Summary
Dieser Artikel zielt darauf ab, eine optimierte Methode zur Beurteilung von Venenthrombosen in einem Mauskrebsmodell vorzustellen, bei der Gefäßclips verwendet werden, um eine venöse Ligatur zu erreichen. Die Optimierung minimiert die Variabilität bei thrombosebedingten Messungen und erhöht die Relevanz für krebsassoziierte Venenthrombosen beim Menschen.
Abstract
Diese methodische Arbeit beleuchtet die chirurgischen Nuancen eines Nagetiermodells der Venenthrombose, insbesondere im Zusammenhang mit der krebsassoziierten Thrombose (CAT). Eine tiefe Venenthrombose ist eine häufige Komplikation bei Krebsüberlebenden und kann potenziell tödlich sein. Bei den aktuellen murinen Venenthrombosemodellen kommt es in der Regel zu einem vollständigen oder teilweisen mechanischen Verschluss der Vena cava inferior (IVC) mittels Naht. Dieses Verfahren induziert eine vollständige oder teilweise Stauung von Blut und Endothelschäden, die eine Thrombogenese auslösen. Die aktuellen Modelle weisen Einschränkungen auf, wie z. B. eine höhere Variabilität der Gerinnselgewichte, eine signifikante Mortalitätsrate und eine verlängerte Lernkurve. In diesem Bericht werden chirurgische Verfeinerungen mit Gefäßklammern vorgestellt, um einige dieser Einschränkungen zu beheben. Unter Verwendung eines syngenen Dickdarmkrebs-Xenotransplantat-Mausmodells verwendeten wir maßgeschneiderte Gefäßclips, um die Hohlvene infrarenale Hohlvene zu ligieren. Diese Clips ermöglichen einen Restlippenraum, ähnlich wie bei einem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial nach IVC-Ligaturen. Mäuse mit der Nahtmethode dienten als Kontrollen. Die Gefäßclip-Methode führte zu einem konsistent reproduzierbaren partiellen Gefäßverschluss und höheren Gerinnselgewichten bei geringerer Variabilität als die Nahtmethode. Die größeren Gerinnselgewichte, die größere Gerinnselmasse und das Gerinnsel auf der luminalen IVC-Oberfläche wurden aufgrund des höheren Druckprofils der Gefäßclips im Vergleich zu einer 6-0-Polypropylennaht erwartet. Der Ansatz wurde durch eine Graustufensonographie validiert, die im Vergleich zur Nahtmethode eine durchweg größere Gerinnselmasse in der infrarenalen Hohlvene mit Gefäßclips zeigte. Diese Beobachtungen wurden durch die Immunfluoreszenzfärbung weiter untermauert. Diese Studie bietet eine verbesserte Methode zur Generierung eines venösen Thrombosemodells in Mäusen, die zur Vertiefung des mechanistischen Verständnisses der CAT und in der translationalen Forschung wie der Wirkstoffforschung eingesetzt werden kann.
Introduction
Krebsassoziierte venöse Thromboembolie (VTE)
Das Risiko für venöse Thromboembolien (VTE) ist bei Krebsüberlebenden 4- bis 7-mal höher als in der Allgemeinbevölkerung 1,2,3. Dieser Zustand verläuft bei einem von sieben Krebspatienten tödlich. Die Inzidenz von VTE variiert je nach Krebsart und Tumorlast und ist bei Patienten mit Bauchspeicheldrüsen- und Magenkrebs am höchsten4.
Die krebsassoziierte VTE bei Krebspatienten hat eine prognostische Bedeutung. Sie ist mit einem ungünstigen Gesamtüberleben im ersten Jahr nach einer Krebsdiagnose verbunden, auch nach Anpassung an Alter, Rasse und Stadium der zugrunde liegenden Krebserkrankung5. Diese Ergebnisse unterstreichen die Bedeutung der Untersuchung der krebsassoziierten VTE und die Notwendigkeit, ihren Mechanismus anhand eines Tiermodells zu untersuchen. Die translationale Relevanz dieses Bereichs wird auch dadurch unterstrichen, dass VTE bei Krebspatienten vermeidbar und mit Thromboprophylaxe und antithrombotischer Therapie behandelbar ist6.
Tiermodelle für Krebs und Venenthrombose
Krebsmodelle werden konventionell als Xenotransplantate bezeichnet, bei denen Mäusen Krebszellen injiziert werden. Die Injektion von Krebszellen an einer Stelle wie ihrem Ursprung wird als orthotopes Modell bezeichnet, während an einer anderen Stelle (subkutane Ebene über der Flanke) als heterotopes Modell bezeichnet wird. Die Ursprungsart von Krebszellen bestimmt sie als allogenes Modell, wie z.B. die HT-29-Zelllinie (menschlicher Darmkrebs)7,8,9. Im Gegensatz dazu verwenden syngene Modelle die murinen Krebszelllinien, einschließlich RenCa- und MC-38-Zelllinien 3,10.
In der Literatur werden arterielle, venöse und kapillare Thrombosemodelle bei Nagetieren beschrieben. Die Venenthrombose wird in der unteren Hohlvene (IVC) durch mechanische Verletzung (Führungsdraht) oder vollständige IVC-Ligatur, chemische (Eisenchlorid) oder elektrolytische Schädigung induziert. Die Eisenchlorid-induzierte Thrombose oder IVC-Ligatur stellt ein vollständiges Okklusionsmodell dar. Letzteres führt zur Stauung von Blut und entzündlichen Infiltraten in den Venen11,12,13. Das vollständige Ligationsmodell führt zu einer hohen Thrombosebildungsrate bei 95% bis 100% der Mäuse. Das partielle IVC-Ligaturmodell kann eine Unterbrechung der lateralen iliolumbalen Äste beinhalten, und der venöse Rückfluss wird durch die Anwendung von Nahtligaturen an den distalen Zielpunkten von IVC12 aufgehoben. Manchmal wird ein Platzhalter verwendet, um den venösen Rückfluss teilweise zu unterbrechen. Das Thrombusgewicht ist jedoch im aktuellen partiellen Okklusionsmodell inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität der Gerinnselgewichte und -höhen führt12,14.
Beide großen mechanischen Modelle (partiell und vollständig) haben ihre Grenzen. Erstens führt die IVC-Ligatur (Stasismodell) häufig zu einer Hypotonie. Das Blut wird durch die Wirbelvenen geleitet. In erfahrenen Händen liegt die Sterblichkeit bei diesem Modell zwischen 5 % und 30 %, wobei die höhere Rate während der Lernkurve zu erwarten ist. Wichtig ist, dass das vollständige Okklusionsmodell keine tiefe Venenthrombose (TVT) beim Menschen reproduziert, bei der ein Thrombus in der Regel nicht okklusiv ist. Ein vollständiger Verschluss verändert wahrscheinlich hämorheologische Faktoren und pharmakodynamische Parameter, wodurch sich die Bioverfügbarkeit von Verbindungen an der lokalen Stelle verändert. Aufgrund dieser Einschränkungen sind vollständige Okklusionsmodelle möglicherweise nicht optimal für die Prüfung neuartiger chemischer Verbindungen für therapeutische Zwecke und Arzneimittelentdeckungen12.
Es sollte beachtet werden, dass zur Bereitstellung eines klinisch relevanteren murinen Modells der Venenthrombose mit vermindertem Fluss und endothelialer Schädigung ein venöses Thrombosemodell eingeführt wurde, bei dem die TVT durch die Einschränkung des Blutflusses ohne Endothelstörung ausgelöst wird. Das Modell wurde mittels Rasterelektronenmikroskopievalidiert 15. Ein bevorzugtes klinisch relevantes Thrombosemodell ist ein Modell mit nahezu vollständiger Thrombose, das die Entdeckung von Medikamenten ermöglicht. Die Gerinnselbildung in den aktuellen partiellen Okklusionsmodellen ist inkonsistent, was zu einer hohen Variabilität des Gerinnselgewichts und der Gerinnselhöhen führt12,16. Darüber hinaus ist das Gerinnselgewicht bei den herkömmlichen Methoden variabel, so dass mehr Mäuse pro Studie benötigtwerden 12.
Bisherige krebsassoziierte Thrombosemodelle konzentrierten sich auf Dickdarm-, Bauchspeicheldrüsen- und Lungenkrebs und waren alle vollständige Okklusionsmodelle17,18,19. Dieses Manuskript modifiziert das partielle Okklusionsthrombosemodell, um Gerinnsel mit geringerer Variabilität und Mausmortalität bereitzustellen (Abbildung 1). In früheren Studien wurden allogene Krebszelllinien an immungeschwächten athymischen Mäusen verwendet Hintergrund 19,20,21. In diesem Manuskript wird ein syngenes MC-38-Zell-Xenotransplantat in C57Bl6/J-Mäusen verwendet, das die Verwendung von immunkompetenten Mäusen und die Untersuchung von Immunkomponenten zur Thrombogenese ermöglicht.
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Protocol
Für diese Studie wurden 16 weibliche C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen und einem Körpergewicht von 20 bis 25 g verwendet. Die Mäuse wurden unter Standardbedingungen untergebracht und ad libitum mit Futter und Wasser gefüttert. Diese Studie wurde mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der Boston University durchgeführt. Die hier beschriebenen offenen Eingriffe wurden in sterilem Zustand durchgeführt.
1. Xenograft-Modell
- Zellkultur
- Vor der heterotopen subkutanen Implantation werden MC-38-Zellen als Monolayer bis zu 80 % Konfluenz gezüchtet.
- Nach Trypsinisierung und Resuspension in 10% FBS-haltigen Medien zentrifugieren die Zellen bei 277 x g, 4 °C für 5 min. Anschließend werden die Zellen in serumfreien Medien auf eine Konzentration von 1 x 104 MC-38-Zellen/μl serumfreiem Medium resuspendiert.
- Für die Trypsinisierung kultivieren Sie die MC-38-Zellen, bis sie einen gewünschten Zusammenfluss erreichen (normalerweise etwa 70%-80%) und saugen dann das Nährmedium aus der Petrischale ab.
- 1 ml Trypsin-EDTA-Lösung zugeben und die Zellen 1 Minute lang bei 37 °C mit Trypsin inkubieren, um eine Ablösung zu ermöglichen. Klopfen oder schütteln Sie vorsichtig auf die Petrischale, um eine gleichmäßige Ablösung zu gewährleisten.
- Fügen Sie ein Kulturmedium hinzu, das Serum oder einen Trypsin-Inhibitor enthält, um die Aktivität zu neutralisieren und eine weitere Zelldissoziation zu verhindern. Sammeln Sie die abgelösten Zellen zusammen mit der neutralisierten Trypsinlösung.
- Für die Resuspension bereiten Sie die Zellen, sobald sie durch Trypsinisierung abgetrennt sind, für die Transplantation oder weitere Experimente vor. Zentrifugieren Sie die gesammelte Zellsuspension bei 277 x g , um die Zellen zu pelletieren.
- Entfernen Sie vorsichtig den Überstand (Flüssigkeit über dem Zellpellet). Fügen Sie dem Zellpellet 9 ml Kulturmedium, Puffer oder Lösung hinzu, um die gewünschte Zellkonzentration für die Transplantation oder das Experimentieren zu erreichen.
- Resuspendieren Sie die Zellen vorsichtig, indem Sie sie auf und ab pipettieren oder einen Kulturkolbenschüttler verwenden. Vermeiden Sie heftiges Pipettieren, das die Zellen beschädigen könnte.
HINWEIS: Abhängig von der verwendeten Variante oder Zelllinie können Zellen in einem 1:1-Verhältnis von solubilisierter Basalmembranmatrix und serumfreien Medien resuspendiert werden, um das hochaggressive Wachstum und die Ausbreitung von Mauszellen nach der Implantation zu verlangsamen. Alle Zellkulturschritte sollten in einer vollständigen aseptischen Haube in einem speziell zugewiesenen Zellkulturraum durchgeführt werden und wurden regelmäßig auf Mykoplasmen getestet.
- Zählen Sie die Zellen mit einem automatischen Zellzähler gemäß dem bereitgestellten manuellen Protokoll.
- Zellimplantation
- Ordnen Sie der Versuchsgruppe nach dem Zufallsprinzip acht Mäuse und der Kontrollgruppe acht Mäuse wie folgt zu. Verwenden Sie in der Kontrollgruppe Mäuse mit MC38-Xenotransplantat und führen Sie eine IVC-Ligatur mit einem Polypropylen-5-0-Naht durch. Verwenden Sie in der Experimentalgruppe Mäuse mit MC38-Xenotransplantat und führen Sie eine IVC-Ligatur mit einem maßgeschneiderten Gefäßclip durch.
- Legen Sie die Maus in die linke Seitenlage und rasieren Sie die rechte Seite zwischen den Vorder- und Hintergliedmaßen. Tragen Sie Alkohol und Jod entlang des dorsalen Lendenwirbelbereichs auf, um den Bereich aseptisch für die Injektion vorzubereiten.
- Injizieren Sie 2 x 106 MC-38-Zellen, die in 200 μl Medium hergestellt wurden, subkutan in die Flanke, auf halbem Weg zwischen der distalsten Rippe des Tieres und der Beckeneminenz mit einer 27G-Nadel, während das Tier sanft in der nicht-dominanten Hand gehalten wird.
- Nach der Injektion sind die Tiere sorgfältig zu untersuchen und wieder in den Käfig zu setzen. Die Tiere sollten auf Folgendes untersucht werden: 1. Veränderungen des Verhaltens, des Aktivitätsniveaus und der allgemeinen Mobilität der Mäuse. Jede signifikante Veränderung kann auf Beschwerden oder gesundheitliche Probleme hinweisen. 2. Der allgemeine körperliche Zustand der Mäuse, einschließlich der Fellqualität, der Pflegegewohnheiten und aller sichtbaren Anzeichen von Stress oder Anomalien 3. Rückkehr zu Nahrungsaufnahme und Wasseraufnahme 4. Jegliche Veränderungen des Aktivitätsniveaus, der Körperhaltung oder der Interaktionen mit den Käfiggenossen. Lethargie oder erhöhte Aggression können Anzeichen für Stress sein.
2. Verlaufskontrolle des Tumorwachstums
- Überwachen Sie die Tiere alle zwei Wochen auf Tumorwachstumstrends für 3-4 Wochen. Messen Sie die Tumore mit einem Messschieber und erfassen Sie die Tumordimensionen.
- Messen Sie die Tumore entlang ihrer längsten Achse (L) und der Achse senkrecht zur Längsachse (W). Berechnen Sie das Tumorvolumen (V) mit der Gleichung L x (W2) = V. Wenn die Tumorgröße in jeder Dimension 20 mm überschreitet und/oder der Tumor Anzeichen von Ulzerationen aufweist, müssen die Tiere vor Beendigung des Versuchs eingeschläfert werden.
- Sobald das Tumorvolumen 400 mm3 erreicht hat, planen Sie, die Mäuse für die IVC-Ligatur zu verwenden.
3. Anästhesie und Vorbereitung
- Betäuben Sie die Maus in einer Isoflurankammer und injizieren Sie das Analgetikum subkutan: Halten Sie das Tier vom Schwanzansatz aus. Halten Sie das Tier auf der Rückenfläche der nicht-dominanten Hand.
- Bringen Sie das Tier in die Induktionskammer für kontinuierliche Anästhesie, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bestätigen Sie eine angemessene Vollnarkose ohne einen Zehenkneifreflex. Verwenden Sie eine Erhaltungsdosis von 1%-3% Isofluran. Tragen Sie Tiersalbe auf beide Augen auf.
- Subkutane Injektion mit Buprenorphin (Opioid zur Schmerzlinderung): Lösen Sie den Buprenorphin-Vorrat in einer Konzentration von 0,3 mg/ml in 0,9% Natriumchlorid (NaCl) auf, um die Konzentration von 0,03 mg/ml zu erreichen.
- Vor der Operation wird eine Dosierung von 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml Buprenorphin zusammen mit 500 μl sterilem 0,9% NaCl subkutan injiziert. Bei einer 20-g-Maus ist eine Menge von 2 μg oder 66 μl von 0,03 mg/ml Buprenorphin erforderlich.
- Hautvorbereitung: Legen Sie die vollnarkotierte Maus in Rückenlage über die Heizdecke. Desinfizieren Sie den vorderen Bauchbereich mit 0,5%iger Chlorhexidin-Tinktur, 2x. Kontrollieren Sie während des Eingriffs regelmäßig die Temperatur der Heizdecke und stellen Sie sicher, dass die Temperatur nicht sinkt.
4. IVC-Ligatur
- Laparotomie in der Mittellinie
- Schneiden Sie die Bauchhaut mit einer feinen Schere von der xiphoidalen Eminenz bis zur Blase ein. Kneifen Sie das Bauchfell mit einer atraumatischen Zange auf halber Höhe des Hautschnitts zusammen. Achten Sie auf einen ausreichenden Abstand zwischen dem Einschnitt und dem darüber liegenden Darm (Abbildung 2A).
- Öffnen Sie das Bauchfell in Längsrichtung zusammen mit der avaskulären Linea alba.
- Ausdehnung des Darms auf die rechte Bauchseite
- Ziehen Sie den Darm mit nassen Wattestäbchen ab. Bedecke den Darm mit einer vollständig feuchten, sterilen Gaze. Achten Sie darauf, dass sich der bedeckte Darm in einer traktionsfreien Richtung befindet, ohne dass es zu einer übermäßigen Zugkraft auf die mesenterialen Gefäße kommt.
- Vollständige Freilegung der IVC und der Äste, einschließlich des Zusammenflusses der linken Nierenvene in die IVC (Abbildung 2B).
- Tropfen Sie 200-300 μl normale Kochsalzlösung. Untersuchen Sie den Verlauf der Harnleiter, der IVC, der Aorta und der Nierenvenen (Abbildung 2).
- Avaskuläre Ebene am Konfluenzpunkt der infrarenalen IVC und der linken Nierenvene.
- Führen Sie das Polypropylen-6-0-Nahtmaterial vorsichtig 2x-3x mit kaudalen bis cephaladischen Bewegungen mit der geschlossenen atraumatischen Zange durch die avaskuläre Ebene.
- Stellen Sie sicher, dass minimales Nässen mit sanftem Druck kontrolliert wird, der mit einer Wattestäbchentamponade versehen ist. Erweitern Sie die vorgesehene Ebene, indem Sie die 6-0-Polypropylen-Naht mit sanften kaudalen bis kranialen Bewegungen durchführen.
- Kauterisierung der Gonaden- und Lendenäste (Abbildung 2D)
- Es können bis zu 4 hintere oder lumbale Äste vorhanden sein. Um mögliche Komplikationen bei spinaler Ischämie und Claudicatio zu vermeiden, lassen Sie die Lendenäste im aktuellen Protokoll intakt.
- Überprüfen Sie, ob 2 bis 3 Seitenäste, einschließlich der bilateralen Gebärmutterhorn-Arterienversorgung und der hypogastrischen Gefäße, vorhanden sind. Sicherstellen einer konsequenten Unterbrechung der ersten bilateral vorhandenen Filialen. Kauterisieren Sie die bilateralen Äste direkt distal des Zusammenflusses der linken Nierenvene und der IVC (infrarenale IVC). Achten Sie darauf, dass die venösen Abflussgefäße des Gebärmutterhorns nicht gestört werden.
HINWEIS: Die Kauterisierung mit Seitenzweigen wird gewählt, da diese Methode eine glatte und ununterbrochene Oberfläche bietet und das Potenzial für unkontrollierte Blutungen reduziert. Darüber hinaus ist die Kauterisierung schneller und praktikabler als die Nahtligatur mit 10:0-Nähten. Daher werden die Tiere einem kürzeren und sichereren Verfahren ausgesetzt.
- Überprüfen Sie den Verlauf der Harnleiter und des Gefäßsystems, um sicherzustellen, dass kein Nässen oder unbeabsichtigtes Kauterisieren auftritt (Abbildung 2C).
- IVC-Ligatur mit Gefäßclips in der Experimentalgruppe
- Passen Sie die Gefäßklammern mit einer Breite von 2-0 Nylonnähten mit einer atraumatischen Zange an. Die angepassten Gefäßklammern in der Experimentalgruppe werden umlaufend um die infrarenale IVC herum angebracht.
- Bringen Sie die Gefäßklammern über der Naht an. Die primäre Nahtpassage bietet eine ausreichende avaskuläre Ebene mit zwei bis drei akribischen kaudalen bis kranialen Bewegungen (Abbildung 2E-F).
- Führen Sie die Gefäßklammern weiter durch die vorbereitete Ebene. Bereiten Sie die Ebene am Zusammenfluss der linken Nierenvene und der IVC vor, die breit genug ist, um eine ereignislose Clippassage zu ermöglichen (Abbildung 2E).
- Platzieren Sie den angepassten Gefäßclip horizontal, senkrecht zum IVC-Verlauf, durch die vorbereitete Ebene. Platzieren Sie die Gefäßklammern über dem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial, um einen ausreichenden verbleibenden Platz zu gewährleisten (Abbildung 2G).
- Stellen Sie sicher, dass die oben genannten Schritte sanft durchgeführt werden, um eine Gefäßschädigung oder Blutung an der Stelle der Gefäßclips zu vermeiden. Beobachten Sie das Operationsfeld auf mögliches Nässen. Üben Sie bei Nässen sanften Druck mit der Wattestäbchen mit der Wattestäbchen auf das Operationsfeld aus.
- IVC-Ligatur mit Naht in der Kontrollgruppe
- Nahtligatur mit 6-0 Polypropylen-Naht. Machen Sie eine chirurgische quadratische Knotennaht um die infrarenale IVC in der vorbereiteten Ebene über einer 5-0-Seidennaht.
- Sobald die Naht abgeschlossen ist, entfernen Sie die Seidennaht vorsichtig, um ausreichend Restplatz zu gewährleisten.
- Führen Sie eine subkutane Injektion von 200 μl normaler Kochsalzlösung durch.
HINWEIS: Um eine vergleichbare Technik für die partielle IVC-Okklusion mit Klemmenanwendung bereitzustellen, wird der Gefäßclip in der aktuellen Studie so angepasst, dass er Platz zwischen den Lippen bietet. Der Gefäßclip wird dann in der vorbereiteten avaskulären Ebene im Zusammenfluss der linken Nierenvene und der IVC platziert. - Schließen Sie die Laparotomie mit kontinuierlich laufender 4-0 Vicryl-Naht.
5. Nachsorge nach der Indexoperation
- Überwachen Sie das Tier nach der Operation kontinuierlich für 1 Stunde oder bis das Gleichgewicht und die Aufrichtfähigkeit wiederhergestellt sind, je nachdem, was zuerst kommt, in einem isolierten, sauberen Käfig, bis es sich vollständig erholt hat.
- Überwachen Sie das Tier täglich für 2 Tage. Wenn das Tier verzweifelt aussieht, überwachen Sie es 2 Tage lang zweimal täglich. Verabreichen Sie postoperative Analgesie und Flüssigkeiten gemäß Protokoll.
- Lösen Sie den Buprenorphin-Vorrat mit einer Konzentration von 0,3 mg/ml in 0,9%igem Natriumchlorid (NaCl) auf, um die Konzentration von 0,03 mg/ml zu erreichen.
- Injizieren Sie eine Dosierung von 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml Buprenorphin subkutan zusammen mit 500 μl sterilem 0,9%igem NaCl alle 8 bis 12 Stunden während der ersten 48 Stunden nach der Indexoperation. Bei einer 20-g-Maus wären 2 μg oder 66 μl von 0,03 mg/ml Buprenorphin erforderlich.
6. Euthanasie und Entnahme des IVC, das das Gerinnsel enthält
- Betäuben Sie die Maus in einer Isofluran-Kammer, halten Sie das Tier vom Schwanzansatz aus und halten Sie das Tier auf der Rückenfläche Ihrer Hand.
- Bringen Sie das Tier in die Induktionskammer für kontinuierliche Anästhesie, die mit 3%-4% Isofluran gefüllt ist. Bringen Sie das Tier in Rückenlage.
- Führen Sie eine lange Mittellinien-Laparotomie durch, beginnend vom Xiphoid bis zur Blase, wie beschrieben.
- Exteriorisieren Sie den Darm auf die rechte Seite des Abdomens und entnehmen Sie die eingeklemmte IVC distal der Beckenbifurkation im Ausmaß der infrarenalen IVC (Abbildung 2G).
- Nach dem Gerinnsel und der Tumorentnahme wird das Tier mit Gebärmutterhalsluxation eingeschläfert.
7. Statistische Analyse
- Präsentieren Sie die statistische Analyse als Mittelwert, Median und Standardabweichung (SD) oder Standardfehler des Mittelwerts (SEM), des 25. oder 75. Perzentils oder des gesamten Wertebereichs, einschließlich Minimal- und Maximalwerten. Führen Sie einen Schüler-t-Test und ggf. den F-Test durch. Bewerten Sie die statistische Signifikanz auf dem Niveau von p <0,05.
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Representative Results
Einer Gruppe weiblicher C57Bl6/J-Mäuse im Alter von 8-12 Wochen wurden MC-38-Zellen in der logarithmischen Phase des Zellwachstums injiziert. Die Xenotransplantate wuchsen zwischen der dritten und vierten Woche nach der Injektion schnell18. Sobald die Tumore ein durchschnittliches Volumen von 400mm3 erreicht hatten, wurden die Mäuse nach dem Zufallsprinzip in die Kontroll- und Experimentalgruppe eingeteilt. Die Kontrollgruppe wurde einer IVC-Ligatur mit Naht unterzogen, während die Versuchsmäuse einer IVC-Ligatur mit Gefäßclip-Applikation unterzogen wurden. Die Tumorvolumina in der Kontroll- und Experimentalgruppe waren ohne signifikante Unterschiede vergleichbar (353 ± 100 mm 3 vs. 367 ± 46,2 mm3, p = 0,445). Nach 48 h wurden infrarenale IVCs zum Bifurkationspunkt der Beckenvenen, der das Gerinnsel enthält, entnommen, und die Gerinnselgewichte dienten als biologischer Messwert für die venöse Thrombogenität. Der postoperative Verlauf verlief bei allen Tieren in der Kontroll- und Versuchsgruppe ohne Zwischenfälle, ohne Hinweise auf eine Verfärbung des Gebärmutterhorns, eine muskuloskelettale Ischämie oder Claudicatio-Probleme in der unteren Extremität. Bei der zweiten Laparotomie wurde keine Gefäßklammerverschiebung beobachtet. Vor Beendigung der Experimente wurde keine Mortalität beobachtet.
Verhältnis von Gerinnselgewicht zu normalisiertem Körpergewicht
Da Mäuse mit Xenotransplantat wahrscheinlich Körpergewicht verlieren, wurden die Gerinnselgewichte (in mg) auf das Gesamtkörpergewicht zum Zeitpunkt der Entnahme (beide in mg) normalisiert. Bei Mäusen der Versuchsgruppe (Mittelwert ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) wurde im Vergleich zu Kontrollmäusen (0,001453 ± 0,002666, P-Wert: 0,0019; Abbildung 3).
Immunfluoreszenz-Assay
Die histopathologische Auswertung diente der Untersuchung der IVC und der Blutgerinnsel. Die in Paraffin eingebetteten Schnitte der infrarenalen Vena cava wurden mit Anti-CD31 (einem Marker für Endothelzellen)20 und Anti-Fibrin sowie DAPI gefärbt (Abbildung 4A).
Die infrarenale Hohlvene von Kontrollmäusen zeigte eine intakte CD31-Färbung und Fibrin, das teilweise das Lumen des Gefäßes besetzte. In der Versuchsgruppe war die CD31-Expression nicht intakt, was auf eine Schädigung der Endothelzellen und ein großes Gerinnsel mit prominenter Fibrinexpression hindeutet. Auch die Gefäßwand zeigte eine Fibrinfärbung (Abbildung 4A).
Für die Immunfluoreszenz wurde ein monoklonaler Fibrin-Maus-Antikörper in einer Verdünnung von 1:1000 verwendet und über Nacht bei 4 °C inkubiert. Für CD31 wurde ein polyklonaler Anti-CD31-Antikörper von Kaninchen verwendet, der für Immunoblots und IF validiert wurde (1:1000 und 1:100 über Nacht bei 4 °C). Es ist bekannt, dass dieser Antikörper gegen CD31 von Maus, Mensch und Schwein reagiert. Für IF bestanden die sekundären Antikörper aus Alex Fluor 488, 594 und 647 in einer Verdünnung von 1:250 für 45 Minuten bei Raumtemperatur.
Zur Bildquantifizierung wurde der gesamte Objektträger von einem motorisierten Tischsystem abgetastet. Die Bilder wurden in ImageJ verarbeitet, wo das Signal in Graustufen umgewandelt und die Anzahl und Intensität der Pixel als integrierte Dichte analysiert wurde. Der Bereich des Erzgangs wurde als interessierender Bereich markiert. Die integrierte Dichte aller Bilder wurde auf ihre Fläche18 normiert.
Es wird gezeigt, dass diese in Modellen der krebsassoziierten tiefen Venenthrombose hochreguliert sind. Die Quantifizierung mehrerer Bilder erfolgte wie zuvor mit Bild J18 mittels integrierter Dichteanalyse. Die Kontrollgruppe wies im Vergleich zur Experimentalgruppe eine signifikant geringere Fibrinexpression auf (p:0,0080; Abbildung 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 Mittelwert ± SD). Bemerkenswert ist, dass die Varianzen in den Fibrin-Expressionen in der experimentellen Gruppe geringer waren als in der Kontrollgruppe (F-Statistik, DFn, Dfd: 3,074, 4, 4).
Graustufen-Ultraschall
Nach 2-tägiger Operation und kurz vor der Gerinnselentnahme wurden die Mäuse einer Graustufen-Ultraschalluntersuchung unterzogen. Mäuse in beiden Gruppen zeigten Gerinnsel in der Hohlvene infrarenal. Allerdings waren die Gerinnsel bei den Mäusen mit Gefäßclip größer. Repräsentative Ultraschallbilder sind in Abbildung 5 dargestellt. Eine reflexionsarme Region des Gefäßes deutet auf ein offenes Lumen hin, und eine echoreiche Dichte im Gefäß deutet auf ein organisiertes Gerinnsel hin. Die ligierte infrarenale Hohlvene einer Maus aus der Kontrollgruppe zeigt in Abbildung 5A ein partielles Gerinnsel, das durch zwei gelbe Pfeilspitzen abgegrenzt ist. Im Gegensatz dazu zeigt Abbildung 5B ein großes Gerinnsel, das die infrarenale Hohlvene fast verschließt, die mit einem Gefäßclipmodell erzeugt wurde (dargestellt durch zwei gelbe Pfeilspitzen und markiert durch weiße Sternchen). Bemerkenswert ist, dass die infrarenale Hohlvene in der Kontrollgruppe kollabierte, während sie in der Experimentalgruppe vergrößert war, was mit der größeren Gerinnselbelastung in der letzteren Gruppe übereinstimmt.
Beide Assays (Ultraschall und IF) deuten darauf hin, dass die Versuchsgruppe durchweg größere Gerinnsel aufwies als die Kontrollgruppe.
Abbildung 1: Eine schematische Darstellung der IVC-Aorta und der Anwendung des Clips über dem Zusammenfluss der linken Nierenvene (LRV)-IVC. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Intraoperatives IVC-Thrombosemodell mit Clip-Applikation . (A) Mittellinien-Laparotomie. (B) Vollständige Exposition der IVC, einschließlich des Zusammenflusses der linken Nierenvene in die IVC. (C) Nachweis des Harnleiterverlaufs und Vermeidung eines iatrogenen Traumas des linken Harnleiters. (D) Verätzung der Gonadenäste. (E) Dissektion des IVC bis zum Konfluenzpunkt der linken Nierenvene. (F) Führen des 5-0-Polypropylen-Nahtmaterials durch die präparierte Ebene, um die Ebene für das Passieren der Naht zu erweitern. (G) Führen einer Gefäßklemme durch die vorbereitete Ebene. (H) Gerinnselbildung 48 h nach der IVC-Klemmung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 3: Die Gruppe der Mäuse mit IVC-Ligatur mit Gefäßklammern wies ein höheres normalisiertes Verhältnis von Gerinnsel zu Körpergewicht auf. Durchschnittliches normalisiertes Verhältnis von Gerinnsel zu Körpergewicht. Die Einheit beider Werte, ausgedrückt in Milligramm. Fehlerbalken = SD. Der t-Test des Schülers wurde angewendet. P <0.0001 Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 4: Erhöhte Fibrin- und CD 31-Expression in einer Gruppe von Mäusen mit IVC-Ligatur mit Gefäßclips. Die repräsentativen Immunfluoreszenzbilder wurden bei 100-facher Vergrößerung von der Kontrollgruppe mit IVC-Ligatur mit Naht und von der Experimentalgruppe mit IVC-Ligatur mit Gefäßclips aufgenommen. Gezeigt werden zufällig ausgewählte Bilder pro Maus (N= 4 Mäuse/Gruppe). (A) Fibrin- und CD31-Expression in der Kontroll- und Versuchsgruppe. Zwei gelbe Pfeilspitzen, die mit weißen Sternchen markiert sind, zeigen das große Gerinnsel, das die IVC fast verschließt, was auf die teilweise verschlossene IVC hindeutet. (B) Die integrierte Dichte von Fibrin: Die Linie stellt den Medianwert dar. Der T-Test des Schülers wurde durchgeführt. p-Wert = 0,0080. IF-Färbung von repräsentativen Bildern der infrarenalen Hohlvene, einschließlich Gerinnseln in der Kontroll- und Experimentalgruppe, die mit Anti-CD31 und Alexa Fluro-Sekundärantikörpern gefärbt wurden. Es wird eine 400-fache Vergrößerung angezeigt. Maßstabsbalken = 100 μm. Fehlerbalken beziehen sich auf das SEM. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 5: Vergrößerte Gerinnseloberfläche innerhalb der teilweise geklemmten IVC in einer Gruppe von Mäusen mit IVC-Ligatur mit Gefäßclips. Die repräsentativen Graustufensonographiebilder der Kontroll- und Experimentalgruppe. (A) Repräsentatives Graustufen-Dopplerbild der Kontrollgruppe: Ein Bereich der IVC zeigt eine reflexionsarme Region, die auf das offene Lumen hindeutet, und der andere Teil zeigt eine echoarme Region, die auf das Gerinnsel hinweist. (B) Repräsentatives Graustufen-Doppler-Bild der Experimentalgruppe: Das organisierte Gerinnsel (weißes Sternchen) innerhalb des IVC, dargestellt mit gelben Pfeilspitzen, war in der Experimentalgruppe stärker ausgeprägt. Darüber hinaus trat das Gerinnsel im sagittalen Abschnitt auf zwei verschiedene Arten auf. Ein Gerinnsel, das den signifikanten Querschnitt des Lumens verschließt, wurde auch auf der anderen Seite der IVC abgegrenzt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
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Discussion
In einem syngenen Xenotransplantat-Kolonkarzinommodell beobachten wir in der Experimentalgruppe eine höhere Thrombogenität und Expression von Gerinnungsmarkern im Vergleich zur Kontrollgruppe. Wichtig ist, dass die Varianz all dieser Parameter in der Experimentalgruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe geringer war. Die Modifikation beinhaltete die Einführung eines Gefäßclips mit einem spezifischen Druckprofil am Konfluenzpunkt der IVC und der linken Nierenvene. Der Clip wurde über einen Abstandshalter gelegt, bei dem es sich um ein 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial handelte. Diese Modifikation reduziert die Variabilität der Gerinnselgröße und der Thrombosemarker. Alle Mäuse erlebten eine Überlebensrate von 100%.
Technische Nuancen
Das Verfahren umfasste mehrere Schritte. Nach der Laparotomie wurden beide Harnleiter gründlich inspiziert, um versehentliche Verletzungen zu vermeiden. Um eine optimale Exposition zu erreichen, wurde der Darm mit feuchter Gaze bedeckt und ohne übermäßige Traktion im rechten oberen Quadranten gehalten. Als nächstes wurden die IVC-Seitenäste 2 bis 3 mm von den Harnleitern, der IVC und der Aorta entfernt kauterisiert, um eine Schädigung der Venen zu vermeiden. Nachdem die vollständige Hämostase sichergestellt war, wurde die Ebene für die IVC-Ligatur vorbereitet. Es ist wichtig zu beachten, dass die Aorta und IVC bei Mäusen entlang ihres Verlaufs eng miteinander verbunden sind und der Versuch, sie zu sezieren, zu Blutungen und zum Verlust des Tieres führen kann. Die einzige Ausnahme ist der Zusammenfluss der linken Nierenvene und der Aorta21. Anschließend wurde eine Nahtpassage mit nicht mehr als drei akribischen, scharfen, divergenten Bewegungen mit einer Zange vorbereitet.
Der IVC-Durchmesser einer 8 bis 12 Wochen alten Maus wird im Bereich von etwa 0,3 bis 0,5 mm angegeben. Das Verfahren der partiellen IVC-Ligatur sollte Raum für die Differenzierung von der vollständigen Ligatur schaffen. In der aktuellen Studie haben wir ein Nahtkaliber von 5-0 in Betracht gezogen, was 0,10 bis 0,15 mm für den Spacer entspricht. Daher wurde der Lippenraum der Gefäßclips für eine 2-0-Naht angepasst, um ausreichend Platz für einen 0,3 mm IVC und einen 0,1 mm Abstand zu schaffen.
Das Polypropylen-Nahtmaterial bot eine unblutige Führung, die es ermöglichte, die Ebene mit wiederholter kaudaler Bewegung um weitere 1 bis 2 mm zu erweitern, um das Anlegen der Gefäßclips aufzunehmen. Abschließend wurden die maßgeschneiderten Gefäßclips mit einem Lippenverbleibensraum platziert, der mit einem 5-0-Polypropylen-Nahtmaterial kompatibel ist.
Die Wahl von Edelmetallklammern, wie z. B. Platin, für den Verschluss von Blutgefäßen wird durch die Tatsache bestimmt, dass dieses Material relativ inert ist und materialinduzierte Entzündungen im Vergleich zu spezifisch resorbierbaren und verzögert resorbierbaren Nähten reduziert22,23,24. Diese Metallklammern sind resistent gegen chemische Reaktionen und damit stabil. Dies führt zu einer sichereren und effektiveren Alternative mit einem geringeren Entzündungsrisiko im Vergleich zur Verwendung von Nahtmaterial.
Translationale Relevanz des Modells
Die murinen Venenthrombosemodelle unterscheiden sich grundlegend von der tiefen Venenthrombose beim Menschen. Zunächst wird in Nagetiermodellen die Gerinnselbildung stromaufwärts beobachtet. Klinische VTs werden jedoch stromabwärts von einem Nidus25,26 gebildet. Zweitens unterscheiden sich die Ursache-Wirkungs-Beziehungen zwischen Menschen- und Mausmodellen. Beim Menschen ist die Bildung von Blutgerinnseln das Indexereignis, gefolgt von einer Obstruktion des Blutflusses. Eine Ausnahme ist das May-Thurner-Syndrom. Das May-Thurner-Syndrom bezieht sich auf eine Erkrankung, bei der ein erhöhter äußerer Druck auf die linke Beckenvene, die sich zwischen der Wirbelsäule und der rechten Beckenarterie befindet, das Risiko einer Thrombose der linken Beckenvene oder eines Blutgerinnsels in der linken Beckenvene erhöht. In Mausmodellen ist die Obstruktion des venösen Flusses das primäre Ereignis, was zu einem trägen Blutfluss und einer Thrombusbildung führt25.
Im Vergleich zu anderen Modellen, wie z.B. der Oberschenkelvenen-Elektrolytverletzung Modell12, bietet die IVC-Stasis einen klaren Vorteil. Es ermöglicht die Untersuchung lokaler therapeutischer Maßnahmen, wie z. B. IVC-Filter, kathetergesteuerte Thrombolyse und endoluminale Rekanalisation, mit der Bereitstellung einer Umgebung für die Bildung von Gerinnseln in Gegenwart von Blutfluss. Dabei werden in diesem Modell zwei Arme der Endothelverletzung und -stase untersucht. Gerinnsel bei IVC sind auch mit einem höheren Auftreten von Komplikationen wie Lungenembolien verbunden. Eine Einschränkung besteht darin, dass IVC eine seltenere Lokalisation für TVT beim Menschen ist.
Reduktions-Verfeinerung-Ersatz (3R)
Es ist wichtig, das 3R-Framework in Tiermodelle zu integrieren. Die Integration des 3R-Rahmenwerks begrenzt das Leid der Tiere und fördert ethische und verantwortungsvolle Tierversuchspraktiken. Die 3R treffen auf unseren aktuellen Befund zu, da wir keine Mortalität bei Mäusen beobachtet haben. Außerdem ist es möglich, weniger Tiere in Studien zu verwenden. So können die Anzahl der Mäuse und die Kosten reduziert werden.
Einschränkungen des Studiums
Eine mögliche Einschränkung der Clip-Methode beinhaltet einen relativ engen Druckprofilbereich der getesteten Gefäßclips. Dementsprechend könnten weitere Studien mit einem breiten Spektrum an Druckprofilen konzipiert werden. Frühere Studien haben gezeigt, dass immungeschwächte Stammmäuse anfälliger für die Bildung von Blutgerinnseln sind und die Gerinnselgewichte bei immunkompetenten Mäusen unterschiedlich sein können12. Zukünftige Studien werden empfohlen, um das Ausmaß der Konsistenz der Gerinnselgewichte in verschiedenen Hintergründen von Mausstämmen zu untersuchen.
Schlussfolgerung
Die derzeitige Methode bietet eine konsistentere Messung für venöse Thrombosestudien über ein partielles IVC-Ligaturmodell. Wir hoffen, dass diese Modifikation die Generierung robuster und zuverlässiger Mausmodelle ermöglichen wird, um die Folgen krebsassoziierter Thrombosen anhand verschiedener Krebsmodelle mit Relevanz für menschliche Erkrankungen zu untersuchen.
Während sich die aktuelle Arbeit speziell auf krebsassoziierte Thrombosen konzentrierte, wird die zukünftige Arbeit eine umfassende Analyse von Mausmodellen mit verschiedenen Komorbiditäten (wie Fettleibigkeit, chronisches Nierenversagen) und normalen Mäusen beinhalten, die das Thromboserisiko erhöhen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center Grant 857078 (KR, VCC, XY und SL) und R01HL166608 (KR und VCC) unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
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