Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tredimensionel morfogenese hos hunde gut-on-a-chip ved hjælp af tarmorganoider afledt af inflammatoriske tarmsygdomspatienter

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

Integration af tarmorganoider hos hunde og et mikrofluidisk system Gut-on-a-Chip tilbyder relevante translationelle modeller for humane tarmsygdomme. De præsenterede protokoller giver mulighed for 3D-morfogenese og dynamisk in vitro-modellering af tarmen, hvilket hjælper med udviklingen af effektive behandlinger for tarmsygdomme hos hunde og mennesker med One Health.

Abstract

Hundetarme har ligheder i anatomi, mikrobiologi og fysiologi med menneskers, og hunde udvikler naturligt spontane tarmlidelser svarende til mennesker. At overvinde den iboende begrænsning af tredimensionale (3D) organoider i adgangen til den apikale overflade af tarmepitelet har ført til dannelsen af todimensionale (2D) monolagskulturer, som udsætter den tilgængelige luminale overflade ved hjælp af celler afledt af organoiderne. Integrationen af disse organoider og organoidafledte enkeltlagskulturer i et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system har videreudviklet teknologien, hvilket giver mulighed for udvikling af mere fysiologisk relevante dynamiske in vitro-tarmmodeller .

I denne undersøgelse præsenterer vi en protokol til generering af 3D-morfogenese af hundens tarmepitel ved hjælp af primære tarmvævsprøver opnået fra hunde, der er ramt af inflammatorisk tarmsygdom (IBD). Vi skitserer også en protokol til generering og vedligeholdelse af 2D-monolagskulturer og tarm-på-en-chip-systemer ved hjælp af celler afledt af 3D-tarmorganoiderne. De protokoller, der præsenteres i denne undersøgelse, tjener som en grundlæggende ramme for etablering af et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system, der er specielt designet til hjørnetænder. Ved at lægge grunden til denne innovative tilgang sigter vi mod at udvide anvendelsen af disse teknikker i biomedicinsk og translationel forskning i overensstemmelse med principperne i One Health-initiativet. Ved at udnytte denne tilgang kan vi udvikle mere fysiologisk relevante dynamiske in vitro-modeller til studier af tarmfysiologi hos både hunde og mennesker. Dette har betydelige konsekvenser for biomedicinske og farmaceutiske anvendelser, da det kan hjælpe med udviklingen af mere effektive behandlinger af tarmsygdomme hos begge arter.

Introduction

Intestinal epitelmorfogenese er i vid udstrækning blevet undersøgt gennem laboratoriedyremodeller, som er dyre, tidskrævende og ikke nøjagtigt repræsenterer menneskelige udviklingsprocesser1. Desuden mangler konventionelle statiske 2D-cellekulturmodeller evnen til at efterligne den komplekse rumlige organisering af en 3D-epitelarkitektur2. Som følge heraf er der behov for en protokol til at inducere in vitro 3D-morfogenese ved hjælp af tarmepitelceller fra menneskerelevante dyremodeller for at fremme vores forståelse af tarmepitelarkitektur.

Selskabshunde har udviklet tarmanatomi og mikrobiomsammensætninger, der bemærkelsesværdigt ligner mennesker på grund af deres fælles miljø og kost under domesticering3. Ud over denne lighed deler både mennesker og hunde forskellige kroniske sygeligheder, der menes at tilskrives tarmsundheden. Hunde, som mennesker, kan spontant udvikle kroniske tilstande som fedme, kognitiv dysfunktion, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsygdom (IBD) og kolorektal adenocarcinom 4,5,6,7,8,9,10. På trods af udviklingen og brugen af humane og murinepitelceller i tidligere Gut-on-a-Chip-undersøgelser 2,11,12,13,14 er hundens tarmepitel ikke blevet brugt indtil nu. Vores nye tilgang, der bruger tarmorganoidepitel hos hunde i et dynamisk kultursystem med en 3D-epitelmorfogenese, har betydelige konsekvenser for både hunde- og humanmedicin.

Nylige fremskridt inden for intestinal organoidkultur har ført til etablering af hundetarmorganoidkultur15. Dette dyrkningssystem involverer dyrkning af tarmstamceller under defineret morfogenkonditionering, hvilket resulterer i en 3D-model med selvfornyende egenskaber afledt af voksne stamceller16. Imidlertid udgør udførelse af transportanalyser eller værtsmikrobiom-cokulturer vanskeligheder med denne 3D-model på grund af den lukkede karakter af tarmlumen17. For at løse dette har forskere genereret et 2D-monolag afledt af tarmorganoider, hvilket muliggør eksponering af lysoverfladen18,19. Imidlertid opretholdes både 3D-organoider og 2D-monolag under statiske forhold, som ikke nøjagtigt afspejler in vivo-biomekanikken i tarmmikromiljøet. Kombinationen af patientafledt teknologi til organoider hos hunde med in vitro 3D-morfogenese giver mulighed for translationel forskning i kroniske multifaktorielle sygdomme. Denne tilgang gør det muligt for forskere at udvikle mere effektive behandlinger til gavn for både mennesker og hunde og yderligere fremme translationel forskning, der er i overensstemmelse med One Health-initiativet, som er en samarbejdstilgang, der anerkender sammenhængen mellem menneskers, dyrs og miljøets sundhed. Det fremmer tværfagligt samarbejde for at tackle komplekse sundhedsudfordringer og opnå optimale sundhedsresultater for alle. Ved at forstå den indbyrdes afhængighed mellem mennesker, dyr og økosystemer sigter initiativet mod at afbøde risici fra nye infektionssygdomme, miljøforringelse og andre fælles sundhedsproblemer20,21,22.

Denne protokol skitserer omfattende metoder til dyrkning af tarmepitelceller fra hunde opnået fra patientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhed med en polydimethylsiloxan (PDMS) -baseret porøs membran. Etablering af 3D-epitelmorfogenese ved at integrere tarmorganoider hos hunde og denne Gut-on-a-Chip-teknologi gør det muligt for os at studere, hvordan tarmen udvikler og vedligeholder sin cellulære organisation og stamcelleniche. Denne platform giver en værdifuld mulighed for at undersøge virkningen af mikrobiomsamfund på tarmsundhed og forstå, hvordan disse samfund genererer mikrobielle metabolitter, der bidrager til intestinal patofysiologi14,23. Disse fremskridt kan nu udvides til hundetarmprøver, hvilket giver forskere mulighed for at udforske det indviklede forhold mellem tarmmikrobiomet og værtsfysiologien. Dette åbner muligheder for at få værdifuld indsigt i de underliggende mekanismer i tarmpatofysiologi og forstå den potentielle rolle mikrobielle metabolitter i både hunde og menneskers sundhed samt forskellige sygdomstilstande. Protokollen, der anvendes til hunde Gut-on-a-Chip, er reproducerbar, hvilket gør den til en passende eksperimentel model til komparativ medicin, da denne tilgang muliggør undersøgelse af værtsmikrobiominteraktioner, patogeninfektioner og probiotiske-baserede terapeutiske virkninger hos både hunde og mennesker.

Protocol

Undersøgelsen blev godkendt og udført i overensstemmelse med Institutional Animal Care and Use Committee of Washington State University (ASAF # 6993). I denne protokol brugte vi en veletableret Gut-on-a-Chip mikrofluidisk enhed lavet af PDMS, som blev fremstillet internt2 (figur 1D). Detaljerede metoder til fremstilling af Gut-on-a-Chip-mikroenheden findes i tidligere rapporter 2,24. Denne protokol demonstrerer en unik integration af intestinale organoider og et mikrofluidisk system (figur 2).

1. Overfladeaktivering af en Gut-on-a-Chip lavet af PDMS

  1. Forbered 1% polyethyleneimin (PEI) opløsning ved at tilsætte 1 ml 50% PEI-opløsning i 49 ml destilleret (DI) vand i et 50 ml konisk rør. Vend røret to til tre gange for at blande opløsningen godt, og filtrer derefter opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter.
    BEMÆRK: Opbevar det ved 4 °C.
  2. Forbered 0,1% glutaraldehyd (GA) opløsning ved at tilsætte 100 μL 50% GA-opløsning i 49,9 ml DI i et 50 ml konisk rør. Vend røret to til tre gange for at blande opløsningen godt, og filtrer derefter opløsningen ved hjælp af et 0,2 μm sprøjtefilter.
    BEMÆRK: Opbevar den ved 4 °C, og sørg for at beskytte den mod udsættelse for direkte lys.
  3. Anbring Gut-on-a-Chip-enheden i en tør ovn, der er indstillet til 60 °C, og inkuber den i mindst 30 minutter for at fjerne eventuel resterende fugt.
  4. Udsæt Gut-on-a-Chip-enheden for UV- og ozonbehandling i 60 minutter ved hjælp af en UV/ozongenerator.
    BEMÆRK: For at sikre optimal aktivering af PDMS-overfladerne under behandlingen skal der holdes en afstand på ca. 3 cm eller mindre mellem UV-lampen og enheden. Undgå overfyldning af enheder i generatoren for at opnå effektiv overfladeaktivering.
  5. Fastgør den øverste mikrokanals indløb, bypass og udløbsslange ved hjælp af bindeclips til at fastspænde dem. Klem også indløbsslangen til den nederste mikrokanal.
  6. Afbryd udløbsslangen til den nederste mikrokanal. Sørg for, at bypassslangen i den nedre mikrokanal forbliver åben.
  7. Brug en P100-mikropipette til at indføre 100 μL af en 1% PEI-opløsning gennem udløbshullet i den nedre mikrokanal.
    BEMÆRK: Det anbefales at udføre denne proces, mens enheden stadig er varm fra UV / ozoneksponering. Overhold PEI-opløsningen, der strømmer gennem mikrokanalen, og PEI-opløsningen falder ud for at komme ud fra bypass-slangen til den nedre mikrokanal.
  8. Tilslut udløbsslangen til den nederste mikrokanal igen.
  9. Fastgør den nederste mikrokanals indløb, bypass og udløbsslange ved hjælp af bindeclips til at fastspænde dem. Klem også indløbsslangen til den øvre mikrokanal.
  10. Afbryd udløbsslangen til den øverste mikrokanal. Sørg for, at bypassslangen i den øvre mikrokanal forbliver åben.
  11. Brug en P100-mikropipette til at indføre 100 μL af en 1% PEI-opløsning gennem udløbshullet i den øvre mikrokanal.
    BEMÆRK: Overhold PEI-opløsningen, der strømmer gennem mikrokanalen, og PEI-opløsningen falder ud for at komme ud fra bypass-slangen til den øvre mikrokanal.
  12. Sæt udløbsslangen på den øvre mikrokanal på igen.
  13. Når både øvre og nedre mikrokanaler er fyldt med 1% PEI-opløsning, skal du lade enheden inkubere ved stuetemperatur (RT) i 10 minutter.
  14. Udfør trin 1.5-1.12 med 0,1 % GA-opløsning.
  15. Når både øvre og nedre mikrokanaler er fyldt med 0,1% GA-opløsning, skal du lade enheden inkubere ved RT i 20 minutter.
  16. Udfør trin 1.5-1.12 med DI-vand for at fjerne overskydende overfladeaktiveringsopløsning.
  17. Anbring spånen i en tør ovn ved 60 °C, og lad den tørre natten over.
    BEMÆRK: Sørg for at fjerne bindeclipsene fra alle slangerne for at undgå at trænge ind i slangen. Denne tørringsproces er afgørende for den jævne overfladeaktivering af mikrokanalen i Gut-on-a-Chip12.

2. Ekstracellulær matrixbelægning (ECM) og tilberedning af dyrkningsmedium til Gut-on-a-Chip-kultur

  1. Der fremstilles en ECM-blanding med organoid basalmedium, således at den endelige koncentration af kollagen I og Matrigel er henholdsvis 60 μg/ml og 2 % (vol/vol).
    BEMÆRK: Forbered 50 μL ECM-blanding pr. tarmchip (dvs. 20 μL ECM-blanding for hver øvre og nedre mikrokanal og 10 μL ekstra). Forbered dette på brugsdagen og opbevar denne opløsning ved 4 °C eller læg den på is, indtil den er klar til brug.
  2. Tag Gut-on-a-Chip, der er blevet behandlet med UV / ozon, PEI og GA, ud af den tørre ovn.
    BEMÆRK: Undersøg under et fasekontrastmikroskop for at se, om der er restfugt.
  3. Lad Gut-on-a-Chip køle af i et biosikkerhedsskab i 10 min.
  4. Fastgør den øverste mikrokanals indløb, bypass og udløbsslange ved hjælp af bindeclips til at fastspænde dem. Klem også indløbsslangen til den nederste mikrokanal.
  5. Afbryd udløbsslangen til den nederste mikrokanal.
  6. Brug en P100-mikropipette til at indføre 20 μL ECM-blanding gennem udløbshullet i den nedre mikrokanal.
    BEMÆRK: Overhold ECM-blandingen, der strømmer gennem mikrokanalen uden nogen luftbobleindfangning. Hvis der er nogen luftboble til stede, introduceres yderligere ECM-blanding til den nedre mikrokanal, indtil boblen er væk.
  7. Sæt udløbsslangen til den nederste mikrokanal på igen.
  8. Fastgør den nederste mikrokanals indløb, bypass og udløbsslange ved hjælp af bindeclips til at fastspænde dem. Klem også indløbsslangen til den øvre mikrokanal.
  9. Afbryd udløbsslangen til den øverste mikrokanal.
  10. Brug en P100-mikropipette til at indføre 20 μL ECM-blanding gennem udløbshullet i den øvre mikrokanal.
  11. Sæt udløbsslangen til den øverste mikrokanal på igen.
  12. Chippen anbringes i en befugtet CO 2 -inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i 1 time for at danne ECM-laget på PDMS-membranen behandlet med PEI og GA (figur 3A).
    BEMÆRK: Sørg for, at alle slanger er fastspændt under inkubationen.
  13. Under inkubationen af ECM-belægningen fremstilles to 1 ml sprøjter, der indeholder koldt såmedium, som er det organoide dyrkningsmedium, der mangler A8301, men indeholder 10 μM Y-27632 og 2,5 μM CHIR99021, som tidligere rapporteret i Gut-on-a-Chip afledt af humane organoider2.
    BEMÆRK: A8301 blev fjernet fra mediet for at forbedre fastgørelsen af celler til den coatede ECM som tidligere rapporteret2. Dag 0 i Gut-on-a-Chip-kulturen kræver kun øvre mikrokanalflow. Forbered derfor en fuld sprøjte til den øverste kanal, mens mindst 0,2 ml til den nederste kanal.
  14. Når ECM-belægningen er afsluttet, skal du tage chippen ud af inkubatoren og frigøre klemmen til bypassslangen, der er forbundet med den nederste mikrokanal.
  15. Tilslut en 1 ml sprøjte fyldt med såmedium til den stumpe kanyle, der er forbundet med den nedre mikrokanal i Gut-on-a-Chip. Indfør forsigtigt såmediet (~50 μL) i bypassslangen. Når slangen er fyldt med det indførte medium, skal du fastgøre bypassslangen, der er forbundet til den nederste mikrokanal, med en bindeclips.
  16. Slip klemmen på udløbsslangen, der er tilsluttet den nederste mikrokanal. Indfør forsigtigt såmediet i den nedre mikrokanal, så det kan strømme jævnt gennem systemet. Fastgør udløbsslangen, der er tilsluttet den nederste mikrokanal, med en bindeclips efter perfusion.
  17. Åbn derefter bypassslangen, der er forbundet til den øvre mikrokanal.
  18. Tilslut en 1 ml sprøjte fyldt med såmedium til den stumpe kanyle, der er forbundet med den øvre mikrokanal i Gut-on-a-Chip. Indfør forsigtigt såmediet (~50 μL) i bypassslangen. Når slangen er fyldt med det indførte medium, skal du fastgøre bypassslangen, der er forbundet til den øverste mikrokanal, med en bindeclips.
  19. Slip udløbsslangen, der er tilsluttet den nederste mikrokanal. Indfør forsigtigt såmediet i den øvre mikrokanal, så det kan strømme jævnt gennem systemet. Fastgør udløbsslangen, der er tilsluttet den øverste mikrokanal, med en bindeclips efter perfusion.

3. Forberedelse af tarmorganoidceller til podning

BEMÆRK: For at generere Gut-on-a-Chip-modellen blev hunde kolonorganoider (kaldet kolonoider) afledt af IBD-patienthunde brugt i denne protokol. Disse kolonoder blev afledt af tre til fem små fragmenter af biopsieret tyktarmsvæv efter en tidligere rapporteret metode15,18. For optimale resultater er det afgørende at bruge hundekolonoider, der har gennemgået mindst tre dyrkningspassager for at etablere stabile organoider, der er egnede til in vitro-applikationer. Det anbefales at dyrke hundekoloiderne i en varighed på mindst 3-4 dage for at lette tilstrækkelig differentiering af multi-lineage celler inden for organoiderne, hvilket sikrer deres funktionelle modenhed og egnethed til efterfølgende eksperimenter i Gut-on-a-Chip-modellen. Den maksimale grænse for passagen for dette arbejde er færre end 20, som det fremgår af en tidligere undersøgelse, der demonstrerede den uændrede fænotype og karyotype gennem 20 på hinanden følgende passager25. Signalerne for disse donorer fremgår af supplerende tabel S1.

  1. Dyrk hundekolonioiderne i plader med 24 brønde indlejret i 30 μL Matrigel 15,18 med organoidt dyrkningsmedium opført i materialetabellen, som er modificeret fra tidligere rapporteret medium 15,26,27. Det konditionerede medium blev opnået ved dyrkning af Rspo1-celler og HEK293-celler konstrueret til at udskille Noggin28.
  2. Kassér det organoide kulturmedium gennem vakuumsugning, og indfør 500 μL cellegendannelsesopløsning ved en iskold temperatur i hvert hul. Der inkuberes i 30 minutter ved 4 °C.
    BEMÆRK: Typisk giver tre brønde ud af en 24 brøndplade af modne tarmorganoider hos hunde en tilstrækkelig mængde dissocierede celler til at frø en enkelt Gut-on-a-Chip-enhed med 40-50 organoider / et synsfelt ved x10-forstørrelse.
  3. Mekanisk forstyrre Matrigel kuplerne i 5 s ved hjælp af en P1000 mikropipette. Derefter samles organoidsuspensionen i et 15 ml konisk rør.
  4. Konisk glas centrifugeres ved 200 × g og 4 °C i 5 min, hvorefter supernatanten fjernes.
  5. Der indføres 1 ml trypsinlignende protease ved stuetemperatur, suppleret med 10 μM Y-27632, og cellepelleten resuspenderes ved pipettering ved hjælp af en P1000-mikropipette.
  6. Cellesuspensionen anbringes i et vandbad, der er indstillet til 37 °C, og inkuberes i 10 minutter, mens blandingen rystes periodisk.
  7. Der indføres 5 ml varmt organoid basalmedium, og cellesuspensionen pipetteres kraftigt ved hjælp af en P1000-mikropipette, indtil den bliver uklar uden synlige celleklumper.
  8. Før cellesuspensionen gennem en cellesil med en 70 μm afskæring for at eliminere Matrigel-affald og store celleklynger.
  9. Det koniske rør centrifugeres ved 200 × g og 4 °C i 5 minutter efterfulgt af resuspension af pellet i såmedium. Til såning af en Gut-on-a-Chip-enhed til hunde skal du bruge 20 μL såmedium til at resuspendere cellepelleten (dvs. brug 20 μL såmedium, når der sås en Gut-on-a-Chip-enhed).
  10. Koncentrationen af levedygtige celler ændres til 1 × 107 celler/ml med såsubstrat som tidligere rapporteret2. Udfør levedygtighedsvurdering ved hjælp af et hæmocytometer ved at kombinere 10 μL af cellesuspensionen med 10 μL trypanblåt, og observer derefter cellerne under et mikroskop.
    BEMÆRK: Det er afgørende at justere cellekoncentrationen korrekt for at sikre optimal cellefastgørelse og dannelse af et ensartet monolag på chipmembranen. Hvis det oprindelige antal celler er utilstrækkeligt, kan det resultere i forsinket eller mislykket etablering af et sammenflydende monolag. Omvendt, hvis antallet af celler er for stort, kan ikke-klæbende celler aggregeres i klumper i kanalen, hvilket fører til uønskede koncentrationseffekter.

4. Såning og dannelse af et 2D-cellemonolag

  1. Afbryd udløbsslangen til den øverste mikrokanal. Sørg for, at bypassslangen i den øvre mikrokanal forbliver åben. Fastgør både indløbet og udløbet på den nedre mikrokanal ved hjælp af bindeclips til at fastspænde dem.
  2. Brug en P100- eller P20-mikropipette til at indføre 20 μL af cellesuspensionen fra protokol 3 til udløbshullet i den øvre mikrokanal (figur 3B-såning ).
  3. Fastgør bypass og indløbsrør på den øvre mikrokanal ved hjælp af bindeclips til at fastspænde den. Sæt derefter udløbsslangen på udløbshullet i den øvre mikrokanal igen, og sørg for, at slangen forbliver åben under hele processen for at undgå, at der påføres tryk på den øvre mikrokanal. Efter dette trin skal du langsomt fastgøre udløbsslangen på den øverste kanal ved hjælp af en bindeclips til at fastspænde den.
  4. Kontroller ved hjælp af et mikroskop, at cellerne er jævnt fordelt i hele den øvre mikrokanal.
    BEMÆRK: Det er vigtigt at fastspænde slangen for at stoppe mediets bevægelse inden i kanalen for at tillade stabile statiske forhold, indtil den ønskede cellefastgørelse er opnået.
  5. Chippen anbringes i en befugtet CO2 -inkubator ved 37 °C.
    BEMÆRK: Det tager ca. 3 timer for tarmorganoidceller at fastgøre til ECM-belægningen (figur 3B-vedhæftning).
  6. Tilslut sprøjten, der er fastgjort til den øvre mikrokanal i Gut-on-a-Chip, til en sprøjtepumpe placeret i en CO2 -inkubator.
    BEMÆRK: Skyl forsigtigt mediet ind i mikrokanalen ved hjælp af knappen på sprøjtepumpen, og fjern ubundne celler. Undersøg chippen under et mikroskop for at sikre, at eventuelle ikke-fastgjorte celler er blevet vasket effektivt væk.
  7. Strømmen af dyrkningsmedium startes ved 30 μL/h med såmedium. Dette kontinuerlige flow er kun for den øvre mikrokanal oprindeligt indtil 2D-monolagsetableringen på en Gut-on-a-Chip. For den nederste mikrokanal skal du lade mikrokanalerne være fastspændt og mediet uskyllet.
  8. Fra dagen efter, at cellerne er podet, ændres dyrkningsmediet til organoidt dyrkningsmedium, som indeholder A8301 og mangler 10 μM Y-27632 og 2,5 μM CHIR99021, fra såmediet.
  9. Når monolaget er etableret, skal du også starte den kontinuerlige mediestrøm til den nedre mikrokanal. Det tager normalt 2 til 3 dage for hunde intestinal organoid epitelceller at etablere epitelmonolag (figur 3C).

5. Etablering af 3D-morfogenese i hunde Gut-on-a-Chip

BEMÆRK: Efter at de sammenflydende monolag er dannet i Gut-on-a-Chip, blev medium flow af både den øvre kanal og den nedre kanal og cellestamme introduceret for at initiere 3D-morfogenese til 2D-monolag som vist i figur 2.

  1. Indfør organoidkulturmediet i både de øvre og nedre mikrokanaler for at starte udviklingen af 3D-morfogenese i et Gut-on-a-Chip-system. For at opnå forskydningsspænding på 0,02 dyne/cm2 i det eksisterende Gut-on-a-Chip-design (dvs. 500 μm højde mikrokanal) øges strømningshastigheden til 50 μL/h29.
  2. Der startes 10 % cellestamme og 0,15 Hz frekvens, som anbefalet før2, ved hjælp af en computerreguleret bioreaktor, der anvender cyklisk belastning på celler, der dyrkes in vitro. Denne proces ville anvende vakuumsugning på Gut-on-a-Chip-enheden.
  3. Oprethold disse dyrkningsforhold i mindst 2 til 3 dage. 3D-morfogenesen af hundens intestinale monolag forekommer normalt 2 til 3 dage efter, at Dural kanalflow og vakuumsugning er startet (figur 3C).

6. Karakterisering af hunde Gut-on-a-Chip

  1. Levende cellebilleder
    1. Fjern eventuelle luftbobler i Gut-on-a-Chip ved forsigtigt at strømme mediet ved hjælp af sprøjtepumpen.
    2. Afbryd Gut-on-a-Chip-enheden fra sprøjtepumpen.
      BEMÆRK: Undgå enhver manøvre, der kan lægge pres i Gut-on-a-Chip.
    3. Placer enheden på et mikroskop for at tage billeder af det etablerede 3D-epitel. For at visualisere strukturen af 3D-epitellagene ved hjælp af fasekontrast skal du bruge 10x og 20x mål (figur 3C).
  2. Immunofluorescens farvning
    1. Den blokerende opløsning fremstilles ved at opløse 1 g BSA i 50 ml fosfatbuffersaltvand (PBS) til 2 % BSA. Opløsningen ledes gennem et sprøjtefilter på 0,2 μm til filtrering. Opbevar opløsningen ved 4 °C.
    2. Forbered permeabiliseringsopløsningen ved at kombinere 150 μL Triton X-100 med 50 ml blokerende opløsning, hvilket resulterer i en slutkoncentration på 0,3% Triton X-100. Opløsningen ledes gennem et sprøjtefilter på 0,2 μm til filtrering. Opbevar opløsningen ved 4 °C.
    3. Der udføres fiksering af cellerne ved at injicere 100 μL af en 4 % PFA i både den øvre og nedre mikrokanal som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    4. Cellerne skylles ved at injicere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    5. Udfør permeabilisering af cellerne ved at injicere 100 μL 0,3% Triton i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11. Placer enheden på RT i 30 minutter.
    6. Cellerne skylles ved at injicere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    7. Udfør blokering af cellerne for at forhindre uspecifik binding ved at injicere 100 μL 2% BSA til både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11. Placer enheden på RT i 1 time.
    8. 20 μL af den primære antistofopløsning fortyndet i 2 % BSA indsprøjtes og anbringes ved RT i 3 timer efterfulgt af inkubation natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Sørg for, at alle slanger er fastspændt under inkubationen ved 4 °C for natten over. Koncentrationen af et primært antistof bør være 2-5 gange højere end den anbefalede koncentration for monolags- eller 3D-organoidfarvning (supplerende figur S1).
    9. Cellerne skylles ved at injicere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    10. Der indsprøjtes 20 μL sekundær antistofopløsning fortyndet i 2% BSA og anbringes ved RT i 1 time.
      BEMÆRK: Sørg for, at alle slanger er fastspændt under inkubationen. Fra dette trin er det nødvendigt at beskytte enhedens opsætning med aluminiumsfolie for at forhindre fotoblegning.
    11. Cellerne skylles ved at injicere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    12. Forbered en kombineret opløsning til F-actin og DAPI (diamidino-2-phenylindol) modfarvning. 20 μL af den kombinerede opløsning indsprøjtes i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
    13. Cellerne skylles ved at injicere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trin 2.4-2.11.
      Udfør fluorescensbilleddannelse af arkitekturen af 3D-epitelcellerne ved hjælp af et fluorescensmikroskop eller et konfokalmikroskop.

7. Epitelbarrierefunktion

  1. Fjern eventuelle luftbobler i Gut-on-a-Chip ved forsigtigt at strømme mediet ved hjælp af sprøjtepumpen. Sørg for, at alle slanger er åbne under målingen.
  2. Fjern Gut-on-a-Chip fra sprøjtepumpen og anbring den på RT i mindst 10 minutter.
  3. Fjern Ag/AgCl-elektroder fra 70 % EtOH-opløsning.
  4. Placer to Ag / AgCl-elektroder i henholdsvis det øverste indløb og det nedre udløb for at måle epitellagets modstand ved hjælp af et multimeter.
  5. Anbring to Ag/AgCl-elektroder i henholdsvis det nedre og det øverste udløb. Rapporter gennemsnittet af disse to værdier som en modstandsværdi for Gut-on-a-Chip.
    BEMÆRK: Den tomme TEER skal måles på en Gut-on-a-Chip med kun ECM-belægning uden epitelet.
  6. Beregn transepitelial elektrisk modstand (TEER) værdi (kΩ × cm2) kan beregnes ved hjælp af ligning (1).
    TEER = (Ωt - Ωtom) × A (1)
    Hvor Ωt er en modstandsværdi målt på det specifikke tidspunkt siden eksperimentets start, er Ωblindprøve en modstandsværdi målt på det tidspunkt uden epitelet, og A er arealet af overfladen dækket af et cellelag (ca. 0,11 cm2 for dette Gut-on-a-Chip-design29).
    1. Beregn normaliseret TEER ved hjælp af ligning (2).
      TEER = Equation 1 (2)
      Hvor Ω0 er en modstandsværdi ved eksperimentets indledende aflæsningstidspunkt som rapporteret tidligere30 (figur 4C).

Representative Results

Denne protokol letter pålideligt den spontane udvikling af 3D intestinal morfogenese i et Gut-on-a-Chip-system. Denne tilgang anvender intestinale epitelceller fra hunde opnået fra intestinale organoider afledt af hunde, der er ramt af inflammatorisk tarmsygdom (IBD) (figur 1B). Lejlighedsvis klyngedannelse af 3D-morfogenese af hunde tarmepitelceller kan observeres i hele mikrokanalen efter 6-9 dages medium flow (figur 3C). Disse morfologiske ændringer kan overvåges ved hjælp af fasekontrastteknikker. I denne undersøgelse brugte vi organoider afledt af to hunde diagnosticeret med IBD. Især blev vellykket 3D-morfogenese observeret i to biologiske replikater, som hver blev udført med to tekniske replikater. Resultaterne fra denne undersøgelse danner grundlag for fremtidige undersøgelser, der involverer tarmorganoider afledt af andre hundedonorer. Disse resultater demonstrerer den potentielle anvendelighed og repeterbarhed af vores eksperimentelle tilgang, som tidligere er blevet rapporteret i humane prøver. Disse resultater giver yderligere bekræftelse af, at Gut-on-a-Chip-teknologien er anvendelig på hundes intestinale epitelceller som tidligere rapporteret med undersøgelserne ved hjælp af humane tarmepitelceller2.

Denne protokol viste, at immunofluorescensfarvning kan bruges til at evaluere 3D-strukturen af organoidafledte monolag, der har dannet villuslignende strukturer i mikrofluidiske chips ved hjælp af konventionel fluorescensmikroskopi (figur 4 A, B). Denne protokol kan tilpasses til at validere de differentierede og rumligt organiserede cellulære fænotyper gennem immunofluorescensfarvning. Visualiseringen af en 3D-morfogenese i en Gut-on-a-Chip giver en glimrende mulighed for at undersøge værtsresponsen under forskellige patologiske interaktioner 14,23,31. Når det kombineres med epitelceller afledt af patientdonorer, som tidligere beskrevet hos mennesker, kan denne teknologi bruges til at konstruere personlige modeller af tarmsygdomme13. Gennem integration af immunfluorescensbilleddannelse med målrettede RNA-visualiseringsteknikker som fluorescens in situ-hybridisering kan det være muligt visuelt at analysere værtens transkriptomer og proteomer inden for et Gut-on-a-Chip-system.

Bevarelse af tarmmembranens integritet er afgørende for at opretholde tarmhomeostase, og Gut-on-a-Chip-platformen giver en værdifuld fordel ved at muliggøre præcis overvågning og kvantificering af denne afgørende funktion. Måling af TEER ved hjælp af Gut-on-a-Chip-teknologien giver flere fordele. For eksempel har tidligere undersøgelser med succes evalueret TEER, mens de dyrkede tarmceller sammen med ikke-patogene og probiotiske bakterier32 såvel som under utætte tarmforhold23. Dette giver forskere mulighed for at studere virkningen af forskellige forhold på tarmbarrierefunktionen og identificere potentielle interventioner for at fremme tarmsundheden.

Figure 1
Figur 1: Etablering af patientafledt IBD Gut-on-a-Chip hos hunde. (A) Integration af de patientafledte tarmorganoider og Gut-on-a-Chip-platformen. Endoskopi biopsi kan udføres for at isolere tarmkryptceller til at udvikle donorspecifikke intestinale organoider. Epitelceller kan dissocieres i enkeltceller fra organoiderne, derefter podet i en PDMS-baseret Gut-on-a-Chip og dyrkes i et unikt dynamisk mikromiljø. (B) Repræsentative billeder af kolonier fra en IBD-hund. Skalabjælke = 100 μm. (C) Dette skema illustrerer en Gut-on-a-Chip-enhed bestående af en porøs membran placeret mellem øvre og nedre mikrokanaler. Den øverste mikrokanal er angivet med det blå område, mens den nederste mikrokanal er angivet med det røde område. Vakuumkamre er til stede på hver side af mikrokanalen, som deformerer den porøse membran for at efterligne peristaltisk bevægelse24. (D) En opsætning af hunde Gut-on-a-Chip omfatter en PDMS-baseret Gut-on-a-Chip samlet med slanger, der er placeret på en dækselslip 2,24. Bypassslangen er afgørende for at undgå trykopbygning i mikrokanalen under håndteringen (dvs. tilslutning til sprøjter). Bindeklemmer bruges til at klemme slangen. Volumenfølsomme materialer kan infunderes via de åbne huller i det øvre eller nedre udløb. Organoid kulturmedium kan infunderes ved at forbinde sprøjterne til de stumpe endenåle og strømmen gennem det øvre og nedre indløb. Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsygdom; PDMS = polydimethylsiloxan. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Dannelse af villuslignende strukturer i hunde IBD Gut-on-a-Chip. De dissocierede epitelceller blev podet i en ECM-belagt Gut-on-a-Chip. Når de dissocierede celler var bundet til PDMS-membranen, blev apikal strømning initieret i 3 dage (D0-D3). Når der dannes et sammenflydende 2D-monolag (D3), initieres basolateral strømning med hyppig strækning (strækning, AP og BL-flow). Efter 2-3 dages dobbeltstrømning og membranstrækning begynder 2D-monolaget at udvikle 3D-morfogenese, og villuslignende strukturer dannes efter 9 dages kultur (3D-morfogenese, D9-D12). Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrix; PDMS = polydimethylsiloxan; AP = apikal; BL = basolateral. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Organoid såning af hunde og 3D-morfogenese i en tarm-på-en-chip . (A) De eksperimentelle trin til overfladeaktivering af en porøs membran i en PDMS-baseret Gut-on-a-Chip. Anvendelsen af UV / ozonbehandling, PEI og GA-behandling sammen letter tværbindingen af aminer, der er til stede i ECM-opløsninger. Denne proces fører til stabil immobilisering af ECM-proteiner på den porøse membran. (B) Fasekontrastbillederne viser cellernes morfologier umiddelbart efter såning (venstre) og 3-5 timer efter såning (højre). Den porøse membran efter 3 timers såning viser tyndere og mørkere områder, hvor enkeltceller har fastgjort, hvilket fremhæver fastgørelsesprocessen. (C) Fasekontrastbillederne viser 3D-morfogenesen af intestinale monolag i et Gut-on-a-Chip-system. Disse monolag blev afledt af hunde, der var ramt af IBD, og disse organoidceller blev dyrket i en periode på 12 dage under dynamiske forhold, hvilket involverede væskestrøm og strækbevægelser. Skalastænger = 50 μm (B,C). Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsygdom; ECM = ekstracellulær matrix; PDMS = polydimethylsiloxan; PEI = polyethylenamin; GA = glutaraldehyd. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Evaluering af 3D-morfologisk udvikling i patientafledt hund Gut-on-a-Chip. (A) Immunofluorescensbilleddannelse af en hund IBD Gut-on-a-Chip, der viser et top-down billede af et fuldt udviklet 3D-epitel efter 12 dages dyrkning, som evalueres af et fluorescensmikroskop. Det stramme forbindelsesprotein (ZO-1) visualiseres i gult; børstekantmembranen (F-actin) vises i rødt; og kernerne er farvet med DAPI og ser blå ud. (B) Immunofluorescensbilleddannelse af en IBD Gut-on-a-Chip hos hunde ved hjælp af et konfokalmikroskop med en langdistancelinse. Som vist i skemaet vises et fluorescerende billede af et tværsnit af en villuslignende struktur af et fuldt udviklet 3D-epitel efter 12 dages kultur. Derudover viser Z-stabling et sidebillede af 3D-epitelet, som afslører dannelsen af villuslignende strukturer. Penselkantmembranen (F-actin) vises i rødt, og kernerne er farvet med DAPI og fremstår blå. (C) Tarmbarrierefunktionen blev evalueret og målt af TEER i patientafledt Gut-on-a-Chips hos hunde. Stabile TEER-værdier blev nået på dag 5 af kulturen på Gut-on-a-Chip. Fejlbjælker udtrykker målingernes SEM. TEER-værdien blev målt blandt to biologiske replikater med en teknisk replikat. Skalastænger = 50 μm (A), 25 μm (B). Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsygdom; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindol; TEER = transepitelial elektrisk modstand. Klik her for at se en større version af denne figur.

Supplerende figur S1: Karakterisering af anti-ZO-1 polyklonalt antistof i monolag afledt af hundekolonier og på Gut-on-a-Chip-enheder. (A) Immunofluorescensfarvning af ZO-1 i gult med F-actin i rødt og deres overlaybillede. Skalabjælke = 25 μm. (B) Immunofluorescensvisualisering af ZO-1 i gult i 'Leaky Gut Chips' blev udført under forskellige forhold, herunder stimulering med probiotiske bakterier (LGG + cytokiner eller VSL # 3 + cytokiner) og kimfri kontrol uden probiotisk stimulering (cytokiner). Skalabjælke = 50 μm. Denne figur er gengivet fra Min et al.23. Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende tabel S1: Et resumé af oplysninger om vævsdonorer. En oversigtstabel over donorernes alder, køn, race, histopatologisk evaluering og CIBDAI-score (Canine IBD activity index). CIBDAI er et numerisk scoringssystem, der bruges til at udlede klinisk sværhedsgrad hos IBD33 hos hunde. Klik her for at downloade denne fil.

Discussion

Denne undersøgelse markerer den banebrydende demonstration af kompatibiliteten af hundetarmorganoider med udviklingen af en IBD Gut-on-a-Chip-model til hunde. Integrationen af tarmorganoider og organoidafledte enkeltlagskulturer i et mikrofluidisk system (dvs. Gut-on-a-Chip-systemet) har videreudviklet teknologien og muliggjort oprettelsen af in vitro-tarmmodeller , der nøje efterligner fysiologisk dynamik og er mere repræsentative for biologiske forhold. Især da der er meget få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur ved hjælp af IBD-afledte organoider hos mennesker, kan den nuværende undersøgelse ved hjælp af IBD-afledt Gut-on-a-Chip hos hunde give førende indsigt i undersøgelsen af IBD hos mennesker.

Den vellykkede udvikling af hundetarmepitel 3D-morfogenese på en Gut-on-a-Chip kræver omhyggelig opmærksomhed på flere kritiske trin. For det første kan den hydrofobe overflade af PDMS-mikrofluidiske kanaler hæmme ECM-vedhæftning og efterfølgende cellefastgørelse, hvilket nødvendiggør overfladeaktivering af PDMS før ECM-belægning og cellesåning (se protokolafsnit 1). For at opnå en stabil enkeltlagskultur er fjernelse af overskydende ikke-bundne celler afgørende efter cellevedhæftning (protokoltrin 4.6-4.7). Derudover er dynamisk stimulering, såsom konstant medium flow og peristaltisk-lignende vakuumbevægelse, nødvendig for 3D-morfogenese af tarmepitelet (protokoltrin 5.2). Omhyggelig håndtering er afgørende for at undgå luftbobler i mikrokanalen under alle trin i Gut-on-a-Chip-kulturen.

Hvis du støder på dårlig cellesåning i Gut-on-a-Chip, kan det skyldes et lavt cellenummer eller dårlig cellevedhæftning. For at fejlfinde lave celletal er det vigtigt at inspicere sundheden hos forberedte tarmorganoider ved at observere deres vækst i Matrigel. Cellelevedygtighed kan vurderes ved Trypan blå farvning efter celledissociation for at sikre, at ikke mere end 20% af cellerne er døde. Hvis levedygtige cellenumre er utilstrækkelige, kan optimering af organoidmedieforhold forsøges. En anden mulighed er ufuldstændig organoid dissociation, hvilket resulterer i et overskud af celleklumper større end 70 μm, der bliver fanget af filteret. For at løse dette er en mulighed at forlænge varigheden af pipettering under celledissociation. Alternativt kan det 15 ml koniske rør forsigtigt omrøres hvert minut, mens det behandles med en trypsinlignende protease. Dårlig cellefastgørelse til Gut-on-a-Chip kan skyldes forkert ECM-belægning. Under belægningsprocessen anbefales det omhyggeligt at kontrollere tilstedeværelsen af luftbobler og forhindre deres dannelse ved forsigtigt at tilføje mere belægningsopløsning efter behov. Overfyldning af celler og manglende vask af ikke-bundne celler kan resultere i et utilstrækkeligt indledende monolag. I et sådant tilfælde kan en mild pulsering påføres, når sprøjtestemplet trykkes på. Disse fejlfindingstrin kan hjælpe med at identificere og løse problemer under Gut-on-a-Chip-kulturprocessen.

Mens denne Gut-on-a-Chip-platform muliggør oprettelse af bølgede 3D-epitellag, anerkender vi behovet for yderligere biologisk kompleksitet for at replikere tarmmikromiljøet fuldt ud. Det er afgørende at overveje interaktionerne mellem epitel- og mesenkymale celler, aflejringen af ECM til 3D-regenerering og tilstedeværelsen af krypt-villus-egenskaber, der etablerer en passende stamcelleniche. Stromaceller, såsom fibroblaster, spiller en afgørende rolle i produktionen af ECM-proteiner og reguleringen af intestinal morfogenese34,35,36. Inkluderingen af mesenkymale celler i denne model har potentialet til at forbedre både morfogenese og effektiviteten af cellebinding. Endotellag, der omfatter kapillær vaskulatur og lymfekar, spiller en afgørende rolle i styringen af molekylær transport og rekruttering af immunceller37,38. Inkluderingen af patientafledte immunceller kan være afgørende for modellering af tarmsygdomme, da det giver mulighed for at påvise samspillet mellem medfødt og adaptiv immunitet samt etablering af vævsspecifik immunitet39. Efter færdiggørelsen af 3D-morfogenese på Gut-on-a-Chip kan organoidkulturmediet modificeres til et organoiddifferentieringsmedium. Dette kan være en levedygtig tilgang til at fremkalde yderligere cellulær differentiering, afhængigt af de eksperimentelle mål.

Billeddannelse af 3D-mikroarkitekturen in situ er udfordrende på grund af den lange arbejdsafstand, der kræves, hvilket kan overvindes med et langdistancemål. Derudover gør lag-for-lag mikrofabrikations- og limningsmetoderne det vanskeligt at få adgang til øverste lag til undersøgelse med SEM. Til det nuværende Gut-on-a-Chip-design er der brug for en sprøjtepumpe pr. Gut-on-a-Chip-mikroenhed, der optager CO2 -inkubatorplads og forhindrer store eksperimenter. Der er behov for innovationer for at øge skalerbarheden for en brugervenlig platform og screening med høj kapacitet.

Disse nuværende protokoller giver mulighed for spontan udvikling af 3D-epitellag in vitro, hvilket overgår begrænsningerne ved traditionelle 3D-organoider, 2D-monolag og statiske mikroenhedskultursystemer. Dette dynamiske in vitro intestinale mikromiljø kan styres ved at indføre samkultur af forskellige celletyper. Tidligere undersøgelser har undersøgt metoder til manipulation af Gut-on-a-Chip-mikromiljøet, herunder co-kultivering af tarmmikrobiomet14,23 og perifere mononukleære celler30. Dette rekonstituerede mikromiljø har adskillige potentielle anvendelser, herunder lægemiddeltestning, grundlæggende mekanistiske undersøgelser og sygdomsmodellering. Det rekonstruerede mikromiljø har et betydeligt potentiale for en bred vifte af applikationer, såsom lægemiddeltest 23,40,41 og sygdomsmodellering 12,13,14,30 samt grundlæggende mekanistiske undersøgelser af intestinal morfogenese 42. En række assays kan udføres enten ved at indsamle supernatanter til vurdering af metabolitter 43, ved at indsamle celler til genomundersøgelse 2,32 eller ved visuelt at undersøge cellerne ved hjælp af levende cellefarvestoffer eller fiksering med henblik på efterfølgende immunfluorescensbilleddannelse 23,44.

Denne undersøgelse præsenterer en reproducerbar protokol til udvikling af 3D-morfogenese af hundens intestinale epitellag i en Gut-on-a-Chip-platform. Den resulterende 3D-epitelstruktur giver en mere realistisk repræsentation af tarmmikromiljøet, som har et enormt potentiale for anvendelser i forskellige biomedicinske undersøgelser. Ved at udnytte denne tarmarkitektur kan vi udføre mere translationel forskning og potentielt give lovende resultater.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt at erklære.

Acknowledgments

Vi vil gerne takke WSU Small Animal Internal Medicine service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) og WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss for deres støtte i tilfælde rekruttering og prøveindsamling fra borgerforskere (patientdonorer). Dette arbejde blev delvist støttet af Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 and R21OD031903 to Y.M.A.) og Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 til I.N.). Figur 1A og figur 3A blev oprettet med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2 (2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368 (2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663 (2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1 (2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300 (2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641 (2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525 (2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13 (2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Tags

Medicin nr. 204
Tredimensionel morfogenese hos hunde gut-on-a-chip ved hjælp af tarmorganoider afledt af inflammatoriske tarmsygdomspatienter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini,… More

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter