Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

מורפוגנזה תלת ממדית במעי על שבב של כלבים באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם במחלות מעי דלקתיות

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

שילוב של אורגנואידים במעי הכלבי ומערכת מיקרופלואידית של מעיים על שבב מציע מודלים תרגומיים רלוונטיים למחלות מעיים אנושיות. הפרוטוקולים שהוצגו מאפשרים מורפוגנזה תלת-ממדית ומידול דינמי במבחנה של המעי, ומסייעים בפיתוח טיפולים יעילים למחלות מעיים בכלבים ובבני אדם עם One Health.

Abstract

למעיים של כלבים יש דמיון באנטומיה, מיקרוביולוגיה ופיזיולוגיה לאלה של בני אדם, וכלבים מפתחים באופן טבעי הפרעות מעיים ספונטניות בדומה לבני אדם. התגברות על המגבלה המובנית של אורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) בגישה למשטח האפי של אפיתל המעי הובילה ליצירת תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות (דו-ממדיות), החושפות את פני השטח הלומינליים הנגישים באמצעות תאים שמקורם באורגנואידים. השילוב של אורגנואידים אלה ותרביות חד-שכבתיות שמקורן באורגנואידים במערכת מעיים על שבב מיקרופלואידית פיתח עוד יותר את הטכנולוגיה, ואיפשר פיתוח של מודלים דינמיים רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית במעי חוץ גופי .

במחקר זה אנו מציגים פרוטוקול ליצירת מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי הכלבי באמצעות דגימות רקמת מעי ראשוניות שהתקבלו מכלבים שנפגעו ממחלות מעי דלקתיות (IBD). כמו כן, אנו מתווים פרוטוקול ליצירה ותחזוקה של תרביות חד-שכבתיות דו-ממדיות ומערכות מעי-על-שבב באמצעות תאים שמקורם באורגנואידים תלת-ממדיים של המעי. הפרוטוקולים המוצגים במחקר זה משמשים מסגרת בסיסית להקמת מערכת מעיים על שבב מיקרופלואידית שתוכננה במיוחד עבור כלבים. על ידי הנחת היסודות לגישה חדשנית זו, אנו שואפים להרחיב את היישום של טכניקות אלה במחקר ביו-רפואי ותרגומי, בהתאם לעקרונות של יוזמת הבריאות האחת. על ידי שימוש בגישה זו, אנו יכולים לפתח מודלים דינמיים במבחנה רלוונטיים יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר הפיזיולוגיה של המעי הן אצל כלבים והן אצל בני אדם. יש לכך השלכות משמעותיות על יישומים ביו-רפואיים ותרופתיים, שכן זה יכול לסייע בפיתוח טיפולים יעילים יותר למחלות מעיים בשני המינים.

Introduction

מורפוגנזה אפיתל של המעי נחקרה בעיקר באמצעות מודלים של חיות מעבדה, שהם יקרים, גוזלים זמן רב ואינם מייצגים במדויק תהליכים התפתחותיים אנושיים1. יתר על כן, מודלים קונבנציונליים של תרביות תאים דו-ממדיות סטטיות חסרים את היכולת לחקות את הארגון המרחבי המורכב של ארכיטקטורת אפיתל תלת-ממדית2. כתוצאה מכך, יש צורך בפרוטוקול להשראת מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה באמצעות תאי אפיתל מעיים ממודלים רלוונטיים לבני אדם של בעלי חיים כדי לקדם את הבנתנו את ארכיטקטורת אפיתל המעי.

כלבי לוויה פיתחו אנטומיה של המעי והרכבי מיקרוביום הדומים להפליא לבני אדם בשל סביבתם המשותפת ותזונתם במהלך הביות3. בנוסף לדמיון זה, גם בני אדם וגם כלבים חולקים תחלואה כרונית שונים המיוחסת ככל הנראה לבריאות המעי. כלבים, כמו בני אדם, יכולים לפתח באופן ספונטני מצבים כרוניים כגון השמנת יתר, תפקוד קוגניטיבי, סוכרת, מחלות מעי דלקתיות (IBD) ואדנוקרצינומה של המעי הגס 4,5,6,7,8,9,10. למרות הפיתוח והשימוש בתאי אפיתל אנושיים ומורין במחקרי מעיים על שבב קודמים 2,11,12,13,14, אפיתל מעיים של כלבים לא היה בשימוש עד כה. לגישה החדשנית שלנו, המשתמשת באפיתל אורגנואיד של המעי הכלבי במערכת תרבית דינמית עם מורפוגנזה אפיתל תלת-ממדית, יש השלכות משמעותיות הן על הרפואה הכלבית והן על רפואת האדם.

ההתקדמות האחרונה בתרבית אורגנואידים במעיים הובילה להקמת תרבית אורגנואידים במעיים של כלבים15. מערכת תרבית זו כוללת גידול תאי גזע במעי תחת התניה מורפוגנית מוגדרת, והתוצאה היא מודל תלת-ממדי בעל תכונות התחדשות עצמית הנגזרות מתאי גזע בוגרים16. עם זאת, ביצוע מבחני הובלה או תרבויות מיקרוביום מארח מציב קשיים עם מודל תלת ממדי זה בגלל האופי הסגור של לומן המעי17. כדי להתמודד עם זה, חוקרים יצרו חד-שכבה דו-ממדית שמקורה באורגנואידים במעי, ומאפשרת חשיפה של פני השטח הלומינליים18,19. עם זאת, הן אורגנואידים תלת-ממדיים והן חד-שכבות דו-ממדיות נשמרים בתנאים סטטיים, שאינם משקפים במדויק את הביומכניקה in vivo של מיקרו-סביבת המעי. שילוב טכנולוגיית אורגנואידים כלביים שמקורם במטופל עם מורפוגנזה תלת-ממדית במבחנה מהווה הזדמנות למחקר תרגומי למחלות כרוניות רב-גורמיות. גישה זו מאפשרת לחוקרים לפתח טיפולים יעילים יותר לטובת בני אדם וכלבים כאחד ולקדם עוד יותר מחקר תרגומי, בהתאם ליוזמת הבריאות האחת, שהיא גישה שיתופית המכירה בקשרים ההדדיים בין בריאות האדם, בעלי החיים והסביבה. היא מקדמת שיתוף פעולה בין-תחומי כדי להתמודד עם אתגרי בריאות מורכבים ולהשיג תוצאות בריאותיות אופטימליות לכולם. על ידי הבנת התלות ההדדית בין בני אדם, בעלי חיים ומערכות אקולוגיות, היוזמה שואפת להפחית סיכונים ממחלות זיהומיות מתפתחות, הידרדרות סביבתית ודאגות בריאותיות משותפות אחרות20,21,22.

פרוטוקול זה מתאר שיטות מקיפות לגידול תאי אפיתל של מעי כלבים המתקבלים מאורגנואידים של מטופלים על גבי מיקרו-מכשיר Gut-on-a-Chip עם קרום נקבובי מבוסס פולידימתילסילוקסאן (PDMS). ביסוס מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל על ידי שילוב אורגנואידים של מעיים כלבים וטכנולוגיית Gut-on-a-Chip זו מאפשרת לנו לחקור כיצד המעי מתפתח ומתחזק את הארגון התאי שלו ואת נישת תאי הגזע שלו. פלטפורמה זו מציעה הזדמנות רבת ערך לחקור את ההשפעה של קהילות מיקרוביום על בריאות המעי ולהבין כיצד קהילות אלה מייצרות מטבוליטים מיקרוביאליים התורמים לפתופיזיולוגיה של המעי14,23. כעת ניתן להרחיב את ההתקדמות הזו גם לדגימות מעיים של כלבים, ולספק לחוקרים הזדמנויות לחקור את הקשר המורכב בין מיקרוביום המעי לבין הפיזיולוגיה של המאכסן. זה פותח דרכים להשגת תובנות יקרות ערך לגבי המנגנונים הבסיסיים של פתופיזיולוגיה של המעי והבנת התפקיד הפוטנציאלי של מטבוליטים מיקרוביאליים הן בבריאות הכלבים והן בבריאות האדם, כמו גם במצבי מחלה שונים. הפרוטוקול המשמש למעיים על שבב כלבים ניתן לשחזור, מה שהופך אותו למודל ניסיוני מתאים לרפואה השוואתית, שכן גישה זו מאפשרת לחקור אינטראקציות מיקרוביום מארח, זיהומים פתוגנים והשפעות טיפוליות מבוססות פרוביוטיקה הן בכלבים והן בבני אדם.

Protocol

המחקר אושר ונערך בהתאם לוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מדינת וושינגטון (ASAF# 6993). בפרוטוקול הזה השתמשנו במכשיר מיקרופלואידי מבוסס היטב של Gut-on-a-Chip שעשוי מ-PDMS אשר יוצר בתוך החברה2 (איור 1D). שיטות מפורטות לייצור המיקרו-מכשיר Gut-on-a-Chip ניתן למצוא בדוחות קודמים 2,24. פרוטוקול זה מדגים שילוב ייחודי של אורגנואידים במעי ומערכת מיקרופלואידית (איור 2).

1. הפעלת משטח של Gut-on-a-Chip עשוי PDMS

  1. הכן תמיסת פוליאתילנימין 1% (PEI) על ידי הוספת 1 מ"ל של תמיסת 50% PEI ל-49 מ"ל מים מזוקקים (DI) בצינור חרוטי של 50 מ"ל. הפוך את הצינור פעמיים עד שלוש כדי לערבב את התמיסה היטב, ולאחר מכן סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
    הערה: שמור אותו מאוחסן בטמפרטורה של 4°C.
  2. הכינו תמיסת 0.1% גלוטראלדהיד (GA) על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של תמיסת GA 50% ל-49.9 מ"ל DI בצינור חרוטי של 50 מ"ל. הפוך את הצינור פעמיים עד שלוש כדי לערבב את התמיסה היטב, ולאחר מכן סנן את התמיסה באמצעות מסנן מזרק 0.2 מיקרומטר.
    הערה: אחסנו אותו בטמפרטורה של 4°C והקפידו להגן עליו מפני חשיפה לאור ישיר.
  3. הכניסו את מכשיר Gut-on-a-Chip לתנור יבש בטמפרטורה של 60°C ודגרו עליו למשך 30 דקות לפחות כדי לסלק את שאריות הלחות.
  4. חשוף את מכשיר Gut-on-a-Chip לטיפול UV ואוזון למשך 60 דקות באמצעות מחולל UV/אוזון.
    הערה: כדי להבטיח הפעלה אופטימלית של משטחי PDMS במהלך הטיפול, יש לשמור על מרחק של כ-3 ס"מ או פחות בין מנורת ה-UV לבין המכשיר. הימנע מצפיפות יתר של מכשירים בגנרטור כדי להשיג הפעלה יעילה של פני השטח.
  5. אבטח את צינורות הכניסה, המעקף והיציאה של המיקרו-ערוץ העליון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותם. כמו כן מהדק את צינורות הכניסה עבור microchannel התחתון.
  6. נתק את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ התחתון. ודא שצינורות המעקף של המיקרו-ערוץ התחתון נשארים פתוחים.
  7. באמצעות מיקרופיפטה P100, להציג 100 μL של תמיסת PEI 1% דרך חור היציאה של microchannel התחתון.
    הערה: מומלץ לבצע תהליך זה כאשר המכשיר עדיין חם מחשיפה לקרינת UV/אוזון. שימו לב לתמיסת PEI הזורמת דרך המיקרו-ערוץ ותמיסת PEI יורדת ויוצאת מצינורות המעקפים עבור המיקרו-ערוץ התחתון.
  8. חבר מחדש את צינורות השקע עבור המיקרו-ערוץ התחתון.
  9. אבטח את צינורות הכניסה, המעקף והיציאה של המיקרו-ערוץ התחתון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותם. כמו כן מהדק את צינורות הכניסה עבור microchannel העליון.
  10. נתק את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ העליון. ודא שהצינור העוקף של המיקרו-ערוץ העליון נשאר פתוח.
  11. באמצעות מיקרופיפטה P100, להציג 100 μL של תמיסת PEI 1% דרך חור היציאה של microchannel העליון.
    הערה: שימו לב לתמיסת PEI הזורמת דרך המיקרו-ערוץ ותמיסת PEI יורדת ויוצאת מצינורות המעקפים עבור המיקרו-ערוץ העליון.
  12. חבר מחדש את צינור היציאה של המיקרו-ערוץ העליון.
  13. לאחר מילוי מיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים בתמיסת PEI 1%, אפשר למכשיר לדגור בטמפרטורת החדר (RT) למשך 10 דקות.
  14. בצע שלבים 1.5-1.12 עם פתרון GA של 0.1%.
  15. לאחר שהמיקרו-ערוצים העליונים והתחתונים מלאים בתמיסת GA של 0.1%, אפשר למכשיר לדגור ב-RT למשך 20 דקות.
  16. בצע את שלבים 1.5-1.12 עם מי DI כדי להסיר תמיסת הפעלה עודפת של פני השטח.
  17. מכניסים את השבב לתנור יבש ל-60°C ומניחים לו להתייבש למשך הלילה.
    הערה: הקפד להסיר את תפסי הקלסר מכל הצינוריות כדי למנוע פגיעה בצינורית. תהליך ייבוש זה הוא קריטי להפעלה אחידה של פני השטח של המיקרו-ערוץ בתוך Gut-on-a-Chip12.

2. ציפוי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והכנת מדיום תרבית לתרבית מעיים על שבב

  1. הכינו תערובת ECM עם מדיום בסיסי אורגנואידי, כך שהריכוז הסופי של קולגן I ומטריג'ל הוא 60 מיקרוגרם/מ"ל ו-2% (vol/vol), בהתאמה.
    הערה: הכינו 50 μL של תערובת ECM לכל שבב מעיים (כלומר, 20 μL של תערובת ECM עבור כל מיקרו-ערוץ עליון ותחתון ו-10 μL נוספים). הכינו את התמיסה ביום השימוש ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C או הניחו אותה על קרח עד שהיא מוכנה לשימוש.
  2. הוציאו את ה-Gut-on-a-Chip שטופל ב-UV/אוזון, PEI ו-GA מהתנור היבש.
    הערה: בדוק תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה כדי לראות אם יש לחות שיורית.
  3. הניחו למעי על השבב להתקרר בארון בטיחות ביולוגית למשך 10 דקות.
  4. אבטח את צינורות הכניסה, המעקף והיציאה של המיקרו-ערוץ העליון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותם. כמו כן מהדק את צינורות הכניסה עבור microchannel התחתון.
  5. נתק את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ התחתון.
  6. באמצעות מיקרופיפטה P100, להציג 20 μL של תערובת ECM דרך חור היציאה של microchannel התחתון.
    הערה: התבונן בתערובת ECM הזורמת דרך המיקרו-ערוץ ללא כל לכידה של בועות אוויר. אם קיימת בועת אוויר, הכניסו תערובת ECM נוספת למיקרו-ערוץ התחתון עד שהבועה תיעלם.
  7. חבר מחדש את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ התחתון.
  8. אבטח את צינורות הכניסה, המעקף והיציאה של המיקרו-ערוץ התחתון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותם. כמו כן מהדק את צינורות הכניסה עבור microchannel העליון.
  9. נתק את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ העליון.
  10. באמצעות מיקרופיפטה P100, להציג 20 μL של תערובת ECM דרך חור היציאה של microchannel העליון.
  11. חבר מחדש את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ העליון.
  12. הניחו את השבב באינקובטור CO 2 לח עם 5% CO2 ב-37°C למשך שעה אחת כדי ליצור את שכבת ה-ECM על קרום PDMS שטופל ב-PEI וב-GA (איור 3A).
    הערה: יש לוודא שכל הצינוריות מהודקות במהלך הדגירה.
  13. במהלך הדגירה של ציפוי ECM, הכינו שני מזרקים 1 מ"ל המכילים מצע זריעה קר, שהוא מדיום תרבית אורגנואידים חסר A8301 אך מכיל 10 מיקרומטר Y-27632 ו 2.5 מיקרומטר CHIR99021, כפי שדווח בעבר ב- Gut-on-a-Chip הנגזר מאורגנואידים אנושיים2.
    הערה: A8301 הוסר מהתווך כדי לשפר את החיבור של תאים ל-ECM המצופה כפי שדווח קודם לכן2. יום 0 של תרבית Gut-on-a-Chip דורש רק זרימה מיקרו-ערוצית עליונה. לכן, להכין מזרק מלא עבור הערוץ העליון בעוד מינימום של 0.2 מ"ל עבור הערוץ התחתון.
  14. לאחר השלמת ציפוי ECM, הוציאו את השבב מהאינקובטור ושחררו את המהדק לצינור המעקף המחובר למיקרו-ערוץ התחתון.
  15. חבר מזרק 1 מ"ל מלא בתווך זריעה למחט הקהה המחוברת למיקרו-ערוץ התחתון של המעיים על השבב. הציגו בזהירות את אמצעי הזריעה (~ 50 μL) לצינורות המעקפים. לאחר מילוי הצינור בתווך המוצג, אבטחו את הצינור העוקף המחובר למיקרו-ערוץ התחתון באמצעות תפס קלסרים.
  16. שחררו את המהדק של צינור היציאה המחובר למיקרו-ערוץ התחתון. הכניסו בזהירות את מדיום הזריעה למיקרו-ערוץ התחתון ואפשרו לו לזרום בצורה חלקה דרך המערכת. אבטח את צינור היציאה המחובר למיקרו-ערוץ התחתון באמצעות תפס קלסר לאחר זילוח.
  17. לאחר מכן, פתח את צינורות המעקף המחוברים למיקרו-ערוץ העליון.
  18. חבר מזרק 1 מ"ל מלא בתווך זריעה למחט הקהה המחוברת למיקרו-ערוץ העליון של המעיים על השבב. הציגו בזהירות את אמצעי הזריעה (~ 50 μL) לצינורות המעקפים. לאחר מילוי הצינור בתווך המוצג, אבטחו את הצינור העוקף המחובר למיקרו-ערוץ העליון באמצעות תפס קלסר.
  19. שחררו את צינור השקע המחובר למיקרו-ערוץ התחתון. הכניסו בזהירות את מדיום הזריעה למיקרו-ערוץ העליון ואפשרו לו לזרום בצורה חלקה דרך המערכת. אבטח את צינור היציאה המחובר למיקרו-ערוץ העליון באמצעות תפס קלסר לאחר זילוח.

3. הכנת תאי אורגנואיד במעי הכלבי לזריעה

הערה: כדי ליצור את מודל Gut-on-a-Chip, נעשה שימוש באורגנואידים של המעי הגס הכלבי (המכונים קולונואידים) שמקורם בכלבים חולי IBD בפרוטוקול זה. קולונואידים אלה נגזרו משלושה עד חמישה מקטעים קטנים של רקמת המעי הגס שעברה ביופסיה, בעקבות שיטה15,18 שדווחה בעבר. לקבלת תוצאות מיטביות, חיוני להשתמש בקולונידים כלבים שעברו לפחות שלושה מעברי תרבית כדי לבסס אורגנואידים יציבים המתאימים ליישומי מבחנה. מומלץ לגדל את הקולונואידים הכלביים למשך 3-4 ימים לפחות כדי לאפשר התמיינות נאותה של תאים רב-שושלותיים בתוך האורגנואידים, ולהבטיח את בשלותם התפקודית ואת התאמתם לניסויים הבאים במודל Gut-on-a-Chip. הגבול המרבי של המעבר לעבודה זו הוא פחות מ -20, כפי שצוין במחקר קודם שהדגים את הפנוטיפ והקריוטיפ ללא שינוי לאורך 20 קטעים רצופים25. האיתות של תורמים אלה מוצג בטבלה משלימה S1.

  1. תרבית את הקולונואידים הכלביים בצלחות של 24 בארות המשובצות ב-30 μL של Matrigel 15,18 עם מדיום תרבית אורגנואידים המופיע בטבלת החומרים, אשר שונה ממדיוםשדווח בעבר 15,26,27. התווך המותנה הושג על ידי טיפוח תאי Rspo1 ותאי HEK293 שהונדסו להפריש Noggin28.
  2. השליכו את מדיום תרבית האורגנואידים דרך שאיבת ואקום והכניסו 500 מיקרוליטר של תמיסת שחזור תאים בטמפרטורה קרה כקרח לכל באר. לדגור במשך 30 דקות ב 4 °C.
    הערה: בדרך כלל, שלוש בארות מתוך 24 בארות של אורגנואידים בוגרים במעיים של כלבים מספקות כמות מספקת של תאים מנותקים כדי לזרוע מכשיר מעיים על שבב יחיד עם 40-50 אורגנואידים / שדה ראייה אחד בהגדלה x10.
  3. משבשים מכנית את כיפות המטריגל למשך 5 שניות באמצעות מיקרופיפטה P1000. לאחר מכן, לאסוף את ההשעיה אורגנואיד בצינור חרוטי 15 מ"ל.
  4. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 200 × גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות, ולאחר מכן הסרת supernatant.
  5. הצג 1 מ"ל של פרוטאז דמוי טריפסין בטמפרטורת החדר, בתוספת 10 מיקרומטר Y-27632, והשהה מחדש את גלולת התא על ידי פיפטינג באמצעות מיקרופיפטה P1000.
  6. הניחו את תרחיף התא באמבט מים בטמפרטורה של 37°C ודגרו עליו למשך 10 דקות תוך ניעור התערובת מעת לעת.
  7. הציגו 5 מ"ל של מדיום בסיסי אורגנואיד חם ופיפטה נמרצת את תרחיף התא באמצעות מיקרופיפטה P1000 עד שהוא הופך מעונן, ללא גושי תאים נראים לעין.
  8. העבירו את תרחיף התא דרך מסננת תאים עם חתך של 70 מיקרומטר כדי לסלק פסולת מטריג'ל וצברי תאים גדולים.
  9. צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 200 × גרם ו 4 ° C במשך 5 דקות, ואחריו השעיה של הגלולה בתווך זריעה. לזריעה של מכשיר Gut-on-a-Chip של כלב אחד, יש להשתמש ב-20 μL של מדיום זריעה כדי להשהות מחדש את כדורית התא (כלומר, להשתמש ב-20 μL של מדיום זריעה בעת זריעת מכשיר Gut-on-a-Chip אחד).
  10. שנה את ריכוז התאים ברי קיימא ל 1 × 107 תאים / מ"ל עם מדיום זריעה כפי שדווח בעבר2. בצע הערכת כדאיות באמצעות המוציטומטר על ידי שילוב של 10 μL של תרחיף התא עם 10 μL של כחול טריפאן, ולאחר מכן התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ.
    הערה: חיוני להתאים את ריכוז התא כראוי כדי להבטיח חיבור תאים אופטימלי ויצירת שכבה אחידה על קרום השבב. אם מספר התאים הראשוני אינו מספיק, הדבר עלול לגרום להקמה מאוחרת או לא מוצלחת של חד-שכבה קונפלואנטית. לעומת זאת, אם מספר התאים מוגזם, תאים שאינם נצמדים יכולים להצטבר לגושים בתוך התעלה, מה שמוביל להשפעות ריכוז לא רצויות.

4. זריעה והיווצרות של תא חד שכבתי דו-ממדי

  1. נתק את צינורות היציאה עבור המיקרו-ערוץ העליון. ודא שהצינור העוקף של המיקרו-ערוץ העליון נשאר פתוח. אבטח הן את הכניסה והן את היציאה של המיקרו-ערוץ התחתון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותם.
  2. באמצעות מיקרופיפטה P100 או P20, הכניסו 20 μL של תרחיף התא מפרוטוקול 3 לחור היציאה של המיקרו-ערוץ העליון (איור 3B זריעה).
  3. אבטח את המעקף ואת צינורות הכניסה של המיקרו-ערוץ העליון באמצעות תפסי קלסרים כדי להדק אותו. לאחר מכן, חבר מחדש את צינור היציאה לחור היציאה של המיקרו-ערוץ העליון, וודא שהצינור נשאר פתוח לאורך כל התהליך כדי למנוע הפעלת לחץ על המיקרו-ערוץ העליון. לאחר שלב זה, אבטח את צינור היציאה של התעלה העליונה באיטיות באמצעות תפס קלסר כדי להדק אותו.
  4. ודא באמצעות מיקרוסקופ שהתאים מפוזרים באופן שווה ברחבי המיקרו-ערוץ העליון.
    הערה: חשוב להדק את הצינור כדי לעצור את תנועת התווך בתוך התעלה כדי לאפשר תנאים סטטיים יציבים עד להשלמת חיבור התא הרצוי.
  5. מקם את השבב באינקובטור CO2 לח ב 37 ° C.
    הערה: נדרשות כ-3 שעות עד שתאי אורגנואיד במעיים של כלבים נצמדים לציפוי ECM (איור 3B מצורף).
  6. חבר את המזרק המחובר למיקרו-ערוץ העליון של ה-Gut-on-a-Chip למשאבת מזרק הממוקמת בתוך אינקובטור CO2 .
    הערה: יש לשטוף בזהירות את המדיום לתוך המיקרו-ערוץ באמצעות הידית של משאבת המזרק ולהסיר תאים לא קשורים. בחן את השבב תחת מיקרוסקופ כדי לוודא שכל התאים שאינם מחוברים נשטפו ביעילות.
  7. התחל את זרימת מדיום התרבית במהירות של 30 μL/h עם מדיום הזריעה. זרימה רציפה זו מיועדת רק למיקרו-ערוץ העליון בתחילה עד להתבססות חד-שכבתית דו-ממדית על גבי גוט-און-א-צ'יפ. עבור המיקרו-ערוץ התחתון, השאר את המיקרו-ערוצים מהודקים ואת המדיום לא סמוק.
  8. מהיום שלאחר זריעת התאים יש לשנות את מדיום התרבית למדיום תרבית אורגנואידי, המכיל A8301 וחסר 10 מיקרומטר Y-27632 ו-2.5 מיקרומטר CHIR99021, ממדיום הזריעה.
  9. לאחר הקמת השכבה החד-שכבתית, התחל את זרימת התווך הרציפה גם למיקרו-ערוץ התחתון. בדרך כלל נדרשים יומיים עד שלושה ימים לתאי אפיתל אורגנואידים של המעי הכלבי כדי לבסס חד-שכבות אפיתל (איור 3C).

5. הקמת מורפוגנזה תלת ממדית במעיים על שבב של כלבים

הערה: לאחר היווצרות החד-שכבות המשולבות ב-Gut-on-a-Chip, הוכנסו זרימה בינונית הן של התעלה העליונה והן של התעלה התחתונה ושל זן התא כדי להתחיל מורפוגנזה תלת-ממדית לחד-שכבה דו-ממדית כפי שמוצג באיור 2.

  1. הכניסו את מדיום תרבית האורגנואידים למיקרו-ערוצים העליונים והתחתונים כדי להתחיל את הפיתוח של מורפוגנזה תלת-ממדית במערכת מעיים על שבב. כדי להשיג לחץ גזירה של 0.02 dyne/cm2 בעיצוב Gut-on-a-Chip הקיים (כלומר, מיקרו-ערוץ בגובה 500 מיקרומטר), הגדל את קצב הזרימה ל-50 μL/h29.
  2. התחל 10% מזן התא ותדר 0.15 הרץ, כפי שהומלץ לפני2, באמצעות ביוריאקטור מווסת מחשב המפעיל זן מחזורי על תאים שגודלו בתרבית חוץ גופית. תהליך זה יחיל שאיבת ואקום על מכשיר Gut-on-a-Chip.
  3. שמור על תנאי תרבית אלה במשך מינימום של 2 עד 3 ימים. המורפוגנזה התלת-ממדית של חד-שכבת המעי הכלבית מתרחשת בדרך כלל 2 עד 3 ימים לאחר תחילת זרימת התעלה הדוראלית ושאיבת הוואקום (איור 3C).

6. אפיון מעיים על שבב כלבים

  1. דימות תאים חי
    1. הסירו בועות אוויר במעיים על שבב על ידי הזרמה עדינה של המדיום באמצעות משאבת המזרק.
    2. נתקו את מכשיר ה-Gut-on-a-Chip ממשאבת המזרק.
      הערה: הימנע מכל תמרון שיכול להפעיל לחץ בתוך המעיים על השבב.
    3. מקם את המכשיר על מיקרוסקופ כדי ללכוד תמונות של אפיתל 3D הוקמה. להמחשת המבנה של שכבות האפיתל התלת-ממדיות באמצעות ניגודיות פאזה, השתמשו במטרות של 10x ו-20x (איור 3C).
  2. צביעה אימונופלואורסצנטית
    1. הכן את פתרון החסימה על-ידי המסת 1 גרם BSA ב-50 מ"ל של מלח חיץ פוספט (PBS) לייצור 2% BSA. מעבירים את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לסינון. שמור תמיסה זו מאוחסנת בטמפרטורה של 4°C.
    2. הכן את התמיסה החדירה על ידי שילוב של 150 μL של Triton X-100 עם 50 מ"ל של תמיסת חסימה, וכתוצאה מכך ריכוז סופי של 0.3% Triton X-100. מעבירים את התמיסה דרך מסנן מזרק של 0.2 מיקרומטר לסינון. שמור תמיסה זו מאוחסנת בטמפרטורה של 4°C.
    3. בצע קיבוע של התאים על ידי הזרקת 100 μL של 4% PFA לתוך שני microchannel העליון והתחתון כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    4. שטפו את התאים על ידי הזרקת 100 מיקרוליטר של PBS למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    5. בצע חדירה של התאים על ידי הזרקת 100 μL של 0.3% טריטון לתוך מיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11. הניחו את המכשיר ב-RT למשך 30 דקות.
    6. שטפו את התאים על ידי הזרקת 100 מיקרוליטר של PBS למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    7. בצע חסימה של התאים כדי למנוע קשירה לא ספציפית על ידי הזרקת 100 μL של 2% BSA למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11. מקם את ההתקן ב- RT למשך שעה אחת.
    8. הזריקו 20 μL של תמיסת הנוגדנים הראשונית המדוללת ב-2% BSA והניחו אותה ב-RT למשך 3 שעות, ולאחר מכן דגירה למשך הלילה ב-4°C.
      הערה: יש לוודא שכל הצינוריות מהודקות במהלך הדגירה בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה. הריכוז של נוגדן ראשוני צריך להיות גבוה פי 2-5 מהריכוז המומלץ עבור צביעה חד-שכבתית או תלת-ממדית של אורגנואידים (איור משלים S1).
    9. שטפו את התאים על ידי הזרקת 100 μL של PBS למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    10. הזריקו 20 μL של תמיסת הנוגדנים המשנית המדוללת ב-2% BSA והניחו אותה ב-RT למשך שעה אחת.
      הערה: יש לוודא שכל הצינוריות מהודקות במהלך הדגירה. החל משלב זה, יש צורך להגן על הגדרת המכשיר עם רדיד אלומיניום כדי למנוע photobleaching.
    11. שטפו את התאים על ידי הזרקת 100 μL של PBS למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    12. הכן פתרון משולב עבור F-actin ו DAPI (diamidino-2-phenylindole) נגד צביעה. הזריקו 20 μL של התמיסה המשולבת למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
    13. שטפו את התאים על ידי הזרקת 100 מיקרוליטר של PBS למיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים כמתואר בשלבים 2.4-2.11.
      בצע הדמיה פלואורסצנטית של הארכיטקטורה של תאי אפיתל תלת ממדיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי או מיקרוסקופ קונפוקלי.

7. פונקציית מחסום אפיתל

  1. הסירו בועות אוויר במעיים על שבב על ידי הזרמה עדינה של המדיום באמצעות משאבת המזרק. יש לוודא שכל הצינורות פתוחים במהלך המדידה.
  2. הוציאו את ה-Gut-on-a-Chip ממשאבת המזרק והניחו אותו ב-RT למשך 10 דקות לפחות.
  3. הסר אלקטרודות Ag/AgCl מתמיסת 70% EtOH.
  4. הניחו שתי אלקטרודות Ag/AgCl בכניסה העליונה ובשקע התחתון, בהתאמה, כדי למדוד את התנגדות שכבת האפיתל באמצעות מולטימטר.
  5. הניחו שתי אלקטרודות Ag/AgCl בכניסה התחתונה ובשקע העליון, בהתאמה. דווח על הממוצע של שני ערכים אלה כערך התנגדות עבור Gut-on-a-Chip.
    הערה: יש למדוד את ה-TEER הריק על גבי מעי על שבב עם ציפוי ECM בלבד ללא האפיתל.
  6. חישוב ערך התנגדות חשמלית טרנסאפיתל (TEER) (kΩ × ס"מ 2) ניתן לחישוב באמצעות משוואה (1).
    TEER = (Ωt - Ωריק) × A (1)
    כאשר Ωt הוא ערך התנגדות שנמדד בנקודת הזמן הספציפית מאז תחילת הניסוי, Ωריק הוא ערך התנגדות שנמדד באותו זמן ללא האפיתל, ו-A הוא שטח פני השטח המכוסה בשכבת תא (בערך 0.11 ס"מ2 עבור תכנון זה של Gut-on-a-Chip29).
    1. חישוב TEER מנורמל באמצעות משוואה (2).
      TEER = Equation 1 (2)
      כאשר Ω0 הוא ערך התנגדות בנקודת זמן הקריאה הראשונית של הניסוי כפי שדווח קודם לכן30 (איור 4C).

Representative Results

פרוטוקול זה מאפשר באופן אמין התפתחות ספונטנית של מורפוגנזה תלת-ממדית של המעי במערכת מעיים-על-שבב. גישה זו משתמשת בתאי אפיתל של המעי הכלבי המתקבלים מאורגנואידי מעיים שמקורם בכלבים שנפגעו ממחלות מעי דלקתיות (IBD) (איור 1B). ניתן לצפות בהתקבצות מזדמנת של מורפוגנזה תלת-ממדית של תאי אפיתל במעי כלבים לאורך המיקרו-ערוץ לאחר 6-9 ימים של זרימה בינונית (איור 3C). ניתן לעקוב אחר שינויים מורפולוגיים אלה באמצעות טכניקות ניגודיות פאזה. במחקר זה השתמשנו באורגנואידים שמקורם בשני כלבים שאובחנו עם IBD. יש לציין כי מורפוגנזה תלת-ממדית מוצלחת נצפתה בשני שכפולים ביולוגיים, שכל אחד מהם בוצע עם שני שכפולים טכניים. ממצאי מחקר זה מספקים בסיס לחקירות עתידיות הקשורות לאורגנואידים במעיים שמקורם בתורמים אחרים של כלבים. תוצאות אלה מדגימות את הישימות והחזרתיות הפוטנציאליות של הגישה הניסויית שלנו, שדווחה בעבר בדגימות אנושיות. ממצאים אלה מספקים אישור נוסף לכך שטכנולוגיית Gut-on-a-Chip ישימה לתאי אפיתל של מעי כלבים, כפי שדווח בעבר במחקרים שהשתמשו בתאי אפיתל של מעי אנושי2.

פרוטוקול זה הראה שניתן להשתמש בצביעת אימונופלואורסצנטיות כדי להעריך את המבנה התלת-ממדי של חד-שכבות שמקורן באורגנואידים שיצרו מבנים דמויי וילוס בשבבים מיקרופלואידים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי (איור 4 A,B). פרוטוקול זה יכול להיות מותאם כדי לאמת את הפנוטיפים התאיים המובחנים והמאורגנים במרחב באמצעות צביעה אימונופלואורסצנטית. הדמיה של מורפוגנזה תלת-ממדית בתוך מעיים על שבב מספקת הזדמנות מצוינת לחקור את תגובת המארח במהלך אינטראקציות פתולוגיות שונות 14,23,31. בשילוב עם תאי אפיתל שמקורם בתורמי חולים, כפי שתואר קודם לכן בבני אדם, ניתן להשתמש בטכנולוגיה זו לבניית מודלים מותאמים אישית של מחלות מעיים13. באמצעות שילוב של דימות אימונופלואורסצנטי עם טכניקות הדמיית RNA ממוקדות כמו הכלאה פלואורסצנטית באתר, זה יכול להיות אפשרי לנתח חזותית את התעתיק והפרוטאומים של המארח בתוך מערכת מעיים על שבב.

שמירה על שלמות קרום המעי חיונית לשמירה על הומאוסטזיס המעי, ופלטפורמת Gut-on-a-Chip מספקת יתרון רב ערך בכך שהיא מאפשרת ניטור וכימות מדויקים של פונקציה חיונית זו. מדידת TEER באמצעות טכנולוגיית Gut-on-a-Chip מציעה מספר יתרונות. לדוגמה, מחקרים קודמים העריכו בהצלחה TEER תוך גידול משותף של תאי מעיים עם חיידקים לא פתוגניים ופרוביוטיים32, כמו גם בתנאי מעי דולף23. זה מאפשר לחוקרים לחקור את ההשפעה של מצבים שונים על תפקוד מחסום המעי ולזהות התערבויות פוטנציאליות לקידום בריאות המעי.

Figure 1
איור 1: התבססות של IBD כלב שמקורו במטופל מעי על שבב. (A) אינטגרציה של אורגנואידי מעיים שמקורם במטופל ופלטפורמת Gut-on-a-Chip. ניתן לבצע ביופסיה אנדוסקופית כדי לבודד תאי קריפטה במעי כדי לפתח אורגנואידים ספציפיים לתורם. תאי אפיתל יכולים להיות מנותקים לתאים בודדים מהאורגנואידים, ואז נזרעים לתוך מעיים על שבב מבוססי PDMS ומתורבתים במיקרו-סביבה דינמית ייחודית. (B) תמונות מייצגות של קולונואידים מכלב IBD. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. (C) סכמה זו מדגימה מכשיר Gut-on-a-Chip המורכב מקרום נקבובי הממוקם בין מיקרו-ערוצים עליונים ותחתונים. המיקרו-ערוץ העליון מסומן על ידי האזור הכחול, ואילו המיקרו-ערוץ התחתון מסומן על ידי האזור האדום. תאי ואקום נמצאים בכל צד של המיקרו-ערוץ, אשר מעוותים את הממברנה הנקבובית כדי לחקות תנועה פריסטלטית24. (D) התקנה של Gut-on-a-Chip לכלבים כוללת Gut-on-a-Chip מבוסס PDMS המורכב עם צינורות המונחים על תלוש כיסוי 2,24. הצינור העוקף הוא קריטי כדי למנוע הצטברות לחץ בתוך המיקרו-תעלה במהלך הטיפול (כלומר, חיבור למזרקים). אטבי קלסרים משמשים להידוק הצינור. ניתן להחדיר חומרים רגישים לנפח דרך החורים הפתוחים של השקע העליון או התחתון. ניתן להחדיר מדיום תרבית אורגנואיד על ידי חיבור המזרקים למחטי הקצה הקהות והזרימה דרך הכניסה העליונה והתחתונה. קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; PDMS = polydimethylsiloxane. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: היווצרות מבנים דמויי וילוס במעי דלקתי של כלבים. תאי האפיתל המנותקים נזרעו במעי על שבב מצופה ECM. לאחר שהתאים המנותקים חוברו לקרום PDMS, החלה זרימה אפית במשך 3 ימים (D0-D3). כאשר נוצרת חד-שכבה דו-ממדית (D3), מתחילה זרימה בזולטרלית עם מתיחה תכופה (Stretching, AP ו-BL Flow). לאחר 2-3 ימים של זרימה כפולה ומתיחה של הממברנה, החד-שכבה הדו-ממדית מתחילה לפתח מורפוגנזה תלת-ממדית, ומבנים דמויי וילוס נוצרים לאחר 9 ימי תרבית (מורפוגנזה תלת-ממדית, D9-D12). קיצורים: ECM = מטריצה חוץ-תאית; PDMS = polydimethylsiloxane; AP = אפיקלי; BL = basolateral. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: זריעת אורגנואידים במעיים של כלבים ומורפוגנזה תלת-ממדית במעי על-שבב . (A) השלבים הניסיוניים להפעלת פני השטח של קרום נקבובי ב-Gut-on-a-Chip מבוסס PDMS. השימוש בטיפול UV / אוזון, PEI וטיפול GA בשילוב מקל על קישור צולב של אמינים הקיימים בתמיסות ECM. תהליך זה מוביל לאימוביליזציה יציבה של חלבוני ECM על הממברנה הנקבובית. (B) תמונות ניגודיות הפאזה מדגימות את המורפולוגיה של תאים מיד לאחר הזריעה (משמאל) ו-3-5 שעות לאחר הזריעה (מימין). הממברנה הנקבובית לאחר 3 שעות של זריעה מציגה אזורים דקים וכהים יותר שבהם התחברו תאים בודדים, ומדגישה את תהליך ההתקשרות. (C) תמונות ניגודיות הפאזה מתארות את המורפוגנזה התלת-ממדית של חד-שכבות מעיים בתוך מערכת Gut-on-a-Chip. חד-שכבות אלה נגזרו מכלבים שנפגעו ממחלת מעי דלקתית ותאי אורגנואיד אלה גודלו בתרבית לתקופה של 12 יום בתנאים דינמיים, שכללו זרימת נוזלים ותנועות מתיחה. פסי קנה מידה = 50 מיקרומטר (B,C). קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; ECM = מטריצה חוץ-תאית; PDMS = polydimethylsiloxane; PEI = פוליאתילן; GA = גלוטראלדהיד. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 4
איור 4: הערכת ההתפתחות המורפולוגית התלת-ממדית ב-gut-on-a-Chip של כלבים שמקורם במטופלים . (A) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מעי דלקתי של כלבים, המציגה תצוגה מלמעלה למטה של אפיתל תלת-ממדי מפותח במלואו לאחר 12 ימי תרבית, המוערך על-ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי. חלבון הצומת ההדוק (ZO-1) מוצג בצהוב; קרום גבול המברשת (F-actin) מופיע באדום; והגרעינים מוכתמים ב-DAPI ונראים כחולים. (B) הדמיה אימונופלואורסצנטית של מעי דלקתי של כלבים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי עם עדשה למרחקים ארוכים. כפי שניתן לראות בסכמה, מוצגת תמונה פלואורסצנטית של חתך רוחב של מבנה דמוי וילוס של אפיתל תלת-ממדי מפותח במלואו לאחר 12 ימי תרבית. בנוסף, ערימת Z מראה מבט צדדי על האפיתל התלת-ממדי, החושף היווצרות מבנים דמויי וילוס. קרום גבול המברשת (F-actin) מופיע באדום, והגרעינים מוכתמים ב-DAPI ונראים כחולים. (C) תפקוד מחסום המעי הוערך ונמדד על ידי TEER במעיים על שבבים שמקורם במטופלים. ערכי TEER יציבים הושגו ביום 5 של התרבית ב- Gut-on-a-Chip. קווי שגיאה מבטאים את ה- SEM של המדידות. ערך TEER נמדד בין שני משכפלים ביולוגיים עם שכפול טכני אחד. מוטות קנה מידה = 50 מיקרומטר (A), 25 מיקרומטר (B). קיצורים: IBD = מחלת מעי דלקתית; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; TEER = התנגדות חשמלית transepithelial. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

איור משלים S1: אפיון נוגדנים רב-שבטיים נגד ZO-1 בשכבות חד-שכבתיות שמקורן בקולונידים בכלבים ובמכשירי Gut-on-a-Chip. (A) צביעה אימונופלואורסצנטית של ZO-1 בצהוב עם F-actin באדום ותמונת הכיסוי שלהם. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. (B) הדמיה אימונופלואורסצנטית של ZO-1 בצהוב ב"שבבי מעיים דולפים" בוצעה בתנאים שונים, כולל גירוי עם חיידקים פרוביוטיים (LGG + ציטוקינים או VSL#3 + ציטוקינים) ובקרות ללא חיידקים ללא גירוי פרוביוטי (ציטוקינים). סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. נתון זה משוכפל מתוך Min et al.23. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

טבלה משלימה S1: סיכום מידע על תורמי רקמות. טבלה מסכמת של גיל התורמים, מין, גזע, הערכה היסטופתולוגית וציון מדד פעילות IBD של כלבים (CIBDAI). CIBDAI היא מערכת ניקוד מספרי המשמשת להסיק חומרה קלינית ב- IBD33 של כלבים. אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.

Discussion

מחקר זה מסמן את ההדגמה החלוצית של התאימות של אורגנואידים במעיים של כלבים עם פיתוח מודל IBD Gut-on-a-Chip של כלבים. השילוב של אורגנואידים במעי ותרביות חד-שכבתיות שמקורן באורגנואידים למערכת מיקרופלואידית (כלומר, מערכת מעיים על שבב) פיתח עוד יותר את הטכנולוגיה, ומאפשר יצירת מודלים של מעיים במבחנה המחקים באופן הדוק דינמיקה פיזיולוגית ומייצגים יותר מצבים ביולוגיים. בפרט, מאחר שיש מעט מאוד דיווחים על תרבית מעיים על שבב באמצעות אורגנואידים שמקורם ב- IBD בבני אדם, המחקר הנוכחי המשתמש ב- Gut-on-a-Chip שמקורו ב- IBD עשוי לספק תובנות מובילות לחקר IBD בבני אדם.

הפיתוח המוצלח של מורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי הכלבי על גבי מעיים על שבב דורש תשומת לב קפדנית למספר שלבים קריטיים. ראשית, פני השטח ההידרופוביים של תעלות מיקרופלואידיות PDMS עלולים לעכב הידבקות ECM וחיבור תאים לאחר מכן, מה שמחייב הפעלת משטח של PDMS לפני ציפוי ECM וזריעת תאים (ראה פרוטוקול סעיף 1). כדי להשיג תרבית חד-שכבתית יציבה, הסרת תאים עודפים שאינם מחוברים היא חיונית לאחר חיבור תאים (שלבי פרוטוקול 4.6-4.7). בנוסף, גירוי דינמי, כגון זרימה בינונית קבועה ותנועת ואקום פריסטלטית, הכרחי למורפוגנזה תלת-ממדית של אפיתל המעי (שלב פרוטוקול 5.2). טיפול זהיר חיוני כדי למנוע בועות אוויר במיקרו-ערוץ במהלך כל שלב של תרבית Gut-on-a-Chip.

אם נתקלים בזריעת תאים לקויה לתוך המעיים על השבב, זה יכול להיות בגלל מספר תאים נמוך או חיבור תאים לקוי. כדי לפתור בעיות של מספרי תאים נמוכים, חשוב לבדוק את בריאותם של אורגנואידי מעיים מוכנים על ידי התבוננות בצמיחתם במטריגל. ניתן להעריך את כדאיות התא על ידי צביעה כחולה של טריפאן לאחר דיסוציאציה של התא כדי להבטיח שלא יותר מ-20% מהתאים מתים. אם מספרי תאים בני קיימא אינם מספיקים, ניתן לנסות למטב תנאים בינוניים אורגנואידים. אפשרות נוספת היא דיסוציאציה אורגנואידית חלקית, וכתוצאה מכך עודף של גושי תאים גדולים מ-70 מיקרומטר שנלכדים על ידי המסנן. כדי לפתור זאת, אפשרות אחת היא להאריך את משך הפיפטינג במהלך דיסוציאציה של תאים. לחלופין, צינור חרוטי 15 מ"ל יכול להיות נסער בעדינות כל דקה תוך כדי טיפול עם פרוטאז דמוי טריפסין. חיבור תאים לקוי למעי על שבב עשוי לנבוע מציפוי ECM לא תקין. במהלך תהליך הציפוי, מומלץ לבדוק היטב נוכחות של בועות אוויר ולמנוע את היווצרותן על ידי הוספה עדינה של תמיסת ציפוי נוספת לפי הצורך. צפיפות יתר של תאים ואי שטיפת תאים לא מחוברים עלולה לגרום לחד-שכבה ראשונית לא מספקת. במקרה כזה, פעימה קלה ניתן ליישם בעת דחיפת הבוכנה מזרק. שלבים אלה לפתרון בעיות יכולים לעזור לזהות בעיות ולטפל בהן במהלך תהליך התרבית של Gut-on-a-Chip.

בעוד שפלטפורמת Gut-on-a-Chip זו מאפשרת יצירת שכבות אפיתל תלת-ממדיות חשופות, אנו מכירים בצורך במורכבות ביולוגית נוספת כדי לשכפל את מיקרו-סביבת המעי במלואה. חשוב לקחת בחשבון את יחסי הגומלין בין תאי אפיתל לתאים מזנכימליים, את התצהיר של ECM להתחדשות תלת-ממדית, ואת נוכחותם של מאפייני קריפטו-וילוס המקימים נישה מתאימה של תאי גזע. תאי סטרומה, כגון פיברובלסטים, ממלאים תפקיד חיוני בייצור חלבוני ECM ובוויסות מורפוגנזה של המעי34,35,36. להכללת תאים מזנכימליים במודל זה יש פוטנציאל לשפר הן את המורפוגנזה והן את יעילות ההתקשרות של התא. שכבות אנדותליות, הכוללות כלי דם נימיים וכלי לימפה, ממלאות תפקיד מכריע בשליטה על הובלה מולקולרית וגיוס תאי חיסון37,38. הכללת תאי חיסון שמקורם בחולה יכולה להיות חיונית במידול מחלות מעיים מכיוון שהיא מאפשרת הדגמה של יחסי הגומלין בין חסינות מולדת ונרכשת, כמו גם הקמת חסינות ספציפית לרקמות39. לאחר השלמת מורפוגנזה תלת-ממדית ב-Gut-on-a-Chip, ניתן לשנות את מדיום תרבית האורגנואידים למדיום התמיינות אורגנואידים. זו יכולה להיות גישה מעשית לגרימת התמיינות תאית נוספת, בהתאם למטרות הניסוי.

הדמיה של מיקרו-ארכיטקטורה תלת-ממדית באתרה מאתגרת בשל מרחק העבודה הארוך הנדרש, שניתן להתגבר עליו באמצעות מטרה למרחקים ארוכים. בנוסף, שיטות המיקרו-ייצור וההדבקה של שכבה אחר שכבה מקשות על הגישה לשכבות העליונות לבדיקה עם SEM. לצורך התכנון הנוכחי של Gut-on-a-Chip, יש צורך במשאבת מזרק אחת לכל מיקרו-מכשיר Gut-on-a-Chip, שתתפוס את שטח אינקובטורCO2 ותמנע ניסויים בקנה מידה גדול. יש צורך בחידושים כדי להגביר את המדרגיות עבור פלטפורמה ידידותית למשתמש וסינון בתפוקה גבוהה.

פרוטוקולים נוכחיים אלה מאפשרים התפתחות ספונטנית של שכבות אפיתל תלת-ממדיות במבחנה, העולות על המגבלות של אורגנואידים תלת-ממדיים מסורתיים, חד-שכבות דו-ממדיות ומערכות תרבית מיקרו-מכשירים סטטיות. ניתן לשלוט בדינמיקה זו של מיקרו-סביבת מעיים חוץ גופית על ידי החדרת תרבית משותפת של סוגי תאים מגוונים. מחקרים קודמים בחנו שיטות למניפולציה של מיקרו-סביבת מעיים-על-שבב, כולל תרבית משותפת של מיקרוביום המעי14,23 ותאים חד-גרעיניים היקפיים30. למיקרו-סביבה משוחזרת זו יש יישומים פוטנציאליים רבים, כולל בדיקות סמים, מחקרים מכניסטיים בסיסיים ומידול מחלות. המיקרו-סביבה המשוחזרת טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי למגוון רחב של יישומים, כגון בדיקות סמים 23,40,41 ומידול מחלות 12,13,14,30, כמו גם חקירות מכניסטיות בסיסיות של מורפוגנזה של המעי 42. מגוון בדיקות יכול להתבצע על ידי איסוף supernatants להערכה של מטבוליטים 43, על ידי איסוף תאים לבדיקה גנומית 2,32, או על ידי בדיקה חזותית של התאים באמצעות צבעים של תאים חיים או קיבוע עבור הדמיה immunofluorescence לאחר מכן23,44.

מחקר זה מציג פרוטוקול הניתן לשחזור לפיתוח מורפוגנזה תלת-ממדית של שכבות אפיתל במעיים של כלבים בפלטפורמת Gut-on-a-Chip. מבנה האפיתל התלת-ממדי שנוצר מספק ייצוג מציאותי יותר של מיקרו-סביבת המעי, שיש לה פוטנציאל עצום ליישומים במחקרים ביו-רפואיים שונים. על ידי שימוש בארכיטקטורת מעיים זו, אנו יכולים לערוך מחקר תרגומי יותר ופוטנציאלית להניב תוצאות מבטיחות.

Disclosures

למחברים אין שום ניגוד עניינים להצהיר.

Acknowledgments

ברצוננו להודות לשירות WSU Small Animal Internal Medicine Service (ד"ר ג'יליאן היינס, ד"ר שרה גוס, Shelley Ensign LVT) ולמתאמת המחקרים הקליניים של WSU VTH Valorie Wiss על תמיכתם בגיוס מקרים ואיסוף דגימות ממדענים אזרחיים (תורמי מטופלים). עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי משרד המנהל, המכונים הלאומיים לבריאות (K01OD030515 ו-R21OD031903 ל-Y.M.A.) והאגודה היפנית לקידום המדע בחו"ל תוכנית אתגר לחוקרים צעירים (202280196 ל-I.N). איור 1A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2 (2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368 (2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663 (2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1 (2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300 (2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641 (2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525 (2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13 (2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Tags

רפואה גיליון 204
מורפוגנזה תלת ממדית במעי על שבב של כלבים באמצעות אורגנואידים במעי שמקורם במחלות מעי דלקתיות
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini,… More

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter