Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Анализ венозного тромбоза на мышиной модели рака

Published: January 5, 2024 doi: 10.3791/65518
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 2, 3, 1, 4,5, 1,6,7,8
1Renal Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 2Vascular Biology Section, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 3Division of Interventional Radiology, Department of Radiology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 4Department of Medicine, Whitaker Cardiovascular Institute, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 5Department of Biochemistry and Cell Biology, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University, 6Veterans Affairs Boston Healthcare System, 7Institute of Medical Engineering and Sciences, Massachusetts Institute of Technology, 8Center of Cross-Organ Vascular Pathology, Department of Medicine, Chobanian and Avedisian School of Medicine, Boston University

Summary

Целью данной статьи является представление оптимизированного метода оценки венозного тромбоза в мышиной модели рака с использованием сосудистых зажимов для достижения венозной лигации. Оптимизация сводит к минимуму вариабельность измерений, связанных с тромбозом, и повышает актуальность для связанного с раком венозного тромбоза человека.

Abstract

В данной методологической работе освещаются хирургические нюансы модели венозного тромбоза на грызунах, особенно в контексте рак-ассоциированного тромбоза (КПП). Тромбоз глубоких вен является распространенным осложнением у людей, перенесших рак, и может привести к летальному исходу. Современные модели мышиного венозного тромбоза, как правило, включают полную или частичную механическую окклюзию нижней полой вены (IVC) с помощью шва. Эта процедура вызывает полный или частичный застой крови и повреждение эндотелия, запуская тромбогенез. Существующие модели имеют ограничения, такие как более высокая вариабельность веса сгустков, значительный уровень смертности и длительная кривая обучения. В этом отчете представлены хирургические усовершенствования с использованием сосудистых зажимов для устранения некоторых из этих ограничений. Используя модель сингенного ксенотрансплантата рака толстой кишки у мышей, мы использовали индивидуальные сосудистые зажимы для перевязки полой вены инфраренала. Эти клипсы обеспечивают остаточное пространство губы, аналогичное полипропиленовому шовному материалу 5-0 после лигирования IVC. Контрольной группой служили мыши с шовным методом. Метод зажима сосудов привел к последовательной воспроизводимой частичной окклюзии сосудов и большему весу сгустка с меньшей вариабельностью, чем метод наложения швов. Больший вес сгустка, большая масса сгустка и сгусток на поверхности просвета IVC были ожидаемы из-за более высокого профиля давления сосудистых зажимов по сравнению с полипропиленовым шовным материалом 6-0. Подход был подтвержден с помощью УЗИ в оттенках серого, которая выявила стабильно большую массу тромба в инфраренальной полой вене с сосудистыми зажимами по сравнению с шовным методом. Эти наблюдения были дополнительно подтверждены иммунофлуоресцентным окрашиванием. Это исследование предлагает усовершенствованный метод создания модели венозного тромбоза у мышей, который может быть использован для углубления механистического понимания CAT и в трансляционных исследованиях, таких как разработка лекарств.

Introduction

Рак-ассоциированная венозная тромбоэмболия (ВТЭ)
Риск венозной тромбоэмболии (ВТЭ) в 4–7 раз выше у пациентов, перенесших рак, по сравнению с общей популяцией 1,2,3. Это состояние приводит к летальному исходу у каждого седьмого пациента с раком. Частота ВТЭ варьируется в зависимости от типа рака и опухолевой нагрузки и наиболее высока среди пациентов с раком поджелудочной железы и желудка4.

Рак-ассоциированная ВТЭ у онкологических больных имеет прогностическое значение. Это связано с неблагоприятной общей выживаемостью в течение первого года после постановки диагноза рака, даже с поправкой на возраст, расу и стадиюосновного рака. Эти результаты подчеркивают важность изучения ВТЭ, ассоциированной с раком, и необходимость изучения ее механизма на животной модели. Трансляционная значимость этого направления дополнительно подчеркивается тем фактом, что ВТЭ у онкологических больных можно предотвратить и лечить с помощью тромбопрофилактики и антитромботической терапии6.

Животные модели рака и венозного тромбоза
Модели рака условно называются ксенотрансплантатами, которые влекут за собой инъекцию раковых клеток мышам. Инъекция раковых клеток в том же месте, что и их источник, называется ортотопической моделью, в то время как в другом месте (подкожная плоскость над боком) известна как гетеротопическая модель. Вид происхождения раковых клеток определяет их как аллогенную модель, такую как клеточная линия HT-29 (рак толстой кишки человека)7,8,9. Напротив, в сингенных моделях используются линии мышиных раковых клеток, в том числе клеточные линии RenCa и MC-38 3,10.

В литературе описаны модели артериального, венозного и капиллярного тромбоза у грызунов. Венозный тромбоз индуцируется в нижней полой вене (НПВ) механическим повреждением (проводник) или полным лигированием НПВ, химическим (хлорид железа) или электролитическим повреждением. Тромбоз, индуцированный хлоридом железа, или лигирование IVC, представляет собой полную окклюзионную модель. Последнее приводит к застою крови и воспалительным инфильтратам в венах11,12,13. Модель полного лигирования приводит к высокой скорости образования тромбозов у 95–100% мышей. Модель частичного лигирования IVC может включать прерывание латеральных подвздошно-поясничных ветвей, а венозный возврат отменяется путем наложения шовных лигаторов в дистальных точках-мишенях IVC12. Иногда для частичного прерывания венозного возврата используется спейсхолдер. Тем не менее, вес тромба непостоянен в текущей модели частичной окклюзии, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты тромба12,14.

Обе эти модели механической обработки крупных вен (частичная и полная) имеют ограничения. Во-первых, лигирование IVC (стазисная модель) часто приводит к гипотензии. Кровь шунтируется по позвоночным венам. Несмотря на то, что в опытных руках смертность с этой моделью колеблется от 5% до 30%, причем более высокий уровень ожидается во время кривой обучения. Важно отметить, что модель полной окклюзии не воспроизводит тромбоз глубоких вен (ТГВ) у людей, где тромб обычно является неокклюзионным. Полная окклюзия, вероятно, изменяет гемореологические факторы и фармакодинамические параметры, изменяя биодоступность соединений в локальном очаге. Из-за этих ограничений полные модели окклюзии могут быть неоптимальными для тестирования новых химических соединений в терапевтических целях и открытия лекарств12.

Следует отметить, что для получения более клинически значимой мышиной модели венозного тромбоза со сниженным током при повреждении эндотелия была введена модель венозного тромбоза, где ТГВ запускается ограничением кровотока при отсутствии эндотелиального разрушения. Валидацию модели проводили методом сканирующей электронной микроскопии15. Предпочтительной клинически значимой моделью тромбоза является модель с почти полным тромбозом, которая позволяет разрабатывать лекарственные препараты. Образование тромба в современных моделях частичной окклюзии непоследовательно, что приводит к высокой вариабельности веса и высоты сгустка12,16. Кроме того, вес сгустка варьируется при использовании традиционных методов, что требует большего количества мышей в исследованиях12.

Предыдущие модели тромбоза, ассоциированного с раком, были сосредоточены на раке толстой кишки, поджелудочной железы и легких и представляли собой модели полной окклюзии17,18,19. В данной рукописи модифицирована модель тромбоза частичной окклюзии, чтобы обеспечить более низкую вариабельность тромбов и смертность мышей (рис. 1). В предыдущих исследованиях использовались аллогенные линии раковых клеток на фоне 19,20,21 мышей с ослабленным иммунитетом. В данной работе используется сингенный ксенотрансплантат клеток MC-38 у мышей линии C57Bl6/J, что позволяет использовать иммунокомпетентных мышей и исследовать иммунные компоненты для тромбогенеза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Для этого исследования были использованы 16 самок мышей C57Bl6/J в возрасте 8-12 недель с массой тела от 20 до 25 г. Мышей содержали в стандартных условиях и кормили кормом и водой вволю. Это исследование было проведено с одобрения Институционального комитета по уходу за животными и их использованию (IACUC) при Бостонском университете. Описанные здесь открытые процедуры проводились в стерильных условиях.

1. Модель ксенотрансплантата

  1. Клеточная культура
    1. Перед гетеротопической подкожной имплантацией вырастить клетки MC-38 в виде монослоя до 80% слияния.
    2. После трипсинизации и ресуспензии в 10%-ной среде, содержащей ФБС, центрифужные ячейки при 277 x g, 4 °C в течение 5 мин. Затем ресуспендируют клетки в бессывороточных средах до концентрации 1 x 104 MC-38 клеток/мкл безсывороточной среды.
      1. Для трипсинизации культивируют клетки MC-38 до тех пор, пока они не достигнут желаемого слияния (обычно около 70%-80%), а затем аспирируют питательную среду из чашки Петри.
      2. Добавьте 1 мл раствора трипсина-ЭДТА и инкубируйте клетки с трипсином в течение 1 мин при 37 °C, чтобы обеспечить отслоение. Осторожно постучите или встряхните чашку Петри, чтобы обеспечить равномерное отделение.
      3. Добавьте питательную среду, содержащую сыворотку или ингибитор трипсина, чтобы нейтрализовать активность и предотвратить дальнейшую диссоциацию клеток. Соберите отделившиеся клетки вместе с нейтрализованным раствором трипсина.
      4. Для ресуспензии, после отделения клеток путем трипсинизации, подготовьте их к трансплантации или дальнейшим экспериментам. Центрифугируйте собранную клеточную суспензию при 277 x g , чтобы гранулировать клетки.
      5. Осторожно удалите надосадочную жидкость (жидкость над клеточной гранулой). Добавьте 9 мл питательной среды, буфера или раствора к клеточной грануле, чтобы достичь желаемой концентрации клеток для трансплантации или экспериментов.
      6. Осторожно ресуспендируйте клетки, пипетируя вверх и вниз или используя встряхиватель колб для культивирования. Избегайте энергичного пипетирования, которое может повредить клетки.
        ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от используемого варианта или клеточной линии, клетки могут быть ресуспендированы в соотношении 1:1 из солюбилизированного матрикса базальной мембраны и безсывороточной среды, чтобы замедлить очень агрессивный рост и распространение клеток мыши после имплантации. Все этапы культивирования клеток должны выполняться в полном асептическом колпаке в специально отведенном для клеточных культур пространстве и регулярно проверяться на микоплазму.
    3. Подсчитайте ячейки с помощью автоматического счетчика ячеек в соответствии с предоставленным ручным протоколом.
  2. Клеточная имплантация
    1. Случайным образом распределите восемь мышей в экспериментальную группу и восемь мышей в контрольную группу следующим образом. В контрольной группе использовали мышей с ксенотрансплантатом MC38 и выполняли лигирование IVC полипропиленовым шовным материалом 5-0. В опытной группе использовали мышей с ксенотрансплантатом MC38 и выполняли лигирование IVC с помощью индивидуального сосудистого зажима.
    2. Поместите мышь в левое боковое положение лежа и побрейте правый бок между передними и задними конечностями. Нанесите спирт и йод вдоль спинной поясничной области, чтобы асептически подготовить область для инъекции.
    3. Ввести 2 x 106 клеток MC-38, приготовленных в 200 мкл среды, подкожно в бок, на полпути между самым дистальным ребром животного и тазовым возвышением, с помощью иглы 27G, осторожно держа животное в недоминантной руке.
    4. После инъекции внимательно осмотрите животных и посадите их обратно в клетку. Животные должны быть осмотрены на наличие следующего: 1. Изменения в поведении, уровнях активности и общей подвижности мышей. Любые значительные изменения могут указывать на дискомфорт или проблемы со здоровьем. 2. Общее физическое состояние мышей, включая качество шерсти, привычки ухода и любые видимые признаки стресса или аномалий 3. Вернуться к потреблению пищи и воды 4. Любые изменения в уровне активности, позе или взаимодействии с соседями по клетке. Вялость или повышенная агрессия могут быть признаками дистресса.

2. Наблюдение за ростом опухоли

  1. Наблюдайте за животными раз в две недели на предмет тенденций роста опухоли в течение 3-4 недель. Измерьте опухоли штангенциркулем и запишите размеры опухоли.
    1. Измерьте опухоли вдоль их самой длинной оси (L) и оси, перпендикулярной длинной оси (W). Рассчитайте объем опухоли (V) по формуле L x (W2) = V. Если размер опухоли превышает 20 мм в каждом измерении и/или опухоль имеет признаки изъязвления, усыпьте животных до окончания эксперимента.
  2. Как только объем опухоли достигнет 400мм3, запланируйте использование мышей для лигирования IVC.

3. Анестезия и подготовка

  1. Обезболивайте мышь в изофлурановой камере и вводите анальгетик подкожно: держите животное за основание хвоста. Держите животное на тыльной поверхности недоминантной руки.
  2. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного действия, заполненную 3%-4% изофлураном. Подтвердить адекватную общую анестезию при отсутствии пальцевого рефлекса. Используйте поддерживающую дозу 1%-3% изофлурана. Нанесите ветеринарную мазь на оба глаза.
  3. Подкожная инъекция бупренорфина (опиоид для облегчения боли): Растворите запас бупренорфина в концентрации 0,3 мг/мл в 0,9% хлорида натрия (NaCl) до достижения концентрации 0,03 мг/мл.
  4. Перед операцией введите 0,05-0,1 мг/кг 0,03 мг/мл бупренорфина вместе с 500 мкл стерильного 0,9% NaCl перед операцией. В 20 г мыши требуется 2 мкг или 66 мкл 0,03 мг/мл бупренорфина.
  5. Подготовка кожи: Поместите мышь под полным наркозом в положение лежа на спине поверх одеяла с подогревом. Дезинфицировать переднюю область живота 0,5% настойкой хлоргексидина, 2 раза. Во время процедуры часто проверяйте температуру одеяла с подогревом и следите за тем, чтобы температура не падала.

4. Лигирование IVC

  1. Срединная лапаротомия
    1. Надрезайте кожу живота тонкими ножницами, начиная от мечевидного возвышения к мочевому пузырю. Зажмите брюшину на полпути вдоль разреза кожи атравматическими щипцами. Обеспечьте достаточное расстояние между разрезом и вышележащими кишками (Рисунок 2A).
    2. Вскрывают брюшину продольно вместе с аваскулярной линией белой губы.
  2. Экстериоризация кишечника в правую брюшную сторону
    1. Потяните кишки влажными ватными кончиками. Накройте кишечник полностью влажной стерильной марлей. Убедитесь, что покрытый кишечник находится в направлении без тракции без чрезмерного вытяжения брыжеечных сосудов.
  3. Полное обнажение НПВ и ветвей, включая слияние левой почечной вены с НПВ (рис. 2Б).
    1. Капните 200-300 мкл физиологического раствора. Исследуйте ход мочеточников, НПВ, аорты и почечных вен (рис. 2).
  4. Аваскулярная плоскость в месте слияния инфраренального НПВ и слияния левой почечной вены.
    1. Полипропиленовый шов 6-0 осторожно пропустите через аваскулярную плоскость 2x-3x каудальными движениями к головоломным движениям атравматическими щипцами с закрытым кончиком.
    2. Убедитесь, что любое минимальное выделение жидкости контролируется мягким давлением, обеспечиваемым тампонадой с ватным наконечником. Расширьте предоставленную плоскость, пропустив полипропиленовый шов 6-0 мягкими каудальными и краниальными движениями.
  5. Прижигание гонадной и поясничной ветвей (рис. 2D)
    1. Может присутствовать до 4 задних или поясничных ветвей. Чтобы избежать потенциальных осложнений в виде ишемии позвоночника и хромоты, в действующем протоколе оставьте поясничные ветви нетронутыми.
    2. Убедитесь, что присутствуют 2-3 боковые ветви, включая двустороннее артериальное кровоснабжение рога матки и гипогастральные сосуды. Обеспечьте последовательное разрушение первых двусторонних ветвей. Прижигают двусторонние ветви чуть дистальнее слияния левой почечной вены и НПВ (инфраренального НПВ). Следите за тем, чтобы венозные дренирующие сосуды рога матки не были нарушены.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Прижигание боковых ветвей предпочтительно, потому что этот метод обеспечивает гладкую и непрерывную поверхность, снижая вероятность неконтролируемого кровотечения. Более того, прижигание происходит быстрее и осуществимее, чем перевязка швов 10-0. Таким образом, животные будут подвергнуты более короткой и безопасной процедуре.
  6. Дважды проверьте ход мочеточников и сосудистую сеть, чтобы убедиться в отсутствии каких-либо сочащихся или непреднамеренного прижигания (рис. 2C).
  7. Лигирование IVC сосудистыми клипсами в опытной группе
    1. Подгоните сосудистые зажимы с помощью нейлонового шва шириной 2-0 с помощью атравматичных щипцов. Наложите индивидуальные сосудистые зажимы в экспериментальной группе по окружности вокруг инфраренальной НПВ.
    2. Наложите сосудистые зажимы поверх шва. Первичный ход шва обеспечивает достаточную аваскулярную плоскость с двумя-тремя тщательными каудальными и краниальными движениями (рис. 2E-F).
    3. Далее пропустите сосудистые зажимы через подготовленную плоскость. Подготовьте плоскость в месте слияния левой почечной вены и НПВ достаточно широкой, чтобы обеспечить беспрепятственное прохождение клипсы (рис. 2E).
    4. Установите индивидуальный сосудистый зажим горизонтально, перпендикулярно ходу НПВ, через подготовленную плоскость. Наложите сосудистые зажимы на полипропиленовый шов 5-0, чтобы обеспечить достаточное оставшееся пространство (Рисунок 2G).
    5. Убедитесь, что вышеуказанные шаги выполняются осторожно, чтобы предотвратить повреждение сосудов или кровотечение в месте наложения сосудистых зажимов. Осмотрите операционное поле на предмет возможного просачивания. Слегка надавите ватным наконечником на операционное поле в случае сочения.
  8. IVC Лигирование со швом в контрольной группе
    1. Наложение шовного материала полипропиленовым шовным материалом 6-0. Наложить хирургический квадратный узел вокруг подпочечного НПВ в подготовленной плоскости поверх шелкового шва 5-0.
    2. После того, как шов будет завершен, осторожно снимите шелковый шов, чтобы обеспечить достаточное пространство для остатков.
  9. Выполнить подкожную инъекцию 200 мкл физиологического раствора.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы обеспечить сопоставимую технику частичной окклюзии IVC с наложением зажима, сосудистый зажим в данном исследовании настроен таким образом, чтобы обеспечить пространство между губами. Затем сосудистый зажим помещают в подготовленную аваскулярную плоскость в месте слияния левой почечной вены и НПВ.
  10. Закрыть лапаротомию непрерывным швом 4-0 vicryl.

5. Последующее наблюдение после индексной операции

  1. Наблюдайте за животным непрерывно после операции в течение 1 часа или до тех пор, пока не будет восстановлено равновесие и способность к выпрямлению, независимо от того, что происходит раньше в изолированной чистой клетке, до полного восстановления.
  2. Наблюдайте за животным ежедневно в течение 2 дней. Если животное выглядит расстроенным, наблюдайте за ним два раза в день в течение 2 дней. Вводите послеоперационную анальгезию и жидкости в соответствии с протоколом.
    1. Запас бупренорфина с концентрацией 0,3 мг/мл растворяют в 0,9% хлорида натрия (NaCl) до достижения концентрации 0,03 мг/мл.
    2. Вводят 0,05-0,1 мг/кг 0,03 мг/мл бупренорфина подкожно вместе с 500 мкл стерильного 0,9% NaCl каждые 8-12 ч в течение первых 48 ч после индексной операции. Для мыши весом 20 г потребуется 2 мкг или 66 мкл бупренорфина в дозе 0,03 мг/мл.

6. Эвтаназия и забор НПВ, содержащего сгусток

  1. Обезболивайте мышь в изофлурановой камере, держите животное за основание хвоста и держите животное на тыльной поверхности руки.
  2. Переведите животное в индукционную камеру непрерывного действия, заполненную 3%-4% изофлураном. Поместите животное в положение лежа на спине.
  3. Выполните длинную срединную лапаротомию, начиная от мечевидного ряда до мочевого пузыря, как описано выше.
  4. Экстериоризируют кишечник в правую сторону брюшной полости и извлекают зажатый НПВ дистальнее бифуркации подвздошной кости до степени инфраренального НПВ (рис. 2G).
  5. После забора тромба и опухоли усыпьте животное при вывихе шейки матки.

7. Статистический анализ

  1. Представьте статистический анализ в виде среднего, медианного и стандартного отклонения (SD) или стандартной ошибки среднего значения (SEM), 25-го или 75-го процентиля или всего диапазона значений, включая минимальные и максимальные значения, в зависимости от ситуации. При необходимости выполните t-критерий Стьюдента и F-критерий. Оценивают статистическую значимость на уровне p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Группе самок мышей C57Bl6/J в возрасте 8-12 недель вводили клетки MC-38 в логарифмическую фазу роста клеток. Ксенотрансплантаты быстро росли между третьей и четвертой неделями после инъекции18. После того, как опухоли достигали среднего объема 400мм3, мышей рандомизировали в контрольную и экспериментальную группы. Контрольная группа подвергалась лигированию IVC с наложением швов, в то время как подопытные мыши подвергались лигированию IVC с наложением сосудистого зажима. Объемы опухолей в контрольной и опытной группах были сопоставимы без существенных различий (353 ± 100 мм3 против 367 ± 46,2мм3, p = 0,445). Через 48 ч инфраренальные НВК к точке бифуркации подвздошных вен, содержащей тромб, собирали через 48 ч, а вес тромба служил биологическим индикатором венозной тромбогенности. Послеоперационный период у всех животных контрольной и экспериментальной групп протекал без осложнений, без признаков изменения цвета рогов матки, ишемии опорно-двигательного аппарата или хромоты в нижних конечностях. Во время второй лапаротомии смещения сосудистого зажима не наблюдалось. До окончания экспериментов смертности не наблюдалось.

Отношение массы тромба к нормализованной массе тела
Поскольку мыши с ксенотрансплантатом, скорее всего, теряют массу тела, вес сгустков (в мг) был нормализован до общей массы тела на момент сбора (оба в мг). Почти в 1,5 раза у мышей опытной группы наблюдалось почти 1,5-кратное увеличение нормализованного веса тромба к телу (среднее ± SEM 0,002580 ± 0,00098) по сравнению с контрольными мышами (0,001453 ± 0,002666, P-значение: 0,0019; Рисунок 3).

Иммунофлуоресцентный анализ
Гистопатологическое исследование использовалось для исследования НПВ и тромбов. Залитые парафином срезы инфраренальной полой вены окрашивали анти-CD31 (маркер эндотелиальных клеток)20 и антифибрином, а также DAPI (рис. 4A).

Инфраренальная полая вена контрольных мышей показала интактное окрашивание CD31 и фибрин, частично занимающий просвет сосуда. В экспериментальной группе экспрессия CD31 не была интактной, что указывает на повреждение эндотелиальных клеток и наличие большого сгустка с выраженной экспрессией фибрина. Стенка сосуда также выражена фибриновым окрашиванием (рис. 4А).

Для иммунофлюоресценции использовали моноклональные антитела к фибрину мышей в разведении 1:1000 и инкубировали в течение ночи при 4 °C. Для CD31 использовали поликлональное антитело к CD31 кролика, валидированное на иммуноблоттинг и ИФ (1:1000 и 1:100 в течение ночи при 4 °C). Известно, что это антитело реагирует против CD31 мыши, человека и свиньи. Для ИФ вторичные антитела состояли из Alex Fluor 488, 594 и 647 в разведении 1:250 в течение 45 мин при комнатной температуре.

Для количественной оценки изображения весь слайд был отсканирован с помощью моторизованной системы сцены. Изображения обрабатывались в ImageJ, где сигнал преобразовывался в оттенки серого, а количество и интенсивность пикселей анализировались как интегральная плотность. Область жилы была отмечена как область интереса. Интегральная плотность всех изображений была нормирована к его площади18.

Показано, что они регулируются в моделях тромбоза глубоких вен, ассоциированного с раком. Количественное определение нескольких изображений было выполнено с помощью интегрированного анализа плотности, как это было сделано ранее на изображении J18. В контрольной группе экспрессия фибрина была значительно ниже по сравнению с опытной группой (p:0,0080; Рисунок 4Б; 174 ± 104 против 503,5 ± 182,4 в среднем ± SD). Примечательно, что дисперсии экспрессии фибрина были ниже в экспериментальной группе по сравнению с контрольной группой (F statistics, DFn, Dfd: 3,074, 4, 4).

Ультразвуковое исследование в оттенках серого
Через 2 дня после операции и непосредственно перед забором тромба мышам проводили УЗИ в оттенках серого. У мышей в обеих группах наблюдались тромбы в полой вене подрендальника. Тем не менее, тромбы были больше у мышей с сосудистым зажимом. Репрезентативные снимки УЗИ представлены на рисунке 5. Безэховая область сосуда указывает на открытый просвет, а гиперэхогенная плотность в сосуде указывает на организованный сгусток. На перевязанной инфраренальной полой вене мыши из контрольной группы виден частичный сгусток, разграниченный двумя желтыми стрелками на рисунке 5А. Напротив, на рисунке 5В показан большой сгусток, почти перекрывающий полую вену инфраренла, образованную с помощью модели сосудистого зажима (изображена двумя желтыми стрелками и отмечена белыми звездочками). Следует отметить, что в контрольной группе схлопнулась инфраренальная полая вена, в то время как в опытной группе она была увеличена, что согласуется с большей нагрузкой тромба в последней группе.

Оба анализа (УЗИ и ИФ) показывают, что в экспериментальной группе тромбы были стабильно больше, чем в контрольной группе.

Figure 1
Рисунок 1: Схема, изображающая IVC-Аорту и наложение клипсы на слияние левой почечной вены (LRV)-IVC. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Интраоперационная модель тромбоза IVC с наложением клипс . (А) Лапаротомия по срединной линии. (Б) Полное обнажение НПВ, включая слияние левой почечной вены с НПВ. (C) Демонстрация хода мочеточника и предотвращение ятрогенной травмы левого мочеточника. (D) Прижигание гонадных ветвей. (E) Рассечение НПВ до точки слияния левой почечной вены. (F) Прохождение полипропиленовой нити 5-0 через рассеченную плоскость для расширения плоскости для прохождения шовной нити. (G) Пропускание сосудистого зажима через подготовленную плоскость. (H) Образование сгустка через 48 ч после пережатия НПВ. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Группа мышей с лигированием IVC сосудистых клипов имела более высокое нормализованное отношение тромба к массе тела. Среднее нормализованное отношение сгустка к массе тела. Единица измерения обоих значений, выраженная в миллиграммах. Полосы ошибок = SD. Применялся t-критерий Стьюдента. P <0.0001 Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Увеличение экспрессии фибрина и CD 31 в группе мышей с лигированием IVC сосудистыми клипами. Репрезентативные иммунофлуоресцентные изображения, полученные при 100-кратном увеличении из контрольной группы с НВК-лигированием швом и из опытной группы с НВК-лигированием с сосудистыми клипсами. Показаны случайно выбранные изображения для каждой мыши (N= 4 мыши в группе). А) Экспрессия фибрина и CD31 в контрольной и экспериментальной группах. Два желтых наконечника стрелок, отмеченные белыми звездочками, изображают большой сгусток, почти закрывающий IVC, что подразумевает частично окклюзированный IVC. (B) Интегральная плотность фибрина: линия представляет собой медианное значение. Проведен Т-критерий Стьюдента. p-значение = 0,0080. ПЧ-окрашивание репрезентативных изображений инфраренальной полой вены, в том числе сгустков в контрольной и экспериментальной группах и окрашенных вторичными антителами к CD31 и Alexa Fluro. Показано 400-кратное увеличение. Масштабные линейки = 100 мкм. Полосы ошибок относятся к SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Увеличение площади поверхности сгустка в частично зажатом НВК в группе мышей с лигированием ВВК сосудистыми клипами. Репрезентативные черно-белые снимки сонографии контрольной и экспериментальной группы. (А) Репрезентативное допплеровское изображение контрольной группы в оттенках серого: в одной области НПВ видна безэховая область, указывающая на открытый просвет, а в другой части видна гиперэхогенная область, указывающая на наличие тромба. (B) Репрезентативное доплеровское изображение экспериментальной группы, полученное в оттенках серого: организованный сгусток (белая звездочка) внутри IVC, изображенный желтыми стрелками, был более заметен в экспериментальной группе. Более того, тромб появлялся в сагиттальном отделе двумя различными способами. Сгусток, закрывающий значительное поперечное сечение просвета, также был очерчен с другой стороны НПВК. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

В сингенной модели рака толстой кишки с помощью сингенного ксенотрансплантата мы наблюдаем более высокую тромбогенность и экспрессию маркеров свертывания крови в опытной группе по сравнению с контрольной группой. Важно отметить, что дисперсия по всем этим параметрам была ниже в опытной группе по сравнению с контрольной. Модификация заключалась во введении сосудистого зажима с определенным профилем давления в месте слияния НПВ и левой почечной вены. Клипса была наложена на спейсер, который представлял собой полипропиленовый шов 5-0. Эта модификация уменьшает вариабельность размеров сгустков и маркеров тромбоза. У всех мышей наблюдалась 100% выживаемость.

Технические нюансы
Процедура включала в себя особое внимание к нескольким этапам. После лапаротомии оба мочеточника были тщательно осмотрены, чтобы предотвратить случайные травмы. Для достижения оптимального воздействия кишечник накрывали влажной марлей и держали в правом верхнем квадранте без чрезмерного вытяжения. Затем боковые ветви НПВ прижигали на расстоянии 2-3 мм от мочеточников, НПВ и аорты, чтобы предотвратить повреждение вен. После обеспечения полного гемостаза была подготовлена плоскость для перевязки ВПК. Важно отметить, что аорта и НПВ у мышей тесно связаны по своему ходу, и попытка их вскрытия может привести к кровотечению и потере животного. Единственное исключение – точка слияния левой почечной вены и аорты21. Затем был подготовлен шовный ход с использованием не более трех тщательных, резких расходящихся движений щипцами.

Сообщается, что диаметр IVC у мышей в возрасте от 8 до 12 недель находится в диапазоне примерно от 0,3 до 0,5 мм. Процедура частичного лигирования IVC должна обеспечить пространство для дифференциации от полного лигирования. В настоящем исследовании мы рассматривали калибр шовного материала 5-0, что соответствует 0,10-0,15 мм для спейсера. Таким образом, расстояние между губами сосудистых зажимов было скорректировано для шва 2-0, чтобы обеспечить достаточное пространство для 0,3 мм НПВ и 0,1 мм.

Полипропиленовый шовный материал обеспечивал бескровную направляющую, что позволяло расширять плоскость с помощью повторяющихся каудальных движений к черепу еще на 1-2 мм для размещения сосудистых зажимов. Наконец, были установлены индивидуальные сосудистые зажимы с оставшимся пространством губы, совместимым с полипропиленовым шовным материалом 5-0.

Выбор клипс из благородных металлов, таких как платина, для закрытия кровеносных сосудов обусловлен тем фактом, что такой материал относительно инертен и уменьшает воспаление, вызванное материалом, по сравнению со специфическими рассасывающимися и рассасывающимися шовными нитямизамедленного типа 22,23,24. Эти металлические клипсы устойчивы к химическим реакциям, что делает их стабильными. Это приводит к более безопасной и эффективной альтернативе с меньшим риском воспаления по сравнению с использованием шовных материалов.

Трансляционная релевантность модели
Модели мышиного венозного тромбоза принципиально отличаются от тромбоза глубоких вен у человека. Во-первых, в моделях грызунов образование сгустка наблюдается в восходящем направлении. Тем не менее, клинические ЖТ формируются ниже по течению от очага25,26. Во-вторых, причинно-следственные связи между людьми и мышами различны. У человека образование тромба является индексным событием, за которым следует обструкция кровотока. Единственным исключением является синдром Мэя-Тернера. Синдром Мэя-Тернера относится к заболеванию, при котором повышенное внешнее давление на левую подвздошную вену, расположенную между позвоночным столбом и правой подвздошной артерией, повышает риск тромбоза левой подвздошной вены или образования тромба в левой подвздошной вене. В мышиных моделях препятствие венозному оттоку является первичным событием, которое приводит к замедлению кровотока и образованию тромбов25.

По сравнению с другими моделями, такими как электролитическое повреждение бедренной вены модели12, стаз IVC имеет явное преимущество. Он позволяет исследовать местные терапевтические мероприятия, такие как фильтры IVC, катетер-направленный тромболизис и эндолюминальная реканализация с обеспечением среды для образования тромба в присутствии кровотока. Таким образом, в данной модели исследуются два плеча эндотелиального повреждения и стаза. Тромбы при НПВ также связаны с более высокой частотой осложнений, таких как тромбоэмболия легочной артерии. Одним из ограничений является то, что IVC является менее распространенным местом ТГВ у людей.

Структура «Сокращение-Уточнение-Замена» (3R)
Важно интегрировать фреймворк 3R в модели животных. Интеграция концепции 3R ограничивает страдания животных и способствует проведению этичных и ответственных исследований на животных. 3R применим к нашему текущему открытию, поскольку мы не наблюдали смертности у мышей. Кроме того, в исследованиях можно использовать меньшее количество животных. Таким образом, количество мышей и стоимость могут быть снижены.

Ограничения исследования
К возможному ограничению метода клипсации относится относительно узкий диапазон профиля давления испытуемых сосудистых клипс. В связи с этим могут быть разработаны дальнейшие исследования с широким диапазоном профилей давления. Предыдущие исследования показали, что мыши с ослабленным иммунитетом более восприимчивы к образованию тромбов, и вес тромба может отличаться у иммунокомпетентных мышей12. В будущих исследованиях рекомендуется изучить степень постоянства веса сгустков в различных штаммах мышей.

Заключение
Данный метод обеспечивает более последовательную оценку для исследования венозного тромбоза с помощью модели частичного лигирования IVC. Мы надеемся, что эта модификация позволит создать устойчивые и надежные мышиные модели для исследования последствий рак-ассоциированного тромбоза, используя различные модели рака, имеющие отношение к заболеванию человека.

В то время как текущая работа была сосредоточена на тромбозе, связанном с раком, будущая работа повлечет за собой проведение всестороннего анализа мышиных моделей различных сопутствующих заболеваний (таких как ожирение, хроническая почечная недостаточность) и нормальных мышей, увеличивающих риск тромбоза.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторам нечего раскрывать.

Acknowledgments

Работа выполнена при поддержке Центра кардиоонкологии AHA SFRN CAT-HD GRANT 857078 (KR, VCC, XY и SL) и R01HL166608 (KR и VCC).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Buprenorphine 0.3 mg/mL PAR Pharmaceutical  NDC 42023-179-05
C57BL/6J mice The Jackson Lab IMSR_JAX:000664
Caliper VWR International, Radnor, PA 12777-830
CD31 Abcam Ab9498
Cell Counter MOXIE MXZ000
Clamp  Fine Science Tools    13002-10
Clips ASSI.B2V Single Clamp, General Purpose, Accurate Surgical & Scientific Instruments PR 2 144.50 289.00
Dumont #5SF Forceps Fine Science Tools 11252-00
Fibrin Millipore MABS2155-100UG
Fine Scissors - Large Loops Fine Science Tools 14040-10
Forceps  Fine Science Tools 11002-12
Hill Hemostat Fine Science Tools 13111-12
Isoflurane, USP  Covetrus NDC 11695-6777-2
MC-38 cell Sigma Aldrich SCC172
Microscope Nikon Eclipse Inverted Microscope TE2000
Scissors  Fine Science Tools   14079-10
Suture- Vicryl AD-Surgical #L-G330R24
Suture-Nylon 2-0 Ethilon 664H
Suture-Prolene 5-0 Ethicon 8661G
Suture-Prolene 6-0 Ethicon PDP127
VEV03100 VisualSonics FujiFilm
Vitrogel Matrigel Matrix The Well Bioscience VHM01 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blom, J. W., et al. Incidence of venous thrombosis in a large cohort of 66,329 cancer patients: results of a record linkage study. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 4 (3), 529-535 (2006).
  2. Gabre, J., et al. Activated protein C accelerates venous thrombus resolution through heme oxygenase-1 induction. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 12 (1), 93-102 (2014).
  3. Chang, Y. S., et al. Sorafenib (BAY 43-9006) inhibits tumor growth and vascularization and induces tumor apoptosis and hypoxia in RCC xenograft models. Cancer Chemotherapy and Pharmacology. 59 (5), 561-574 (2007).
  4. Khorana, A. A., Kuderer, N. M., Culakova, E., Lyman, G. H., Francis, C. W. Development and validation of a predictive model for chemotherapy-associated thrombosis. Blood. 111 (10), 4902-4907 (2008).
  5. Chew, H. K., Wun, T., Harvey, D., Zhou, H., White, R. H. Incidence of venous thromboembolism and its effect on survival among patients with common cancers. Archives of Internal Medicine. 166 (4), 458-464 (2006).
  6. Leiva, O., Newcomb, R., Connors, J. M., Al-Samkari, H. Cancer and thrombosis: new insights to an old problem. Journal de Medecine Vasculaire. 45 (6S), 6S8-6S16 (2020).
  7. Chen, N., et al. Bevacizumab promotes venous thromboembolism through the induction of PAI-1 in a mouse xenograft model of human lung carcinoma. Molecular Cancer. 14, 140 (2015).
  8. Goto, H., et al. Activity of a new vascular targeting agent, ZD6126, in pulmonary metastases by human lung adenocarcinoma in nude mice. Cancer Research. 62 (13), 3711-3715 (2002).
  9. Jiang, Y., et al. Inhibition of anchorage-independent growth and lung metastasis of A549 lung carcinoma cells by IkappaBbeta. Oncogene. 20 (18), 2254-2263 (2001).
  10. Salup, R. R., Wiltrout, R. H. Adjuvant immunotherapy of established murine renal cancer by interleukin 2-stimulated cytotoxic lymphocytes. Cancer Research. 46 (7), 3358-3363 (1986).
  11. Deatrick, K. B., et al. The effect of matrix metalloproteinase 2 and matrix metalloproteinase 2/9 deletion in experimental post-thrombotic vein wall remodeling. Journal of Vascular Surgery. 58 (5), 1375.e2-1384.e2 (2013).
  12. Diaz, J. A., et al. Choosing a mouse model of venous thrombosis: a consensus assessment of utility and application. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 17 (4), 699-707 (2019).
  13. Henke, P. K., et al. Toll-like receptor 9 signaling is critical for early experimental deep vein thrombosis resolution. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 31 (1), 43-49 (2011).
  14. Liu, H., et al. Inferior vena cava stenosis-induced deep vein thrombosis is influenced by multiple factors in rats. Biomedicine & Pharmacotherapy. 128, 110270 (2020).
  15. von Brühl, M. L., et al. Monocytes, neutrophils, and platelets cooperate to initiate and propagate venous thrombosis in mice in vivo. The Journal of Experimental Medicine. 209 (4), 819-835 (2012).
  16. Brill, A., et al. von Willebrand factor-mediated platelet adhesion is critical for deep vein thrombosis in mouse models. Blood. 117 (4), 1400-1407 (2011).
  17. Stark, K., et al. Distinct Pathogenesis of Pancreatic Cancer Microvesicle-Associated Venous Thrombosis Identifies New Antithrombotic Targets In Vivo. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 38 (4), 772-786 (2018).
  18. Belghasem, M., et al. Metabolites in a mouse cancer model enhance venous thrombogenicity through the aryl hydrocarbon receptor-tissue factor axis. Blood. 134 (26), 2399-2413 (2019).
  19. Tracz, A., Mastri, M., Lee, C. R., Pili, R., Ebos, J. M. Modeling spontaneous metastatic renal cell carcinoma (mRCC) in mice following nephrectomy. Journal of Visualized Experiments. (86), e51485 (2014).
  20. Lertkiatmongkol, P., Liao, D., Mei, H., Hu, Y., Newman, P. J. Endothelial functions of platelet/endothelial cell adhesion molecule-1 (CD31). Current Opinion in Hematology. 23 (3), 253-259 (2016).
  21. Payne, H., Brill, A. Stenosis of the Inferior Vena Cava: A Murine Model of Deep Vein Thrombosis. Journal of Visualized Experiments. (130), e56697 (2017).
  22. Yabit, F., Hughes, L., Sylvester, B., Tiesenga, F. Hypersensitivity Reaction Post Laparoscopic Cholecystectomy Due to Retained Titanium Clips. Cureus. 14 (6), e26167 (2022).
  23. Nagorni, E. A., et al. Post-laparoscopic cholecystectomy Mirizzi syndrome induced by polymeric surgical clips: a case report and review of the literature. Journal of Medical Case Reports. 10, 135 (2016).
  24. Zemelka-Wiacek, M. Metal Allergy: State-of-the-Art Mechanisms, Biomarkers, Hypersensitivity to Implants. Journal of Clinical Medicine. 11 (23), 6971 (2022).
  25. Poyyamoli, S., et al. May-Thurner syndrome. Cardiovascular Diagnosis and Therapy. 11 (5), 1104-1111 (2021).
  26. Streiff, M. B., et al. NCCN Guidelines Insights: Cancer-Associated Venous Thromboembolic Disease, Version 2.2018. Journal of the National Comprehensive Cancer Network. 16 (11), 1289-1303 (2018).

Tags

Cancer Research выпуск 203 тромбоз ассоциированный с раком ксенотрансплантат частичное лигирование IVC
Анализ венозного тромбоза на мышиной модели рака
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lotfollahzadeh, S., Yang, X., Wu… More

Lotfollahzadeh, S., Yang, X., Wu Wong, D. J., Han, J., Seta, F., Ganguli, S., Jose, A., Ravid, K., Chitalia, V. C. Venous Thrombosis Assay in a Mouse Model of Cancer. J. Vis. Exp. (203), e65518, doi:10.3791/65518 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter