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भड़काऊ आंत्र रोग रोगियों से व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड का उपयोग करके कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप में त्रि-आयामी मॉर्फोजेनेसिस

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड और एक गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम का एकीकरण मानव आंतों के रोगों के लिए प्रासंगिक अनुवाद मॉडल प्रदान करता है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल 3 डी मोर्फोजेनेसिस और आंत के इन विट्रो मॉडलिंग में गतिशील के लिए अनुमति देते हैं, कुत्तों और मनुष्यों में आंतों के रोगों के लिए प्रभावी उपचार के विकास में सहायता करते हैं।

Abstract

कैनाइन आंतों में शरीर रचना विज्ञान, सूक्ष्म जीव विज्ञान और शरीर विज्ञान में मनुष्यों के समान समानताएं होती हैं, और कुत्ते स्वाभाविक रूप से मनुष्यों के समान सहज आंतों के विकार विकसित करते हैं। आंतों के उपकला की शिखर सतह तक पहुंचने में त्रि-आयामी (3 डी) ऑर्गेनोइड की अंतर्निहित सीमा पर काबू पाने से दो-आयामी (2 डी) मोनोलेयर संस्कृतियों की पीढ़ी हुई है, जो ऑर्गेनोइड से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करके सुलभ ल्यूमिनल सतह को उजागर करती हैं। इन ऑर्गेनोइड्स और ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृतियों के एकीकरण ने माइक्रोफ्लुइडिक गट-ऑन-ए-चिप सिस्टम में प्रौद्योगिकी को और विकसित किया है, जिससे इन विट्रो आंतों के मॉडल में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक गतिशील के विकास की अनुमति मिलती है।

इस अध्ययन में, हम सूजन आंत्र रोग (आईबीडी) से प्रभावित कुत्तों से प्राप्त प्राथमिक आंतों के ऊतकों के नमूनों का उपयोग करके कैनाइन आंतों के उपकला के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस उत्पन्न करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। हम 3 डी आंतों के ऑर्गेनोइड से प्राप्त कोशिकाओं का उपयोग करके 2 डी मोनोलेयर संस्कृतियों और आंत-ऑन-ए-चिप सिस्टम को उत्पन्न करने और बनाए रखने के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा भी तैयार करते हैं। इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल विशेष रूप से कैनाइन के लिए डिज़ाइन किए गए माइक्रोफ्लुइडिक गट-ऑन-ए-चिप सिस्टम की स्थापना के लिए एक मूलभूत ढांचे के रूप में कार्य करते हैं। इस अभिनव दृष्टिकोण के लिए आधार तैयार करके, हमारा लक्ष्य जैव चिकित्सा और अनुवाद संबंधी अनुसंधान में इन तकनीकों के अनुप्रयोग का विस्तार करना है, जो वन हेल्थ इनिशिएटिव के सिद्धांतों के साथ संरेखित है। इस दृष्टिकोण का उपयोग करके, हम कुत्तों और मनुष्यों दोनों में आंतों के शरीर विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इन विट्रो मॉडल में अधिक शारीरिक रूप से प्रासंगिक गतिशील विकसित कर सकते हैं। बायोमेडिकल और फार्मास्युटिकल अनुप्रयोगों के लिए इसका महत्वपूर्ण प्रभाव है, क्योंकि यह दोनों प्रजातियों में आंतों के रोगों के लिए अधिक प्रभावी उपचार के विकास में सहायता कर सकता है।

Introduction

आंतों के उपकला आकृति विज्ञान का बड़े पैमाने पर प्रयोगशाला पशु मॉडल के माध्यम से अध्ययन किया गया है, जो महंगा, समय लेने वाला है, और मानवविकास प्रक्रियाओं का सही प्रतिनिधित्व नहीं करता है। इसके अलावा, पारंपरिक स्थैतिक 2 डी सेल संस्कृति मॉडल में 3 डी उपकला वास्तुकला2 के जटिल स्थानिक संगठन की नकल करने की क्षमता का अभाव है। नतीजतन, आंत उपकला वास्तुकला की हमारी समझ को आगे बढ़ाने के लिए मानव-प्रासंगिक पशु मॉडल से आंतों के उपकला कोशिकाओं का उपयोग करके इन विट्रो 3 डी मॉर्फोजेनेसिस में प्रेरित करने के लिए एक प्रोटोकॉल की आवश्यकता है।

साथी कुत्तों ने आंतों की शारीरिक रचना और माइक्रोबायोम रचनाएं विकसित की हैं जो पालतू बनाने के दौरान उनके साझा वातावरण और आहार के कारण मनुष्यों के समानहैं। इस समानता के अलावा, मनुष्य और कुत्ते दोनों विभिन्न पुरानी रुग्णताओं को साझा करते हैं जिन्हें आंतों के स्वास्थ्य के लिए जिम्मेदार माना जाता है। कुत्ते, मनुष्यों की तरह, अनायास मोटापे, संज्ञानात्मक शिथिलता, मधुमेह मेलेटस, सूजन आंत्र रोग (आईबीडी), और कोलोरेक्टल एडेनोकार्सिनोमा 4,5,6,7,8,9,10 जैसी पुरानी स्थितियों को विकसित कर सकते हैं। पिछले गट-ऑन-ए-चिप अध्ययनों 2,11,12,13,14में मानव और मूत्र उपकला कोशिकाओं के विकास और उपयोग के बावजूद, कैनाइन आंतों के उपकला का अब तक उपयोग नहीं किया गया है। हमारा उपन्यास दृष्टिकोण, एक 3 डी उपकला आकृति विज्ञान के साथ एक गतिशील संस्कृति प्रणाली में कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड एपिथेलियम का उपयोग करते हुए, कुत्ते और मानव चिकित्सा दोनों के लिए महत्वपूर्ण प्रभाव पड़ता है।

आंतों organoid संस्कृति में हाल ही में प्रगति कैनाइन आंतों organoid संस्कृति15 की स्थापना के लिए नेतृत्व किया है. इस संस्कृति प्रणाली में परिभाषित मोर्फोजेन कंडीशनिंग के तहत आंतों स्टेम कोशिकाओं की खेती शामिल है, जिसके परिणामस्वरूप वयस्क स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त आत्म-नवीनीकरण गुणों के साथ एक 3 डी मॉडल होता है16. हालांकि, परिवहन परख या मेजबान-माइक्रोबायोम cocultures का संचालन आंतों के लुमेन17 की संलग्न प्रकृति की वजह से इस 3 डी मॉडल के साथ कठिनाइयों पैदा करता है. इसे संबोधित करने के लिए, शोधकर्ताओं ने आंतों के ऑर्गेनोइड से प्राप्त एक 2D मोनोलेयर उत्पन्न किया है, जो ल्यूमिनल सतह18,19के संपर्क की अनुमति देता है। हालांकि, 3 डी ऑर्गेनोइड और 2 डी मोनोलेयर्स दोनों को स्थिर परिस्थितियों में बनाए रखा जाता है, जो आंतों के माइक्रोएन्वायरमेंट के इन विवो बायोमैकेनिक्स को सटीक रूप से प्रतिबिंबित नहीं करते हैं। इन विट्रो 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के साथ रोगी-व्युत्पन्न कैनाइन ऑर्गेनोइड तकनीक का संयोजन पुरानी बहुक्रियात्मक बीमारियों में अनुवाद संबंधी अनुसंधान के लिए एक अवसर प्रस्तुत करता है। यह दृष्टिकोण शोधकर्ताओं को मनुष्यों और कुत्तों दोनों को लाभान्वित करने वाले अधिक प्रभावी उपचार विकसित करने में सक्षम बनाता है और वन हेल्थ इनिशिएटिव के साथ संरेखित अनुवाद संबंधी अनुसंधान को आगे बढ़ाता है, जो एक सहयोगी दृष्टिकोण है जो मानव, पशु और पर्यावरणीय स्वास्थ्य के परस्पर संबंध को पहचानता है। यह जटिल स्वास्थ्य चुनौतियों का समाधान करने और सभी के लिए इष्टतम स्वास्थ्य परिणाम प्राप्त करने के लिए अंतःविषय सहयोग को बढ़ावा देता है। मनुष्यों, जानवरों और पारिस्थितिक तंत्र के बीच अन्योन्याश्रितताओं को समझकर, पहल का उद्देश्य उभरते संक्रामक रोगों, पर्यावरणीय गिरावट और अन्य साझा स्वास्थ्य चिंताओं20,21,22 से जोखिम को कम करना है।

यह प्रोटोकॉल एक पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) आधारित झरझरा झिल्ली के साथ एक गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस पर रोगी ऑर्गेनोइड से प्राप्त कैनाइन आंतों के उपकला कोशिकाओं के संवर्धन के लिए व्यापक तरीकों की रूपरेखा तैयार करता है। कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड को एकीकृत करके 3 डी उपकला मोर्फोजेनेसिस की स्थापना और यह गट-ऑन-ए-चिप तकनीक हमें यह अध्ययन करने में सक्षम बनाती है कि आंत अपने सेलुलर संगठन और स्टेम सेल आला को कैसे विकसित और बनाए रखती है। यह मंच आंत के स्वास्थ्य पर माइक्रोबायोम समुदायों के प्रभाव की जांच करने और यह समझने का एक मूल्यवान अवसर प्रदान करता है कि ये समुदाय माइक्रोबियल मेटाबोलाइट्स कैसे उत्पन्न करते हैं जो आंतों के पैथोफिज़ियोलॉजी 14,23में योगदान करते हैं। इन प्रगति को अब कैनाइन आंतों के नमूनों तक बढ़ाया जा सकता है, जिससे शोधकर्ताओं को आंत माइक्रोबायोम और मेजबान शरीर विज्ञान के बीच जटिल संबंधों का पता लगाने के अवसर मिलते हैं। यह आंतों के पैथोफिज़ियोलॉजी के अंतर्निहित तंत्र में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्राप्त करने और कैनाइन और मानव स्वास्थ्य दोनों में माइक्रोबियल चयापचयों की संभावित भूमिका को समझने के साथ-साथ विभिन्न रोग स्थितियों को समझने के लिए रास्ते खोलता है। कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप के लिए उपयोग किया जाने वाला प्रोटोकॉल प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है, जिससे यह तुलनात्मक चिकित्सा के लिए एक उपयुक्त प्रयोगात्मक मॉडल बन जाता है, क्योंकि यह दृष्टिकोण कुत्तों और मनुष्यों दोनों में मेजबान-माइक्रोबायोम इंटरैक्शन, रोगज़नक़ संक्रमण और प्रोबायोटिक-आधारित चिकित्सीय प्रभावों की जांच को सक्षम बनाता है।

Protocol

अध्ययन को वाशिंगटन स्टेट यूनिवर्सिटी (ASAF # 6993) की संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति के अनुसार अनुमोदित और आयोजित किया गया था। इस प्रोटोकॉल में, हमने पीडीएमएस से बने एक अच्छी तरह से स्थापित गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस का उपयोग किया जो घरमें 2 (चित्रा 1 डी) गढ़ा गया था। गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस के निर्माण के विस्तृत तरीके पिछली रिपोर्ट 2,24 में पाए जा सकते हैं। यह प्रोटोकॉल आंतों के ऑर्गेनोइड और एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम(चित्रा 2)के एक अद्वितीय एकीकरण को दर्शाता है।

1. पीडीएमएस से बने गट-ऑन-ए-चिप की सतह सक्रियण

  1. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में आसुत (डीआई) पानी के 49 एमएल में 50% पीईआई समाधान के 1 एमएल जोड़कर 1% पॉलीथीनमाइन (पीईआई) समाधान तैयार करें। समाधान को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को दो से तीन बार पलटें, फिर 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
    नोट: इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत रखें।
  2. 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में डीआई के 49.9 एमएल में 50% जीए समाधान के 100 माइक्रोन जोड़कर 0.1% ग्लूटार्डाल्डिहाइड (जीए) समाधान तैयार करें। समाधान को अच्छी तरह से मिश्रण करने के लिए ट्यूब को दो से तीन बार पलटें, फिर 0.2 माइक्रोन सिरिंज फिल्टर का उपयोग करके समाधान को फ़िल्टर करें।
    नोट: इसे 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें और इसे प्रत्यक्ष प्रकाश के संपर्क से बचाने के लिए सुनिश्चित करें।
  3. 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट एक सूखी ओवन में आंत पर एक चिप डिवाइस प्लेस और किसी भी शेष नमी को खत्म करने के लिए 30 मिनट की एक न्यूनतम के लिए यह सेते हैं.
  4. यूवी/ओजोन जनरेटर का उपयोग करके 60 मिनट के लिए यूवी और ओजोन उपचार के लिए गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस को बेनकाब करें।
    नोट: उपचार के दौरान पीडीएमएस सतहों की इष्टतम सक्रियता सुनिश्चित करने के लिए, यूवी लैंप और डिवाइस के बीच लगभग 3 सेमी या उससे कम की दूरी बनाए रखें। कुशल सतह सक्रियण को पूरा करने के लिए जनरेटर में उपकरणों की भीड़भाड़ से बचें।
  5. ऊपरी माइक्रोचैनल के इनलेट, बाईपास, और उन्हें जकड़ना करने के लिए बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करके आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित. इसके अलावा निचले माइक्रोचैनल के लिए इनलेट टयूबिंग दबाना.
  6. निचले माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग डिस्कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि निचले माइक्रोचैनल की बाईपास टयूबिंग खुली रहती है।
  7. P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, निचले माइक्रोचैनल के आउटलेट छेद के माध्यम से 1% PEI समाधान के 100 माइक्रोन का परिचय दें।
    नोट: इस प्रक्रिया को करने की अनुशंसा की जाती है जबकि डिवाइस अभी भी यूवी/ओजोन एक्सपोजर से गर्म है। माइक्रोचैनल के माध्यम से बहने वाले पीईआई समाधान का निरीक्षण करें और पीईआई समाधान निचले माइक्रोचैनल के लिए बाईपास टयूबिंग से बाहर आने के लिए गिरता है।
  8. निचले माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग को फिर से कनेक्ट करें।
  9. निचले माइक्रोचैनल के इनलेट, बाईपास, और उन्हें क्लैंप करने के लिए बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करके आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित. इसके अलावा ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए इनलेट टयूबिंग दबाना.
  10. ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग डिस्कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि ऊपरी माइक्रोचैनल की बाईपास टयूबिंग खुली रहती है।
  11. P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, ऊपरी माइक्रोचैनल के आउटलेट छेद के माध्यम से 1% PEI समाधान के 100 माइक्रोन का परिचय दें।
    नोट: माइक्रोचैनल के माध्यम से बहने वाले पीईआई समाधान का निरीक्षण करें और पीईआई समाधान ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए बाईपास ट्यूबिंग से बाहर आने के लिए गिरता है।
  12. ऊपरी माइक्रोचैनल के आउटलेट टयूबिंग को फिर से संलग्न करें।
  13. एक बार ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल 1% पीईआई समाधान से भर जाते हैं, डिवाइस को 10 मिनट के लिए कमरे के तापमान (आरटी) पर इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
  14. 0.1% GA समाधान के साथ चरण 1.5-1.12 करें।
  15. एक बार दोनों ऊपरी और निचले microchannels 0.1% जीए समाधान के साथ भर रहे हैं, डिवाइस 20 मिनट के लिए आरटी पर सेते हैं.
  16. किसी भी अतिरिक्त सतह सक्रियण समाधान को हटाने के लिए डि पानी के साथ कदम 1.5-1.12 करें।
  17. चिप को सूखे ओवन में 60 डिग्री सेल्सियस पर रखें और इसे रात भर सूखने दें।
    नोट: टयूबिंग के किसी भी प्रभाव से बचने के लिए सभी टयूबिंग से बाइंडर क्लिप को हटाना सुनिश्चित करें। यह सुखाने की प्रक्रिया गुट-ऑन-ए-चिप12 के भीतर माइक्रोचैनल की सतह सक्रियण के लिए महत्वपूर्ण है।

2. एक्स्ट्रासेलुलर मैट्रिक्स (ईसीएम) कोटिंग और संस्कृति मध्यम तैयारी के लिए आंत-ऑन-ए-चिप संस्कृति

  1. ऑर्गेनॉइड बेसल माध्यम के साथ एक ईसीएम मिश्रण तैयार करें ताकि कोलेजन I और मैट्रिगेल की अंतिम सांद्रता क्रमशः 60 μg/mL और 2% (वॉल्यूम/वॉल्यूम) हो।
    नोट: आंत चिप प्रति ईसीएम मिश्रण के 50 माइक्रोन तैयार करें (यानी, प्रत्येक ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल के लिए ईसीएम मिश्रण के 20 माइक्रोन और 10 माइक्रोन अतिरिक्त)। उपयोग के दिन इसे तैयार करें और इस घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें या इसे बर्फ पर रखें जब तक कि यह उपयोग के लिए तैयार न हो जाए।
  2. सूखे ओवन से यूवी/ओजोन, पीईआई और जीए के साथ इलाज किए गए गट-ऑन-ए-चिप को बाहर निकालें।
    नोट: यह देखने के लिए चरण-विपरीत माइक्रोस्कोप के तहत निरीक्षण करें कि क्या कोई अवशिष्ट नमी है।
  3. 10 मिनट के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में ठंडा करने के लिए आंत पर एक चिप की अनुमति दें.
  4. ऊपरी माइक्रोचैनल के इनलेट, बाईपास, और उन्हें जकड़ना करने के लिए बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करके आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित. इसके अलावा निचले माइक्रोचैनल के लिए इनलेट टयूबिंग दबाना.
  5. निचले माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग डिस्कनेक्ट.
  6. P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, निचले माइक्रोचैनल के आउटलेट छेद के माध्यम से ईसीएम मिश्रण के 20 माइक्रोन का परिचय दें।
    नोट: किसी भी हवाई बुलबुला फंसाने के बिना माइक्रोचैनल के माध्यम से बहने वाले ईसीएम मिश्रण का निरीक्षण करें। यदि कोई हवाई बुलबुला मौजूद है, तो बुलबुला चले जाने तक अतिरिक्त ईसीएम मिश्रण को निचले माइक्रोचैनल में पेश करें।
  7. निचले माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग को फिर से लगाएं।
  8. निचले माइक्रोचैनल के इनलेट, बाईपास, और उन्हें क्लैंप करने के लिए बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग करके आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित. इसके अलावा ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए इनलेट टयूबिंग दबाना.
  9. ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग डिस्कनेक्ट.
  10. P100 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, ऊपरी माइक्रोचैनल के आउटलेट छेद के माध्यम से ईसीएम मिश्रण के 20 माइक्रोन का परिचय दें।
  11. ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग को फिर से संलग्न करें।
  12. पीईआई और जीए(चित्रा 3ए)के साथ इलाज किए गए पीडीएमएस झिल्ली पर ईसीएम परत बनाने के लिए 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर 5% सीओ 2 के साथ एक आर्द्र सीओ2 इनक्यूबेटर में चिप रखें।
    नोट: सुनिश्चित करें कि सभी टयूबिंग हैamp इनक्यूबेशन के दौरान ।
  13. ईसीएम कोटिंग के इनक्यूबेशन के दौरान, दो 1 एमएल सीरिंज तैयार करें जिसमें कोल्ड सीडिंग माध्यम होता है, जो ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम है जिसमें A8301 की कमी होती है, लेकिन जिसमें 10 माइक्रोन Y-27632 और 2.5 माइक्रोन CHIR99021 होते हैं, जैसा कि पहले मानव ऑर्गेनोइड2 से प्राप्त गट-ऑन-ए-चिप में बताया गया था।
    नोट: A8301 को लेपित ईसीएम में कोशिकाओं के लगाव को बढ़ाने के लिए माध्यम से हटा दिया गया था जैसा कि पहले रिपोर्ट किया गयाथा 2. गट-ऑन-ए-चिप संस्कृति के दिन 0 को केवल ऊपरी माइक्रोचैनल प्रवाह की आवश्यकता होती है। इसलिए, ऊपरी चैनल के लिए एक पूर्ण सिरिंज तैयार करते हैं, जबकि निचले चैनल के लिए न्यूनतम 0.2 एमएल।
  14. एक बार ईसीएम कोटिंग पूरा हो गया है, इनक्यूबेटर से बाहर चिप ले लो और निचले माइक्रोचैनल से जुड़े बाईपास टयूबिंग के लिए दबाना छोड़ना.
  15. बीजारोपण माध्यम से भरे 1 एमएल सिरिंज को ब्लंट-एंड सुई से कनेक्ट करें जो गट-ऑन-ए-चिप के निचले माइक्रोचैनल से जुड़ा हुआ है। ध्यान से बाईपास टयूबिंग के लिए बोने माध्यम (~ 50 μL) परिचय. एक बार टयूबिंग शुरू किए माध्यम से भर जाता है, एक बांधने की मशीन क्लिप के साथ कम microchannel से जुड़े बाईपास टयूबिंग सुरक्षित.
  16. निचले माइक्रोचैनल से जुड़े आउटलेट टयूबिंग के क्लैंप को छोड़ दें। ध्यान से कम microchannel यह प्रणाली के माध्यम से सुचारू रूप से प्रवाह करने के लिए अनुमति में बोने माध्यम परिचय. छिड़काव के बाद एक बांधने की मशीन क्लिप के साथ कम microchannel से जुड़े आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित.
  17. अगला, ऊपरी माइक्रोचैनल से जुड़े बाईपास टयूबिंग खोलें।
  18. बीजारोपण माध्यम से भरे 1 एमएल सिरिंज को ब्लंट-एंड सुई से कनेक्ट करें जो गट-ऑन-ए-चिप के ऊपरी माइक्रोचैनल से जुड़ा हुआ है। ध्यान से बाईपास टयूबिंग के लिए बोने माध्यम (~ 50 μL) परिचय. एक बार टयूबिंग शुरू किए माध्यम से भर जाता है, एक बांधने की मशीन क्लिप के साथ ऊपरी microchannel से जुड़े बाईपास टयूबिंग सुरक्षित.
  19. निचले माइक्रोचैनल से जुड़े आउटलेट टयूबिंग को छोड़ दें। ध्यान से ऊपरी microchannel में बोने के माध्यम से यह प्रणाली के माध्यम से सुचारू रूप से प्रवाह करने के लिए अनुमति देता है परिचय. छिड़काव के बाद एक बांधने की मशीन क्लिप के साथ ऊपरी microchannel से जुड़े आउटलेट टयूबिंग सुरक्षित.

3. सीडिंग के लिए कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड सेल की तैयारी

नोट: गुट-ऑन-ए-चिप मॉडल उत्पन्न करने के लिए, आईबीडी रोगी कुत्तों से व्युत्पन्न कैनाइन कोलन ऑर्गेनोइड (कोलोनोइड के रूप में संदर्भित) का उपयोग इस प्रोटोकॉल में किया गया था। इन colonoids biopsied colonic ऊतक के तीन से पांच छोटे टुकड़े से व्युत्पन्न थे, एक पहले से रिपोर्ट विधि15,18 निम्नलिखित. इष्टतम परिणामों के लिए, कैनाइन कॉलोनॉइड का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो इन विट्रो अनुप्रयोगों के लिए उपयुक्त स्थिर ऑर्गेनोइड स्थापित करने के लिए न्यूनतम तीन संस्कृति मार्ग से गुजर चुके हैं। ऑर्गेनोइड के भीतर बहु-वंश कोशिकाओं के पर्याप्त भेदभाव की सुविधा के लिए कम से कम 3-4 दिनों की अवधि के लिए कैनाइन कॉलोनॉइड को कल्चर करने की सिफारिश की जाती है, जिससे उनकी कार्यात्मक परिपक्वता और गट-ऑन-ए-चिप मॉडल में बाद के प्रयोगों के लिए उपयुक्तता सुनिश्चित होती है। इस काम के लिए मार्ग की अधिकतम सीमा 20 से कम है, जैसा कि पिछले अध्ययन से संकेत मिलता है जिसने 20 लगातार मार्ग25 में अनछुए फेनोटाइप और कैरियोटाइप का प्रदर्शन किया था। इन दाताओं का संकेत पूरक तालिका एस 1 में प्रस्तुत किया गया है।

  1. संस्कृति सामग्री की तालिका में सूचीबद्ध ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम के साथ मैट्रिगेल 15,18 के 30 माइक्रोन में एम्बेडेड 24-अच्छी प्लेटों में कैनाइन कॉलोनॉइड को संस्कृति करें, जिसे पहले रिपोर्ट किए गए माध्यम 15,26,27 से संशोधित किया गया है। वातानुकूलित माध्यम को Noggin28 को स्रावित करने के लिए इंजीनियर Rspo1 कोशिकाओं और HEK293 कोशिकाओं की खेती करके प्राप्त किया गया था।
  2. वैक्यूम सक्शन के माध्यम से ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम को त्यागें और प्रत्येक कुएं में बर्फ-ठंडे तापमान पर सेल रिकवरी सॉल्यूशन के 500 माइक्रोन का परिचय दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए सेते हैं.
    नोट: आम तौर पर, परिपक्व कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड के 24 अच्छी तरह से प्लेट से बाहर तीन कुएं 40-50 ऑर्गेनोइड्स / एक्स 10 आवर्धन पर देखने के एक क्षेत्र के साथ एक एकल गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस को बीज देने के लिए पर्याप्त मात्रा में विघटित कोशिकाएं प्रदान करते हैं।
  3. यंत्रवत् एक P1000 micropipette का उपयोग कर 5 s के लिए Matrigel गुंबदों बाधित. इसके बाद, ऑर्गेनॉइड निलंबन को 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में इकट्ठा करें।
  4. 5 मिन के लिए 200 × ग्राम और 4 डिग्री सेल्सियस पर शंक्वाकार ट्यूब को सेंट्रीफ्यूज करें, इसके बाद सतह पर तैरनेवाला को हटा दिया जाए।
  5. कमरे के तापमान पर ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के 1 एमएल का परिचय दें, 10 माइक्रोन वाई -27632 के साथ पूरक, और पी 1000 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके पाइपिंग द्वारा सेल गोली को फिर से निलंबित करें।
  6. सेल निलंबन को 37 डिग्री सेल्सियस पर सेट पानी के स्नान में रखें और समय-समय पर मिश्रण को मिलाते हुए इसे 10 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
  7. गर्म organoid बेसल माध्यम के 5 एमएल का परिचय दें और सख्ती एक P1000 micropipette का उपयोग कर सेल निलंबन विंदुक जब तक यह बादल बन जाता है, बिना किसी दृश्य सेल गुच्छों के.
  8. किसी भी Matrigel मलबे और बड़े सेल समूहों को खत्म करने के लिए एक 70 माइक्रोन cutoff के साथ एक सेल झरनी के माध्यम से सेल निलंबन पास.
  9. शंक्वाकार ट्यूब को 200 × ग्राम और 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र करें, इसके बाद सीडिंग माध्यम में गोली का पुनरुत्थान करें। एक कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस के सीडिंग के लिए, सेल पेलेट को फिर से निलंबित करने के लिए सीडिंग माध्यम के 20 माइक्रोन का उपयोग करें (यानी, एक गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस को सीडिंग करते समय सीडिंग माध्यम के 20 माइक्रोन का उपयोग करें)।
  10. व्यवहार्य कोशिकाओं की एकाग्रता को 1 × 107 कोशिकाओं / एमएल को सीडिंग माध्यम के साथ संशोधित करें जैसा कि पहले बताया गयाथा 2. ट्राइपैन नीले रंग के 10 माइक्रोन के साथ सेल निलंबन के 10 माइक्रोन के संयोजन से हेमोसाइटोमीटर का उपयोग करके व्यवहार्यता मूल्यांकन करें, और फिर माइक्रोस्कोप के तहत कोशिकाओं का निरीक्षण करें।
    नोट: इष्टतम सेल लगाव और चिप झिल्ली पर एक समान मोनोलेयर के गठन को सुनिश्चित करने के लिए सेल एकाग्रता को उचित रूप से समायोजित करना महत्वपूर्ण है। यदि कोशिकाओं की प्रारंभिक संख्या अपर्याप्त है, तो इसके परिणामस्वरूप एक संगम मोनोलेयर की विलंबित या असफल स्थापना हो सकती है। इसके विपरीत, यदि कोशिकाओं की संख्या अत्यधिक है, तो गैर-पक्षपाती कोशिकाएं चैनल के भीतर गुच्छों में एकत्र हो सकती हैं, जिससे अवांछनीय एकाग्रता प्रभाव हो सकता है।

4. सीडिंग और एक 2 डी सेल मोनोलेयर का गठन

  1. ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए आउटलेट टयूबिंग डिस्कनेक्ट. सुनिश्चित करें कि ऊपरी माइक्रोचैनल की बाईपास टयूबिंग खुली रहती है। उन्हें क्लैंप करने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करके निचले माइक्रोचैनल के इनलेट और आउटलेट दोनों को सुरक्षित करें।
  2. P100 या P20 माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, प्रोटोकॉल 3 से सेल निलंबन के 20 माइक्रोन को ऊपरी माइक्रोचैनल(चित्रा 3B सीडिंग)के आउटलेट छेद में पेश करें।
  3. इसे क्लैंप करने के लिए बाइंडर क्लिप का उपयोग करके ऊपरी माइक्रोचैनल के बाईपास और इनलेट टयूबिंग को सुरक्षित करें। फिर, ऊपरी microchannel के आउटलेट छेद करने के लिए आउटलेट टयूबिंग reattach है, सुनिश्चित करना है कि टयूबिंग ऊपरी microchannel के लिए लागू किया जा रहा किसी भी दबाव से बचने के लिए प्रक्रिया के दौरान खुला रहता है. इस कदम के बाद, ऊपरी चैनल के आउटलेट टयूबिंग धीरे-धीरे एक बांधने की मशीन क्लिप का उपयोग सुरक्षित करने के लिए यह दबाना.
  4. एक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके सत्यापित करें कि कोशिकाओं को समान रूप से ऊपरी माइक्रोचैनल में वितरित किया जाता है।
    नोट: यह चैनल के भीतर माध्यम की गति को रोकने के लिए टयूबिंग दबाना महत्वपूर्ण है स्थिर स्थिर स्थिति की अनुमति देने के लिए जब तक वांछनीय सेल लगाव पूरा किया जाता है.
  5. चिप को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक आर्द्र सीओ2 इनक्यूबेटर में रखें।
    नोट: ईसीएम कोटिंग(चित्रा 3बी अटैचमेंट)से जुड़ने के लिए कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं के लिए लगभग 3 घंटे लगते हैं।
  6. एक सीओ2 इनक्यूबेटर के भीतर तैनात एक सिरिंज पंप के लिए आंत पर एक चिप के ऊपरी माइक्रोचैनल से जुड़ी सिरिंज कनेक्ट करें.
    नोट: सिरिंज पंप के नॉब का उपयोग करके माध्यम को माइक्रोचैनल में सावधानीपूर्वक फ्लश करें और अनबाउंड कोशिकाओं को हटा दें। यह सुनिश्चित करने के लिए माइक्रोस्कोप के नीचे चिप की जांच करें कि किसी भी अनासक्त कोशिकाओं को प्रभावी ढंग से धोया गया है।
  7. बीजारोपण माध्यम के साथ 30 μL/h पर संस्कृति माध्यम के प्रवाह की शुरुआत करें। यह निरंतर प्रवाह केवल ऊपरी माइक्रोचैनल के लिए शुरू में एक गट-ऑन-ए-चिप पर 2 डी मोनोलेयर स्थापना तक होता है। निचले माइक्रोचैनल के लिए, माइक्रोचैनल को छोड़ देंamped और माध्यम को अनफ्लश करें।
  8. कोशिकाओं वरीयता प्राप्त कर रहे हैं के बाद दिन से, A8301 शामिल हैं और बोने के माध्यम से 10 माइक्रोन Y-27632 और 2.5 माइक्रोन CHIR99021 की कमी है, जो organoid संस्कृति माध्यम के लिए संस्कृति माध्यम में परिवर्तन.
  9. एक बार मोनोलेयर स्थापित हो जाने के बाद, निरंतर मध्यम प्रवाह को निचले माइक्रोचैनल में भी आरंभ करें। उपकला मोनोलेयर्स (चित्रा 3सी)स्थापित करने के लिए कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड उपकला कोशिकाओं के लिए आमतौर पर 2 से 3 दिन लगते हैं।

5. कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप में 3डी मॉर्फोजेनेसिस की स्थापना

नोट: संगम मोनोलेयर्स के बाद गुट-ऑन-ए-चिप में बनते हैं, ऊपरी चैनल और निचले चैनल और सेल स्ट्रेन दोनों के मध्यम प्रवाह को 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को 2 डी मोनोलेयर में शुरू करने के लिए पेश किया गया था जैसा कि चित्रा 2में प्रस्तुत किया गया है।

  1. एक आंत पर एक चिप प्रणाली में 3 डी morphogenesis के विकास आरंभ करने के लिए ऊपरी और निचले दोनों microchannels में organoid संस्कृति माध्यम परिचय. मौजूदा गट-ऑन-ए-चिप डिजाइन (यानी, 500 माइक्रोन ऊंचाई माइक्रोचैनल) में 0.02 डाइन/सेमी2 के कतरनी तनाव को प्राप्त करने के लिए, प्रवाह दर को 50 माइक्रोन / एच29 तक बढ़ाएं।
  2. सेल तनाव के 10% और आवृत्ति के 0.15 हर्ट्ज आरंभ करें, जैसा कि2 से पहले अनुशंसित है, इन विट्रो में सुसंस्कृत कोशिकाओं के लिए चक्रीय तनाव लागू करने वाले कंप्यूटर-विनियमित बायोरिएक्टर का उपयोग करके। यह प्रक्रिया गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस पर वैक्यूम सक्शन लागू करेगी।
  3. कम से कम 2 से 3 दिनों के लिए इन संस्कृति स्थितियों को बनाए रखें। कैनाइन आंतों मोनोलेयर का 3 डी मॉर्फोजेनेसिस आमतौर पर ड्यूरल चैनल प्रवाह और वैक्यूम सक्शन शुरू होने के 2 से 3 दिन बाद होता है(चित्रा 3सी)।

6. कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप की विशेषता

  1. लाइव सेल इमेजिंग
    1. धीरे सिरिंज पंप का उपयोग माध्यम बह द्वारा आंत पर एक चिप में किसी भी हवा बुलबुले निकालें.
    2. सिरिंज पंप से गट-ऑन-ए-चिप डिवाइस को डिस्कनेक्ट करें।
      नोट: किसी भी पैंतरेबाज़ी से बचें जो गट-ऑन-ए-चिप के भीतर दबाव लागू कर सकता है।
    3. स्थापित 3 डी उपकला की छवियों को पकड़ने के लिए डिवाइस को माइक्रोस्कोप पर रखें। चरण-विपरीत का उपयोग करके 3 डी उपकला परतों की संरचना की कल्पना करने के लिए, 10x और 20x उद्देश्यों(चित्रा 3सी)का उपयोग करें।
  2. इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना
    1. 2% बीएसए बनाने के लिए फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस) के 50 एमएल में बीएसए के 1 ग्राम को भंग करके अवरुद्ध समाधान तैयार करें। निस्पंदन के लिए 0.2 माइक्रोन के सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान पास करें। इस घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित रखें।
    2. अवरुद्ध समाधान के 50 एमएल के साथ ट्राइटन एक्स -100 के 150 माइक्रोन के संयोजन से पारगम्यता समाधान तैयार करें, जिसके परिणामस्वरूप 0.3% ट्राइटन एक्स -100 की अंतिम एकाग्रता होती है। निस्पंदन के लिए 0.2 माइक्रोन के सिरिंज फिल्टर के माध्यम से समाधान पास करें। इस घोल को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहित रखें।
    3. चरणों 2.4-2.11 में वर्णित के रूप में ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स में 4% पीएफए के 100 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं का निर्धारण करें।
    4. पीबीएस के 100 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स में इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को कुल्ला करें जैसा कि चरणों 2.4-2.11 में वर्णित है।
    5. चरणों 2.4-2.11 में वर्णित के रूप में ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल में 0.3% ट्राइटन के 100 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा कोशिकाओं के permeabilization प्रदर्शन. 30 मिनट के लिए आरटी पर डिवाइस रखें.
    6. पीबीएस के 100 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स में इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को कुल्ला करें जैसा कि चरणों 2.4-2.11 में वर्णित है।
    7. चरणों 2.4-2.11 में वर्णित के रूप में ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स के लिए 2% बीएसए के 100 माइक्रोन इंजेक्शन द्वारा निरर्थक बंधन को रोकने के लिए कोशिकाओं के अवरुद्ध प्रदर्शन करें। डिवाइस को 1 घंटे के लिए आरटी पर रखें।
    8. 2% बीएसए में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें और इसे 3 घंटे के लिए आरटी पर रखें, इसके बाद रात भर इनक्यूबेशन 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी टयूबिंग रात भर के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन के दौरान क्लैंप किया गया है। एक प्राथमिक एंटीबॉडी की एकाग्रता मोनोलेयर या 3 डी ऑर्गेनॉइड धुंधला (पूरक चित्रा एस 1) के लिए अनुशंसित एकाग्रता से 2-5 गुना अधिक होना चाहिए।
    9. पीबीएस के 100 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स को इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को कुल्ला जैसा कि चरण 2.4-2.11 में वर्णित है।
    10. 2% बीएसए में पतला माध्यमिक एंटीबॉडी समाधान के 20 माइक्रोन इंजेक्ट करें और इसे 1 घंटे के लिए आरटी पर रखें।
      नोट: सुनिश्चित करें कि सभी टयूबिंग हैamp इनक्यूबेशन के दौरान । इस चरण से शुरू होकर, फोटोब्लीचिंग को रोकने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ डिवाइस सेटअप को ढालना आवश्यक है।
    11. पीबीएस के 100 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स को इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को कुल्ला जैसा कि चरण 2.4-2.11 में वर्णित है।
    12. एफ-एक्टिन और डीएपीआई (डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल) काउंटरस्टेनिंग के लिए एक संयुक्त समाधान तैयार करें। संयुक्त समाधान के 20 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स में इंजेक्ट करें जैसा कि चरण 2.4-2.11 में वर्णित है।
    13. पीबीएस के 100 माइक्रोन को ऊपरी और निचले दोनों माइक्रोचैनल्स में इंजेक्शन लगाकर कोशिकाओं को कुल्ला करें जैसा कि चरणों 2.4-2.11 में वर्णित है।
      एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप या एक confocal माइक्रोस्कोप का उपयोग कर 3 डी उपकला कोशिकाओं की वास्तुकला की प्रतिदीप्ति इमेजिंग प्रदर्शन.

7. उपकला बाधा समारोह

  1. धीरे सिरिंज पंप का उपयोग माध्यम बह द्वारा आंत पर एक चिप में किसी भी हवा बुलबुले निकालें. सुनिश्चित करें कि माप के दौरान सभी टयूबिंग खुली है।
  2. सिरिंज पंप से आंत पर एक चिप निकालें और कम से कम 10 मिनट के लिए आरटी पर जगह है.
  3. 70% EtOH समाधान से Ag/AgCl इलेक्ट्रोड निकालें।
  4. एक मल्टीमीटर का उपयोग करके उपकला परत के प्रतिरोध को मापने के लिए क्रमशः ऊपरी इनलेट और निचले आउटलेट में दो एजी/एजीसीएल इलेक्ट्रोड रखें।
  5. दो Ag/AgCl इलेक्ट्रोड को क्रमशः निचले इनलेट और ऊपरी आउटलेट में रखें। गट-ऑन-ए-चिप के प्रतिरोध मूल्य के रूप में इन दो मूल्यों के माध्य की रिपोर्ट करें।
    नोट: रिक्त टीईईआर को उपकला के बिना केवल ईसीएम कोटिंग के साथ एक गट-ऑन-ए-चिप पर मापा जाना चाहिए।
  6. ट्रांसपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध (टीईईआर) मूल्य (केΩ × सेमी2) की गणना समीकरण (1) का उपयोग करके गणना की जा सकती है।
    TEER = (Ωt - Ωरिक्त) × A (1)
    जहां Ωटी प्रयोग की शुरुआत के बाद से विशिष्ट समय बिंदु पर मापा गया एक प्रतिरोध मान है, Ωरिक्त एक प्रतिरोध मूल्य है जो उपकला के बिना उस समय मापा जाता है, और ए एक सेल परत द्वारा कवर सतह का क्षेत्र है (लगभग 0.11 सेमी2 इस आंत-ऑन-ए-चिप डिजाइन29 के लिए)।
    1. समीकरण (2) का उपयोग करके सामान्यीकृत टीईईआर की गणना करें।
      तीर = Equation 1 (2)
      जहां Ω0 प्रयोग के प्रारंभिक पढ़ने के समय बिंदु पर एक प्रतिरोध मूल्य है जैसा कि पहले30 (चित्रा 4 सी) की सूचना दी गई थी।

Representative Results

यह प्रोटोकॉल मज़बूती से एक आंत-ऑन-ए-चिप प्रणाली में 3 डी आंतों के आकारिकी के सहज विकास की सुविधा प्रदान करता है। यह दृष्टिकोण सूजन आंत्र रोग (आईबीडी)(चित्रा 1बी)से प्रभावित कुत्तों से प्राप्त आंतों के ऑर्गेनोइड से प्राप्त कैनाइन आंतों के उपकला कोशिकाओं का उपयोग करता है। कैनाइन आंतों के उपकला कोशिकाओं के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के समसामयिक क्लस्टरिंग को मध्यम प्रवाह(चित्रा 3सी)के 6-9 दिनों के बाद पूरे माइक्रोचैनल में देखा जा सकता है। चरण-विपरीत तकनीकों का उपयोग करके इन रूपात्मक परिवर्तनों की निगरानी की जा सकती है। इस अध्ययन में, हमने आईबीडी के निदान वाले दो कुत्तों से प्राप्त ऑर्गेनोइड का उपयोग किया। विशेष रूप से, सफल 3 डी मॉर्फोजेनेसिस दो जैविक प्रतिकृतियों में देखा गया था, जिनमें से प्रत्येक को दो तकनीकी प्रतिकृतियों के साथ किया गया था। इस अध्ययन के निष्कर्ष अन्य कैनाइन दाताओं से प्राप्त आंतों के ऑर्गेनोइड से जुड़े भविष्य की जांच के लिए एक आधार प्रदान करते हैं। ये परिणाम हमारे प्रयोगात्मक दृष्टिकोण की संभावित प्रयोज्यता और पुनरावृत्ति को प्रदर्शित करते हैं, जो पहले मानव नमूनों में रिपोर्ट किया गया है। ये निष्कर्ष आगे की पुष्टि प्रदान करते हैं कि गट-ऑन-ए-चिप तकनीक कैनाइन आंतों के उपकला कोशिकाओं पर लागू होती है जैसा कि पहले मानव आंतों के उपकलाकोशिकाओं का उपयोग करने वाले अध्ययनों के साथ रिपोर्ट किया गया था।

इस प्रोटोकॉल से पता चला है कि इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना पारंपरिक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी(चित्रा 4,ए,बी)का उपयोग कर माइक्रोफ्लुइडिक चिप्स में विलस जैसी संरचनाओं का गठन किया है कि ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर्स की 3 डी संरचना का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल immunofluorescence धुंधला के माध्यम से विभेदित और स्थानिक संगठित सेलुलर phenotypes मान्य करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है. एक आंत पर एक चिप के भीतर एक 3 डी morphogenesis के दृश्य विभिन्न रोग बातचीत 14,23,31 के दौरान मेजबान प्रतिक्रिया की जांच करने के लिए एक उत्कृष्ट अवसर प्रदान करता है. जब रोगी दाताओं से व्युत्पन्न उपकला कोशिकाओं के साथ संयुक्त, जैसा कि पहले मनुष्यों में वर्णित है, इस तकनीक का उपयोग आंतों के रोगों के व्यक्तिगत मॉडल13 के निर्माण के लिए किया जा सकता है। स्वस्थानी संकरण में प्रतिदीप्ति की तरह लक्षित शाही सेना दृश्य तकनीक के साथ immunofluorescence इमेजिंग के एकीकरण के माध्यम से, यह नेत्रहीन एक आंत पर एक चिप प्रणाली के भीतर मेजबान के transcriptomes और proteomes का विश्लेषण करने के लिए संभव हो सकता है.

आंतों की झिल्ली की अखंडता को संरक्षित करना आंतों के होमियोस्टेसिस को बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, और आंत-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म इस महत्वपूर्ण कार्य की सटीक निगरानी और मात्रा का ठहराव की अनुमति देकर एक मूल्यवान लाभ प्रदान करता है। गट-ऑन-ए-चिप तकनीक का उपयोग करके TEER का मापन कई लाभ प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, पिछले अध्ययनों ने टीईईआर का सफलतापूर्वक मूल्यांकन किया है, जबकि गैर-रोगजनक और प्रोबायोटिक बैक्टीरिया32 के साथ-साथ लीकी-आंत स्थितियों के तहत आंतों की कोशिकाओं को सह-संवर्धन23 के तहत। यह शोधकर्ताओं को आंतों के बाधा समारोह पर विभिन्न स्थितियों के प्रभाव का अध्ययन करने और आंतों के स्वास्थ्य को बढ़ावा देने के लिए संभावित हस्तक्षेपों की पहचान करने की अनुमति देता है।

Figure 1
चित्रा 1: रोगी-व्युत्पन्न कैनाइन आईबीडी गट-ऑन-ए-चिप की स्थापना। (ए) रोगी-व्युत्पन्न आंतों के ऑर्गेनोइड और गट-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म का एकीकरण। दाता-विशिष्ट आंतों के ऑर्गेनोइड विकसित करने के लिए आंतों के क्रिप्ट कोशिकाओं को अलग करने के लिए एंडोस्कोपी बायोप्सी की जा सकती है। उपकला कोशिकाओं को ऑर्गेनोइड से एकल कोशिकाओं में अलग किया जा सकता है, फिर पीडीएमएस-आधारित गट-ऑन-ए-चिप में वरीयता प्राप्त की जा सकती है और एक अद्वितीय गतिशील माइक्रोएन्वायरमेंट में सुसंस्कृत किया जा सकता है। (बी) एक आईबीडी कुत्ते से कोलोनॉइड की प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 100 माइक्रोन। (सी) यह योजनाबद्ध एक आंत-ऑन-ए-चिप डिवाइस दिखाता है जिसमें ऊपरी और निचले माइक्रोचैनल्स के बीच रखा गया झरझरा झिल्ली होता है। ऊपरी माइक्रोचैनल को नीले क्षेत्र द्वारा इंगित किया जाता है, जबकि निचले माइक्रोचैनल को लाल क्षेत्र द्वारा इंगित किया जाता है। वैक्यूम कक्षों क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला गति24 नकल करने के लिए झरझरा झिल्ली विकृत, जो microchannel, के प्रत्येक पक्ष पर मौजूद हैं. (डी) कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप के एक सेटअप में एक पीडीएमएस-आधारित गट-ऑन-ए-चिप शामिल है जो टयूबिंग के साथ इकट्ठा होता है जिसे कवरस्लिप 2,24 पर रखा जाता है। बाईपास टयूबिंग हैंडलिंग के दौरान microchannel के भीतर निर्मित दबाव से बचने के लिए महत्वपूर्ण है (यानी, सीरिंज से कनेक्ट). बाइंडर क्लिप का उपयोग ट्यूबिंग को क्लैंप करने के लिए किया जाता है। वॉल्यूम-संवेदनशील सामग्री को ऊपरी या निचले आउटलेट के खुले छेद के माध्यम से संक्रमित किया जा सकता है। ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम को सीरिंज को कुंद अंत सुइयों और ऊपरी और निचले इनलेट के माध्यम से प्रवाह से जोड़कर संक्रमित किया जा सकता है। संक्षिप्ताक्षर: आईबीडी = सूजन आंत्र रोग; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्रा 2: कैनाइन आईबीडी गट-ऑन-ए-चिप में विलस जैसी संरचनाओं का गठन। विघटित उपकला कोशिकाओं को ईसीएम-लेपित गट-ऑन-ए-चिप में वरीयता दी गई थी। एक बार जब अलग-अलग कोशिकाओं को पीडीएमएस झिल्ली से जोड़ा गया, तो 3 दिनों (डी 0-डी 3) के लिए एपिकल प्रवाह शुरू किया गया था। जब एक संगम 2D मोनोलेयर बनता है (D3), बार-बार खींचने के साथ बेसोलेटरल प्रवाह शुरू किया जाता है (स्ट्रेचिंग, एपी और बीएल फ्लो)। दोहरे प्रवाह और झिल्ली के खिंचाव के 2-3 दिनों के बाद, 2 डी मोनोलेयर 3 डी मॉर्फोजेनेसिस विकसित करना शुरू कर देता है, और 9 दिनों की संस्कृति (3 डी मॉर्फोजेनेसिस, डी 9-डी 12) के बाद विलस जैसी संरचनाएं बनती हैं। संक्षिप्ताक्षर: ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; एपी = एपिकल; BL = बेसोलेटरल। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: कैनाइन आंतों के ऑर्गेनॉइड सीडिंग और एक गट-ऑन-ए-चिप में 3 डी मॉर्फोजेनेसिस। (ए) पीडीएमएस आधारित गट-ऑन-ए-चिप में झरझरा झिल्ली की सतह सक्रियण के लिए प्रयोगात्मक कदम। यूवी/ओजोन उपचार, पीईआई और जीए उपचार का संयोजन के रूप में उपयोग ईसीएम समाधानों में मौजूद अमाइन के क्रॉस-लिंकिंग की सुविधा प्रदान करता है। यह प्रक्रिया छिद्रपूर्ण झिल्ली पर ईसीएम प्रोटीन के स्थिर स्थिरीकरण की ओर ले जाती है। (बी)चरण विपरीत छवियों तुरंत बोने (बाएं) और 3-5 घंटे बोने (दाएं) के बाद कोशिकाओं की आकृति विज्ञान का प्रदर्शन. सीडिंग के 3 घंटे के बाद झरझरा झिल्ली पतले और गहरे क्षेत्रों को प्रदर्शित करती है जहां एकल कोशिकाएं संलग्न होती हैं, लगाव प्रक्रिया को उजागर करती हैं। (सी) चरण विपरीत छवियां एक आंत-ऑन-ए-चिप प्रणाली के भीतर आंतों के मोनोलेयर्स के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस को दर्शाती हैं। इन मोनोलेयर्स को आईबीडी से प्रभावित कुत्तों से प्राप्त किया गया था और इन ऑर्गेनॉइड कोशिकाओं को गतिशील परिस्थितियों में 12 दिनों की अवधि के लिए सुसंस्कृत किया गया था, जिसमें द्रव प्रवाह और स्ट्रेचिंग गति शामिल थी। स्केल बार = 50 माइक्रोन (बी, सी)। संक्षिप्ताक्षर: आईबीडी = सूजन आंत्र रोग; ईसीएम = बाह्य मैट्रिक्स; पीडीएमएस = पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन; पीईआई = पॉलीथीनमाइन; GA = ग्लूटार्डाल्डिहाइड। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: रोगी-व्युत्पन्न कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप में 3 डी रूपात्मक विकास का मूल्यांकन। (ए) एक कैनाइन आईबीडी गट-ऑन-ए-चिप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग, 12 दिनों की संस्कृति के बाद पूरी तरह से विकसित 3 डी उपकला के टॉप-डाउन दृश्य को प्रदर्शित करती है, जिसका मूल्यांकन प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप द्वारा किया जाता है। तंग जंक्शन प्रोटीन (ZO-1) को पीले रंग में देखा जाता है; ब्रश-बॉर्डर झिल्ली (एफ-एक्टिन) लाल रंग में दिखाई देती है; और नाभिक डीएपीआई से सने होते हैं और नीले दिखाई देते हैं। (बी)एक लंबी दूरी के लेंस के साथ एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके एक कैनाइन आईबीडी गट-ऑन-ए-चिप की इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग। जैसा कि योजनाबद्ध में दिखाया गया है, 12 दिनों की संस्कृति के बाद पूरी तरह से विकसित 3 डी उपकला की विलस जैसी संरचना के क्रॉस सेक्शन की एक फ्लोरोसेंट छवि दिखाई गई है। इसके अलावा, जेड-स्टैकिंग 3 डी एपिथेलियम का एक साइड व्यू दिखाता है, जो विलस जैसी संरचनाओं के गठन का खुलासा करता है। ब्रश-बॉर्डर झिल्ली (एफ-एक्टिन) लाल रंग में दिखाई देती है, और नाभिक डीएपीआई से सना हुआ होता है और नीला दिखाई देता है। (सी) आंत्र बाधा समारोह का मूल्यांकन और टीईईआर द्वारा रोगी-व्युत्पन्न कैनाइन गट-ऑन-ए-चिप्स में मापा गया था। गट-ऑन-ए-चिप पर संस्कृति के दिन 5 पर स्थिर टीईआर मूल्यों तक पहुंच गए थे। त्रुटि पट्टियाँ माप के SEM को व्यक्त करती हैं। टीईईआर मूल्य को एक तकनीकी प्रतिकृति के साथ दो जैविक प्रतिकृतियों के बीच मापा गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन (ए), 25 माइक्रोन (बी)। संक्षिप्ताक्षर: आईबीडी = सूजन आंत्र रोग; डीएपीआई = 4', 6-डायमिडिनो-2-फेनिलिंडोल; TEER = ट्रान्सीपीथेलियल विद्युत प्रतिरोध। कृपया इस चित्र का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

अनुपूरक चित्रा एस 1: कैनाइन कोलोनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर्स में और आंत-ऑन-ए-चिप उपकरणों पर एंटी-जेडओ -1 पॉलीक्लोनल एंटीबॉडी की विशेषता। (ए)लाल रंग में एफ-एक्टिन और उनकी ओवरले छवि के साथ पीले रंग में जेडओ -1 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला हो जाना। स्केल बार = 25 माइक्रोन। (बी) 'लीकी गट चिप्स' में पीले रंग में जेडओ -1 का इम्यूनोफ्लोरेसेंस दृश्य विभिन्न परिस्थितियों में आयोजित किया गया था, जिसमें प्रोबायोटिक बैक्टीरिया (एलजीजी + साइटोकिन्स या वीएसएल # 3 + साइटोकिन्स) के साथ उत्तेजना और प्रोबायोटिक उत्तेजना (साइटोकिन्स) के बिना रोगाणु मुक्त नियंत्रण शामिल हैं। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा मिन एट अल.23 से पुन: प्रस्तुत किया गया है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

पूरक तालिका एस 1: ऊतक दाताओं की जानकारी का सारांश। दाताओं की आयु, लिंग, नस्ल, हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन और कैनाइन आईबीडी गतिविधि सूचकांक (सीआईबीडीएआई) स्कोर की एक सारांश तालिका। CIBDAI एक संख्यात्मक स्कोरिंग प्रणाली है जिसका उपयोग कैनाइन आईबीडी33 में नैदानिक गंभीरता का अनुमान लगाने के लिए किया जाता है। कृपया इस फ़ाइल को डाउनलोड करने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Discussion

यह अध्ययन एक कैनाइन आईबीडी गट-ऑन-ए-चिप मॉडल के विकास के साथ कैनाइन आंतों के ऑर्गेनोइड की संगतता के अग्रणी प्रदर्शन को चिह्नित करता है। आंतों के ऑर्गेनोइड और ऑर्गेनोइड-व्युत्पन्न मोनोलेयर संस्कृतियों के एकीकरण ने एक माइक्रोफ्लुइडिक सिस्टम (यानी, गट-ऑन-ए-चिप सिस्टम) में तकनीक को और विकसित किया है, जिससे इन विट्रो आंतों के मॉडल का निर्माण सक्षम हो गया है जो शारीरिक गतिशीलता की बारीकी से नकल करते हैं और जैविक स्थितियों के अधिक प्रतिनिधि हैं। विशेष रूप से, चूंकि मनुष्यों में आईबीडी-व्युत्पन्न ऑर्गेनोइड का उपयोग करके गट-ऑन-ए-चिप संस्कृति की बहुत कम रिपोर्टें हैं, इसलिए कैनाइन आईबीडी-व्युत्पन्न गट-ऑन-ए-चिप का उपयोग करने वाला वर्तमान अध्ययन मनुष्यों में आईबीडी के अध्ययन में अग्रणी अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकता है।

गट-ऑन-ए-चिप पर कैनाइन आंतों के उपकला 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के सफल विकास के लिए कई महत्वपूर्ण चरणों पर सावधानीपूर्वक ध्यान देने की आवश्यकता होती है। सबसे पहले, पीडीएमएस माइक्रोफ्लुइडिक चैनलों की हाइड्रोफोबिक सतह ईसीएम आसंजन और बाद में सेल लगाव को बाधित कर सकती है, ईसीएम कोटिंग और सेल सीडिंग से पहले पीडीएमएस की सतह सक्रियण की आवश्यकता होती है (प्रोटोकॉल अनुभाग 1 देखें)। एक स्थिर monolayer संस्कृति को प्राप्त करने के लिए, अतिरिक्त अनासक्त कोशिकाओं को हटाने सेल लगाव (प्रोटोकॉल कदम 4.6-4.7) निम्नलिखित महत्वपूर्ण है. इसके अतिरिक्त, गतिशील उत्तेजना, जैसे निरंतर मध्यम प्रवाह और क्रमिक वृत्तों में सिकुड़नेवाला जैसी वैक्यूम गति, आंतों के उपकला (प्रोटोकॉल चरण 5.2) के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के लिए आवश्यक है। गुट-ऑन-ए-चिप संस्कृति के किसी भी चरण के दौरान माइक्रोचैनल में हवा के बुलबुले से बचने के लिए सावधानीपूर्वक हैंडलिंग आवश्यक है।

यदि गट-ऑन-ए-चिप में खराब सेल सीडिंग का सामना करना पड़ रहा है, तो यह कम सेल नंबर या खराब सेल अटैचमेंट के कारण हो सकता है। कम सेल संख्याओं का निवारण करने के लिए, मैट्रिगेल में उनकी वृद्धि को देखकर तैयार आंतों के ऑर्गेनोइड के स्वास्थ्य का निरीक्षण करना महत्वपूर्ण है। सेल व्यवहार्यता सेल पृथक्करण के बाद Trypan नीले धुंधला द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है सुनिश्चित करने के लिए कोशिकाओं के 20% से अधिक मृत हैं. यदि व्यवहार्य सेल नंबर अपर्याप्त हैं, तो ऑर्गेनॉइड मध्यम स्थितियों को अनुकूलित करने का प्रयास किया जा सकता है। एक और संभावना अपूर्ण ऑर्गेनॉइड पृथक्करण है, जिसके परिणामस्वरूप 70 माइक्रोन से बड़े सेल क्लंप की अधिकता होती है जो फिल्टर द्वारा फंस जाती है। इसे हल करने के लिए, एक विकल्प सेल पृथक्करण के दौरान पाइपिंग की अवधि का विस्तार करना है। वैकल्पिक रूप से, 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को ट्रिप्सिन जैसे प्रोटीज के साथ इलाज के दौरान हर मिनट धीरे से उत्तेजित किया जा सकता है। गट-ऑन-ए-चिप के लिए खराब सेल लगाव अनुचित ईसीएम कोटिंग के कारण हो सकता है। कोटिंग प्रक्रिया के दौरान, यह सलाह दी जाती है कि हवाई बुलबुले की उपस्थिति की सावधानीपूर्वक जांच करें और आवश्यकतानुसार अधिक कोटिंग समाधान जोड़कर धीरे से उनके गठन को रोकें। कोशिकाओं की भीड़भाड़ और अनासक्त कोशिकाओं को धोने में विफलता के परिणामस्वरूप अपर्याप्त प्रारंभिक मोनोलेयर हो सकता है। ऐसे मामले में, सिरिंज प्लंजर को धक्का देते समय एक हल्के स्पंदन को लागू किया जा सकता है। ये समस्या निवारण चरण गट-ऑन-ए-चिप संस्कृति प्रक्रिया के दौरान समस्याओं को पहचानने और उनका समाधान करने में मदद कर सकते हैं।

जबकि यह गट-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म लहरदार 3 डी उपकला परतों के निर्माण को सक्षम बनाता है, हम आंतों के माइक्रोएन्वायरमेंट को पूरी तरह से दोहराने के लिए अतिरिक्त जैविक जटिलता की आवश्यकता को पहचानते हैं। उपकला और मेसेनकाइमल कोशिकाओं के बीच बातचीत, 3 डी पुनर्जनन के लिए ईसीएम के जमाव और क्रिप्ट-विलस विशेषताओं की उपस्थिति पर विचार करना महत्वपूर्ण है जो एक उपयुक्त स्टेम सेल आला स्थापित करते हैं। स्ट्रोमल कोशिकाएं, जैसे फाइब्रोब्लास्ट्स, ईसीएम प्रोटीन के उत्पादन और आंतों की आकृति विज्ञान34,35,36के नियमन में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। इस मॉडल में मेसेनकाइमल कोशिकाओं को शामिल करने से मॉर्फोजेनेसिस और सेल अटैचमेंट की दक्षता दोनों को बढ़ाने की क्षमता है। एंडोथेलियल परतें, जो केशिका वाहिका और लसीका वाहिकाओं को शामिल करती हैं, आणविक परिवहन को नियंत्रित करने और प्रतिरक्षा कोशिकाओं37,38की भर्ती में महत्वपूर्ण भूमिका निभाती हैं। रोगी व्युत्पन्न प्रतिरक्षा कोशिकाओं का समावेश आंतों के रोगों मॉडलिंग में आवश्यक हो सकता है के रूप में यह जन्मजात और अनुकूली प्रतिरक्षा के बीच परस्पर क्रिया के प्रदर्शन के साथ ही ऊतक-विशिष्ट प्रतिरक्षा39 की स्थापना के लिए अनुमति देता है. गट-ऑन-ए-चिप पर 3 डी मॉर्फोजेनेसिस के पूरा होने के बाद, ऑर्गेनॉइड कल्चर माध्यम को ऑर्गेनॉइड भेदभाव माध्यम में संशोधित किया जा सकता है। यह प्रयोगात्मक उद्देश्यों के आधार पर अतिरिक्त सेलुलर भेदभाव को प्रेरित करने के लिए एक व्यवहार्य दृष्टिकोण हो सकता है।

सीटू में 3 डी माइक्रोआर्किटेक्चर इमेजिंग लंबी कामकाजी दूरी की आवश्यकता के कारण चुनौतीपूर्ण है, जिसे लंबी दूरी के उद्देश्य से दूर किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, परत-दर-परत माइक्रोफैब्रिकेशन और बॉन्डिंग विधियां एसईएम के साथ परीक्षा के लिए ऊपरी परतों तक पहुंचना मुश्किल बनाती हैं। वर्तमान गट-ऑन-ए-चिप डिज़ाइन के लिए, गट-ऑन-ए-चिप माइक्रोडिवाइस प्रति एक सिरिंज पंप की आवश्यकता होती है, सीओ2 इनक्यूबेटर स्पेस पर कब्जा करना और बड़े पैमाने पर प्रयोगों को रोकना। उपयोगकर्ता के अनुकूल मंच और उच्च-थ्रूपुट स्क्रीनिंग के लिए मापनीयता बढ़ाने के लिए नवाचारों की आवश्यकता है।

ये वर्तमान प्रोटोकॉल इन विट्रो में 3 डी उपकला परतों के सहज विकास के लिए अनुमति देते हैं, पारंपरिक 3 डी ऑर्गेनोइड्स, 2 डी मोनोलेयर्स और स्थिर माइक्रोडिवाइस कल्चर सिस्टम की सीमाओं को पार करते हैं। इन विट्रो आंतों के माइक्रोएन्वायरमेंट में इस गतिशील को विभिन्न सेल प्रकारों की सह-संस्कृति शुरू करके नियंत्रित किया जा सकता है। पिछले अध्ययनों ने आंतों के माइक्रोबायोम14,23 और परिधीय मोनोन्यूक्लियर कोशिकाओं30 की सह-संवर्धन सहित आंत-ऑन-ए-चिप माइक्रोएन्वायरमेंट में हेरफेर करने के तरीकों का पता लगाया है। इस पुनर्गठित माइक्रोएन्वायरमेंट में कई संभावित अनुप्रयोग हैं, जिनमें दवा परीक्षण, मौलिक यंत्रवत अध्ययन और रोग मॉडलिंग शामिल हैं। पुनर्निर्मित माइक्रोएन्वायरमेंट में अनुप्रयोगों की एक विस्तृत श्रृंखला के लिए महत्वपूर्ण क्षमता है, जैसे कि दवा परीक्षण 23,40,41 और रोग मॉडलिंग 12,13,14,30, साथ ही आंतों के मोर्फोजेनेसिस 42 की मौलिक यंत्रवत जांच। परख की एक किस्म या तो चयापचयों 43 के आकलन के लिए सतह पर तैरनेवाला इकट्ठा करके, जीनोमिक परीक्षा 2,32 के लिए कोशिकाओं को इकट्ठा करके, या नेत्रहीन बाद में immunofluorescence इमेजिंग23,44 के लिए लाइव सेल रंजक या निर्धारण का उपयोग कर कोशिकाओं की जांच करके प्रदर्शन किया जा सकता है.

यह अध्ययन एक गट-ऑन-ए-चिप प्लेटफॉर्म में कैनाइन आंतों के उपकला परतों के 3 डी मॉर्फोजेनेसिस विकसित करने के लिए एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। परिणामी 3 डी उपकला संरचना आंतों के माइक्रोएन्वायरमेंट का अधिक यथार्थवादी प्रतिनिधित्व प्रदान करती है, जिसमें विभिन्न जैव चिकित्सा अध्ययनों में अनुप्रयोगों की अपार संभावनाएं हैं। इस आंतों की वास्तुकला का उपयोग करके, हम अधिक अनुवाद संबंधी अनुसंधान कर सकते हैं और संभावित रूप से आशाजनक परिणाम प्राप्त कर सकते हैं।

Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम WSU स्मॉल एनिमल इंटरनल मेडिसिन सर्विस (डॉ. जिलियन हेन्स, डॉ. सारा गेस, शेली एनसाइन LVT) और WSU VTH क्लिनिकल स्टडीज कोऑर्डिनेटर वैलोरी विस को नागरिक वैज्ञानिकों (रोगी दाताओं) से केस भर्ती और नमूना संग्रह में उनके समर्थन के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। इस काम को निदेशक कार्यालय, राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (K01OD030515 और R21OD031903 से वाईएमए) और जापान सोसाइटी फॉर द प्रमोशन ऑफ साइंस ओवरसीज चैलेंज प्रोग्राम फॉर यंग रिसर्चर्स (202280196 से आईएन) द्वारा समर्थित किया गया था। चित्रा 1 ए और चित्रा 3 ए BioRender.com के साथ बनाए गए थे।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

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Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

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