med endotelskade er der indført en venøs trombosemodel, hvor DVT udløses af begrænsningen af blodgennemstrømningen i fravær af endotelforstyrrelser. Modellen blev valideret ved scanning elektronmikroskopi15. En foretrukken klinisk relevant trombosemodel er en med næsten fuldstændig trombose, der muliggør lægemiddelopdagelser. Koagulationsdannelsen i de nuværende partielle okklusionsmodeller er inkonsekvent, hvilket resulterer i høj variation i koagulationsvægten og højderne12,16. Desuden er koagulationsvægten variabel med de konventionelle metoder, hvilket kræver flere mus pr. Undersøgelse12.
Tidligere kræftassocierede trombosemodeller fokuserede på tyktarms-, bugspytkirtel- og lungekræft og var alle komplette okklusionsmodeller17,18,19. Dette manuskript ændrer modellen for delvis okklusionstrombose for at give blodpropper lavere variabilitet og musedødelighed (figur 1). Tidligere undersøgelser brugte allogene kræftcellelinjer på immunkompromitterede athymiske mus baggrund 19,20,21. Dette manuskript bruger en MC-38 celle syngeneisk xenograft i C57Bl6/J mus, som tillader brug af immunkompetente mus og undersøgelse af immunkomponenter til trombogenese.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Til denne undersøgelse blev der anvendt 16 C57Bl6/J-hunmus, 8-12 uger i alderen og en kropsvægt på 20 til 25 g. Musene blev opstaldet under standardforhold og blev fodret med chow og vand ad libitum. Denne undersøgelse blev udført med godkendelse af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Boston University. De åbne procedurer, der er beskrevet her, blev gennemført i steril tilstand.
1. Xenograft model
- Cellekultur
- Før heterotopisk subkutan implantation vokser MC-38-celler som et monolag til 80% sammenløb.
- Efter trypsinisering og resuspension i 10% FBS-holdige medier, centrifugeres celler ved 277 x g, 4 °C i 5 min. Derefter resuspenderes cellerne i serumfrie medier til en koncentration på 1 x 104 MC-38 celler/μL serumfrie medier.
- Til trypsinisering dyrkes MC-38-cellerne, indtil de når en ønsket sammenløb (normalt omkring 70% -80%) og aspirer derefter kulturmediet fra petriskålen.
- Tilsæt 1 ml trypsin-EDTA-opløsning og inkuber cellerne med trypsin i 1 min ved 37 °C for at tillade løsrivelse. Bank let på eller ryst petriskålen for at sikre jævn løsrivelse.
- Tilsæt et dyrkningsmedium indeholdende serum eller en trypsinhæmmer for at neutralisere aktiviteten og forhindre yderligere celledissociation. Saml de løsrevne celler sammen med den neutraliserede trypsinopløsning.
- Til resuspension, når cellerne er løsrevet gennem trypsinisering, forberede dem til transplantation eller yderligere forsøg. Den opsamlede cellesuspension centrifugeres ved 277 x g for at pelletere cellerne.
- Supernatanten (væske over cellepellet) fjernes forsigtigt. Tilsæt 9 ml dyrkningsmedium, buffer eller opløsning til cellepelleten for at opnå den ønskede cellekoncentration til transplantation eller forsøg.
- Cellerne resuspenderes forsigtigt ved pipettering op og ned eller ved hjælp af en kulturkolberyster. Undgå kraftig pipettering, der kan beskadige cellerne.
BEMÆRK: Afhængigt af den anvendte variant eller cellelinje kan celler resuspenderes i et 1: 1-forhold mellem opløselig kældermembranmatrix og serumfrie medier for at bremse meget aggressiv musecellevækst og formidling efter implantation. Alle cellekulturtrin skal udføres i en komplet aseptisk hætte i en cellekultur, der specifikt tildeles plads, og blev testet for mycoplasma regelmæssigt.
- Tæl cellerne med en automatiseret celletæller i henhold til den medfølgende manuelle protokol.
- Celleimplantation
- Tildel tilfældigt otte mus til forsøgsgruppen og otte mus til kontrolgruppen som følger. I kontrolgruppen skal du bruge mus med MC38 xenograft og udføre IVC-ligering med en polypropylen 5-0 sutur. I forsøgsgruppen skal du bruge mus med MC38 xenograft og udføre IVC-ligering med et tilpasset vaskulært klip.
- Placer musen i venstre lateral liggende og barber højre side mellem forbenene og bagbenene. Påfør alkohol og jod langs det dorsale lændehvirvelområde for aseptisk at forberede området til injektion.
- Der injiceres 2 x 106 MC-38 celler fremstillet i 200 μL medium subkutant i flanken, halvvejs mellem dyrets mest distale ribben og bækkeneminens ved hjælp af en 27G nål, mens dyret forsigtigt holdes i den ikke-dominerende hånd.
- Efter injektionen inspiceres dyrene omhyggeligt og sættes tilbage i buret. Dyrene bør inspiceres for følgende: 1. Ændringer i adfærd, aktivitetsniveauer og musenes samlede mobilitet. Eventuelle væsentlige ændringer kan indikere ubehag eller sundhedsmæssige problemer. 2. Musenes generelle fysiske tilstand, herunder pelskvalitet, plejevaner og eventuelle synlige tegn på angst eller abnormiteter 3. Tilbage til fødevareforbrug og vandindtag 4. Eventuelle ændringer i deres aktivitetsniveau, kropsholdning eller interaktioner med burkammerater. Sløvhed eller øget aggression kan være tegn på nød.
2. Opfølgning af tumorvækst
- Overvåg dyrene hver anden uge for tumorvæksttendenser i 3-4 uger. Mål tumorerne med en tykkelse og registrer tumordimensionerne.
- Mål tumorerne langs deres længste akse (L) og aksen vinkelret på den lange akse (W). Beregn tumorvolumenet (V) ved hjælp af ligningen L x (W2) = V. Hvis tumorstørrelsen overstiger 20 mm i hver dimension, og eller tumoren har tegn på sårdannelse, aflives dyrene inden forsøgets afslutning.
- Når tumorvolumenet når 400 mm3, skal du planlægge at bruge musene til IVC-ligering.
3. Anæstesi og forberedelse
- Bedøv musen i et isoflurankammer og injicer smertestillende subkutant: Hold dyret fra bunden af halen. Hold dyret på dorsum overfladen af den ikke-dominerende hånd.
- Overfør dyret til det kontinuerlige anæstetiske induktionskammer fyldt med 3% -4% isofluran. Bekræft tilstrækkelig generel anæstesi med fravær af en tåklemmerefleks. Brug en vedligeholdelsesdosis på 1%-3% isofluran. Påfør dyrlægesalve på begge øjne.
- Subkutan injektion med buprenorphin (opioid til lindring af smerter): Buprenorphinstammen opløses i en koncentration på 0,3 mg/ml i 0,9 % natriumchlorid (NaCl) for at opnå en koncentration på 0,03 mg/ml.
- Injicer en dosis på 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorphin sammen med 500 μL steril 0,9% NaCl subkutant før operationen. I en 20 g musemængde på 2 μg eller 66 μL 0,03 mg/ml buprenorphin er påkrævet.
- Hudforberedelse: Placer den fuldt bedøvede mus i liggende stilling over varmetæppet. Desinficere det forreste abdominalområde med 0,5% chlorhexidintinktur, 2x. Kontroller ofte temperaturen på varmetæppet under proceduren, og sørg for, at temperaturen ikke falder.
4. IVC ligering
- Midterlinie laparotomi
- Skær mavehuden med en fin saks, der starter fra xiphoidal eminence til blæren. Klem peritoneum halvvejs langs hudsnittet med atraumatiske tang. Sørg for tilstrækkelig plads mellem snittet og de overliggende tarme (figur 2A).
- Åbn bughinden i længderetningen sammen med avaskulær linea alba.
- Udvendig tarmdannelse til højre abdominalside
- Træk tarmene med våde bomuldsspidser. Dæk tarmene i en helt fugtig steril gasbind. Sørg for, at de dækkede tarme er i en trækfri retning uden overdreven trækkraft på mesenteriske kar.
- Fuld eksponering af IVC og grene, herunder sammenløbet af venstre nyrevene til IVC (figur 2B).
- Drop 200-300 μL normalt saltvand. Udforsk urinledernes, IVC, Aorta og nyrevenernes forløb (figur 2).
- Avaskulært plan ved sammenløbspunktet for den infrarenale IVC og den venstre renale venesammenløb.
- Før polypropylen 6-0 suturen gennem det avaskulære plan forsigtigt 2x-3x med kaudale til cephalad bevægelser med den lukkede spids atraumatiske tang.
- Sørg for, at enhver minimal udsivning kontrolleres med let tryk forsynet med en tamponade med bomuldsspids. Udvid det medfølgende plan ved at passere 6-0 polypropylensuturen med blide kaudale til kraniale bevægelser.
- Cauterizing gonadal og lændehvirvelgrene (figur 2D)
- Der kan være op til 4 bageste eller lændehvirvelgrene. For at undgå potentielle komplikationer af spinal iskæmi og claudicatio skal du lade lændehvirvelgrenene være intakte i den aktuelle protokol.
- Kontroller, at 2 til 3 sidegrener, herunder den bilaterale livmoderhornarteriel forsyning og hypogastriske kar er til stede. Sørg for konsekvent forstyrrelse af de første bilateralt tilstedeværende grene. Cauterize de bilaterale grene lige distalt til sammenløbet af venstre nyrevene og IVC (infra-renal IVC). Sørg for, at livmoderhornets venøse dræningsbeholdere ikke forstyrres.
BEMÆRK: Sidegrencauterization er valgt, fordi denne metode giver en glat og uafbrudt overflade, hvilket reducerer ethvert potentiale for ukontrolleret blødning. Desuden er cauterization hurtigere og mere gennemførlig end suturligering med 10-0 suturer. Derfor vil dyrene blive udsat for en kortere og sikrere procedure.
- Dobbelttjek urinledernes forløb og vaskulaturen for at sikre, at der ikke siver eller utilsigtet cauterizing (figur 2C).
- IVC-ligering med vaskulære klip i forsøgsgruppen
- Tilpas de vaskulære klip med en bredde på 2-0 nylonsutur ved atraumatiske tang. Påfør de tilpassede vaskulære klip i forsøgsgruppen omkreds omkring den infrarenale IVC.
- Påfør de vaskulære klip over suturen. Den primære suturpassage giver et tilstrækkeligt avaskulært plan med to til tre omhyggelige kaudale til kraniale bevægelser (figur 2E-F).
- Yderligere passere de vaskulære klip gennem det forberedte plan. Forbered planet ved sammenløbet af venstre nyrevene og IVC bredt nok til at tillade en begivenhedsløs klippassage (figur 2E).
- Placer det tilpassede vaskulære klip vandret, vinkelret på IVC-kurset, gennem det forberedte plan. Placer de vaskulære klip over 5-0 polypropylensuturen for at sikre tilstrækkelig resterende plads (figur 2G).
- Sørg for, at ovenstående trin udføres forsigtigt for at forhindre beskadigelse af kar eller blødning på stedet for vaskulære klip. Overhold det kirurgiske felt for potentiel osning. Påfør forsigtigt tryk med bomuldsspidsen til det kirurgiske felt i tilfælde af udsivning.
- IVC Ligation med sutur i kontrolgruppen
- Suturligering med 6-0 polypropylensutur. Lav en kirurgisk firkantet knudesutur omkring den infrarenale IVC i det forberedte plan over en 5-0 silkesutur.
- Når suturen er færdig, skal du forsigtigt fjerne silkesuturen for at sikre tilstrækkelig resterende plads.
- Udfør subkutan injektion af 200 μL normalt saltvand.
BEMÆRK: For at give en sammenlignelig teknik til delvis IVC-okklusion med klemmepåføring tilpasses vaskulær klip i den aktuelle undersøgelse for at give plads mellem læberne. Det vaskulære klip placeres derefter i det forberedte avaskulære plan i sammenløbet mellem venstre nyrevene og IVC. - Luk laparotomien med kontinuerlig løbende 4-0 vicryl sutur.
5. Opfølgning efter indeksoperationen
- Dyret overvåges kontinuerligt efter operationen i 1 time, eller indtil balancen og opretteevnen er genoprettet, uanset hvad der kommer først i et isoleret rent bur, indtil det er helt genoprettet.
- Overvåg dyret dagligt i 2 dage. Hvis dyret ser nødlidende ud, skal du overvåge det to gange om dagen i 2 dage. Administrer postoperativ analgesi og væsker pr. Protokol.
- Buprenorphin opløses med en koncentration på 0,3 mg/ml i 0,9% natriumchlorid (NaCl) for at opnå en koncentration på 0,03 mg/ml.
- Injicer en dosis på 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorphin subkutant sammen med 500 μL steril 0,9% NaCl hver 8. til 12. time i de første 48 timer efter indeksoperationen. I en mus på 20 g kræves 2 μg eller 66 μL 0,03 mg/ml buprenorphin.
6. Eutanasi og høstning af IVC indeholdende blodproppen
- Bedøv musen i et isoflurankammer, hold dyret fra bunden af halen og hold dyret på dorsumoverfladen af din hånd.
- Overfør dyret til det kontinuerlige anæstetiske induktionskammer fyldt med 3% -4% isofluran. Placer dyret i liggende stilling.
- Udfør en lang midterlinje laparotomi startende fra xiphoid til blæren som beskrevet.
- Udvendig tarmen til højre side af maven og høst den fastspændte IVC distale til iliac bifurcation i omfanget af infrarenal IVC (figur 2G).
- Efter blodproppen og tumorhøsten skal du aflive dyret med cervikal dislokation.
7. Statistisk analyse
- Præsentere statistisk analyse som middelværdi, median og standardafvigelse (SD) eller standardfejl for middelværdien (SEM), 25. eller 75. percentilen eller hele værdiområdet, herunder minimums- og maksimumsværdier, alt efter hvad der er relevant. Udfør en elev-t-test og F-testen efter behov. Vurder statistisk signifikans på p <0,05 niveau.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En gruppe kvindelige C57Bl6/J-mus, 8-12 uger gamle, blev injiceret med MC-38-celler i den logaritmiske fase af cellevæksten. Xenotransplantaterne voksede hurtigt mellem tredje og fjerde uge efter injektion18. Når tumorerne nåede et gennemsnitligt volumen på 400 mm3, blev mus randomiseret til kontrol- og eksperimentelle grupper. Kontrolgruppen gennemgik IVC-ligering med sutur, mens forsøgsmusene blev udsat for IVC-ligering med vaskulær klippåføring. Tumorvolumenerne i kontrol- og eksperimentelle grupper var sammenlignelige uden signifikante forskelle (353 ± 100 mm 3 vs. 367 ± 46,2 mm3, p = 0,445). Infrarenale IVC'er til iliacvenernes bifurcationspunkt indeholdende blodproppen blev høstet efter 48 timer, og koagulationsvægtene tjente som den biologiske aflæsning af venøs trombogenicitet. Det postoperative forløb hos alle dyr i kontrol- og forsøgsgrupper var begivenhedsløst uden tegn på misfarvning af livmoderhornet, muskuloskeletal iskæmi eller claudicatio problemer i underekstremiteterne. Under den anden laparotomi blev der ikke observeret nogen vaskulær klipforskydning. Der blev ikke observeret dødelighed før afslutningen af forsøgene.
Koagulationsvægt til normaliseret kropsvægtforhold
Da mus med xenograft sandsynligvis vil tabe kropsvægt, blev koagulationsvægten (i mg) normaliseret til den samlede kropsvægt på høsttidspunktet (begge i mg). Tæt på en 1,5 gange stigning i den normaliserede koagulationsvægt blev observeret hos mus i forsøgsgruppen (gennemsnit ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) sammenlignet med kontrolmus (0,001453 ± 0,002666, P-værdi: 0,0019; Figur 3).
Immunofluorescensanalyse
Den histopatologiske evaluering blev brugt til at undersøge IVC og blodpropper. De paraffinindlejrede sektioner fra infrarenale vena cava blev farvet med anti-CD31 (en markør for endotelceller)20 og antifibrin og DAPI (figur 4A).
Den infrarenale vena cava fra kontrolmus viste intakt CD31-farvning og fibrin, der delvist optog fartøjets lumen. I den eksperimentelle gruppe var CD31-ekspression ikke intakt, hvilket tyder på endotelcelleskader og en stor blodprop med fremtrædende fibrinekspression. Karvæggen udtrykte også fibrinfarvning (figur 4A).
Til immunfluorescens blev fibrinmusemonoklonalt antistof anvendt i 1:1000 fortynding og inkuberet natten over ved 4 °C. Til CD31 blev der anvendt et kaninpolyklonalt anti-CD31-antistof valideret til immunblots og IF (1:1000 og 1:100 natten over ved 4 °C). Dette antistof er kendt for at reagere mod mus, mennesker og svin CD31. For IF bestod de sekundære antistoffer af Alex Fluor 488, 594 og 647 ved 1:250 fortynding i 45 minutter ved stuetemperatur.
Til billedkvantificering blev hele diaset scannet af et motoriseret scenesystem. Billederne blev behandlet i ImageJ, hvor signalet blev konverteret til gråtoner, og antallet og intensiteten af pixels blev analyseret som integreret tæthed. Venens område blev markeret som interesseområdet. Den integrerede tæthed af alle billederne blev normaliseret til sit område18.
Disse er vist at være opreguleret i modeller af kræft-associeret dyb venetrombose. Kvantificeringen af flere billeder blev udført ved hjælp af integreret densitetsanalyse, som tidligere gjort ved hjælp af billede J18. Kontrolgruppen havde signifikant lavere fibrinekspression sammenlignet med den eksperimentelle gruppe (p:0,0080; Figur 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 betyder ± SD). Især var varianserne i Fibrin-udtrykkene lavere i eksperimentet sammenlignet med kontrolgruppen (F-statistik, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).
Gråtoner ultralyd
Efter 2 dages operation og lige før blodprophøsten gennemgik mus gråtoner ultralyd. Mus i begge grupper viste blodpropper i den infrarenale vena cava. Blodpropperne var dog større hos musene med vaskulær klip. Repræsentative ultralydsbilleder er vist i figur 5. En lyddød region af fartøjet antyder et patentlumen, og en hyperechoisk tæthed i beholderen er tegn på en organiseret blodprop. Den ligerede infrarenale vena cava hos en mus fra kontrolgruppen viser en delvis blodprop afgrænset af to gule pilespidser i figur 5A. I modsætning hertil viser figur 5B en stor blodprop, der næsten lukker den infrarenale vena cava genereret med en vaskulær klipmodel (afbildet af to gule pilespidser og markeret med hvide stjerner). Det skal bemærkes, at den infrarenale vena cava kollapsede i kontrolgruppen, mens den blev forstørret i forsøgsgruppen, i overensstemmelse med den større koagulationsbyrde i sidstnævnte gruppe.
Begge analyser (ultralyd og IF) tyder på, at den eksperimentelle gruppe havde konsekvent større blodpropper end kontrolgruppen.
Figur 1: Et skema, der viser IVC-Aorta og anvendelsen af klippet over sammenløbet af venstre nyrevene (LRV)-IVC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Intraoperativ IVC trombosemodel med clips applikation . (A) Midline laparotomi. (B) Fuld eksponering af IVC, herunder sammenløbet af venstre nyrevene til IVC. (C) Demonstration af ureterforløbet og undgåelse af iatrogent traume til venstre ureter. (D) Cauterizing gonadale grene. (E) Dissektion af IVC til det venstre renale venesammenløbspunkt. (F) Passerer 5-0 polypropylensuturen gennem det dissekerede plan for at udvide planet til at passere suturen. (G) Før en vaskulær klemme gennem det forberedte plan. (H) Dannelse af koagulation 48 timer efter IVC-fastspændingen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Gruppen af mus med vaskulære klip IVC-ligering havde højere normaliseret blodprop-til-kropsvægt-forhold. Gennemsnitlig normaliseret blodprop-til-kropsvægt-forhold. Enheden for begge værdier udtrykt i milligram. Fejlbjælker = SD. Elevens t-test blev anvendt. P <0.0001 Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Øget fibrin- og CD 31-ekspression i gruppe af mus med vaskulære klip IVC-ligering. De repræsentative immunfluorescensbilleder opnået ved 100x forstørrelse fra kontrolgruppen med IVC-ligering med sutur og fra forsøgsgruppen med IVC-ligering med vaskulære klip. Der vises tilfældigt udvalgte billeder pr. mus (N= 4 mus/gruppe). A) Fibrin- og CD31-ekspression i kontrol- og forsøgsgrupperne. To gule pilespidser markeret med hvide stjerner viser den store blodprop, der næsten lukker IVC, hvilket indebærer den delvist okkluderede IVC. (B) Fibrins integrerede massefylde: Linjen repræsenterer medianværdien. Elevens T-test blev udført. p-værdi = 0,0080. IF-farvning af repræsentative infrarenale vena cava-billeder, herunder blodpropper i kontrol- og eksperimentelle grupper og farvet med anti-CD31 og Alexa Fluro sekundære antistoffer. 400x forstørrelse vises. Skalastænger = 100 μm. Fejlbjælker henviser til SEM. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Forøget koagulationsoverfladeareal inden for den delvist fastspændte IVC i gruppe af mus med vaskulære klip IVC-ligering. De repræsentative gråtonesonografibilleder af kontrol- og eksperimentgruppen. (A) Repræsentativt gråtone-Doppler-billede af kontrolgruppen: Et område med IVC viser et lyddødt område, der tyder på patentlumen, og den anden del viser et hyperechoisk område, der indikerer blodproppen. (B) Repræsentativt gråtone-Doppler-billede af forsøgsgruppen: Den organiserede blodprop (hvid stjerne) inden for IVC, som afbildet med gule pilespidser, var mere fremtrædende i forsøgsgruppen. Desuden optrådte blodproppen på to forskellige måder i sagittalafsnittet. En blodprop, der udelukkede det signifikante tværsnit af lumen, blev også afgrænset på den anden side af IVC. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I en syngeneisk xenograft tyktarmskræftmodel observerer vi højere trombogenicitet og ekspressioner af koagulationsmarkører i forsøgsgruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Det er vigtigt, at variansen i alle disse parametre var lavere i den eksperimentelle gruppe sammenlignet med kontrolgruppen. Modifikationen involverede introduktion af et vaskulært klip med en specifik trykprofil ved sammenløbspunktet for IVC og venstre nyrevene. Klippet blev placeret over en spacer, som var en 5-0 polypropylen sutur. Denne ændring reducerer variabiliteten i koagulationsstørrelse og trombosemarkører. Alle mus oplevede 100% overlevelse.
Tekniske nuancer
Proceduren indebar særlig opmærksomhed på flere trin. Efter laparotomi blev begge urinledere grundigt inspiceret for at forhindre utilsigtet skade. For at opnå optimal eksponering blev tarmene dækket af fugtigt gasbind og holdt i højre øvre kvadrant uden overdreven trækkraft. Derefter blev IVC-sidegrenene cauterized 2 til 3 mm væk fra urinlederne, IVC og aorta for at forhindre skade på vener. Efter at have sikret fuldstændig hæmostase blev flyet til IVC-ligering forberedt. Det er vigtigt at bemærke, at aorta og IVC hos mus er tæt forbundet langs deres forløb, og forsøg på at dissekere dem kan føre til blødning og tab af dyret. Den eneste undtagelse er venstre nyrevene og aorta sammenløb punkt21. En suturpassage blev derefter forberedt ved hjælp af højst tre omhyggelige, skarpe divergerende bevægelser med tang.
IVC-diameteren på en 8- til 12 uger gammel mus rapporteres at ligge i området ca. 0,3 til 0,5 mm. Den delvise IVC-ligeringsprocedure skal sikre plads til at skelne fra fuldstændig ligering. I den aktuelle undersøgelse overvejede vi en 5-0 suturkaliber, svarende til 0,10 til 0,15 mm for afstandsstykket. Derfor blev de vaskulære klips læberum justeret til en 2-0 sutur for at give tilstrækkelig plads til en 0,3 mm IVC og et 0,1 mm mellemrum.
Polypropylensuturen tilvejebragte en blodløs guide, der gjorde det muligt at udvide planet med gentagen kaudal til kraniebevægelsen i yderligere 1 til 2 mm for at rumme anvendelsen af de vaskulære klip. Endelig blev de tilpassede vaskulære klip med en læbe resterende plads, der var kompatibel med en 5-0 polypropylensutur, placeret.
Valget af ædelmetalklip, såsom platin, til lukning af blodkar, er drevet af det faktum, at sådant materiale er relativt inert og reducerer materialeinduceret inflammation sammenlignet med specifikke absorberbare og forsinkede absorberbare suturer22,23,24. Disse metalklip er modstandsdygtige over for kemiske reaktioner, hvilket gør dem stabile. Dette fører til et sikrere og mere effektivt alternativ med en lavere risiko for betændelse sammenlignet med brugen af suturmaterialer.
Modellens translationelle relevans
De murin venøse trombose modeller er fundamentalt forskellige fra dyb venetrombose hos mennesker. For det første observeres koagulationsdannelsen i opstrøms retning i gnavermodeller. Imidlertid dannes kliniske VT'er nedstrøms fra en nidus25,26. For det andet er årsag-virkningsforholdet forskelligt mellem mennesker og musemodeller. Hos mennesker er koagulationsdannelse indekshændelsen efterfulgt af blodgennemstrømningsobstruktion. En undtagelse er May-Thurner syndrom. May-Thurner syndrom refererer til en medicinsk tilstand, hvor øget eksternt tryk på venstre iliac vene, der ligger mellem rygsøjlen og højre iliac arterie, øger risikoen for venstre iliac venetrombose eller en blodprop i venstre iliac vene. I musemodeller er obstruktion af venøs strømning den primære begivenhed, hvilket resulterer i træg blodgennemstrømning og trombosedannelse25.
Sammenlignet med andre modeller, såsom lårbensvenens elektrolytiske skademodel12, giver IVC-stasis en klar fordel. Det tillader undersøgelse af lokale terapeutiske foranstaltninger, såsom IVC-filtre, kateterrettet trombolyse og endoluminal rekanalisering med tilvejebringelse af et miljø for koagulationsdannelse i nærvær af blodgennemstrømning. Derved undersøges to arme af endotelskade og stasis i denne model. Blodpropper i IVC er også forbundet med højere forekomst af komplikationer, såsom lungeemboli. En begrænsning er, at IVC er et mindre almindeligt sted for DVT hos mennesker.
Ramme for reduktion-forfinelse-erstatning (3R)
Det er vigtigt at integrere 3R-rammen i dyremodeller. Integrationen af 3R-rammen begrænser dyrs lidelser og fremmer etisk og ansvarlig dyreforskningspraksis. 3R'erne gælder for vores nuværende fund, da vi ikke observerede nogen dødelighed hos mus. Det er også muligt at bruge færre dyr i undersøgelser. Således kan antallet af mus og omkostningerne reduceres.
Undersøgelsens begrænsninger
En mulig begrænsning af klipmetoden inkluderer et relativt snævert trykprofilområde for de testede vaskulære klip. Derfor kan der designes yderligere undersøgelser med en bred vifte af trykprofiler. Tidligere undersøgelser har vist, at immunkompromitterede stammemus er mere modtagelige for koagulationsdannelse, og koagulationsvægtene kan variere hos immunkompetente mus12. Fremtidige undersøgelser opfordres til at undersøge omfanget af konsistens af koagulationsvægte i forskellige musestammebaggrunde.
Konklusion
Den nuværende metode giver et mere konsistent mål for venøs tromboseundersøgelse via en delvis IVC-ligeringsmodel. Vi håber, at denne ændring vil gøre det muligt at generere robuste og pålidelige murinmodeller til at undersøge konsekvenserne af kræftassocieret trombose ved hjælp af forskellige kræftmodeller med relevans for menneskelig sygdom.
Mens det nuværende arbejde specifikt fokuserede på kræftassocieret trombose, vil det fremtidige arbejde indebære at udføre en omfattende analyse af musemodeller af forskellige comorbiditeter (såsom fedme, kronisk nyresvigt) og normale mus, der øger risikoen for trombose.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY og SL) og R01HL166608 (KR og VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
