Summary
Denna artikel syftar till att presentera en optimerad metod för att bedöma venös trombos i en muscancermodell, med hjälp av vaskulära klämmor för att uppnå venös ligering. Optimering minimerar variabiliteten i trombosrelaterade mätningar och ökar relevansen för human cancerassocierad venös trombos.
Abstract
Denna metodartikel belyser de kirurgiska nyanserna av en gnagarmodell av venös trombos, särskilt i samband med cancerassocierad trombos (CAT). Djup ventrombos är en vanlig komplikation hos canceröverlevare och kan vara potentiellt dödlig. De nuvarande murina venösa trombosmodellerna involverar vanligtvis en fullständig eller partiell mekanisk ocklusion av den nedre hålvenen (IVC) med hjälp av en sutur. Denna procedur inducerar en total eller partiell stas av blod och endotelskada, vilket utlöser trombogenes. De nuvarande modellerna har begränsningar som högre variabilitet i koagulationsvikter, betydande dödlighet och förlängd inlärningskurva. Denna rapport introducerar kirurgiska förfiningar med hjälp av vaskulära klämmor för att ta itu med några av dessa begränsningar. Med hjälp av en syngen xenograftmusmodell för koloncancer använde vi skräddarsydda kärlklämmor för att ligera infrarenal vena cava. Dessa klämmor tillåter kvarvarande läpputrymme som liknar en 5-0 polypropensutur efter IVC-ligeringar. Möss med suturmetoden fungerade som kontroller. Vascular clip-metoden resulterade i en konsekvent reproducerbar partiell vaskulär ocklusion och större koagulationsvikter med mindre variabilitet än suturmetoden. De större koagulationsvikterna, den större koagulationsmassan och koaguleringen till IVC-luminalytan förväntades på grund av den högre tryckprofilen för kärlklämmorna jämfört med en 6-0 polypropensutur. Tillvägagångssättet validerades med ultraljud i gråskala, som visade genomgående större koagulationsmassa i infrarenal vena cava med kärlklämmor jämfört med suturmetoden. Dessa observationer bekräftades ytterligare med immunofluorescensfärgningen. Denna studie erbjuder en förbättrad metod för att generera en venös trombosmodell i möss, som kan användas för att fördjupa den mekanistiska förståelsen av CAT och i translationell forskning som läkemedelsutveckling.
Introduction
Cancerassocierad venös tromboembolism (VTE)
Risken för venös tromboembolism (VTE) är 4 till 7 gånger högre hos canceröverlevare jämfört med den allmänna befolkningen 1,2,3. Detta tillstånd visar sig vara dödligt hos en av sju patienter med cancer. Incidensen av VTE varierar beroende på typ av cancer och tumörbörda och är högst bland patienter med bukspottkörtel- och magcancer4.
Cancerassocierad VTE hos cancerpatienter har prognostisk betydelse. Det är förknippat med ogynnsam total överlevnad under det första året efter en cancerdiagnos, även efter justering för ålder, ras och stadium av underliggande cancer5. Dessa fynd belyser vikten av att undersöka cancerassocierad VTE och behovet av att undersöka dess mekanism med hjälp av en djurmodell. Den translationella relevansen av detta område understryks ytterligare av det faktum att VTE hos cancerpatienter kan förebyggas och behandlas med tromboprofylax och antitrombotisk terapi6.
Djurmodeller av cancer och venös trombos
Cancermodeller kallas konventionellt för xenograft, vilket innebär att cancerceller injiceras i möss. Injektionen av cancerceller på ett ställe som dess ursprung kallas en ortotopisk modell, medan på en annan plats (subkutant plan över flanken) är känd som en heterotopisk modell. Cancercellernas ursprungsart bestämmer dem som en allogen modell, såsom HT-29-cellinjen (human tjocktarmscancer)7,8,9. Tvärtom använder syngena modeller murina cancercellinjer, inklusive RenCa- och MC-38-cellinjerna 3,10.
Litteraturen har beskrivit arteriella, venösa och kapillära trombosmodeller hos gnagare. Venös trombos induceras i nedre hålvenen (IVC) genom mekanisk skada (ledare) eller fullständig IVC-ligering, kemisk (järnklorid) eller elektrolytisk skada. Järnklorid-inducerad trombos eller IVC-ligering representerar kompletta ocklusionsmodeller. Det senare resulterar i blodets stas och inflammatoriska infiltrat i venerna11,12,13. Den fullständiga ligeringsmodellen resulterar i en hög grad av trombosbildning hos 95 % till 100 % av mössen. Den partiella IVC-ligeringsmodellen kan inkludera avbrott i laterala iliolumbala grenar, och det venösa återflödet upphävs genom att applicera suturligationer i de distala målpunkterna för IVC12. Ibland används en mellanslagshållare för att delvis avbryta det venösa återflödet. Trombvikten är dock inkonsekvent i den nuvarande partiella ocklusionsmodellen, vilket resulterar i hög variabilitet i koagulationsvikter och höjder12,14.
Båda dessa mekaniska modeller med stora ådror (partiella och fullständiga) har begränsningar. För det första resulterar IVC-ligering (stasismodell) ofta i hypotoni. Blodet shuntas genom kotvenerna. Även om dödligheten med denna modell är i erfarna händer varierar den mellan 5 % och 30 %, och den högre frekvensen förväntas under inlärningskurvan. Det är viktigt att notera att den fullständiga ocklusionsmodellen inte reproducerar djup ventrombos (DVT) hos människa, där en tromb vanligtvis är icke-ocklusiv. Fullständig ocklusion kommer sannolikt att förändra hemorheologiska faktorer och farmakodynamiska parametrar, vilket förändrar biotillgängligheten av föreningar på den lokala platsen. På grund av dessa begränsningar kan det hända att fullständiga ocklusionsmodeller inte är optimala för att testa nya kemiska föreningar för terapeutiska ändamål och läkemedelsupptäckter12.
Det bör noteras att för att ge en mer kliniskt relevant murin modell av venös trombos med minskat flöde med endotelskada har en venös trombosmodell introducerats, där DVT utlöses av begränsning av blodflödet i frånvaro av endotelstörning. Modellen validerades med svepelektronmikroskopi15. En föredragen kliniskt relevant trombosmodell är en med nästan fullständig trombos som möjliggör läkemedelsupptäckter. Blodproppsbildningen i de nuvarande modellerna för partiell ocklusion är inkonsekvent, vilket resulterar i hög variabilitet i koagulationsvikt och höjd12,16. Dessutom varierar koagulationsvikten med de konventionella metoderna, vilket kräver fler möss per studie12.
Tidigare cancerassocierade trombosmodeller fokuserade på tjocktarms-, bukspottkörtel- och lungcancer och var alla kompletta ocklusionsmodeller17,18,19. Detta manuskript modifierar den partiella ocklusionstrombosmodellen för att ge blodproppar med lägre variabilitet och musdödlighet (Figur 1). Tidigare studier använde allogena cancercellinjer på immunsupprimerade atymiska möss bakgrund 19,20,21. Detta manuskript använder ett MC-38 cellsyngent xenograft i C57Bl6/J-möss, vilket möjliggör användning av immunkompetenta möss och undersökning av immunkomponenter till trombogenes.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
För denna studie användes 16 C57Bl6/J-möss av honkön, 8-12 veckor gamla, och en kroppsvikt på 20 till 25 g. Mössen inhystes under normala förhållanden och matades med mat och vatten ad libitum. Denna studie utfördes med godkännande av Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) vid Boston University. De öppna procedurer som beskrivs här utfördes i sterilt tillstånd.
1. Xenograft-modellen
- Cellodling
- Före heterotopisk subkutan implantation, odla MC-38-celler som ett monolager till 80 % sammanflöde.
- Efter trypsinisering och resuspension i 10 % FBS-innehållande media, centrifugera cellerna vid 277 x g, 4 °C i 5 minuter. Återsuspendera sedan cellerna i serumfria medier till en koncentration av 1 x 104 MC-38-celler/μl serumfritt medium.
- För trypsinisering, odla MC-38-cellerna tills de når ett önskat sammanflöde (vanligtvis runt 70%-80%) och aspirera sedan odlingsmediet från petriskålen.
- Tillsätt 1 ml trypsin-EDTA-lösning och inkubera cellerna med trypsin i 1 minut vid 37 °C så att de kan lossna. Knacka eller skaka petriskålen försiktigt för att säkerställa att den lossnar jämnt.
- Tillsätt ett odlingsmedium som innehåller serum eller en trypsinhämmare för att neutralisera aktiviteten och förhindra ytterligare celldissociation. Samla upp de lossnade cellerna tillsammans med den neutraliserade trypsinlösningen.
- För resuspension, när cellerna har lossnat genom trypsinisering, förbered dem för transplantation eller ytterligare experiment. Centrifugera den uppsamlade cellsuspensionen vid 277 x g för att pelletera cellerna.
- Ta försiktigt bort supernatanten (vätskan ovanför cellpelleten). Tillsätt 9 ml odlingsmedium, buffert eller lösning till cellpelleten för att uppnå önskad cellkoncentration för transplantation eller experiment.
- Återsuspendera cellerna försiktigt genom pipettering upp och ner eller med hjälp av en odlingsflaskskakare. Undvik kraftig pipettering som kan skada cellerna.
OBS: Beroende på vilken variant eller cellinje som används kan cellerna återsuspenderas i förhållandet 1:1 mellan solubiliserad basalmembranmatris och serumfria medier för att bromsa mycket aggressiv muscellstillväxt och spridning efter implantation. Alla steg i cellodlingen ska utföras i en komplett aseptisk huva i ett specifikt avsatt utrymme för cellodling och testas regelbundet för mykoplasma.
- Räkna cellerna med en automatiserad cellräknare enligt det medföljande manuella protokollet.
- Implantation av celler
- Tilldela slumpmässigt åtta möss till experimentgruppen och åtta möss till kontrollgruppen enligt följande. I kontrollgruppen, använd möss med MC38 xenograft och utför IVC-ligering med en polypropen 5-0-sutur. I experimentgruppen använder du möss med MC38 xenograft och utför IVC-ligering med en anpassad vaskulär klämma.
- Placera musen i vänster sidoläge och raka höger sida mellan frambenen och bakbenen. Applicera alkohol och jod längs det dorsala ländryggen för att aseptiskt förbereda området för injektion.
- Injicera 2 x 106 MC-38-celler preparerade i 200 μl medium subkutant i flanken, halvvägs mellan djurets mest distala revben och bäckenets eminens med hjälp av en 27G-nål medan du försiktigt håller djuret i den icke-dominanta handen.
- Efter injektionen inspekteras djuren noggrant och sätts tillbaka i buren. Djuren bör inspekteras med avseende på följande: 1. Förändringar i beteende, aktivitetsnivåer och övergripande rörlighet hos mössen. Alla betydande förändringar kan tyda på obehag eller hälsoproblem. 2. Mössens allmänna fysiska tillstånd, inklusive pälskvalitet, putsningsvanor och eventuella synliga tecken på lidande eller avvikelser 3. Återgå till matkonsumtion och vattenintag 4. Eventuella förändringar i deras aktivitetsnivå, hållning eller interaktioner med burkamrater. Slöhet eller ökad aggression kan vara tecken på ångest.
2. Uppföljning av tumörtillväxt
- Övervaka djuren varannan vecka för tumörtillväxttrender i 3-4 veckor. Mät tumörerna med ett skjutmått och registrera tumörens dimensioner.
- Mät tumörerna längs deras längsta axel (L) och axeln vinkelrätt mot den långa axeln (W). Beräkna tumörvolymen (V) med ekvationen L x (W2) = V. Om tumörstorleken överstiger 20 mm i varje dimension och/eller om tumören har tecken på sårbildning, avlivas djuren innan försöket avslutas.
- När tumörvolymen når 400 mm3 planerar du att använda mössen för IVC-ligering.
3. Anestesi och förberedelse
- Bedöva musen i en isoflurankammare och injicera smärtstillande medel subkutant: Håll djuret från svansroten. Håll djuret på ryggsidan av den icke-dominanta handen.
- Överför djuret till en induktionskammare för kontinuerlig anestesi, fylld med 3-4 % isofluran. Bekräfta adekvat generell anestesi med frånvaro av en tånypreflex. Använd en underhållsdos på 1%-3% isofluran. Applicera veterinärsalva på båda ögonen.
- Subkutan injektion med buprenorfin (opioid för att lindra smärta): Lös upp buprenorfinstammen i en koncentration av 0,3 mg/ml i 0,9 % natriumklorid (NaCl) för att uppnå en koncentration på 0,03 mg/ml.
- Injicera en dos på 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfin tillsammans med 500 μL steril 0,9% NaCl subkutant före operationen. I en mängd på 20 g hos möss på 2 μg eller 66 μl på 0,03 mg/ml krävs buprenorfin.
- Hudförberedelse: Placera den helt bedövade musen på rygg över värmefilten. Desinficera det främre bukområdet med 0,5% klorhexidintinktur, 2x. Kontrollera ofta temperaturen på värmefilten under proceduren och se till att temperaturen inte sjunker.
4. IVC-ligering
- Laparotomi mittlinjen
- Snitta bukhuden med en fin sax från xiphoidal eminens till urinblåsan. Nyp ihop bukhinnan halvvägs längs hudsnittet med en traumatisk pincett. Se till att det finns tillräckligt med utrymme mellan snittet och de överliggande tarmarna (Figur 2A).
- Öppna bukhinnan på ett längsgående sätt tillsammans med avascular linea alba.
- Exteriorisering av tarmarna till höger buksida
- Dra ut tarmarna med våta bomullsspetsar. Täck tarmarna med en helt fuktig steril gasbinda. Se till att de täckta tarmarna är i en dragfri riktning utan överdriven dragkraft på de mesenteriska kärlen.
- Full exponering av IVC och förgreningar, inklusive sammanflödet av vänster njurven till IVC (Figur 2B).
- Droppa 200-300 μL normal saltlösning. Utforska urinledarnas, IVC-, aorta- och njurvenernas kurs (Figur 2).
- Avaskulärt plan vid sammanflödespunkten för infrarenal IVC och vänster njurvenkonfluens.
- För polypropen 6-0-suturen genom avaskulärplanet försiktigt 2x-3x med kaudala till cephalad-rörelser med den atraumatiska pincetten med stängd spets.
- Se till att all minimal sippring kontrolleras med ett lätt tryck försett med en bomullsspets tamponad. Vidga det medföljande planet genom att passera 6-0 polypropensuturen med mjuka kaudala till kraniala rörelser.
- Kauterisering av gonad- och ländryggsgrenarna (Figur 2D)
- Upp till 4 bakre grenar eller ländryggsgrenar kan förekomma. För att undvika potentiella komplikationer av spinal ischemi och claudicatio ska ländryggsgrenarna lämnas intakta i det aktuella protokollet.
- Kontrollera att 2 till 3 sidogrenar, inklusive den bilaterala livmoderhornsarteriella tillförseln och hypogastriska kärl är närvarande. Säkerställ konsekventa störningar i de första bilateralt närvarande grenarna. Kauterisera de bilaterala grenarna precis distalt om sammanflödet av vänster njurven och IVC (infra-renal IVC). Se till att livmoderhornets venösa dränerande kärl inte störs.
OBS: Sidogrenskauterisering väljs eftersom denna metod ger en slät och oavbruten yta, vilket minskar risken för okontrollerad blödning. Dessutom är kauterisering snabbare och mer genomförbar än suturligering med 10-0 suturer. Därför kommer djuren att utsättas för ett kortare och säkrare ingrepp.
- Dubbelkolla urinledarnas kurs och kärlen för att säkerställa att det inte sipprar eller oavsiktligt kauteriseras (Figur 2C).
- IVC-ligering med vaskulära klämmor i experimentgruppen
- Anpassa kärlklämmorna med en bredd på 2-0 nylonsutur med en traumatisk pincett. Applicera de anpassade kärlklämmorna i experimentgruppen runt om den infrarenala IVC.
- Applicera kärlklämmorna över suturen. Den primära suturpassagen ger ett tillräckligt avaskulärt plan med två till tre noggranna kaudala till kraniala rörelser (Figur 2E-F).
- För vidare kärlklämmorna genom det förberedda planet. Förbered planet vid sammanflödet av vänster njurven och IVC tillräckligt brett för att tillåta en händelselös klipppassage (Figur 2E).
- Placera den anpassade vaskulära klämman horisontellt, vinkelrätt mot IVC-kursen, genom det förberedda planet. Placera kärlklämmorna över 5-0 polypropensuturen för att säkerställa tillräckligt med återstående utrymme (Figur 2G).
- Se till att ovanstående steg utförs försiktigt för att förhindra kärlskador eller blödning på platsen för kärlklämmor. Observera det kirurgiska fältet för potentiell utsöndring. Applicera ett lätt tryck med bomullsspetsen på det kirurgiska området om det sipprar.
- IVC-ligering med sutur i kontrollgruppen
- Suturligering med 6-0 polypropensutur. Gör en kirurgisk fyrkantig knutsutur runt den infrarenala IVC i det förberedda planet över en 5-0 silkessutur.
- När suturen är klar, ta försiktigt bort silkessuturen för att säkerställa tillräckligt med kvarvarande utrymme.
- Utför subkutan injektion av 200 μl normal koksaltlösning.
OBS: För att tillhandahålla en jämförbar teknik för partiell IVC-ocklusion med klämapplikation, är kärlklämman anpassad i den aktuella studien för att ge utrymme mellan läpparna. Kärlklämman placeras sedan i det preparerade avaskulära planet i sammanflödet av vänster njurven och IVC. - Stäng laparotomin med kontinuerlig 4-0 vicryl-sutur.
5. Uppföljning efter indexoperationen
- Övervaka djuret kontinuerligt efter operationen i 1 timme eller tills balansen och rätningsförmågan har återställts, beroende på vad som kommer först i en isolerad ren bur tills det är helt återställt.
- Övervaka djuret dagligen i 2 dagar. Om djuret ser stressat ut, övervaka det två gånger om dagen i 2 dagar. Administrera postoperativ smärtlindring och vätskor enligt protokoll.
- Lös upp buljongen med en koncentration på 0,3 mg/ml i 0,9 % natriumklorid (NaCl) för att uppnå koncentrationen 0,03 mg/ml.
- Injicera en dos på 0,05-0,1 mg/kg 0,03 mg/ml buprenorfin subkutant tillsammans med 500 μl steril 0,9 % NaCl, var 8:e till 12:e timme under de första 48 timmarna efter indexoperationen. I en mus på 20 g krävs 2 μg eller 66 μl 0,03 mg/ml buprenorfin.
6. Avlivning och uttagning av IVC som innehåller blodproppen
- Bedöva musen i en isoflurankammare, håll djuret från svansroten och håll djuret på handens ryggyta.
- Överför djuret till en induktionskammare för kontinuerlig anestesi, fylld med 3-4 % isofluran. Placera djuret i ryggläge.
- Utför en lång laparotomi i mittlinjen med början från xiphoiden till urinblåsan enligt beskrivningen.
- Exteriorisera tarmen till höger sida av buken och skörda den fastklämda IVC distalt om höftbensförgreningen i samma utsträckning som infrarenal IVC (Figur 2G).
- Efter blodproppen och tumörskörden avlivas djuret med livmoderhalsluxation.
7. Statistisk analys
- Presentera statistisk analys som medelvärde, median och standardavvikelse (SD) eller standardfel för medelvärdet (SEM), 25:e eller 75:e percentilen, eller hela värdeintervallet, inklusive minimi- och maximivärden, beroende på vad som är lämpligt. Utför ett student-t-test och F-testet efter behov. Bedöm statistisk signifikans på p-<0,05-nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En grupp C57Bl6/J-möss av honkön, 8-12 veckor gamla, injicerades med MC-38-celler i den logaritmiska fasen av celltillväxten. Xenotransplantaten växte snabbt mellan den tredje och fjärde veckan efter injektionen18. När tumörerna nådde en genomsnittlig volym på 400mm3 randomiserades mössen till kontroll- och experimentgrupperna. Kontrollgruppen genomgick IVC-ligering med sutur, medan experimentmössen utsattes för IVC-ligering med vaskulär clip-applicering. Tumörvolymerna i kontroll- och experimentgrupperna var jämförbara utan signifikanta skillnader (353 ± 100 mm 3 jämfört med 367 ± 46,2 mm3, p = 0,445). Intravenal intravenös intravens förgreningspunkt som innehåller koaguleringen skördades efter 48 timmar, och koagulationsvikterna fungerade som biologisk avläsning av venös trombogenicitet. Det postoperativa förloppet hos alla djur i kontroll- och försöksgrupper var händelselöst, utan tecken på missfärgning av livmoderhornen, muskuloskeletal ischemi eller problem med claudicatio i nedre extremiteterna. Under den andra laparotomin observerades ingen förskjutning av vaskulär klämma. Ingen mortalitet observerades innan försöken avslutades.
Förhållandet mellan koaguleringsvikt och normaliserad kroppsvikt
Eftersom möss med xenograft sannolikt kommer att gå ner i vikt, normaliserades blodproppsvikterna (i mg) till den totala kroppsvikten vid skördetillfället (båda i mg). Nära en 1,5-faldig ökning av den normaliserade koaguleringsvikten observerades hos möss i experimentgruppen (medelvärde ± SEM, 0,002580 ± 0,00098) jämfört med kontrollmöss (0,001453 ± 0,002666, P-värde: 0,0019; Figur 3).
Immunofluorescensanalys
Den histopatologiska utvärderingen användes för att undersöka IVC och blodproppar. De paraffininbäddade snitten från infrarenal vena cava färgades med anti-CD31 (en markör för endotelceller)20 och anti-fibrin, och DAPI (Figur 4A).
Den infrarenala vena cava från kontrollmöss visade intakt CD31-färgning och fibrin som delvis upptog kärlets lumen. I experimentgruppen var CD31-uttrycket inte intakt, vilket tyder på endotelcellsskada och en stor propp med framträdande fibrinuttryck. Kärlväggen uttryckte också fibrinfärgning (Figur 4A).
För immunofluorescens användes monoklonal fibrinantikropp från mus vid spädning 1:1000 och inkuberades över natten vid 4 °C. För CD31 användes en polyklonal anti-CD31-antikropp från kanin validerad för immunofläckar och IF (1:1000 och 1:100 över natten vid 4 °C). Denna antikropp är känd för att reagera mot CD31 från möss, människa och gris. För IF bestod de sekundära antikropparna av Alex Fluor 488, 594 och 647 vid 1:250 spädning i 45 minuter vid rumstemperatur.
För bildkvantifiering skannades hela bilden av ett motoriserat scensystem. Bilderna bearbetades i ImageJ, där signalen konverterades till gråskala, och antalet och intensiteten av pixlar analyserades som integrerad densitet. Området för venen markerades som det intressanta området. Den integrerade densiteten för alla bilder normaliserades till dess yta18.
Dessa har visat sig vara uppreglerade i modeller av cancerassocierad djup ventrombos. Kvantifieringen av flera bilder utfördes med hjälp av integrerad densitetsanalys, vilket tidigare gjorts med hjälp av bild J18. Kontrollgruppen hade signifikant lägre fibrinuttryck jämfört med experimentgruppen (p:0,0080; Figur 4B; 174 ± 104 jämfört med 503,5 ± 182,4 medelvärde ± SD). Noterbart är att varianserna i Fibrin-uttrycken var lägre i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen (F-statistik, DFn, Dfd: 3,074, 4, 4).
Ultraljud i gråskala
Efter 2 dagars operation och strax före proppskörden genomgick mössen ultraljud i gråskala. Möss i båda grupperna uppvisade blodproppar i infrarenal vena cava. Blodpropparna var dock större hos mössen med vaskulär klippning. Representativa ultraljudsbilder visas i figur 5. En ekofri del av kärlet tyder på en patenterad lumen och en hyperekoisk densitet i kärlet tyder på en organiserad koagel. Den ligerade infrarenala hålvenen hos en mus från kontrollgruppen visar en partiell koagel avgränsad av två gula pilspetsar i figur 5A. Som kontrast till detta visar figur 5B en stor propp som nästan täpper till den infrarenala hålvenen som genererats med en vaskulär klippmodell (avbildad av två gula pilspetsar och markerad med vita asterisker). Värt att notera är att den infrarenala vena cava kollapsade i kontrollgruppen medan den var förstorad i experimentgruppen, vilket överensstämmer med den större blodproppsbördan i den senare gruppen.
Båda analyserna (ultraljud och IF) tyder på att experimentgruppen genomgående hade större blodproppar än kontrollgruppen.
Figur 1: En schematisk bild av IVC-aortan och appliceringen av klämman över sammanflödet av vänster njurven (LRV)-IVC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Intraoperativ IVC-trombosmodell med clips-applicering . (A) Laparotomi i mittlinjen. B) Full exponering av IVC, inklusive sammanflödet av vänster njurven till IVC. (C) Demonstrera urinledarens förlopp och undvika iatrogent trauma mot vänster urinledare. (D) Kauterisering av gonadgrenarna. (E) Dissektion av IVC till den vänstra njurvenens sammanflödespunkt. (F) Passera 5-0 polypropensuturen genom det dissekerade planet för att vidga planet för att passera suturen. (G) Föra en vaskulär klämma genom det förberedda planet. (H) Bildning av blodpropp 48 timmar efter IVC-fastspänningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Gruppen möss med vaskulära klipp IVC-ligering hade högre normaliserat förhållande mellan koagel och kroppsvikt. Genomsnittligt normaliserat förhållande mellan koagel och kroppsvikt. Enheten för båda värdena uttryckta i milligram. Felstaplar = SD. Elevens t-test tillämpades. P <0.0001 Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4: Ökat fibrin- och CD 31-uttryck i en grupp möss med vaskulära klipp IVC-ligering. De representativa immunofluorescensbilderna erhållna vid 100x förstoring från kontrollgruppen med IVC-ligering med sutur och från experimentgruppen med IVC-ligering med vaskulära klämmor. Slumpmässigt utvalda bilder per mus visas (N= 4 möss/grupp). (A) Fibrin- och CD31-uttryck i kontroll- och experimentgrupperna. Två gula pilspetsar markerade med vita asterisker visar den stora proppen som nästan täpper till IVC, vilket antyder den delvis ockluderade IVC. (B) Den integrerade densiteten av fibrin: Linjen representerar medianvärdet. Elevens T-test genomfördes. p-värde = 0,0080. IF-färgning av representativa infrarenala vena cava-bilder, inklusive blodproppar i kontroll- och experimentgrupperna och färgade med anti-CD31, och Alexa Fluro sekundära antikroppar. 400x förstoring visas. Skalstreck = 100 μm. Felstaplar hänvisar till SEM. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5: Ökad koagulationsyta inom den delvis fastklämda IVC i grupp av möss med vaskulära clips IVC-ligering. De representativa sonografibilderna i gråskala av kontroll- och experimentgruppen. (A) Representativ dopplerbild i gråskala av kontrollgruppen: En region av IVC visar en ekofri region som tyder på patentlumen, och den andra delen visar en hyperekoisk region som indikerar koageln. (B) Representativ gråskaledopplerbild av experimentgruppen: Den organiserade koagulen (vit asterisk) inom IVC, som avbildas med gula pilspetsar, var mer framträdande i experimentgruppen. Dessutom uppträdde proppen på två olika sätt i sagittalsektionen. En propp som täpper till lumens signifikanta tvärsnitt avgränsades också på andra sidan IVC. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I en syngen xenograft koloncancermodell observerar vi högre trombogenicitet och uttryck av koagulationsmarkörer i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen. Det är viktigt att notera att variansen i alla dessa parametrar var lägre i experimentgruppen jämfört med kontrollgruppen. Modifieringen innebar att man införde en vaskulär klämma med en specifik tryckprofil vid sammanflödespunkten för IVC och vänster njurven. Klämman placerades över en distans, som var en 5-0 polypropensutur. Denna modifiering minskar variabiliteten i koagulationsstorlek och trombosmarkörer. Alla möss överlevde till 100 %.
Tekniska nyanser
Förfarandet innebar särskild uppmärksamhet på flera steg. Efter laparotomin inspekterades båda urinledarna noggrant för att förhindra oavsiktlig skada. För att uppnå optimal exponering täcktes tarmarna med fuktig gasväv och hölls i den högra övre kvadranten utan överdriven dragkraft. Därefter brännskadades IVC-sidogrenarna 2 till 3 mm från urinledarna, IVC och aorta för att förhindra skador på venerna. Efter att ha säkerställt fullständig hemostas förbereddes planet för IVC-ligering. Det är viktigt att notera att aorta och IVC hos möss är nära sammankopplade längs deras förlopp, och att försöka dissekera dem kan leda till blödning och förlust av djuret. Det enda undantaget är den vänstra njurvenen och aorta konfluenspunkt21. En suturpassage förbereddes sedan med högst tre noggranna, skarpa divergerande rörelser med pincett.
IVC-diametern hos en 8 till 12 veckor gammal mus rapporteras ligga i intervallet cirka 0,3 till 0,5 mm. Den partiella IVC-ligeringsproceduren bör säkra utrymme för att skilja från fullständig ligering. I den aktuella studien övervägde vi en 5-0 suturkaliber, motsvarande 0,10 till 0,15 mm för distansen. Därför justerades kärlklämmans läpputrymme för en 2-0 sutur för att ge tillräckligt utrymme för en 0,3 mm IVC och en 0,1 mm rymd.
Polypropensuturen gav en blodfri guide, vilket gjorde det möjligt att vidga planet med repetitiv kaudal till kraniell rörelse i ytterligare 1 till 2 mm för att rymma appliceringen av kärlklämmorna. Slutligen placerades de skräddarsydda kärlklämmorna med en läpp som är kompatibel med en 5-0 polypropensutur.
Valet av ädelmetallklämmor, såsom platina, för blodkärlsförslutning, drivs av det faktum att sådant material är relativt inert och minskar materialinducerad inflammation jämfört med specifika absorberbara och fördröjda absorberbara suturer22,23,24. Dessa metallklämmor är resistenta mot kemiska reaktioner, vilket gör dem stabila. Detta leder till ett säkrare och effektivare alternativ med lägre risk för inflammation jämfört med användning av suturmaterial.
Modellens translationella relevans
De murina venösa trombosmodellerna skiljer sig fundamentalt från djup ventrombos hos människa. För det första, i gnagarmodeller, observeras koagulationsbildningen i uppströmsriktningen. Kliniska VT bildas dock nedströms från en nidus25,26. För det andra är orsak-verkan-sambanden olika mellan människor och musmodeller. Hos människor är blodproppsbildning indexhändelsen följt av obstruktion av blodflödet. Ett undantag är May-Thurners syndrom. May-Thurners syndrom är ett medicinskt tillstånd där ökat yttre tryck på vänster höftven, som ligger mellan ryggraden och den högra höftartären, ökar risken för trombos i vänster höftven, eller en blodpropp i vänster höftven. I musmodeller är obstruktionen av venöst flöde den primära händelsen, vilket resulterar i trögt blodflöde och trombbildning25.
Jämfört med andra modeller, såsom femoralvenelektrolytskada modell12, erbjuder IVC-stasis en klar fördel. Det möjliggör undersökning av lokala terapeutiska åtgärder, såsom IVC-filter, kateterriktad trombolys och endoluminal rekanalisering med en miljö för koagelbildning i närvaro av blodflöde. Därmed undersöks två armar av endotelskadan och stasis i denna modell. Blodproppar vid IVC är också förknippade med högre förekomst av komplikationer, såsom lungemboli. En begränsning är att IVC är en mindre vanlig plats för DVT hos människor.
Ram för minskning-förfining-ersättning (3R)
Det är viktigt att integrera 3R-ramverket i djurmodeller. Integreringen av 3R-ramen begränsar djurens lidande och främjar etiska och ansvarsfulla djurförsöksmetoder. 3R gäller för vårt nuvarande fynd eftersom vi inte observerade någon dödlighet hos möss. Det är också möjligt att använda färre djur i studier. På så sätt kan antalet möss och kostnaden minskas.
Begränsningar i studierna
En möjlig begränsning av clip-metoden inkluderar ett relativt smalt tryckprofilområde för de testade kärlklämmorna. Följaktligen kan ytterligare studier med ett brett spektrum av tryckprofiler utformas. Tidigare studier har visat att immunsupprimerade stammöss är mer mottagliga för koagelbildning, och koagulationsvikterna kan skilja sig åt hos immunkompetenta möss12. Framtida studier uppmuntras för att undersöka graden av konsistens av koagulationsvikter i olika musstamsbakgrunder.
Slutsats
Den nuvarande metoden ger ett mer konsistent mått för venös trombosstudie via en partiell IVC-ligeringsmodell. Vi hoppas att denna modifiering kommer att göra det möjligt att generera robusta och tillförlitliga murina modeller för att undersöka konsekvenserna av cancerassocierad trombos med hjälp av olika cancermodeller med relevans för mänskliga sjukdomar.
Medan det nuvarande arbetet specifikt fokuserade på cancerassocierad trombos, kommer det framtida arbetet att innebära att utföra en omfattande analys av musmodeller av olika samsjukligheter (såsom fetma, kronisk njursvikt) och normala möss som ökar risken för trombos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av AHA Cardio-oncology SFRN CAT-HD Center grant 857078 (KR, VCC, XY och SL) och R01HL166608 (KR och VCC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Buprenorphine 0.3 mg/mL | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
| C57BL/6J mice | The Jackson Lab | IMSR_JAX:000664 | |
| Caliper | VWR International, Radnor, PA | 12777-830 | |
| CD31 | Abcam | Ab9498 | |
| Cell Counter | MOXIE | MXZ000 | |
| Clamp | Fine Science Tools | 13002-10 | |
| Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, | Accurate Surgical & Scientific Instruments | PR 2 144.50 289.00 | |
| Dumont #5SF Forceps | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Fibrin | Millipore | MABS2155-100UG | |
| Fine Scissors - Large Loops | Fine Science Tools | 14040-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 11002-12 | |
| Hill Hemostat | Fine Science Tools | 13111-12 | |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC 11695-6777-2 | |
| MC-38 cell | Sigma Aldrich | SCC172 | |
| Microscope | Nikon Eclipse Inverted Microscope | TE2000 | |
| Scissors | Fine Science Tools | 14079-10 | |
| Suture- Vicryl | AD-Surgical | #L-G330R24 | |
| Suture-Nylon 2-0 | Ethilon | 664H | |
| Suture-Prolene 5-0 | Ethicon | 8661G | |
| Suture-Prolene 6-0 | Ethicon | PDP127 | |
| VEV03100 | VisualSonics | FujiFilm | |
| Vitrogel Matrigel Matrix | The Well Bioscience | VHM01 |
References
- Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
- Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
- Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
- Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
- Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
- Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
- Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
- Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
- Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
- Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
- Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
- Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
- Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
- Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
- von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
- Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
- Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
- Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
- Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
- Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
- Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
- Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
- Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
- Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
- Poyyamoli, S., et al.
- Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).
