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JoVE Journal Cancer Research
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Cancer Research

Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/65518
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 4,5, 1,6,7,8
1Renal Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 2Vascular Biology Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 3Division of Interventional Radiology, Department of Radiology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 4Department of Medicine, Whitaker Cardiovascular Institute, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 5Department of Biochemistry and Cell Biology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 6Veterans Affairs Boston Healthcare System, 7Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology, 8Center of Cross-Organ Vascular Pathology, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University

Summary

Este artículo tiene como objetivo presentar un método optimizado para evaluar la trombosis venosa en un modelo de cáncer de ratón, utilizando clips vasculares para lograr la ligadura venosa. La optimización minimiza la variabilidad en las mediciones relacionadas con la trombosis y mejora la relevancia para la trombosis venosa asociada al cáncer humano.

Abstract

En este trabajo metodológico se destacan los matices quirúrgicos de un modelo de trombosis venosa en roedores, específicamente en el contexto de la trombosis asociada al cáncer (TAC). La trombosis venosa profunda es una complicación común en los sobrevivientes de cáncer y puede ser potencialmente mortal. Los modelos actuales de trombosis venosa murina suelen implicar una oclusión mecánica completa o parcial de la vena cava inferior (VCI) mediante una sutura. Este procedimiento induce una estasis total o parcial de la sangre y daño endotelial, desencadenando la trombogénesis. Los modelos actuales tienen limitaciones, como una mayor variabilidad en el peso de los coágulos, una tasa de mortalidad significativa y una curva de aprendizaje prolongada. Este informe presenta mejoras quirúrgicas utilizando clips vasculares para abordar algunas de estas limitaciones. Utilizando un modelo de ratón de xenoinjerto de cáncer de colon singénico, empleamos clips vasculares personalizados para ligar la vena cava infrarrenal. Estos clips permiten un espacio labial residual similar a una sutura de polipropileno 5-0 después de las ligaduras de VCI. Los ratones con el método de sutura sirvieron como controles. El método de clip vascular dio lugar a una oclusión vascular parcial consistente y reproducible y a un mayor peso de los coágulos con menos variabilidad que el método de sutura. Se esperaba que los pesos de coágulos más grandes, la mayor masa de coágulos y el coágulo en el área de superficie luminal de la VCI se deban al perfil de presión más alto de los clips vasculares en comparación con una sutura de polipropileno 6-0. El abordaje se validó mediante ecografía en escala de grises, que reveló una masa de coágulo consistentemente mayor en la vena cava infrarrenal con clips vasculares en comparación con el método de sutura. Estas observaciones se corroboraron aún más con la tinción de inmunofluorescencia. Este estudio ofrece un método mejorado para generar un modelo de trombosis venosa en ratones, que puede emplearse para profundizar en la comprensión mecanicista de la TAC y en la investigación traslacional, como el descubrimiento de fármacos.

Introduction

Tromboembolismo venoso asociado al cáncer (TEV)
El riesgo de tromboembolismo venoso (TEV) es de 4 a 7 veces mayor en los supervivientes de cáncer en comparación con la población general 1,2,3. Esta afección resulta mortal en uno de cada siete pacientes con cáncer. La incidencia de TEV varía según el tipo de cáncer y la carga tumoral, y es mayor entre los pacientes con cáncer de páncreas y gástrico4.

El TEV asociado al cáncer en pacientes con cáncer tiene importancia pronóstica. Se asocia con una supervivencia general desfavorable en el primer año después de un diagnóstico de cáncer, incluso después de ajustar por edad, raza y estadio del cáncer subyacente5. Estos hallazgos ponen de relieve la importancia de examinar el TEV asociado al cáncer y la necesidad de investigar su mecanismo utilizando un modelo animal. La relevancia traslacional de esta área se acentúa aún más por el hecho de que el TEV en pacientes con cáncer es prevenible y tratable con tromboprofilaxis y terapia antitrombótica6.

Modelos animales de cáncer y trombosis venosa
Los modelos de cáncer se denominan convencionalmente xenoinjertos, que implican la inyección de células cancerosas en ratones. La inyección de células cancerosas en un sitio similar a su origen se conoce como modelo ortotópico, mientras que en un sitio diferente (plano subcutáneo sobre el flanco) se conoce como modelo heterotópico. La especie de origen de las células cancerosas las determina como modelo alogénico, como la línea celular HT-29 (cáncer de colon humano)7,8,9. Por el contrario, los modelos singénicos utilizan las líneas celulares de cáncer murino, incluidas las líneas celulares RenCa y MC-38 3,10.

La literatura ha descrito modelos de trombosis arterial, venosa y capilar en roedores. La trombosis venosa es inducida en la vena cava inferior (VCI) por lesión mecánica (alambre guía) o ligadura completa de la VCI, química (cloruro férrico) o lesión electrolítica. La trombosis inducida por cloruro férrico o ligadura de VCI representa modelos de oclusión completa. Esto último resulta en la estasis de la sangre y los infiltrados inflamatorios en las venas11,12,13. El modelo de ligadura completa da como resultado una alta tasa de formación de trombosis en el 95% al 100% de los ratones. El modelo de ligadura parcial de la VCI puede incluir la interrupción de las ramas iliolumbares laterales, y el retorno venoso se anula mediante la aplicación de ligaduras de sutura en los puntos diana distales de la VCI12. A veces, se utiliza un soporte de espacio para interrumpir parcialmente el retorno venoso. Sin embargo, el peso del trombo es inconsistente en el modelo actual de oclusión parcial, resultando en una alta variabilidad en el peso de los coágulos y en las alturas12,14.

Ambos modelos mecánicos de vetas grandes (parcial y completa) tienen limitaciones. En primer lugar, la ligadura de la VCI (modelo de estasis) suele provocar hipotensión. La sangre se desvía a través de las venas vertebrales. Aunque en manos experimentadas, la mortalidad con este modelo oscila entre el 5% y el 30%, y la tasa más alta se espera durante la curva de aprendizaje. Es importante destacar que el modelo de oclusión completa no reproduce la trombosis venosa profunda (TVP) en humanos, donde un trombo suele ser no oclusivo. Es probable que la oclusión completa altere los factores hemorreológicos y los parámetros farmacodinámicos, alterando la biodisponibilidad de los compuestos en el sitio local. Debido a estas limitaciones, los modelos de oclusión completa pueden no ser óptimos para probar nuevos compuestos químicos con fines terapéuticos y descubrimientos de fármacos12.

Cabe señalar que para proporcionar un modelo murino clínicamente más relevante de trombosis venosa con flujo disminuido con daño endotelial, se ha introducido un modelo de trombosis venosa, donde la TVP se desencadena por la restricción del flujo sanguíneo en ausencia de disrupción endotelial. El modelo fue validado por microscopía electrónica de barrido15. Un modelo de trombosis clínicamente relevante preferido es aquel con trombosis casi completa que permite el descubrimiento de fármacos. La formación de coágulos en los modelos actuales de oclusión parcial es inconsistente, resultando en una alta variabilidad en el peso y la altura del coágulo12,16. Además, el peso del coágulo es variable con los métodos convencionales, requiriendo más ratones por estudio12.

Los modelos anteriores de trombosis asociada al cáncer se centraron en el cáncer de colon, páncreas y pulmón y todos fueron modelos de oclusión completa17,18,19. Este manuscrito modifica el modelo de trombosis de oclusión parcial para proporcionar coágulos con menor variabilidad y mortalidad en ratones (Figura 1). Estudios anteriores utilizaron líneas celulares de cáncer alogénico en ratones atímicos inmunodeprimidos 19,20,21. Este manuscrito utiliza un xenoinjerto singénico de células MC-38 en ratones C57Bl6/J, que permite el uso de ratones inmunocompetentes y el examen de componentes inmunes a la trombogénesis.

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Protocol

Para este estudio, se utilizaron 16 ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad y un peso corporal de 20 a 25 g. Los ratones fueron alojados en condiciones estándar y fueron alimentados con comida y agua ad libitum. Este estudio se realizó con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Boston. Los procedimientos abiertos descritos aquí se llevaron a cabo en condiciones estériles.

1. Modelo de xenoinjerto

  1. Cultivo celular
    1. Antes de la implantación subcutánea heterotópica, cultivar células MC-38 como una monocapa hasta una confluencia del 80%.
    2. Después de la tripsinización y la resuspensión en medios que contienen FBS al 10%, centrifugue las células a 277 x g, 4 °C durante 5 min. A continuación, vuelva a suspender las células en medios sin suero hasta una concentración de 1 x 104 células MC-38/μL de medios sin suero.
      1. Para la tripsinización, cultive las células MC-38 hasta que alcancen la confluencia deseada (generalmente alrededor del 70%-80%) y luego aspire el medio de cultivo de la placa de Petri.
      2. Añadir 1 ml de solución de tripsina-EDTA e incubar las células con tripsina durante 1 min a 37 °C para permitir el desprendimiento. Golpee o agite suavemente la placa de Petri para asegurar un desprendimiento uniforme.
      3. Añadir un medio de cultivo que contenga suero o un inhibidor de tripsina para neutralizar la actividad y evitar una mayor disociación celular. Recoja las células desprendidas junto con la solución de tripsina neutralizada.
      4. Para la resuspensión, una vez que las células se desprenden a través de la tripsinización, prepáralas para el trasplante o otros experimentos. Centrifugar la suspensión celular recolectada a 277 x g para granular las células.
      5. Retire con cuidado el sobrenadante (líquido sobre el gránulo de la célula). Agregue 9 ml de medio de cultivo, tampón o solución al gránulo celular para lograr la concentración celular deseada para trasplante o experimentación.
      6. Resuspenda suavemente las células pipeteando hacia arriba y hacia abajo o usando un agitador de matraz de cultivo. Evite el pipeteo vigoroso que podría dañar las células.
        NOTA: Dependiendo de la variante o línea celular utilizada, las células pueden resuspenderse en una proporción de 1:1 de matriz de membrana basal solubilizada y medios libres de suero para ralentizar el crecimiento y la diseminación de células de ratón altamente agresivas después de la implantación. Todos los pasos del cultivo celular deben llevarse a cabo en una campana aséptica completa en un espacio específicamente asignado al cultivo celular y se sometieron a pruebas periódicas para detectar micoplasma.
    3. Cuente las celdas con un contador de celdas automatizado según el protocolo manual proporcionado.
  2. Implantación celular
    1. Asigne aleatoriamente ocho ratones al grupo experimental y ocho ratones al grupo de control de la siguiente manera. En el grupo control, utilizar ratones con xenoinjerto MC38 y realizar la ligadura de la VCI con una sutura de polipropileno 5-0. En el grupo experimental, utilizar ratones con xenoinjerto MC38 y realizar la ligadura de la VCI con un clip vascular personalizado.
    2. Coloque al ratón en decúbito lateral izquierdo y afeite el lado derecho entre las extremidades anteriores y traseras. Aplique alcohol y yodo a lo largo de la zona lumbar dorsal para preparar asépticamente la zona para la inyección.
    3. Inyectar 2 x 106 células MC-38 preparadas en 200 μL de medio por vía subcutánea en el flanco, a medio camino entre la costilla más distal del animal y la eminencia pélvica utilizando una aguja de 27G mientras se sujeta suavemente al animal con la mano no dominante.
    4. Después de la inyección, inspeccione cuidadosamente a los animales y vuelva a colocarlos en la jaula. Los animales deben ser inspeccionados para lo siguiente; 1. Cambios en el comportamiento, los niveles de actividad y la movilidad general de los ratones. Cualquier cambio significativo podría indicar malestar o problemas de salud. 2. La condición física general de los ratones, incluida la calidad del pelaje, los hábitos de aseo y cualquier signo visible de angustia o anomalías. Volver al consumo de alimentos y a la ingesta de agua 4. Cualquier cambio en su nivel de actividad, postura o interacciones con sus compañeros de jaula. El letargo o el aumento de la agresión pueden ser signos de angustia.

2. Seguimiento del crecimiento tumoral

  1. Monitoree a los animales cada dos semanas para detectar las tendencias de crecimiento del tumor durante 3-4 semanas. Mida los tumores con un calibrador y registre las dimensiones del tumor.
    1. Mida los tumores a lo largo de su eje más largo (L) y el eje perpendicular al eje largo (W). Calcular el volumen tumoral (V) mediante la ecuación L x (W2) = V. Si el tamaño del tumor supera los 20 mm en cada dimensión y/o el tumor tiene evidencia de ulceración, sacrificar a los animales antes de la finalización del experimento.
  2. Una vez que el volumen tumoral alcance los 400mm3, planifique el uso de los ratones para la ligadura de la VCI.

3. Anestesia y preparación

  1. Anestesiar al ratón en una cámara de isoflurano e inyectar el analgésico por vía subcutánea: Sujetar al animal desde la base de la cola. Mantenga al animal sobre la superficie del dorso de la mano no dominante.
  2. Trasladar al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3%-4%. Confirmar una anestesia general adecuada con la ausencia de un reflejo de pellizco en los dedos de los pies. Utilizar una dosis de mantenimiento de isoflurano al 1%-3%. Aplica ungüento veterinario en ambos ojos.
  3. Inyección subcutánea con buprenorfina (opioide para mitigar el dolor): Disolver el stock de buprenorfina a una concentración de 0,3 mg/ml en cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% para alcanzar la concentración de 0,03 mg/ml.
  4. Inyectar una dosis de 0,05-0,1 mg/kg de 0,03 mg/ml de buprenorfina junto con 500 μl de NaCl estéril al 0,9% por vía subcutánea antes de la cirugía. En un ratón de 20 g se requiere una cantidad de 2 μg o 66 μL de 0,03 mg/ml de buprenorfina.
  5. Preparación de la piel: Coloque el ratón completamente anestesiado en posición supina sobre la manta térmica. Desinfectar la zona abdominal anterior con tintura de clorhexidina al 0,5%, 2x. Verifique con frecuencia la temperatura de la manta térmica durante el procedimiento y asegúrese de que la temperatura no baje.

4. Ligadura de la VCI

  1. Laparotomía de línea media
    1. Incidir la piel abdominal con unas tijeras finas desde la eminencia xifoides hasta la vejiga. Pellizque el peritoneo hasta la mitad de la incisión cutánea con pinzas atraumáticas. Asegure un espacio adecuado entre la incisión y los intestinos suprayacentes (Figura 2A).
    2. Abrir el peritoneo de forma longitudinal junto con la línea alba avascular.
  2. Exteriorización de los intestinos hacia el lado abdominal derecho
    1. Tire de los intestinos con puntas de algodón mojadas. Cubra los intestinos con una gasa estéril completamente húmeda. Asegúrese de que los intestinos cubiertos estén en una dirección libre de tracción sin ninguna tracción excesiva en los vasos mesentéricos.
  3. Exposición completa de la VCI y las ramas, incluida la confluencia de la vena renal izquierda a la VCI (Figura 2B).
    1. Dejar caer 200-300 μL de solución salina normal. Explorar el curso de los uréteres, la VCI, la aorta y las venas renales (Figura 2).
  4. Plano avascular en el punto de confluencia de la VCI infrarrenal y la confluencia de la vena renal izquierda.
    1. Pasar la sutura de polipropileno 6-0 a través del plano avascular suavemente 2x-3x con movimientos caudales a cefálicos con la punta cerrada pinzas atraumáticas.
    2. Asegúrese de que cualquier supuración mínima se controle con una presión suave proporcionada con un taponamiento con punta de algodón. Ensanchar el plano provisto pasando la sutura de polipropileno 6-0 con suaves movimientos caudales a craneales.
  5. Cauterización de las ramas gonadal y lumbar (Figura 2D)
    1. Puede haber hasta 4 ramas posteriores o lumbares. Para evitar posibles complicaciones de isquemia espinal y claudicación, deje intactas las ramas lumbares en el protocolo actual.
    2. Verifique que estén presentes de 2 a 3 ramas laterales, incluido el asta uterina bilateral, el suministro arterial y los vasos hipogástricos. Asegurar la interrupción constante de las primeras sucursales bilateralmente presentes. Cauterizar las ramas bilaterales justo distales a la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI (VCI infrarrenal). Asegúrese de que los vasos de drenaje venoso del asta uterina no se interrumpan.
      NOTA: Se opta por la cauterización de ramas laterales porque este método proporciona una superficie lisa e ininterrumpida, lo que reduce cualquier posibilidad de sangrado incontrolado. Además, la cauterización es más rápida y factible que la ligadura de suturas con suturas 10-0. Por lo tanto, los animales estarán expuestos a un procedimiento más corto y seguro.
  6. Vuelva a verificar el curso de los uréteres y la vasculatura para asegurarse de que no haya supuración o cauterización inadvertida (Figura 2C).
  7. Ligadura de VCI con clips vasculares en el grupo experimental
    1. Personaliza las pinzas vasculares con un ancho de sutura de nylon 2-0 mediante pinzas atraumáticas. Aplicar los clips vasculares personalizados en el grupo experimental circunferencialmente alrededor de la VCI infrarrenal.
    2. Aplique las pinzas vasculares sobre la sutura. El pasaje primario de la sutura proporciona un plano avascular suficiente con dos o tres movimientos meticulosos de caudal a craneal (Figura 2E-F).
    3. A continuación, pase los clips vasculares a través del plano preparado. Prepare el plano en la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI lo suficientemente ancha como para permitir un paso de clip sin incidentes (Figura 2E).
    4. Coloque la pinza vascular personalizada horizontalmente, perpendicular a la línea de la VCI, a través del plano preparado. Coloque los clips vasculares sobre la sutura de polipropileno 5-0 para asegurar un espacio restante adecuado (Figura 2G).
    5. Asegúrese de que los pasos anteriores se realicen con cuidado para evitar cualquier daño o sangrado en los vasos sanguíneos en el sitio de los clips vasculares. Observe el campo quirúrgico en busca de posibles supuraciones. Aplique una presión suave con la punta de algodón sobre el campo quirúrgico en caso de supuración.
  8. Ligadura de VCI con sutura en el grupo control
    1. Ligadura de sutura con sutura de polipropileno 6-0. Realice una sutura quirúrgica de nudo cuadrado alrededor de la VCI infrarrenal en el plano preparado sobre una sutura de seda 5-0.
    2. Una vez que la sutura esté completa, retire suavemente la sutura de seda para asegurar un espacio remanente adecuado.
  9. Realizar inyección subcutánea de 200 μL de solución salina normal.
    NOTA: Para proporcionar una técnica comparable para la oclusión parcial de la VCI con la aplicación de pinzas, el clip vascular se personaliza en el estudio actual para proporcionar espacio entre los labios. A continuación, se coloca el clip vascular en el plano avascular preparado en la confluencia de la vena renal izquierda y la VCI.
  10. Cerrar la laparotomía con sutura vicryl 4-0 de corrido continuo.

5. Seguimiento después de la cirugía índice

  1. Monitoree al animal continuamente después de la operación durante 1 h o hasta que se recupere el equilibrio y la capacidad de enderezamiento, lo que ocurra primero en una jaula limpia aislada hasta que se recupere por completo.
  2. Vigile al animal diariamente durante 2 días. Si el animal se ve angustiado, vigílelo dos veces al día durante 2 días. Administrar analgesia postoperatoria y líquidos según protocolo.
    1. Disolver el caldo de buprenorfina con una concentración de 0,3 mg/ml en cloruro de sodio (NaCl) al 0,9% para alcanzar la concentración de 0,03 mg/ml.
    2. Inyectar una dosis de 0,05-0,1 mg/kg de buprenorfina 0,03 mg/ml por vía subcutánea junto con 500 μl de NaCl estéril al 0,9%, cada 8 a 12 h durante las primeras 48 h después de la cirugía índice. En un ratón de 20 g, se necesitarían 2 μg o 66 μL de 0,03 mg/ml de buprenorfina.

6. Eutanasia y extracción de la VCI que contiene el coágulo

  1. Anestesia al ratón en una cámara de isoflurano, sostén al animal desde la base de la cola y mantenlo en la superficie dorsum de tu mano.
  2. Trasladar al animal a la cámara de inducción anestésica continua llena de isoflurano al 3%-4%. Coloque al animal en decúbito supino.
  3. Realice una laparotomía larga de la línea media desde el xifoides hasta la vejiga como se describe.
  4. Exteriorizar el intestino hacia el lado derecho del abdomen y extraer la VCI pinzada distal a la bifurcación ilíaca hasta la extensión de la VCI infrarrenal (Figura 2G).
  5. Después de la extracción del coágulo y el tumor, eutanasiar al animal con dislocación cervical.

7. Análisis estadístico

  1. Presente el análisis estadístico como la media, la mediana y la desviación estándar (DE) o el error estándar de la media (SEM), el percentil 25 o 75, o todo el rango de valores, incluidos los valores mínimos y máximos, según corresponda. Realice una prueba t de Student y la prueba F según corresponda. Evaluar la significación estadística a nivel de p <0,05.

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Representative Results

A un grupo de ratones hembra C57Bl6/J, de 8 a 12 semanas de edad, se les inyectaron células MC-38 en la fase logarítmica del crecimiento celular. Los xenoinjertos crecieron rápidamente entre la tercera y la cuarta semana después de la inyección18. Una vez que los tumores alcanzaron un volumen promedio de 400mm3, los ratones fueron aleatorizados a los grupos control y experimental. El grupo control se sometió a ligadura de la VCI con sutura, mientras que los ratones experimentales se sometieron a la ligadura de la VCI con la aplicación de clip vascular. Los volúmenes tumorales en los grupos control y experimental fueron comparables sin diferencias significativas (353 ± 100 mm3 vs. 367 ± 46,2mm3, p = 0,445). Las IVC infrarrenales hasta el punto de bifurcación de las venas ilíacas que contenían el coágulo se recolectaron después de 48 h, y los pesos de los coágulos sirvieron como lectura biológica de la trombogenicidad venosa. La evolución postoperatoria en todos los animales de los grupos control y experimental transcurrió sin complicaciones, sin evidencia de decoloración del cuerno uterino, isquemia musculoesquelética o problemas de claudicación en las extremidades inferiores. Durante la segunda laparotomía, no se observó desplazamiento del clip vascular. No se observó mortalidad antes de la finalización de los experimentos.

Relación entre el peso del coágulo y el peso corporal normalizado
Como es probable que los ratones con xenoinjerto pierdan peso corporal, el peso de los coágulos (en mg) se normalizó al peso corporal total en el momento de la cosecha (ambos en mg). Se observó un aumento cercano a 1,5 veces en el peso normalizado del coágulo al cuerpo en los ratones del grupo experimental (media ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) en comparación con los ratones control (0,001453 ± 0,002666, valor P: 0,0019; Figura 3).

Ensayo de inmunofluorescencia
La evaluación histopatológica se utilizó para examinar la VCI y los coágulos. Las secciones de la vena cava infrarrenal incluidas en parafina se tiñeron con anti-CD31 (un marcador de las células endoteliales)20 y antifibrina, y DAPI (Figura 4A).

La vena cava infrarrenal de los ratones control mostró una tinción intacta de CD31 y una fibrina que ocupaba parcialmente la luz del vaso. En el grupo experimental, la expresión de CD31 no estaba intacta, lo que sugiere daño en las células endoteliales y un coágulo grande con expresión prominente de fibrina. La pared del vaso también expresaba tinción de fibrina (Figura 4A).

Para la inmunofluorescencia, se utilizó un anticuerpo monoclonal de ratón con fibrina en una dilución de 1:1000 y se incubó durante la noche a 4 °C. Para CD31, se utilizó un anticuerpo policlonal anti-CD31 de conejo validado para inmunoblots e IF (1:1000 y 1:100 durante la noche a 4 °C). Se sabe que este anticuerpo reacciona contra el CD31 de ratones, humanos y cerdos. Para el IF, los anticuerpos secundarios consistieron en Alex Fluor 488, 594 y 647 a una dilución de 1:250 durante 45 min a temperatura ambiente.

Para la cuantificación de la imagen, toda la diapositiva fue escaneada por un sistema de escenario motorizado. Las imágenes se procesaron en ImageJ, donde la señal se convirtió a escala de grises, y el número y la intensidad de los píxeles se analizaron como densidad integrada. El área de la veta se marcó como la región de interés. La densidad integrada de todas las imágenes se normalizó a su área18.

Se ha demostrado que estos están regulados al alza en modelos de trombosis venosa profunda asociada al cáncer. La cuantificación de varias imágenes se realizó mediante análisis de densidad integrado, como se hacía anteriormente con la Imagen J18. El grupo control tuvo una expresión de fibrina significativamente menor en comparación con el grupo experimental (p:0.0080; Figura 4B; 174 ± 104 vs. 503,5 ± 182,4 media ± DE). En particular, las varianzas en las expresiones de fibrina fueron menores en el grupo experimental en comparación con el grupo control (estadístico F, DFn, Dfd: 3.074, 4, 4).

Ecografía en escala de grises
Después de 2 días de cirugía y justo antes de la extracción del coágulo, los ratones se sometieron a una ecografía en escala de grises. Los ratones de ambos grupos mostraron coágulos en la vena cava infrarrenal. Sin embargo, los coágulos eran más grandes en los ratones con clip vascular. En la Figura 5 se muestran imágenes representativas de la ecografía. Una región anecoica del vaso sugiere una luz permeable y una densidad hiperecogénica en el vaso es indicativa de un coágulo organizado. La vena cava infrarrenal ligada de un ratón del grupo control muestra un coágulo parcial demarcado por dos puntas de flecha amarillas en la Figura 5A. En contraste, la Figura 5B muestra un gran coágulo que casi ocluye la vena cava infrarrenal generado con un modelo de clip vascular (representado por dos puntas de flecha amarillas y marcado con asteriscos blancos). Cabe destacar que la vena cava infrarrenal colapsó en el grupo control, mientras que en el grupo experimental se agrandó, lo que es consistente con la mayor carga de coágulos en este último grupo.

Ambos ensayos (ultrasonografía e IF) sugieren que el grupo experimental tuvo coágulos consistentemente más grandes que el grupo de control.

Figure 1
Figura 1: Esquema que representa la VCI-Aorta y la aplicación de la pinza sobre la confluencia de la vena renal izquierda (VRI)-VCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: Modelo de trombosis intraoperatoria de la VCI con aplicación de clips . (A) Laparotomía de línea media. (B) Exposición completa de la VCI, incluida la confluencia de la vena renal izquierda a la VCI. (C) Demostrar el curso del uréter y evitar cualquier traumatismo iatrogénico en el uréter izquierdo. (D) Cauterización de las ramas gonadales. (E) Disección de la VCI hasta el punto de confluencia de la vena renal izquierda. (F) Pasar la sutura de polipropileno 5-0 a través del plano diseccionado para ensanchar el plano para pasar la sutura. (G) Pasar una pinza vascular a través del plano preparado. (H) Formación de coágulos 48 h después del pinzamiento de la VCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: El grupo de ratones con ligadura de pinzas vasculares en la VCI tuvo una mayor relación normalizada entre el coágulo y el peso corporal. Promedio Relación normalizada entre el coágulo y el peso corporal. La unidad de ambos valores expresados en miligramos. Barras de error = SD. Se aplicó la prueba t de Student. P <0.0001 Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Aumento de la expresión de fibrina y CD 31 en un grupo de ratones con ligadura de vértices vasculares IVC. Las imágenes representativas de inmunofluorescencia obtenidas con un aumento de 100x del grupo control con ligadura de VCI con sutura y del grupo experimental con ligadura de VCI con clips vasculares. Se muestran imágenes seleccionadas al azar por ratón (N= 4 ratones/grupo). (A) Expresión de fibrina y CD31 en los grupos control y experimental. Dos puntas de flecha amarillas marcadas con asteriscos blancos representan el gran coágulo que casi ocluye la VCI, lo que implica la VCI parcialmente ocluida. (B) La densidad integrada de la fibrina: La línea representa el valor medio. Se realizó la prueba T de Student. Valor p = 0,0080. Tinción de FI de imágenes representativas de la vena cava infrarrenal, incluidos los coágulos en los grupos control y experimentales y teñidas con anticuerpos secundarios anti-CD31 y Alexa Fluro. Se muestra un aumento de 400x. Barras de escala = 100 μm. Las barras de error se refieren al SEM. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: Aumento de la superficie del coágulo dentro de la VCI parcialmente pinzada en un grupo de ratones con ligadura de VCI con clips vasculares. Las imágenes representativas de la ecografía en escala de grises del grupo control y experimental. (A) Imagen Doppler representativa en escala de grises del grupo de control: Una región de la VCI muestra una región anecoica que sugiere la luz permeable, y la otra parte muestra una región hiperecogénica indicativa del coágulo. (B) Imagen Doppler representativa en escala de grises del grupo experimental: El coágulo organizado (asterisco blanco) dentro de la VCI, representado con puntas de flecha amarillas, fue más prominente en el grupo experimental. Además, el coágulo apareció de dos maneras distintas en la sección sagital. También se delineó un coágulo que ocluía la sección transversal significativa de la luz en el otro lado de la VCI. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Discussion

En un modelo singénico de cáncer de colon con xenoinjerto, observamos una mayor trombogenicidad y expresiones de marcadores de coagulación en el grupo experimental en comparación con el grupo control. Es importante destacar que la varianza en todos estos parámetros fue menor en el grupo experimental en comparación con el grupo control. La modificación consistió en la introducción de un clip vascular con un perfil de presión específico en el punto de confluencia de la VCI y la vena renal izquierda. El clip se colocó sobre un espaciador, que era una sutura de polipropileno 5-0. Esta modificación reduce la variabilidad en el tamaño del coágulo y los marcadores de trombosis. Todos los ratones experimentaron un 100% de supervivencia.

Matices técnicos
El procedimiento implicó una atención específica a varios pasos. Después de la laparotomía, ambos uréteres fueron inspeccionados minuciosamente para evitar cualquier lesión accidental. Para lograr una exposición óptima, los intestinos se cubrieron con gasas húmedas y se mantuvieron en el cuadrante superior derecho sin una tracción excesiva. A continuación, se cauterizaron las ramas laterales de la VCI a una distancia de 2 a 3 mm de los uréteres, la VCI y la aorta para evitar daños en las venas. Después de asegurar la hemostasia completa, se preparó el avión para la ligadura de la VCI. Es importante tener en cuenta que la aorta y la VCI en ratones están estrechamente conectadas a lo largo de su curso, y el intento de diseccionarlas puede provocar hemorragias y la pérdida del animal. La única excepción es el punto de confluencia21 de la vena renal izquierda y la aorta. A continuación, se preparó un pasaje de sutura utilizando no más de tres movimientos divergentes meticulosos y agudos con fórceps.

Se informa que el diámetro de la VCI de un ratón de 8 a 12 semanas de edad está en el rango de aproximadamente 0,3 a 0,5 mm. El procedimiento de ligadura parcial de la VCI debe asegurar un espacio para diferenciarlo de la ligadura completa. En el presente estudio, se consideró un calibre de sutura 5-0, correspondiente a 0,10 a 0,15 mm para el espaciador. Por lo tanto, el espacio labial de los clips vasculares se ajustó para una sutura 2-0 para proporcionar un espacio adecuado para una VCI de 0,3 mm y un espacio de 0,1 mm.

La sutura de polipropileno proporcionó una guía sin sangre, lo que permitió ensanchar el plano con movimientos caudales repetitivos al cráneo durante 1 a 2 mm adicionales para acomodar la aplicación de los clips vasculares. Finalmente, se colocaron las pinzas vasculares personalizadas con un espacio restante en el labio compatible con una sutura de polipropileno 5-0.

La elección de clips de metales nobles, como el platino, para el cierre de los vasos sanguíneos, está impulsada por el hecho de que dicho material es relativamente inerte y reduce la inflamación inducida por el material en comparación con las suturas absorbibles específicas y absorbibles retardadas22,23,24. Estos clips metálicos son resistentes a las reacciones químicas, lo que los hace estables. Esto conduce a una alternativa más segura y eficaz con un menor riesgo de inflamación en comparación con el uso de materiales de sutura.

Relevancia traslacional del modelo
Los modelos de trombosis venosa murina son fundamentalmente diferentes de la trombosis venosa profunda en humanos. En primer lugar, en los modelos de roedores, la formación de coágulos se observa en la dirección aguas arriba. Sin embargo, las TV clínicas se forman aguas abajo de un nido25,26. En segundo lugar, las relaciones de causa y efecto son diferentes entre los modelos humanos y los de ratón. En los seres humanos, la formación de coágulos es el evento índice seguido de la obstrucción del flujo sanguíneo. Una excepción es el síndrome de May-Thurner. El síndrome de May-Thurner se refiere a una afección médica en la que el aumento de la presión externa en la vena ilíaca izquierda, ubicada entre la columna vertebral y la arteria ilíaca derecha, aumenta el riesgo de trombosis de la vena ilíaca izquierda o un coágulo de sangre en la vena ilíaca izquierda. En modelos de ratón, la obstrucción del flujo venoso es el evento primario, lo que resulta en un flujo sanguíneo lento y la formación de trombos25.

En comparación con otros modelos, como el modelo12 de lesión electrolítica de la vena femoral, la estasis de la VCI ofrece una clara ventaja. Permite examinar las medidas terapéuticas locales, como los filtros IVC, la trombólisis dirigida por catéter y la recanalización endoluminal, proporcionando un entorno para la formación de coágulos en presencia de flujo sanguíneo. De este modo, en este modelo se examinan dos brazos de la lesión endotelial y la estasis. Los coágulos en la VCI también se asocian con una mayor incidencia de complicaciones, como la embolia pulmonar. Una limitación es que la VCI es un sitio menos común para la TVP en humanos.

Marco de Reducción-Refinamiento-Reemplazo (3R)
Es importante integrar el marco de las 3R en modelos animales. La integración del marco de las 3R limita el sufrimiento animal y promueve prácticas éticas y responsables de investigación con animales. Las 3R se aplican a nuestro hallazgo actual, ya que no observamos mortalidad en ratones. Además, es posible utilizar menos animales en los estudios. Por lo tanto, se puede reducir el número de ratones y el costo.

Limitaciones del estudio
Una posible limitación del método de clip incluye un rango de perfil de presión relativamente estrecho de los clips vasculares probados. En consecuencia, se podrían diseñar estudios adicionales con una amplia gama de perfiles de presión. Estudios previos han demostrado que los ratones inmunodeprimidos son más susceptibles a la formación de coágulos, y los pesos de los coágulos pueden diferir en ratonesinmunocompetentes. Se recomienda realizar estudios futuros para examinar el grado de consistencia de los pesos de los coágulos en diferentes orígenes de cepas de ratones.

Conclusión
El método actual proporciona una medida más consistente para el estudio de la trombosis venosa a través de un modelo de ligadura parcial de la VCI. Esperamos que esta modificación permita la generación de modelos murinos robustos y fiables para investigar las consecuencias de la trombosis asociada al cáncer utilizando diferentes modelos de cáncer con relevancia para la enfermedad humana.

Si bien el trabajo actual se centró específicamente en la trombosis asociada al cáncer, el trabajo futuro implicará realizar un análisis exhaustivo de modelos de ratón de diferentes comorbilidades (como obesidad, insuficiencia renal crónica) y ratones normales que aumentan el riesgo de trombosis.

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Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo contó con el apoyo de la subvención del Centro de Cardio-oncología SFRN CAT-HD de la AHA 857078 (KR, VCC, XY y SL) y R01HL166608 (KR y VCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
Caliper VWR International, Radnor, PA 12777-830
CD31 Abcam Ab9498
Cell Counter MOXIE MXZ000
Clamp  Fine Science Tools    13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, Accurate Surgical & Scientific Instruments PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Fibrin Millipore MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Isoflurane, USP  Covetrus NDC 11695-6777-2
MC-38 cell Sigma Aldrich SCC172
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Scissors  Fine Science Tools   14079-10
Suture- Vicryl AD-Surgical #L-G330R24
Suture-Nylon 2-0 Ethilon 664H
Suture-Prolene 5-0 Ethicon 8661G
Suture-Prolene 6-0 Ethicon PDP127
VEV03100 VisualSonics FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix The Well Bioscience VHM01 

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References

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Cancer Research Número 203 trombosis asociada al cáncer xenoinjerto ligadura parcial de la VCI
Ensayo de trombosis venosa en un modelo de cáncer en ratones
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