Summary
Integratie van darmorganoïden bij honden en een Gut-on-a-Chip microfluïdisch systeem biedt relevante translationele modellen voor menselijke darmziekten. De gepresenteerde protocollen maken 3D-morfogenese en dynamische in vitro modellering van de darm mogelijk, wat helpt bij de ontwikkeling van effectieve behandelingen voor darmziekten bij honden en mensen met One Health.
Abstract
Hondendarmen vertonen overeenkomsten in anatomie, microbiologie en fysiologie met die van mensen, en honden ontwikkelen van nature spontane darmaandoeningen die vergelijkbaar zijn met die van mensen. Het overwinnen van de inherente beperking van driedimensionale (3D) organoïden bij het verkrijgen van toegang tot het apicale oppervlak van het darmepitheel heeft geleid tot het genereren van tweedimensionale (2D) monolaagculturen, die het toegankelijke luminale oppervlak blootleggen met behulp van cellen die zijn afgeleid van de organoïden. De integratie van deze organoïden en van organoïden afgeleide monolaagculturen in een microfluïdisch Gut-on-a-Chip-systeem heeft de technologie verder ontwikkeld, waardoor meer fysiologisch relevante dynamische in-vitro-darmmodellen kunnen worden ontwikkeld.
In deze studie presenteren we een protocol voor het genereren van 3D-morfogenese van het darmepitheel van honden met behulp van primaire darmweefselmonsters verkregen van honden met inflammatoire darmaandoeningen (IBD). We schetsen ook een protocol voor het genereren en onderhouden van 2D-monolaagculturen en darm-op-een-chip-systemen met behulp van cellen die zijn afgeleid van de 3D-darmorganoïden. De protocollen die in deze studie worden gepresenteerd, dienen als een fundamenteel raamwerk voor het opzetten van een microfluïdisch Gut-on-a-Chip-systeem dat speciaal is ontworpen voor honden. Door de basis te leggen voor deze innovatieve aanpak, willen we de toepassing van deze technieken in biomedisch en translationeel onderzoek uitbreiden, in lijn met de principes van het One Health Initiative. Door deze aanpak te gebruiken, kunnen we meer fysiologisch relevante dynamische in vitro modellen ontwikkelen voor het bestuderen van darmfysiologie bij zowel honden als mensen. Dit heeft belangrijke implicaties voor biomedische en farmaceutische toepassingen, omdat het kan helpen bij de ontwikkeling van effectievere behandelingen voor darmziekten bij beide soorten.
Introduction
Intestinale epitheliale morfogenese is grotendeels bestudeerd door middel van proefdiermodellen, die kostbaar en tijdrovend zijn en de menselijke ontwikkelingsprocessen niet nauwkeurigweergeven1. Bovendien missen conventionele statische 2D-celkweekmodellen het vermogen om de complexe ruimtelijke organisatie van een 3D-epitheliale architectuur na te bootsen. Als gevolg hiervan is er behoefte aan een protocol om in vitro 3D-morfogenese te induceren met behulp van darmepitheelcellen uit mensrelevante diermodellen om ons begrip van de darmepitheelarchitectuur te vergroten.
Gezelschapshonden hebben darmanatomie en microbioomsamenstellingen ontwikkeld die opmerkelijk veel lijken op mensen vanwege hun gedeelde omgeving en dieet tijdens domesticatie3. Naast deze gelijkenis delen zowel mensen als honden verschillende chronische morbiditeiten waarvan wordt gedacht dat ze worden toegeschreven aan de darmgezondheid. Honden kunnen, net als mensen, spontaan chronische aandoeningen ontwikkelen, zoals obesitas, cognitieve disfunctie, diabetes mellitus, inflammatoire darmziekte (IBD) en colorectaal adenocarcinoom 4,5,6,7,8,9,10. Ondanks de ontwikkeling en het gebruik van menselijke en muizenepitheelcellen in eerdere Gut-on-a-Chip-onderzoeken 2,11,12,13,14, is het darmepitheel van honden tot nu toe niet gebruikt. Onze nieuwe aanpak, waarbij gebruik wordt gemaakt van organoïde-epitheel bij honden in een dynamisch kweeksysteem met een 3D-epitheliale morfogenese, heeft belangrijke implicaties voor zowel de honden- als de menselijke geneeskunde.
Recente ontwikkelingen op het gebied van darmorganoïdekweek hebben geleid tot de oprichting van darmorganoïdecultuur bij honden15. Dit kweeksysteem omvat het kweken van darmstamcellen onder gedefinieerde morfogeenconditionering, wat resulteert in een 3D-model met zelfvernieuwende eigenschappen afgeleid van volwassen stamcellen16. Het uitvoeren van transporttesten of gastheer-microbioom-coculturen levert echter problemen op met dit 3D-model vanwege de ingesloten aard van het darmlumen17. Om dit aan te pakken, hebben onderzoekers een 2D-monolaag gegenereerd die is afgeleid van darmorganoïden, waardoor het luminale oppervlak kan worden blootgesteld18,19. Zowel 3D-organoïden als 2D-monolagen worden echter gehandhaafd onder statische omstandigheden, die de in vivo biomechanica van de intestinale micro-omgeving niet nauwkeurig weergeven. Het combineren van van patiënten afgeleide technologie voor hondenorganoïden met in vitro 3D-morfogenese biedt een kans voor translationeel onderzoek naar chronische multifactoriële ziekten. Deze aanpak stelt onderzoekers in staat om effectievere behandelingen te ontwikkelen die zowel mensen als honden ten goede komen en translationeel onderzoek verder te bevorderen, in lijn met het One Health Initiative, een gezamenlijke aanpak die de onderlinge verbondenheid van de gezondheid van mens, dier en milieu erkent. Het bevordert interdisciplinaire samenwerking om complexe gezondheidsuitdagingen aan te pakken en optimale gezondheidsresultaten voor iedereen te bereiken. Door inzicht te krijgen in de onderlinge afhankelijkheid tussen mensen, dieren en ecosystemen, heeft het initiatief tot doel de risico's van opkomende infectieziekten, aantasting van het milieu en andere gedeelde gezondheidsproblemen te beperken20,21,22.
Dit protocol schetst uitgebreide methoden voor het kweken van darmepitheelcellen bij honden die zijn verkregen uit organoïden van patiënten op een Gut-on-a-Chip-microapparaat met een poreus membraan op basis van polydimethylsiloxaan (PDMS). Het vaststellen van de 3D-epitheliale morfogenese door het integreren van darmorganoïden van honden en deze Gut-on-a-Chip-technologie stelt ons in staat om te bestuderen hoe de darm zich ontwikkelt en zijn cellulaire organisatie en stamcelniche handhaaft. Dit platform biedt een waardevolle kans om de impact van microbioomgemeenschappen op de darmgezondheid te onderzoeken en te begrijpen hoe deze gemeenschappen microbiële metabolieten genereren die bijdragen aan de pathofysiologie van de darm14,23. Deze vooruitgang kan nu worden uitgebreid naar darmmonsters van honden, waardoor onderzoekers de mogelijkheid krijgen om de ingewikkelde relatie tussen het darmmicrobioom en de fysiologie van de gastheer te onderzoeken. Dit opent mogelijkheden voor het verkrijgen van waardevolle inzichten in de onderliggende mechanismen van de pathofysiologie van de darm en het begrijpen van de mogelijke rol van microbiële metabolieten in de gezondheid van zowel honden als mensen, evenals verschillende ziektetoestanden. Het protocol dat wordt gebruikt voor Gut-on-a-Chip bij honden is reproduceerbaar, waardoor het een geschikt experimenteel model is voor vergelijkende geneeskunde, aangezien deze benadering onderzoek mogelijk maakt naar interacties tussen gastheer en microbioom, pathogene infecties en op probiotica gebaseerde therapeutische effecten bij zowel honden als mensen.
Protocol
De studie werd goedgekeurd en uitgevoerd in overeenstemming met het Institutional Animal Care and Use Committee van de Washington State University (ASAF# 6993). In dit protocol hebben we gebruik gemaakt van een gerenommeerd Gut-on-a-Chip microfluïdisch apparaat gemaakt van PDMS datin eigen huis is gefabriceerd 2 (Figuur 1D). Gedetailleerde methoden voor de fabricage van het Gut-on-a-Chip-microdevice zijn te vinden in eerdere rapporten 2,24. Dit protocol demonstreert een unieke integratie van darmorganoïden en een microfluïdisch systeem (Figuur 2).
1. Oppervlakteactivering van een Gut-on-a-Chip gemaakt van PDMS
- Bereid 1% polyethyleenimine (PEI)-oplossing door 1 ml 50% PEI-oplossing toe te voegen aan 49 ml gedestilleerd (DI) water in een conische buis van 50 ml. Keer de buis twee tot drie keer om om de oplossing goed te mengen en filter de oplossing vervolgens met een spuitfilter van 0,2 μm.
NOTITIE: Bewaar het bij 4 °C. - Bereid 0,1% glutaaraldehyde (GA)-oplossing door 100 μL 50% GA-oplossing toe te voegen aan 49,9 ml DI in een conische buis van 50 ml. Keer de buis twee tot drie keer om om de oplossing goed te mengen en filter de oplossing vervolgens met een spuitfilter van 0,2 μm.
NOTITIE: Bewaar het bij 4 °C en zorg ervoor dat u het beschermt tegen blootstelling aan direct licht. - Plaats het Gut-on-a-Chip-apparaat in een droge oven op 60 °C en incubeer het gedurende minimaal 30 minuten om eventueel achtergebleven vocht te verwijderen.
- Stel het Gut-on-a-Chip-apparaat gedurende 60 minuten bloot aan UV- en ozonbehandeling met behulp van een UV/ozongenerator.
NOTITIE: Om een optimale activering van de PDMS-oppervlakken tijdens de behandeling te garanderen, moet u een afstand van ongeveer 3 cm of minder aanhouden tussen de UV-lamp en het apparaat. Voorkom overbevolking van apparaten in de generator om een efficiënte oppervlakteactivering te bereiken. - Zet de inlaat-, bypass- en uitlaatslang van het bovenste microkanaal vast met behulp van bindclips om ze vast te klemmen. Klem ook de inlaatslang voor het onderste microkanaal vast.
- Koppel de uitlaatslang voor het onderste microkanaal los. Zorg ervoor dat de bypass-slang van het onderste microkanaal open blijft.
- Breng met behulp van een P100-micropipet 100 μL van een 1% PEI-oplossing door het uitlaatgat van het onderste microkanaal.
NOTITIE: Het wordt aanbevolen om dit proces uit te voeren terwijl het apparaat nog warm is door blootstelling aan UV/ozon. Observeer de PEI-oplossing die door het microkanaal stroomt en de PEI-oplossing valt om uit de bypass-slang voor het onderste microkanaal te komen. - Sluit de uitlaatslang voor het onderste microkanaal weer aan.
- Zet de inlaat-, bypass- en uitlaatslang van het onderste microkanaal vast met behulp van bindclips om ze vast te klemmen. Klem ook de inlaatslang voor het bovenste microkanaal vast.
- Koppel de uitlaatslang voor het bovenste microkanaal los. Zorg ervoor dat de bypass-slang van het bovenste microkanaal open blijft.
- Breng met behulp van een P100-micropipet 100 μL van een 1% PEI-oplossing door het uitlaatgat van het bovenste microkanaal.
NOTITIE: Observeer de PEI-oplossing die door het microkanaal stroomt en de PEI-oplossing valt om uit de bypass-slang voor het bovenste microkanaal te komen. - Sluit de uitlaatslang van het bovenste microkanaal weer aan.
- Zodra zowel de bovenste als de onderste microkanalen zijn gevuld met 1% PEI-oplossing, laat u het apparaat gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur (RT) incuberen.
- Voer stap 1.5-1.12 uit met een 0,1% GA-oplossing.
- Zodra zowel de bovenste als de onderste microkanalen zijn gevuld met 0.1% GA-oplossing, laat u het apparaat gedurende 20 minuten bij RT incuberen.
- Voer stap 1.5-1.12 uit met gedistilleerd water om overtollige oppervlakteactiveringsoplossing te verwijderen.
- Plaats de chip in een droge oven op 60 °C en laat hem een nacht drogen.
NOTITIE: Zorg ervoor dat u de bindklemmen van alle slangen verwijdert om te voorkomen dat de slang in botsing komt. Dit droogproces is van cruciaal belang voor de gelijkmatige oppervlakteactivering van het microkanaal in de Gut-on-a-Chip12.
2. Extracellulaire matrix (ECM) coating en kweekmediumvoorbereiding voor Gut-on-a-Chip-cultuur
- Bereid een ECM-mengsel met organoïde basaal medium zodat de uiteindelijke concentratie collageen I en matrigel respectievelijk 60 μg/ml en 2 % (vol/vol) is.
OPMERKING: Bereid 50 μL ECM-mengsel per darmchip (d.w.z. 20 μL ECM-mengsel voor elk bovenste en onderste microkanaal en 10 μL extra). Bereid dit op de dag van gebruik en bewaar deze oplossing bij 4 °C of leg het op ijs tot het klaar is voor gebruik. - Haal de Gut-on-a-Chip die is behandeld met UV/Ozon, PEI en GA uit de droge oven.
NOTITIE: Inspecteer onder een fasecontrastmicroscoop om te zien of er restvocht is. - Laat de Gut-on-a-Chip 10 minuten afkoelen in een bioveiligheidskast.
- Zet de inlaat-, bypass- en uitlaatslang van het bovenste microkanaal vast met behulp van bindclips om ze vast te klemmen. Klem ook de inlaatslang voor het onderste microkanaal vast.
- Koppel de uitlaatslang voor het onderste microkanaal los.
- Breng met behulp van een P100-micropipet 20 μL ECM-mengsel in via het uitlaatgat van het onderste microkanaal.
NOTITIE: Observeer het ECM-mengsel dat door het microkanaal stroomt zonder dat er luchtbellen in de lucht komen. Als er een luchtbel aanwezig is, breng dan extra ECM-mengsel in het onderste microkanaal totdat de bel verdwenen is. - Sluit de uitlaatslang voor het onderste microkanaal weer aan.
- Zet de inlaat-, bypass- en uitlaatslang van het onderste microkanaal vast met behulp van bindclips om ze vast te klemmen. Klem ook de inlaatslang voor het bovenste microkanaal vast.
- Koppel de uitlaatslang voor het bovenste microkanaal los.
- Breng met behulp van een P100-micropipet 20 μL ECM-mengsel door het uitlaatgat van het bovenste microkanaal.
- Sluit de uitlaatslang voor het bovenste microkanaal weer aan.
- Plaats de chip gedurende 1 uur in een bevochtigde CO 2 -incubator met 5% CO2 bij 37 °C om de ECM-laag te vormen op het PDMS-membraan dat is behandeld met PEI en GA (Figuur 3A).
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle slangen tijdens de incubatie zijn vastgeklemd. - Bereid tijdens de incubatie van de ECM-coating twee spuiten van 1 ml voor met koud zaaimedium, het organoïdekweekmedium zonder A8301 maar met 10 μM Y-27632 en 2,5 μM CHIR99021, zoals eerder gerapporteerd in Gut-on-a-Chip afgeleid van menselijke organoïden2.
OPMERKING: A8301 werd uit het medium verwijderd om de hechting van cellen aan de gecoate ECM te verbeteren, zoals eerder gemeld2. Dag 0 van de Gut-on-a-Chip-cultuur vereist alleen de bovenste microkanaalstroom. Maak daarom een volle spuit klaar voor het bovenste kanaal en minimaal 0,2 ml voor het onderste kanaal. - Zodra de ECM-coating is voltooid, haalt u de chip uit de incubator en laat u de klem los op de bypass-slang die is aangesloten op het onderste microkanaal.
- Sluit een spuit van 1 ml gevuld met zaaimedium aan op de naald met stompe uiteinde die is gekoppeld aan het onderste microkanaal van de Gut-on-a-Chip. Breng het zaaimedium (~50 μL) voorzichtig aan in de bypass-slang. Zodra de slang is gevuld met het ingebrachte medium, zet u de bypass-slang vast die is aangesloten op het onderste microkanaal met een bindclip.
- Maak de klem los van de uitlaatslang die is aangesloten op het onderste microkanaal. Breng het zaaimedium voorzichtig in het onderste microkanaal in, zodat het soepel door het systeem kan stromen. Zet de uitlaatslang die is aangesloten op het onderste microkanaal na perfusie vast met een bindclip.
- Open vervolgens de bypass-slang die is aangesloten op het bovenste microkanaal.
- Sluit een spuit van 1 ml gevuld met zaaimedium aan op de naald met stompe uiteinde die is gekoppeld aan het bovenste microkanaal van de Gut-on-a-Chip. Breng het zaaimedium (~50 μL) voorzichtig aan in de bypass-slang. Zodra de slang is gevuld met het ingebrachte medium, zet u de bypass-slang vast die is aangesloten op het bovenste microkanaal met een bindclip.
- Maak de uitlaatslang los die is aangesloten op het onderste microkanaal. Breng het zaaimedium voorzichtig in het bovenste microkanaal zodat het soepel door het systeem kan stromen. Zet de uitlaatslang die is aangesloten op het bovenste microkanaal na perfusie vast met een bindclip.
3. Voorbereiding van organoïdecellen bij honden voor zaaien
OPMERKING: Om het Gut-on-a-Chip-model te genereren, werden in dit protocol organoïden van de dikke darm van honden (colonoïden genoemd) gebruikt die zijn afgeleid van honden van IBD-patiënten. Deze colonoïden werden afgeleid van drie tot vijf kleine fragmenten van gebiopteerd darmweefsel, volgens een eerder gerapporteerde methode15,18. Voor optimale resultaten is het van cruciaal belang om hondencolonoïden te gebruiken die minimaal drie kweekpassages hebben ondergaan om stabiele organoïden te creëren die geschikt zijn voor in vitro toepassingen. Het wordt aanbevolen om de colonoïden van honden gedurende een duur van ten minste 3-4 dagen te kweken om adequate differentiatie van cellen met meerdere afstammingslijnen in de organoïden te vergemakkelijken, waardoor hun functionele rijpheid en geschiktheid voor volgende experimenten in het Gut-on-a-Chip-model wordt gegarandeerd. De maximale limiet van de passage voor dit werk is minder dan 20, zoals aangegeven door een eerdere studie die het ongewijzigde fenotype en karyotype aantoonde gedurende 20 opeenvolgende passages25. De signalering van deze donoren is weergegeven in aanvullende tabel S1.
- Kweek de hondencolonoïden in platen met 24 putjes ingebed in 30 μL Matrigel 15,18 met organoïdekweekmedium vermeld in de materiaaltabel, dat is gewijzigd ten opzichte van eerder gerapporteerd medium 15,26,27. Het geconditioneerde medium werd verkregen door het kweken van Rspo1-cellen en HEK293-cellen die zijn ontworpen om Noggin28 af te scheiden.
- Gooi het organoïdekweekmedium weg door middel van vacuümzuiging en breng 500 μL Cell Recovery Solution bij een ijskoude temperatuur in elk putje. Incubeer gedurende 30 minuten bij 4 °C.
OPMERKING: Doorgaans leveren drie putjes uit een plaat met 24 putjes van volwassen darmorganoïden bij honden voldoende gedissocieerde cellen om een enkel Gut-on-a-Chip-apparaat te zaaien met 40-50 organoïden/één gezichtsveld bij een vergroting van x10. - Verstoor de Matrigel-koepels gedurende 5 s mechanisch met behulp van een P1000-micropipet. Verzamel vervolgens de organoïdussuspensie in een conische buis van 15 ml.
- Centrifugeer de conische buis bij 200 × g en 4 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door het verwijderen van het supernatant.
- Breng 1 ml trypsine-achtig protease toe bij kamertemperatuur, aangevuld met 10 μM Y-27632, en resuspendeer de celpellet door te pipetteren met behulp van een P1000-micropipet.
- Plaats de celsuspensie in een waterbad van 37 °C en incubeer het gedurende 10 minuten terwijl u het mengsel regelmatig schudt.
- Breng 5 ml warm organoïde basaal medium in en pipetteer de celsuspensie krachtig met een P1000-micropipet totdat deze troebel wordt, zonder zichtbare celklonten.
- Haal de celsuspensie door een celzeef met een afsnijding van 70 μm om Matrigel-resten en grote celclusters te verwijderen.
- Centrifugeer de conische buis bij 200 × g en 4 °C gedurende 5 minuten, gevolgd door resuspensie van de pellet in zaaimedium. Gebruik voor het zaaien van één Gut-on-a-Chip-apparaat 20 μL zaaimedium om de celpellet te resuspenderen (d.w.z. gebruik 20 μL zaaimedium bij het zaaien van één Gut-on-a-Chip-apparaat).
- Wijzig de concentratie van levensvatbare cellen naar 1 × 107 cellen/ml met zaaimedium zoals eerder gerapporteerd2. Voer een levensvatbaarheidsbeoordeling uit met behulp van een hemocytometer door 10 μL van de celsuspensie te combineren met 10 μL Trypanblauw en observeer vervolgens de cellen onder een microscoop.
OPMERKING: Het is van cruciaal belang om de celconcentratie op de juiste manier aan te passen om een optimale celhechting en de vorming van een uniforme monolaag op het chipmembraan te garanderen. Als het aanvankelijke aantal cellen onvoldoende is, kan dit leiden tot een vertraagde of mislukte vorming van een confluente monolaag. Omgekeerd, als het aantal cellen te groot is, kunnen niet-hechtende cellen zich samenvoegen tot klonten in het kanaal, wat leidt tot ongewenste concentratie-effecten.
4. Zaaien en vormen van een 2D-celmonolaag
- Koppel de uitlaatslang voor het bovenste microkanaal los. Zorg ervoor dat de bypass-slang van het bovenste microkanaal open blijft. Zet zowel de inlaat als de uitlaat van het onderste microkanaal vast met behulp van bindclips om ze vast te klemmen.
- Breng met behulp van een P100- of P20-micropipet 20 μl van de celsuspensie uit Protocol 3 in het uitlaatgat van het bovenste microkanaal (Figuur 3B Zaaien).
- Zet de bypass en inlaatslang van het bovenste microkanaal vast met behulp van bindclips om het vast te klemmen. Bevestig vervolgens de uitlaatslang weer aan het uitlaatgat van het bovenste microkanaal en zorg ervoor dat de slang gedurende het hele proces open blijft om te voorkomen dat er druk wordt uitgeoefend op het bovenste microkanaal. Zet na deze stap de uitlaatslang van het bovenste kanaal langzaam vast met een bindclip om deze vast te klemmen.
- Controleer met een microscoop of de cellen gelijkmatig over het bovenste microkanaal zijn verdeeld.
NOTITIE: Het is belangrijk om de slang vast te klemmen om de beweging van het medium in het kanaal te stoppen om stabiele statische omstandigheden mogelijk te maken totdat de gewenste celbevestiging is bereikt. - Plaats de chip in een bevochtigde CO2 -incubator bij 37 °C.
NOTITIE: Het duurt ongeveer 3 uur voordat de darmorganoïdecellen van honden zich aan de ECM-coating hechten (Afbeelding 3B Bijlage). - Sluit de spuit die is bevestigd aan het bovenste microkanaal van de Gut-on-a-Chip aan op een spuitpomp die in een CO2 -incubator is geplaatst.
OPMERKING: Spoel het medium voorzichtig in het microkanaal met behulp van de knop van de spuitpomp en verwijder ongebonden cellen. Onderzoek de chip onder een microscoop om er zeker van te zijn dat eventuele losse cellen effectief zijn weggespoeld. - Start de stroom van kweekmedium bij 30 μL/h met zaaimedium. Deze continue stroom is in eerste instantie alleen voor het bovenste microkanaal tot de 2D-monolaagvestiging op een Gut-on-a-Chip. Laat voor het onderste microkanaal de microkanalen vastgeklemd en het medium niet doorgespoeld.
- Verander vanaf de dag nadat de cellen zijn gezaaid het kweekmedium in organoïde kweekmedium, dat A8301 bevat en 10 μM Y-27632 en 2,5 μM CHIR99021 mist, van het zaaimedium.
- Zodra de monolaag tot stand is gebracht, start u ook de continue mediumstroom naar het onderste microkanaal. Het duurt meestal 2 tot 3 dagen voordat organoïde epitheelcellen van de darm van honden epitheliale monolagen hebben gevormd (Figuur 3C).
5. Vaststelling van 3D-morfogenese bij honden Gut-on-a-Chip
OPMERKING: Nadat de confluente monolagen zijn gevormd in Gut-on-a-Chip, werden de gemiddelde stroom van zowel het bovenste kanaal als het onderste kanaal en de celstam geïntroduceerd om 3D-morfogenese naar 2D-monolaag te initiëren, zoals weergegeven in figuur 2.
- Introduceer het organoïde kweekmedium in zowel de bovenste als de onderste microkanalen om de ontwikkeling van 3D-morfogenese in een Gut-on-a-Chip-systeem te initiëren. Om een schuifspanning van 0,02 dyne/cm2 te bereiken in het bestaande Gut-on-a-Chip-ontwerp (d.w.z. een microkanaal met een hoogte van 500 μm), verhoogt u het debiet tot 50 μL/h29.
- Start 10% van de celspanning en 0,15 Hz frequentie, zoals aanbevolen vóór2, met behulp van een computergestuurde bioreactor die cyclische rek toepast op cellen die in vitro zijn gekweekt. Dit proces zou vacuümzuiging toepassen op het Gut-on-a-Chip-apparaat.
- Houd deze kweekomstandigheden minimaal 2 tot 3 dagen aan. De 3D-morfogenese van de darmmonolaag van de hond vindt meestal plaats 2 tot 3 dagen nadat de Duralkanaalstroom en vacuümafzuiging zijn gestart (Figuur 3C).
6. Karakterisering van Gut-on-a-Chip bij honden
- Beeldvorming van levende cellen
- Verwijder eventuele luchtbellen in de Gut-on-a-Chip door het medium voorzichtig te laten stromen met behulp van de spuitpomp.
- Koppel het Gut-on-a-Chip-apparaat los van de spuitpomp.
NOTITIE: Vermijd elke manoeuvre die druk kan uitoefenen in de Gut-on-a-Chip. - Plaats het apparaat op een microscoop om beelden van het gevestigde 3D-epitheel vast te leggen. Voor het visualiseren van de structuur van de 3D-epitheellagen met behulp van fasecontrast, gebruikt u 10x en 20x objectieven (Figuur 3C).
- Immunofluorescentie kleuring
- Bereid de blokkeringsoplossing voor door 1 g BSA op te lossen in 50 ml fosfaatbufferzoutoplossing (PBS) om 2% BSA te maken. Haal de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm voor filtratie. Bewaar deze oplossing bij 4 °C.
- Bereid de permeabiliserende oplossing door 150 μL Triton X-100 te combineren met 50 ml blokkeringsoplossing, wat resulteert in een uiteindelijke concentratie van 0,3% Triton X-100. Haal de oplossing door een spuitfilter van 0,2 μm voor filtratie. Bewaar deze oplossing bij 4 °C.
- Voer fixatie van de cellen uit door 100 μL van een 4% PFA in zowel de bovenste als de onderste microkanalen te injecteren, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
- Spoel de cellen door 100 μL PBS in zowel de bovenste als de onderste microkanalen te injecteren, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
- Voer permeabilisatie van de cellen uit door 100 μL 0,3% Triton in zowel de bovenste als de onderste microkanalen te injecteren, zoals beschreven in stap 2.4-2.11. Zet het apparaat 30 minuten op RT.
- Spoel de cellen door 100 μL PBS in zowel de bovenste als de onderste microkanalen te injecteren, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
- Voer blokkering van de cellen uit om niet-specifieke binding te voorkomen door 100 μL 2% BSA te injecteren in zowel de bovenste als de onderste microkanalen zoals beschreven in stap 2.4-2.11. Plaats het apparaat gedurende 1 uur op RT.
- Injecteer 20 μl van de primaire antilichaamoplossing verdund met 2% BSA en breng deze gedurende 3 uur bij RT, gevolgd door een nachtelijke incubatie bij 4 °C.
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle slangen tijdens de incubatie bij 4 °C gedurende een nacht zijn vastgeklemd. De concentratie van een primair antilichaam moet 2-5 keer hoger zijn dan de aanbevolen concentratie voor monolaag- of 3D-organoïdekleuring (aanvullende figuur S1). - Spoel de cellen door 100 μL PBS te injecteren in zowel de bovenste als de onderste microkanalen, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
- Injecteer 20 μl van de secundaire antilichaamoplossing verdund in 2% BSA en plaats deze gedurende 1 uur op RT.
NOTITIE: Zorg ervoor dat alle slangen tijdens de incubatie zijn vastgeklemd. Vanaf deze stap is het noodzakelijk om de opstelling van het apparaat af te schermen met aluminiumfolie om fotobleken te voorkomen. - Spoel de cellen door 100 μL PBS te injecteren in zowel de bovenste als de onderste microkanalen, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
- Bereid een gecombineerde oplossing voor het tegengaan van F-actine en DAPI (diamidino-2-fenylindolie). Injecteer 20 μl van de gecombineerde oplossing in zowel de bovenste als de onderste microkanalen zoals beschreven in de stappen 2.4-2.11.
- Spoel de cellen door 100 μL PBS in zowel de bovenste als de onderste microkanalen te injecteren, zoals beschreven in stap 2.4-2.11.
Voer fluorescentiebeeldvorming uit van de architectuur van de 3D-epitheelcellen met behulp van een fluorescentiemicroscoop of een confocale microscoop.
7. Epitheliale barrièrefunctie
- Verwijder eventuele luchtbellen in de Gut-on-a-Chip door het medium voorzichtig te laten stromen met behulp van de spuitpomp. Zorg ervoor dat alle slangen open zijn tijdens de meting.
- Verwijder de Gut-on-a-Chip uit de spuitpomp en plaats deze minimaal 10 minuten op RT.
- Verwijder Ag/AgCl-elektroden uit 70% EtOH-oplossing.
- Plaats twee Ag/AgCl-elektroden in respectievelijk de bovenste inlaat en de onderste uitlaat om de weerstand van de epitheellaag te meten met behulp van een multimeter.
- Plaats twee Ag/AgCl-elektroden in respectievelijk de onderste inlaat en de bovenste uitlaat. Rapporteer het gemiddelde van deze twee waarden als weerstandswaarde voor de Gut-on-a-Chip.
NOTITIE: De blanco TEER moet worden gemeten op een Gut-on-a-Chip met alleen ECM-coating zonder het epitheel. - De waarde van de transepitheliale elektrische weerstand (TEER) (kΩ ×cm2) kan worden berekend met behulp van vergelijking (1).
TEER = (Ωt - Ωblanco) × A (1)
Waarbij Ωt een weerstandswaarde is die is gemeten op het specifieke tijdstip sinds het begin van het experiment, Ωblanco een weerstandswaarde is die op dat moment is gemeten zonder het epitheel, en A het gebied van het oppervlak dat bedekt is met een cellaag (ongeveer 0,11cm2 voor dit Gut-on-a-Chip-ontwerp29).- Bereken de genormaliseerde TEER met behulp van vergelijking (2).
TEER =
(2)
Waarbij Ω0 een weerstandswaarde is op het eerste afleestijdstip van het experiment, zoals eerder gerapporteerd30 (figuur 4C).
- Bereken de genormaliseerde TEER met behulp van vergelijking (2).
(2)Representative Results
Dit protocol faciliteert op betrouwbare wijze de spontane ontwikkeling van 3D-darmmorfogenese in een Gut-on-a-Chip-systeem. Deze benadering maakt gebruik van darmepitheelcellen bij honden die zijn verkregen uit darmorganoïden die zijn afgeleid van honden met inflammatoire darmaandoeningen (IBD) (Figuur 1B). Incidentele clustering van 3D-morfogenese van darmepitheelcellen bij honden kan worden waargenomen in het hele microkanaal na 6-9 dagen mediumstroom (Figuur 3C). Deze morfologische veranderingen kunnen worden gemonitord met behulp van fasecontrasttechnieken. In deze studie gebruikten we organoïden afkomstig van twee honden met de diagnose IBD. Met name werd succesvolle 3D-morfogenese waargenomen in twee biologische replicaten, die elk werden uitgevoerd met twee technische replicaten. De bevindingen van deze studie vormen een basis voor toekomstig onderzoek met darmorganoïden afkomstig van andere hondendonoren. Deze resultaten tonen de potentiële toepasbaarheid en herhaalbaarheid aan van onze experimentele aanpak, die eerder is gerapporteerd in menselijke monsters. Deze bevindingen bieden een verdere bevestiging dat Gut-on-a-Chip-technologie van toepassing is op darmepitheelcellen bij honden, zoals eerder gerapporteerd met de onderzoeken waarbij menselijke darmepitheelcellen werden gebruikt.
Dit protocol toonde aan dat immunofluorescentiekleuring kan worden gebruikt om de 3D-structuur te evalueren van organoïde-afgeleide monolagen die villusachtige structuren hebben gevormd in microfluïdische chips met behulp van conventionele fluorescentiemicroscopie (Figuur 4 A,B). Dit protocol kan worden aangepast om de gedifferentieerde en ruimtelijk georganiseerde cellulaire fenotypes te valideren door middel van immunofluorescentiekleuring. De visualisatie van een 3D-morfogenese in een Gut-on-a-Chip biedt een uitstekende gelegenheid om de reactie van de gastheer tijdens verschillende pathologische interacties te onderzoeken 14,23,31. In combinatie met epitheelcellen afkomstig van patiëntdonoren, zoals eerder beschreven bij mensen, kan deze technologie worden gebruikt om gepersonaliseerde modellen vandarmziekten te construeren. Door de integratie van immunofluorescentiebeeldvorming met gerichte RNA-visualisatietechnieken zoals fluorescentie in situ hybridisatie, kan het haalbaar zijn om de transcriptomen en proteomen van de gastheer visueel te analyseren binnen een Gut-on-a-Chip-systeem.
Het behoud van de integriteit van het darmmembraan is van vitaal belang voor het handhaven van de darmhomeostase, en het Gut-on-a-Chip-platform biedt een waardevol voordeel door nauwkeurige monitoring en kwantificering van deze cruciale functie mogelijk te maken. Het meten van TEER met behulp van de Gut-on-a-Chip-technologie biedt verschillende voordelen. Eerdere studies hebben TEER bijvoorbeeld met succes geëvalueerd tijdens het co-kweken van darmcellen met niet-pathogene en probiotische bacteriën32, evenals onder lekkende darmomstandigheden23. Dit stelt onderzoekers in staat om de impact van verschillende aandoeningen op de darmbarrièrefunctie te bestuderen en mogelijke interventies te identificeren om de darmgezondheid te bevorderen.
Figuur 1: Vaststelling van patiënt-afgeleide canine IBD Gut-on-a-Chip. (A) Integratie van de patiënt-afgeleide darmorganoïden en het Gut-on-a-Chip platform. Endoscopiebiopsie kan worden uitgevoerd om intestinale cryptecellen te isoleren om donorspecifieke darmorganoïden te ontwikkelen. Epitheelcellen kunnen worden gedissocieerd in afzonderlijke cellen van de organoïden, vervolgens worden gezaaid in een PDMS-gebaseerde Gut-on-a-Chip en gekweekt in een unieke dynamische micro-omgeving. (B) Representatieve afbeeldingen van colonoïden van een IBD-hond. Schaalbalk = 100 μm. (C) Dit schema illustreert een Gut-on-a-Chip-apparaat dat bestaat uit een poreus membraan dat tussen de bovenste en onderste microkanalen is geplaatst. Het bovenste microkanaal wordt aangegeven door het blauwe gebied, terwijl het onderste microkanaal wordt aangegeven door het rode gebied. Aan weerszijden van het microkanaal zijn vacuümkamers aanwezig, die het poreuze membraan vervormen om peristaltische beweging na te bootsen24. (D) Een opstelling van Gut-on-a-Chip voor honden omvat een op PDMS gebaseerde Gut-on-a-Chip die is geassembleerd met slangen die op een afdekglaasje 2,24 worden geplaatst. De bypass-slang is van cruciaal belang om te voorkomen dat er druk wordt opgebouwd in het microkanaal tijdens het hanteren (d.w.z. aansluiten op spuiten). Binderclips worden gebruikt om de slang vast te klemmen. Volumegevoelige materialen kunnen worden toegediend via de open gaten van de bovenste of onderste uitlaat. Organoïde-kweekmedium kan worden toegediend door de spuiten aan te sluiten op de naalden met stomp uiteinde en de stroom door de bovenste en onderste inlaat. Afkortingen: IBD = inflammatoire darmziekte; PDMS = polydimethylsiloxaan. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vorming van villusachtige structuren bij IBD bij honden Gut-on-a-Chip. De gedissocieerde epitheelcellen werden gezaaid in een ECM-gecoate Gut-on-a-Chip. Nadat de gedissocieerde cellen aan het PDMS-membraan waren bevestigd, werd gedurende 3 dagen een apicale stroom geïnitieerd (D0-D3). Wanneer een confluente 2D-monolaag wordt gevormd (D3), wordt een basolaterale stroom met frequente rek geïnitieerd (Stretching, AP en BL Flow). Na 2-3 dagen van dubbele stroming en membraanrek begint de 2D-monolaag 3D-morfogenese te ontwikkelen en worden villusachtige structuren gevormd na 9 dagen kweken (3D-morfogenese, D9-D12). Afkortingen: ECM = extracellulaire matrix; PDMS = polydimethylsiloxaan; AP = apicaal; BL = basolateraal. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Intestinale organoïde-seeding bij honden en 3D-morfogenese in een Gut-on-a-Chip. (A) De experimentele stappen voor de oppervlakteactivering van een poreus membraan in een PDMS-gebaseerde Gut-on-a-Chip. Het gebruik van UV/ozonbehandeling, PEI en GA-behandeling in combinatie vergemakkelijkt de verknoping van aminen die aanwezig zijn in ECM-oplossingen. Dit proces leidt tot de stabiele immobilisatie van ECM-eiwitten op het poreuze membraan. (B) De fasecontrastbeelden tonen de morfologieën van cellen onmiddellijk na het zaaien (links) en 3-5 uur na het zaaien (rechts). Het poreuze membraan vertoont na 3 uur zaaien dunnere en donkerdere gebieden waar enkele cellen zich hebben gehecht, wat het hechtingsproces benadrukt. (C) De fasecontrastbeelden tonen de 3D-morfogenese van intestinale monolagen binnen een Gut-on-a-Chip-systeem. Deze monolagen waren afkomstig van honden met IBD en deze organoïde cellen werden gedurende een periode van 12 dagen gekweekt onder dynamische omstandigheden, waarbij vloeistofstroom en strekkende bewegingen betrokken waren. Schaalbalken = 50 μm (B,C). Afkortingen: IBD = inflammatoire darmziekte; ECM = extracellulaire matrix; PDMS = polydimethylsiloxaan; PEI = polyethyleenimine; GA = glutaaraldehyde. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Evaluatie van de 3D-morfologische ontwikkeling in Gut-on-a-Chip bij patiënten bij honden. (A) Immunofluorescentiebeeldvorming van een IBD bij honden Gut-on-a-Chip, met een top-down weergave van een volledig ontwikkeld 3D-epitheel na 12 dagen kweek, dat wordt geëvalueerd door een fluorescentiemicroscoop. Het tight junction eiwit (ZO-1) wordt in geel gevisualiseerd; het borstelrandmembraan (F-actine) wordt rood weergegeven; en de kernen zijn gekleurd met DAPI en zien er blauw uit. (B) Immunofluorescentiebeeldvorming van een IBD bij honden Gut-on-a-Chip met behulp van een confocale microscoop met een langeafstandslens. Zoals weergegeven in het schema, wordt een fluorescerend beeld getoond van een dwarsdoorsnede van een villusachtige structuur van een volledig ontwikkeld 3D-epitheel na 12 dagen kweek. Bovendien toont Z-stacking een zijaanzicht van het 3D-epitheel, dat de vorming van villusachtige structuren laat zien. Het borstelrandmembraan (F-actine) wordt rood weergegeven en de kernen zijn gekleurd met DAPI en zien er blauw uit. (C) De intestinale barrièrefunctie werd geëvalueerd en gemeten door TEER in van patiënten afkomstige Gut-on-a-Chips bij honden. Stabiele TEER-waarden werden bereikt op dag 5 van de kweek op Gut-on-a-Chip. Foutbalken drukken de SEM van de metingen uit. De TEER-waarde werd gemeten bij twee biologische replicaten met één technische replicaat. Schaalbalken = 50 μm (A), 25 μm (B). Afkortingen: IBD = inflammatoire darmziekte; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylinderol; TEER = transepitheliale elektrische weerstand. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur S1: Karakterisering van anti-ZO-1 polyklonaal antilichaam in van de colonoïde afgeleide monolagen van honden en op Gut-on-a-Chip-apparaten. (A) Immunofluorescentiekleuring van ZO-1 in geel met F-actine in rood en hun overlaybeeld. Schaalbalk = 25 μm. (B) Immunofluorescentievisualisatie van ZO-1 in geel in 'Leaky Gut Chips' werd uitgevoerd onder verschillende omstandigheden, waaronder stimulatie met probiotische bacteriën (LGG + Cytokines of VSL#3 + Cytokines) en kiemvrije controles zonder probiotische stimulatie (Cytokines). Schaalbalk = 50 μm. Deze figuur is overgenomen uit Min et al.23. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende tabel S1: Een samenvatting van de informatie over weefseldonoren. Een overzichtstabel van de leeftijd, het geslacht, het ras, de histopathologische evaluatie en de score van de Canine IBD activity index (CIBDAI). De CIBDAI is een numeriek scoresysteem dat wordt gebruikt om de klinische ernst af te leiden bij IBDbij honden 33. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Deze studie markeert de baanbrekende demonstratie van de compatibiliteit van darmorganoïden bij honden met de ontwikkeling van een IBD Gut-on-a-Chip-model voor honden. De integratie van darmorganoïden en van organoïden afgeleide monolaagculturen in een microfluïdisch systeem (d.w.z. Gut-on-a-Chip-systeem) heeft de technologie verder ontwikkeld, waardoor in-vitro-darmmodellen kunnen worden gemaakt die de fysiologische dynamiek nauw nabootsen en meer representatief zijn voor biologische omstandigheden. In het bijzonder, aangezien er zeer weinig meldingen zijn van Gut-on-a-Chip-cultuur met behulp van IBD-afgeleide organoïden bij mensen, kan de huidige studie met behulp van IBD-afgeleide Gut-on-a-Chip bij honden toonaangevende inzichten verschaffen in de studie van IBD bij mensen.
De succesvolle ontwikkeling van intestinale epitheliale 3D-morfogenese bij honden op een Gut-on-a-Chip vereist zorgvuldige aandacht voor verschillende kritieke stappen. Ten eerste kan het hydrofobe oppervlak van PDMS-microfluïdische kanalen de ECM-adhesie en de daaropvolgende celhechting belemmeren, waardoor oppervlakteactivering van PDMS nodig is voorafgaand aan ECM-coating en celseeding (zie protocolsectie 1). Om een stabiele monolaagcultuur te bereiken, is het verwijderen van overtollige ongebonden cellen na celhechting cruciaal (protocolstappen 4.6-4.7). Bovendien is dynamische stimulatie, zoals constante mediumstroom en peristaltische vacuümbeweging, noodzakelijk voor 3D-morfogenese van het darmepitheel (protocolstap 5.2). Zorgvuldige behandeling is essentieel om luchtbellen in het microkanaal te voorkomen tijdens alle stappen van de Gut-on-a-Chip-cultuur.
Als u een slechte celuitzaaiing in de Gut-on-a-Chip tegenkomt, kan dit te wijten zijn aan een laag celaantal of een slechte celhechting. Om problemen met lage celaantallen op te lossen, is het belangrijk om de gezondheid van geprepareerde darmorganoïden te inspecteren door hun groei in Matrigel te observeren. De levensvatbaarheid van de cellen kan worden beoordeeld door Trypan-blauwe kleuring na celdissociatie om ervoor te zorgen dat niet meer dan 20% van de cellen dood is. Als het aantal levensvatbare cellen onvoldoende is, kan worden geprobeerd de omstandigheden van het organoïdemedium te optimaliseren. Een andere mogelijkheid is onvolledige dissociatie van organoïden, wat resulteert in een overmaat aan celklonten groter dan 70 μm die door het filter worden opgesloten. Om dit op te lossen, is een optie om de duur van het pipetteren tijdens celdissociatie te verlengen. Als alternatief kan de conische buis van 15 ml elke minuut zachtjes worden geschud terwijl hij wordt behandeld met een trypsine-achtige protease. Een slechte celhechting aan de Gut-on-a-Chip kan te wijten zijn aan een onjuiste ECM-coating. Tijdens het coatingproces wordt geadviseerd om zorgvuldig te controleren op de aanwezigheid van luchtbellen en de vorming ervan te voorkomen door indien nodig voorzichtig meer coatingoplossing toe te voegen. Overbevolking van cellen en het niet wegspoelen van niet-aangehechte cellen kan leiden tot een onvoldoende initiële monolaag. In zo'n geval kan een lichte puls worden toegepast bij het indrukken van de zuiger van de spuit. Deze stappen voor probleemoplossing kunnen helpen bij het identificeren en aanpakken van problemen tijdens het Gut-on-a-Chip-kweekproces.
Hoewel dit Gut-on-a-Chip-platform het mogelijk maakt om golvende 3D-epitheellagen te creëren, erkennen we de behoefte aan extra biologische complexiteit om de darmmicro-omgeving volledig na te bootsen. Het is van cruciaal belang om rekening te houden met de interacties tussen epitheel- en mesenchymale cellen, de afzetting van ECM voor 3D-regeneratie en de aanwezigheid van cryptvilluskenmerken die een geschikte stamcelniche tot stand brengen. Stromale cellen, zoals fibroblasten, spelen een vitale rol bij de productie van ECM-eiwitten en de regulatie van de morfogenese van de darm34,35,36. De opname van mesenchymale cellen in dit model heeft het potentieel om zowel de morfogenese als de efficiëntie van celhechting te verbeteren. Endotheellagen, die capillaire vasculatuur en lymfevaten omvatten, spelen een cruciale rol bij het regelen van moleculair transport en de rekrutering van immuuncellen37,38. De opname van van patiënten afkomstige immuuncellen zou essentieel kunnen zijn bij het modelleren van darmziekten, omdat het de wisselwerking tussen aangeboren en adaptieve immuniteit mogelijk maakt, evenals het tot stand brengen van weefselspecifieke immuniteit39. Na de voltooiing van 3D-morfogenese op Gut-on-a-Chip kan het organoïdekweekmedium worden gemodificeerd tot een organoïdedifferentiatiemedium. Dit kan een levensvatbare benadering zijn om extra cellulaire differentiatie te induceren, afhankelijk van de experimentele doelstellingen.
Het in beeld brengen van de 3D-microarchitectuur in situ is een uitdaging vanwege de grote werkafstand die nodig is, die kan worden overwonnen met een langeafstandsobjectief. Bovendien maken de laag-voor-laag microfabricage- en hechtingsmethoden het moeilijk om toegang te krijgen tot de bovenste lagen voor onderzoek met SEM. Voor het huidige Gut-on-a-Chip-ontwerp is één spuitpomp per Gut-on-a-Chip-microdevice nodig, wat CO2 -incubatorruimte inneemt en grootschalige experimenten voorkomt. Innovaties zijn nodig om de schaalbaarheid te vergroten voor een gebruiksvriendelijk platform en high-throughput screening.
Deze huidige protocollen maken de spontane ontwikkeling van 3D-epitheellagen in vitro mogelijk, waarbij de beperkingen van traditionele 3D-organoïden, 2D-monolagen en statische kweeksystemen voor microdevices worden overtroffen. Deze dynamische in-vitro-darmmicro-omgeving kan worden gecontroleerd door co-cultuur van verschillende celtypen te introduceren. Eerdere studies hebben methoden onderzocht voor het manipuleren van de Gut-on-a-Chip-micro-omgeving, waaronder het gezamenlijk kweken van darmmicrobioom14,23 en perifere mononucleaire cellen30. Deze gereconstitueerde micro-omgeving heeft tal van potentiële toepassingen, waaronder het testen van geneesmiddelen, fundamentele mechanistische studies en ziektemodellering. De gereconstrueerde micro-omgeving heeft een aanzienlijk potentieel voor een breed scala aan toepassingen, zoals het testen van geneesmiddelen 23,40,41 en ziektemodellering 12,13,14,30, evenals fundamenteel mechanistisch onderzoek naar intestinale morfogenese 42. Een verscheidenheid aan tests kan worden uitgevoerd door ofwel supernatanten te verzamelen voor beoordeling van metabolieten 43, door cellen te verzamelen voor genoomonderzoek 2,32, of door de cellen visueel te onderzoeken met behulp van kleurstoffen van levende cellen of fixatie voor daaropvolgende immunofluorescentiebeeldvorming 23,44.
Deze studie presenteert een reproduceerbaar protocol voor het ontwikkelen van 3D-morfogenese van darmepitheellagen bij honden in een Gut-on-a-Chip-platform. De resulterende 3D-epitheelstructuur biedt een meer realistische weergave van de intestinale micro-omgeving, die een enorm potentieel heeft voor toepassingen in verschillende biomedische studies. Door gebruik te maken van deze darmarchitectuur kunnen we meer translationeel onderzoek doen en mogelijk veelbelovende resultaten opleveren.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflict te melden.
Acknowledgments
We willen de WSU-dienst voor interne geneeskunde voor kleine dieren (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) en WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss bedanken voor hun steun bij het werven van gevallen en het verzamelen van monsters van burgerwetenschappers (patiëntdonoren). Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door het Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 and R21OD031903 to Y.M.A.) en Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 to I.N.). Figuur 1A en Figuur 3A zijn gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid basal medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
| 1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
| 100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
| Organoids and organoid medium | |||
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
| HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
| N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
| R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
| R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
| Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
| [Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
| Reagents | |||
| 4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
| Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
| Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
| Materials and Equipment | |||
| 24-well culture plates | Corning | 3524 | |
| 87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
| DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
| Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
| FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
| Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
| SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
| Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
| Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
| UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
| Software | |||
| LAS X imaging software | Leica microsystems |
References
- Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2 (2009).
- Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
- Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
- German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
- Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
- Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
- Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368 (2016).
- Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F.
- Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
- Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
- Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
- Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
- Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663 (2020).
- Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
- Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
- Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
- Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
- Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
- Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
- Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1 (2014).
- Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300 (2015).
- Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
- Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641 (2022).
- Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
- Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
- Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525 (2022).
- Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
- Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
- Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
- Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
- Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
- Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
- Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
- Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
- Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
- Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
- Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
- Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
- Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13 (2020).
- Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
- Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
- Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
- Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
- Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).
