Summary
イヌ腸オルガノイドとGut-on-a-Chipマイクロ流体システムの統合により、ヒトの腸疾患に関連するトランスレーショナルモデルが提供されます。提示されたプロトコルは、腸の3D形態形成と動的 in vitro モデリングを可能にし、One Healthの犬と人間の腸疾患の効果的な治療法の開発を支援します。
Abstract
犬の腸は解剖学、微生物学、生理学において人間と類似しており、犬は自然に人間と同様の自然発生的な腸障害を発症します。腸上皮の頂端表面にアクセスする際の3次元(3D)オルガノイドの固有の制限を克服することで、オルガノイドに由来する細胞を使用してアクセス可能な管腔表面を露出させる2次元(2D)単層培養が生成されました。これらのオルガノイドとオルガノイド由来の単層培養物をマイクロ流体のGut-on-a-Chipシステムに統合することで、技術はさらに進化し、より生理学的に関連性のある動態in vitro 腸モデルの開発が可能になりました。
本研究では、炎症性腸疾患(IBD)に罹患したイヌから採取した初代腸組織サンプルを用いて、イヌ腸上皮の3次元形態形成を図るためのプロトコールを提示する。また、3D腸オルガノイド由来の細胞を用いて、2D単層培養および腸管オンチップシステムを生成および維持するためのプロトコルについても概説します。この研究で提示されたプロトコルは、犬用に特別に設計されたマイクロ流体Gut-on-a-Chipシステムを確立するための基本的なフレームワークとして機能します。この革新的なアプローチの基礎を築くことで、ワンヘルスイニシアチブの原則に沿って、生物医学およびトランスレーショナル研究におけるこれらの技術の適用を拡大することを目指しています。このアプローチを利用することで、犬とヒトの両方の腸生理学を研究するための、より生理学的に関連性のある動的 in vitro モデルを開発することができます。これは、生物医学および製薬の応用において、両種の腸疾患に対するより効果的な治療法の開発に役立つため、重要な意味を持ちます。
Introduction
腸管上皮の形態形成は、主に実験動物モデルによって研究されてきましたが、実験動物モデルはコストと時間がかかり、ヒトの発生プロセスを正確に表していません1。さらに、従来の静的な2D細胞培養モデルでは、3D上皮構造の複雑な空間構成を模倣する能力が欠けています2。その結果、腸管上皮構造の理解を進めるために、ヒト関連動物モデルの腸管上皮細胞を使用して in vitro 3D形態形成を誘導するプロトコルが必要です。
コンパニオン・ドッグは、家畜化中に環境と食事を共有していたため、腸の解剖学的構造とマイクロバイオームの組成が人間と非常によく似ています3。この類似性に加えて、人間と犬の両方に、腸の健康に起因すると考えられているさまざまな慢性的な罹患率があります。犬は、人間と同様に、肥満、認知機能障害、糖尿病、炎症性腸疾患(IBD)、結腸直腸腺癌などの慢性疾患を自然に発症する可能性があります4,5,6,7,8,9,10。以前のGut-on-a-Chip研究2,11,12,13,14でヒトおよびマウスの上皮細胞の開発と使用にもかかわらず、イヌの腸上皮はこれまで利用されていませんでした。イヌの腸管オルガノイド上皮を3D上皮形態形成の動的培養系で利用する私たちの新しいアプローチは、イヌとヒトの両方の医療に重要な意味を持ちます。
腸管オルガノイド培養の最近の進歩により、イヌ腸オルガノイド培養が確立されました15。この培養システムでは、定義されたモルフォゲンコンディショニング下で腸管幹細胞を培養し、成体幹細胞に由来する自己複製特性を持つ3Dモデルを作成します16。しかし、輸送アッセイや宿主とマイクロバイオームの共培養を行うことは、腸管腔が密閉されているため、この3Dモデルでは困難を伴います17。これに対処するために、研究者は腸管オルガノイドに由来する2D単層を生成し、内腔表面の露出を可能にしました18,19。しかし、3Dオルガノイドと2D単分子膜はどちらも静的な条件下で維持されており、腸内微小環境のin vivoバイオメカニクスを正確に反映していません。患者由来のイヌオルガノイド技術とin vitro 3D形態形成を組み合わせることで、慢性多因子疾患のトランスレーショナルリサーチの機会が得られます。このアプローチにより、研究者は人間と犬の両方に利益をもたらすより効果的な治療法を開発し、人間、動物、環境の健康の相互関連性を認識する共同アプローチであるOne Health Initiativeと連携して、トランスレーショナルリサーチをさらに進めることができます。複雑な健康課題に対処し、すべての人にとって最適な健康成果を達成するための学際的な協力を促進します。このイニシアチブは、人間、動物、生態系の相互依存性を理解することにより、新興感染症、環境悪化、およびその他の共通の健康上の懸念によるリスクを軽減することを目的としています20,21,22。
このプロトコルはpolydimethylsiloxane (PDMS)基づかせていた多孔質の膜が付いているGut-on-a-Chipのマイクロデバイス上の忍耐強いオルガノイドから得られる犬の腸の上皮細胞を培養するための広範囲な方法を概説する。イヌの腸管オルガノイドとこのGut-on-a-Chip技術を統合して3次元上皮形態形成を確立することで、腸管がどのように細胞組織と幹細胞ニッチを発達・維持しているかを研究することができます。このプラットフォームは、マイクロバイオームコミュニティが腸の健康に及ぼす影響を調査し、これらのコミュニティが腸の病態生理学に寄与する微生物代謝物をどのように生成するかを理解する貴重な機会を提供します14,23。これらの進歩は、現在、犬の腸サンプルにまで拡張することができ、研究者は腸内細菌叢と宿主の生理機能の間の複雑な関係を探求する機会を得ることができます。これにより、腸の病態生理学の根本的なメカニズムに関する貴重な洞察を得るための道が開かれ、犬と人間の健康、およびさまざまな疾患状態における微生物代謝産物の潜在的な役割を理解するための道が開かれます。イヌのGut-on-a-Chipに用いられたプロトコルは再現性があり、このアプローチにより、犬とヒトの両方における宿主とマイクロバイオームの相互作用、病原体感染、プロバイオティクスベースの治療効果を調査できるため、比較医療に適した実験モデルとなります。
Protocol
この研究は、ワシントン州立大学の動物管理および使用委員会(ASAF#6993)に従って承認され、実施されました。このプロトコルでは、社内で製造されたPDMS製の定評あるGut-on-a-Chipマイクロ流体デバイスを利用しました2(図1D)。Gut-on-a-Chipマイクロデバイスの製造の詳細な方法は、以前のレポート2,24に記載されています。このプロトコルは、腸管オルガノイドとマイクロ流体システムのユニークな統合を示しています(図2)。
1. PDMS製Gut-on-a-Chipの表面活性化
- 50 mLのコニカルチューブ内の蒸留(DI)水49 mLに50%PEI溶液1 mLを加えて、1%ポリエチレンイミン(PEI)溶液を調製します。チューブを2〜3回ひっくり返して溶液をよく混合し、0.2μmのシリンジフィルターで溶液をろ過します。
注意: 4°Cで保管してください。 - 50 mLのコニカルチューブ内の49.9 mLのDIに100 μLの50%GA溶液を加えて、0.1%グルタルアルデヒド(GA)溶液を調製します。チューブを2〜3回ひっくり返して溶液をよく混合し、0.2μmのシリンジフィルターで溶液をろ過します。
注意: 4°Cで保管し、直射日光にさらさないように保護してください。 - Gut-on-a-Chipデバイスを60°Cに設定したドライオーブンに入れ、30分以上インキュベートして水分を取り除きます。
- UV/オゾン発生器を使用して、Gut-on-a-ChipデバイスをUVおよびオゾン処理に60分間さらします。
注意: 処理中にPDMS表面を最適に活性化するために、UVランプとデバイスの間に約3cm以下の距離を維持してください。効率的な表面活性化を実現するために、発電機内のデバイスの過密を避けてください。 - 上部マイクロチャンネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、下部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。
- 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。下部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。
- P100マイクロピペットを使用して、下部マイクロチャンネルの出口穴から100 μLの1% PEI溶液を導入します。
注意: このプロセスは、デバイスがUV /オゾン曝露からまだ暖かくなっている間に実行することをお勧めします。PEI溶液がマイクロ流路を流れ、PEI溶液が滴下して下部マイクロ流路のバイパスチューブから出てくるのを観察します。 - 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを再接続します。
- 下部マイクロチャネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、上部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。
- 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。上部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。
- P100マイクロピペットを使用して、100 μLの1% PEI溶液を上部マイクロチャンネルの出口穴から導入します。
メモ:PEI溶液がマイクロチャネルを流れ、PEI溶液が滴下して上部マイクロチャネルのバイパスチューブから出てくるのを観察します。 - 上部マイクロ流路の出口チューブを再度取り付けます。
- 上部と下部の両方のマイクロチャネルを 1% PEI 溶液で満たしたら、デバイスを室温(RT)で 10 分間インキュベートします。
- 手順1.5〜1.12を0.1%GA溶液で実行します。
- 上部と下部の両方のマイクロチャネルを0.1%GA溶液で満たしたら、デバイスを室温で20分間インキュベートします。
- 脱イオン水で手順1.5〜1.12を実行し、余分な表面活性化溶液を取り除きます。
- チップを60°Cの乾燥オーブンに入れ、一晩乾燥させます。
注意: チューブの衝突を避けるために、すべてのチューブからバインダークリップを必ず取り外してください。この乾燥プロセスは、Gut-on-a-Chip12内のマイクロチャネルの表面活性化に不可欠です。
2. Gut-on-a-Chip培養のための細胞外マトリックス(ECM)コーティングおよび培地の調製
- コラーゲンIおよびマトリゲルの最終濃度がそれぞれ60 μg/mLおよび2 %(vol/vol)となるように、オルガノイド基礎培地とECM混合物を調製します。
注:腸チップごとに 50 μL の ECM 混合物を調製します(つまり、上下のマイクロチャンネルごとに 20 μL の ECM 混合物と 10 μL のエクストラ)。使用当日にこれを調製し、この溶液を4°Cで保存するか、使用する準備ができるまで氷上に置いてください。 - UV /オゾン、PEI、およびGAで処理されたGut-on-a-Chipをドライオーブンから取り出します。
注意: 位相差顕微鏡で検査して、水分が残っていないか確認してください。 - Gut-on-a-Chipをバイオセーフティキャビネット内で10分間冷却します。
- 上部マイクロチャンネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、下部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。
- 下部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。
- P100マイクロピペットを使用して、20 μLのECM混合物を下部マイクロチャンネルの出口穴から導入します。
注:気泡が閉じ込められることなくマイクロチャネルを流れるECM混合物を観察します。気泡が存在する場合は、気泡がなくなるまで、追加のECM混合物を下部マイクロチャネルに導入します。 - 下部マイクロチャネルのアウトレットチューブを再度取り付けます。
- 下部マイクロチャネルの入口、バイパス、および出口チューブをバインダークリップを使用してクランプして固定します。また、上部マイクロ流路のインレットチューブをクランプします。
- 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。
- P100マイクロピペットを使用して、上部マイクロチャンネルの出口穴から20 μLのECM混合物を導入します。
- 上部マイクロ流路のアウトレットチューブを再度取り付けます。
- チップを加湿したCO2インキュベーターに5%CO2を含ませ、37°Cで1時間、PEIおよびGAで処理したPDMSメンブレン上にECM層を形成します(図3A)。
注:インキュベーション中は、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。 - ECMコーティングのインキュベーション中に、A8301を欠くが、10 μM Y-27632および2.5 μMのCHIR99021を含むオルガノイド培養培地である冷播種培地を含む2つの1 mLシリンジを調製します。
注:A8301 は培地から除去し、以前に報告されたように、コーティングされた ECM への細胞の接着を強化しました2。Gut-on-a-Chip培養の 0 日目には、上部マイクロチャネルフローのみが必要です。したがって、上部チャネルにはフルシリンジを、下部チャネルには最低0.2 mLを準備します。 - ECMコーティングが完了したら、チップをインキュベーターから取り出し、下部マイクロチャネルに接続されたバイパスチューブへのクランプを外します。
- 播種培地を充填した1 mLシリンジを、Gut-on-a-Chipの下部マイクロチャネルに連結された平滑端ニードルに接続します。播種培地(~50 μL)をバイパスチューブに慎重に導入します。導入した培地をチューブに充填したら、下部のマイクロチャンネルに接続されたバイパスチューブをバインダークリップで固定します。
- 下部マイクロチャンネルに接続されているアウトレットチューブのクランプを解除します。播種培地を下部マイクロ流路に慎重に導入し、システム内をスムーズに流れるようにします。灌流後、下部マイクロチャネルに接続されたアウトレットチューブをバインダークリップで固定します。
- 次に、上部マイクロ流路に接続されているバイパスチューブを開きます。
- 播種培地を充填した1 mLシリンジを、Gut-on-a-Chipの上部マイクロチャンネルに連結された平滑末端ニードルに接続します。播種培地(~50 μL)をバイパスチューブに慎重に導入します。導入した培地をチューブに充填したら、上部マイクロチャンネルに接続されたバイパスチューブをバインダークリップで固定します。
- 下部マイクロチャネルに接続されているアウトレットチューブを外します。播種培地を上部マイクロ流路に慎重に導入し、システム内をスムーズに流れるようにします。上部マイクロチャンネルに接続されたアウトレットチューブは、灌流後にバインダークリップで固定します。
3. 播種用イヌ腸オルガノイド細胞調製
注:Gut-on-a-Chipモデルを生成するために、IBD患者犬に由来する犬の結腸オルガノイド(コロノイドと呼ばれる)をこのプロトコルで利用しました。これらのコロノイドは、以前に報告された方法に従って、生検された結腸組織の3〜5個の小さな断片に由来しました15,18。最適な結果を得るには、in vitroアプリケーションに適した安定したオルガノイドを確立するために、少なくとも3回の培養継代を経た犬用コロノイドを使用することが重要です。オルガノイド内の多系統細胞の適切な分化を促進し、機能的成熟度とGut-on-a-Chipモデルでのその後の実験への適合性を確保するために、少なくとも3〜4日間犬コロノイドを培養することをお勧めします。この研究の継代の上限は、20の連続した継代を通して変化していない表現型と核型を実証した以前の研究によって示されているように、20未満です25。これらのドナーのシグナルは、補足表S1に示されている。
- 以前に報告された培地15,26,27から改変した材料表に記載されているオルガノイド培養培地を用いて、30μLのマトリゲル15,18に埋め込まれた24ウェルプレートでイヌコロノイドを培養します。馴化培地は、Noggin28を分泌するように操作されたRspo1細胞およびHEK293細胞を培養することによって得られた。
- オルガノイド培養培地を真空吸引して廃棄し、氷冷温度で500 μLの細胞回収溶液を各ウェルに導入します。4°Cで30分間インキュベートします。
注:典型的には、成熟したイヌ腸オルガノイドの24ウェルプレートのうち3ウェルは、10倍の倍率で40-50オルガノイド/1視野を持つ単一のGut-on-a-Chipデバイスを播種するのに十分な量の解離細胞を提供します。 - P1000マイクロピペットを使用して、マトリゲル・ドームを機械的に5秒間破壊します。続いて、オルガノイド懸濁液を15 mLのコニカルチューブに集めます。
- コニカルチューブを200 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、続いて上清を除去します。
- 1 mLのトリプシン様プロテアーゼを室温で導入し、10 μM Y-27632を添加し、P1000マイクロピペットを使用してピペッティングして細胞ペレットを再懸濁します。
- 細胞懸濁液を37°Cにセットしたウォーターバスに入れ、混合物を定期的に振とうしながら10分間インキュベートします。
- 5 mLの温かいオルガノイド基礎培地を導入し、P1000マイクロピペットを使用して細胞懸濁液が濁り、目に見える細胞塊がなくなるまで激しくピペット操作します。
- 細胞懸濁液を70 μmカットオフのセルストレーナーに通し、マトリゲルの破片や大きな細胞クラスターを除去します。
- コニカルチューブを200 × g 、4°Cで5分間遠心分離し、続いてペレットを播種培地に再懸濁します。1台のイヌGut-on-a-Chipデバイスの播種では、20 μLの播種培地を使用して細胞ペレットを再懸濁します(すなわち、1つのGut-on-a-Chipデバイスを播種する場合は20 μLの播種培地を使用します)。
- 以前に報告されたように、播種培地で生細胞の濃度を1×107細胞/mLに変更します2。10 μLの細胞懸濁液と10 μLのトリパンブルーを組み合わせて血球計算盤を用いて生存率を評価し、顕微鏡で細胞を観察します。
注:細胞濃度を適切に調整して、最適な細胞接着とチップ膜上に均一な単層を形成することが重要です。初期の細胞数が不十分な場合、コンフルエント単分子膜の確立が遅れたり、失敗したりする可能性があります。逆に、細胞数が多すぎると、非接着細胞がチャネル内で凝集して凝集し、望ましくない濃縮効果につながる可能性があります。
4. 2次元細胞単分子膜の播種と形成
- 上部マイクロチャンネルのアウトレットチューブを外します。上部マイクロチャネルのバイパスチューブが開いたままであることを確認します。下部マイクロチャネルの入口と出口の両方をバインダークリップで固定して固定します。
- P100 または P20 マイクロピペットを使用して、プロトコル 3 の細胞懸濁液 20 μL を上部マイクロチャンネルの出口ホールに導入します(図 3B 播種)。
- 上部マイクロチャネルのバイパスチューブとインレットチューブをバインダークリップで固定して固定します。次に、出口チューブを上部マイクロ流路の出口穴に再度取り付け、上部マイクロ流路に圧力がかからないように、プロセス全体を通してチューブが開いたままになるようにします。このステップの後、バインダークリップを使用して上部チャネルのアウトレットチューブをゆっくりと固定し、クランプします。
- 顕微鏡を使用して、細胞が上部マイクロチャネル全体に均等に分布していることを確認します。
注:チューブをクランプしてチャネル内の培地の動きを停止し、望ましい細胞接着が完了するまで安定した静的状態を可能にすることが重要です。 - チップを加湿したCO2 インキュベーター(37°C)に入れます。
注:犬の腸管オルガノイド細胞がECMコーティングに付着するまでに約3時間かかります(図3B の付着)。 - Gut-on-a-Chipの上部マイクロチャネルに取り付けられたシリンジを、CO2 インキュベーター内に配置されたシリンジポンプに接続します。
注:シリンジポンプのノブを使用して培地をマイクロチャンネルに慎重に洗い流し、結合していない細胞を取り除きます。チップを顕微鏡で観察し、付着していない細胞が効果的に洗い流されていることを確認します。 - 播種培地で30μL/hの培養培地の流れを開始します。この連続フローは、Gut-on-a-Chip上に2D単層が確立されるまで、最初は上部マイクロチャネルのみを対象としています。下部のマイクロチャネルについては、マイクロチャネルをクランプし、媒体をフラッシュしないままにします。
- 細胞を播種した翌日から、培養液を播種培地からA8301を含み、10μMのY-27632と2.5μMのCHIR99021を欠いたオルガノイド培養液に変更します。
- 単分子膜が確立されたら、下部マイクロチャネルへの連続培地フローも開始します。イヌの腸管オルガノイド上皮細胞が上皮単層を確立するまでには通常2〜3日かかります(図3C)。
5. イヌGut-on-a-Chipにおける3次元形態形成の確立
注:Gut-on-a-Chipでコンフルエント単分子膜を形成した後、 図2に示すように、上流路と下流路の両方の培地フローと細胞株を導入して、2D単分子膜への3D形態形成を開始しました。
- オルガノイド培養培地を上部と下部の両方のマイクロチャネルに導入して、Gut-on-a-Chipシステムで3D形態形成の発達を開始します。既存の Gut-on-a-Chip 設計 (高さ 500 μm のマイクロチャネル) で 0.02 dyne/cm2 のせん断応力を達成するには、流速を 50 μL/h に増やします29。
- in vitroで培養した細胞に周期的なひずみを適用するコンピューター制御のバイオリアクターを使用して、2の前に推奨されているように、細胞株の10%と周波数の0.15Hzを開始します。このプロセスでは、Gut-on-a-Chipデバイスに真空吸引が適用されます。
- これらの培養条件を最低2〜3日間維持します。イヌ腸単層の3D形態形成は、通常、硬膜チャネルの流れと真空吸引が開始されてから2〜3日後に発生します(図3C)。
6. イヌGut-on-a-Chipの特性評価
- ライブセルイメージング
- シリンジポンプを使用して培地を静かに流し、Gut-on-a-Chip内の気泡を取り除きます。
- Gut-on-a-Chipデバイスをシリンジポンプから外します。
注意: Gut-on-a-Chip内で圧力をかける可能性のある操作は避けてください。 - デバイスを顕微鏡上に配置して、確立された3D上皮の画像を撮影します。位相差を使用して3D上皮層の構造を可視化するには、10倍および20倍の対物レンズを使用します(図3C)。
- 免疫蛍光染色
- 1 g の BSA を 50 mL のリン酸緩衝生理食塩水(PBS)に溶解して 2% BSA を調製し、ブロッキング溶液を調製します。溶液を0.2μmのシリンジフィルターに通してろ過します。この溶液を4°Cで保存してください。
- 150 μL の Triton X-100 と 50 mL のブロッキング溶液を混合して透過処理溶液を調製し、最終濃度が 0.3% Triton X-100 になるようにします。溶液を0.2μmのシリンジフィルターに通してろ過します。この溶液を4°Cで保存してください。
- ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の 4% PFA を上部と下部の両方のマイクロチャンネルに注入して、細胞を固定します。
- ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。
- ステップ2.4-2.11で説明したように、100μLの0.3%トリトンを上部および下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞の透過処理を行います。デバイスを室温に30分間置きます。
- ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。
- ステップ2.4〜2.11で説明したように、100 μLの2% BSAを上部および下部の両方のマイクロチャネルに注入して、非特異的結合を防ぐために細胞のブロッキングを行います。デバイスを室温に1時間置きます。
- 2% BSAで希釈した一次抗体溶液20 μLを注入し、室温で3時間置いた後、4°Cで一晩インキュベートします。
注:4°Cで一晩インキュベーションしている間、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。一次抗体の濃度は、単層または3Dオルガノイド染色の推奨濃度の2〜5倍にする必要があります(補足図S1)。 - ステップ2.4-2.11で説明したように、100 μLのPBSを上下両方のマイクロチャンネルに注入して細胞をすすぎます。
- 2% BSAで希釈した二次抗体溶液20 μLを注入し、室温で1時間置きます。
注:インキュベーション中は、すべてのチューブがクランプされていることを確認してください。このステップから始めて、光退色を防ぐためにデバイスのセットアップをアルミホイルでシールドする必要があります。 - ステップ2.4-2.11で説明したように、100 μLのPBSを上下両方のマイクロチャンネルに注入して細胞をすすぎます。
- F-アクチンとDAPI(ジアミジノ-2-フェニルインドール)の対比染色用の複合溶液を調製します。ステップ 2.4-2.11 の説明に従って、20 μL の混合溶液を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入します。
- ステップ 2.4-2.11 で説明したように、100 μL の PBS を上部と下部の両方のマイクロチャネルに注入して、細胞をすすぎます。
蛍光顕微鏡または共焦点顕微鏡を使用して、3D上皮細胞の構造の蛍光イメージングを行います。
7.上皮バリア機能
- シリンジポンプを使用して培地を静かに流し、Gut-on-a-Chip内の気泡を取り除きます。測定中は、すべてのチューブが開いていることを確認してください。
- シリンジポンプからGut-on-a-Chipを取り出し、室温に少なくとも10分間置きます。
- 70% EtOH溶液からAg/AgCl電極を除去します。
- 上部入口と下部出口にそれぞれ2つのAg/AgCl電極を配置し、マルチメーターを使用して上皮層の抵抗を測定します。
- 2つのAg/AgCl電極をそれぞれ下部入口と上部出口に配置します。これら 2 つの値の平均を Gut-on-a-Chip の抵抗値として報告します。
注:ブランクTEERは、上皮のないECMコーティングのみを施したGut-on-a-Chipで測定する必要があります。 - 経上皮電気抵抗(TEER)値(kΩ×cm2)の計算は、式(1)を用いて算出することができる。
TEER = (Ωt - Ωブランク) × A (1)
ここで、Ωtは実験開始以降の特定の時点で測定された抵抗値であり、Ωブランクは上皮のない時点で測定された抵抗値であり、Aは細胞層で覆われた表面の面積である(このGut-on-a-Chip設計では約0.11cm22)。- 式 (2) を使用して正規化された TEER を計算します。
ティール =
(2)
ここで、Ω0 は、以前に報告された実験の最初の読み取り時点における抵抗値です30 (図4C)。
- 式 (2) を使用して正規化された TEER を計算します。
(2)Representative Results
このプロトコルは確実にGut-on-a-Chipシステムにおける3D腸の形態形成の自発的な開発を促進します。このアプローチでは、炎症性腸疾患(IBD)に罹患したイヌ由来の腸管オルガノイドから得られたイヌの腸管上皮細胞を利用します(図1B)。イヌ腸上皮細胞の3D形態形成の時折のクラスタリングは、6〜9日間の培地フローの後、マイクロチャネル全体で観察できます(図3C)。これらの形態学的変化は、位相差技術を使用して監視できます。この研究では、IBDと診断された2匹の犬に由来するオルガノイドを利用しました。特筆すべきは、3D形態形成の成功が2つの生物学的複製で観察され、それぞれが2つの技術的複製で実施されたことです。この研究で得られた知見は、他のイヌのドナーに由来する腸管オルガノイドに関する今後の研究の基礎となる。これらの結果は、以前にヒトサンプルで報告された実験アプローチの潜在的な適用性と再現性を示しています。これらの知見は、ヒト腸上皮細胞を用いた研究で以前に報告されたように、Gut-on-a-Chip技術がイヌの腸上皮細胞に適用できることをさらに裏付けるものです2。
このプロトコルは、従来の蛍光顕微鏡法を用いて、マイクロ流体チップに絨毛様構造を形成したオルガノイド由来単層の3D構造を評価するために免疫蛍光染色を使用できることを示しました(図4 A、B)。このプロトコルは、免疫蛍光染色によって区別され、空間的に組織された細胞表現型を検証するために適合させることができます。Gut-on-a-Chip内の3D形態形成の視覚化は、さまざまな病理学的相互作用中の宿主応答を調査する絶好の機会を提供します14,23,31。以前にヒトで報告されたように、患者ドナー由来の上皮細胞と組み合わせると、この技術を利用して腸疾患の個別化モデルを構築することができます13。免疫蛍光イメージングと蛍光in situハイブリダイゼーションなどのターゲットRNA可視化技術を統合することで、Gut-on-a-Chipシステム内で宿主のトランスクリプトームおよびプロテオームを視覚的に解析することが可能になります。
腸管の恒常性を維持するためには、腸の恒常性を維持するために腸の完全性を維持することが不可欠であり、Gut-on-a-Chipプラットフォームは、この重要な機能の正確なモニタリングと定量化を可能にすることで、貴重な利点を提供します。Gut-on-a-Chip技術を使用したTEERの測定には、いくつかの利点があります。例えば、これまでの研究で、腸内細胞を非病原菌やプロバイオティクス菌と共培養したり32したり、リーキーガット条件下でTEERを評価することに成功しています23。これにより、研究者はさまざまな状態が腸のバリア機能に与える影響を研究し、腸の健康を促進するための潜在的な介入を特定することができます。
図1:患者由来のイヌIBD Gut-on-a-Chipの確立。 (A)患者由来の腸管オルガノイドとGut-on-a-Chipプラットフォームの統合。内視鏡生検を実施して腸陰窩細胞を単離し、ドナー特異的な腸オルガノイドを作製することができます。上皮細胞は、オルガノイドから単一細胞に解離し、PDMSベースのGut-on-a-Chipに播種し、独自の動的微小環境で培養することができます。(B)IBD犬のコロノイドの代表的な画像。スケールバー = 100 μm。 (C)この回路図は、上部と下部のマイクロチャネルの間に配置された多孔質膜で構成されるGut-on-a-Chipデバイスを示しています。上段のマイクロ流路は青色の領域で示され、下段のマイクロ流路は赤色の領域で示されます。真空チャンバーはマイクロチャネルの両側に存在し、多孔質膜を変形させて蠕動運動24を模倣する。(d)イヌのGut−on−a−Chipのセットアップは、カバースリップ2,24上に置かれたチューブで組み立てられたPDMSベースのGut−on−a−Chipを含む。バイパスチューブは、取り扱い中(シリンジへの接続中)にマイクロチャネル内に圧力がかかるのを防ぐために重要です。バインダークリップは、チューブをクランプするために使用されます。体積に敏感な材料は、上部または下部の出口の開いた穴から注入できます。オルガノイド培養培地は、シリンジを平滑端針に接続し、上下の入口を通る流れを注入することができる。略語:IBD =炎症性腸疾患;PDMS = ポリジメチルシロキサン。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:イヌIBD Gut-on-a-Chipにおける絨毛様構造の形成。 解離した上皮細胞をECMでコーティングしたGut-on-a-Chipに播種しました。解離した細胞がPDMSメンブレンに付着した後、頂端流を3日間開始しました(D0-D3)。コンフルエントな2次元単分子膜が形成されると(D3)、頻繁な伸張を伴う基底側流が開始されます(伸張、AP、およびBL流)。2〜3日間のデュアルフローと膜の伸張の後、2D単層は3D形態形成を発達させ始め、9日間の培養後に絨毛様構造が形成されます(3D形態形成、D9-D12)。略語:ECM =細胞外マトリックス;PDMS = ポリジメチルシロキサン;AP =頂端;BL =基底側。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:Gut-on-a-Chipにおけるイヌ腸オルガノイド播種と3D形態形成。 (A)PDMSベースのGut-on-a-Chipにおける多孔質膜の表面活性化の実験ステップ。UV/オゾン処理、PEI、GA処理を併用することで、ECM溶液中に存在するアミンの架橋が容易になります。このプロセスにより、ECMタンパク質が多孔質膜に安定的に固定化されます。(B)位相差画像は、播種直後(左)と播種後3〜5時間後(右)の細胞の形態を示しています。播種後3時間後の多孔質膜は、単一細胞が付着した部分が薄く暗い領域を示し、接着プロセスを強調しています。(C)位相差画像は、Gut-on-a-Chipシステム内の腸単分子膜の3D形態形成を示しています。これらの単層はIBDに罹患したイヌに由来し、これらのオルガノイド細胞は、流体の流れと伸張運動を含む動的条件下で12日間培養されました。スケールバー = 50 μm (B,C)。略語:IBD =炎症性腸疾患;ECM = 細胞外マトリックス;PDMS = ポリジメチルシロキサン;PEI =ポリエチレンイミン;GA =グルタルアルデヒド。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図4:患者由来のイヌGut-on-a-Chipにおける3D形態学的発達の評価。 (A)イヌIBD Gut-on-a-Chipの免疫蛍光イメージング、12日間の培養後に完全に発達した3D上皮を蛍光顕微鏡で評価した上半身のトップダウン図。タイトジャンクションタンパク質(ZO-1)は黄色で可視化されています。ブラシ境界膜(F-アクチン)は赤で表示されます。核はDAPIで染色され、青色に見えます。(B)長距離レンズ付き共焦点顕微鏡を用いたイヌIBD Gut-on-a-Chipの免疫蛍光イメージング。概略図に示されているように、12日間の培養後に完全に発達した3D上皮の絨毛様構造の断面の蛍光画像が示されている。さらに、Zスタッキングは3D上皮の側面図を示し、絨毛様構造の形成を明らかにします。ブラシ境界膜(F-アクチン)は赤色で、核はDAPIで染色されて青色で表示されます。(C)腸管バリア機能は、患者由来のイヌGut-on-a-ChipsにおいてTEERによって評価および測定されました。安定したTEER値は、Gut-on-a-Chipでの培養の5日目に達しました。エラーバーは、測定値のSEMを表します。TEER 値は、2 つの生物学的反復と 1 つの技術的反復で測定されました。スケールバー = 50 μm (A)、25 μm (B)。略語:IBD =炎症性腸疾患;DAPI = 4',6-ジアミジノ-2-フェニルインドール;TEER = 経上皮電気抵抗。この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
補足図S1:イヌコロノイド由来単層およびGut-on-a-Chipデバイスにおける抗ZO-1ポリクローナル抗体の特性評価。 (A)黄色のZO-1と赤のF-アクチンの免疫蛍光染色とその重ね合わせ画像。スケールバー = 25 μm。 (B)「Leaky Gut Chips」中の黄色のZO-1の免疫蛍光可視化は、プロバイオティクス細菌(LGG+サイトカインまたはVSL#3+サイトカイン)による刺激や、プロバイオティクス刺激を伴わない無菌コントロール(サイトカイン)など、さまざまな条件下で行われました。スケールバー = 50 μm。この図は、Min et al.23 から転載したものです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足表S1:組織ドナー情報の要約。 ドナーの年齢、性別、品種、病理組織学的評価、および犬のIBD活動性指数(CIBDAI)スコアの要約表。CIBDAI は、犬の IBD33 の臨床的重症度を推測するために使用される数値スコアリング システムです。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
Discussion
この研究は、イヌ腸オルガノイドとイヌIBD腸オンチップモデルの開発との適合性の先駆的な実証を示しています。腸管オルガノイドとオルガノイド由来の単層培養物をマイクロ流体システム(すなわち、Gut-on-a-Chipシステム)に統合することで、この技術はさらに進化し、生理学的動態を厳密に模倣し、生物学的状態をより代表する in vitro 腸モデルの作成が可能になりました。特に、ヒトにおけるIBD由来オルガノイドを用いたGut-on-a-Chip培養の報告は非常に少ないため、イヌIBD由来のGut-on-a-Chipを用いた今回の研究は、ヒトにおけるIBD研究に先駆けとなる知見を提供する可能性があります。
Gut-on-a-Chip上でイヌの腸管上皮3D形態形成を成功させるには、いくつかの重要なステップに細心の注意を払う必要があります。第1に、PDMSマイクロ流体チャネルの疎水性表面は、ECMの接着とその後の細胞接着を妨げる可能性があり、ECMコーティングと細胞播種の前にPDMSの表面活性化が必要になります(プロトコルセクション1を参照)。安定した単層培養を達成するためには、細胞接着(プロトコルステップ4.6-4.7)に続いて、過剰な未結合細胞の除去が重要です。さらに、一定の媒体の流れや蠕動運動のような真空運動などの動的刺激は、腸上皮の3D形態形成に必要です(プロトコルステップ5.2)。Gut-on-a-Chip培養のどのステップでもマイクロチャネル内の気泡を避けるためには、慎重な取り扱いが不可欠です。
Gut-on-a-Chipへの細胞播種が不十分な場合は、細胞数が少ないか、細胞の接着が不十分であることが原因である可能性があります。細胞数が少ない場合のトラブルシューティングには、調製した腸管オルガノイドのマトリゲル中での増殖を観察し、その健康状態を検査することが重要です。細胞の生存率は、細胞の20%以下が死滅していないことを確認するために、細胞解離後のトリパンブルー染色によって評価できます。生細胞数が不十分な場合は、オルガノイド培地条件の最適化を試みることができます。別の可能性として、オルガノイドの解離が不完全になり、その結果、70 μmを超える細胞塊が過剰になり、フィルターに捕捉されることもあります。これを解決するための1つの選択肢は、細胞解離中のピペッティングの期間を延長することです。あるいは、15 mLのコニカルチューブは、トリプシン様プロテアーゼによる処理を受けている間、毎分穏やかに攪拌することができます。Gut-on-a-Chipへの細胞の接着不良は、ECMコーティングが不適切であることが原因である可能性があります。コーティングプロセス中は、気泡の存在を注意深く確認し、必要に応じてコーティング液をそっと追加して気泡の形成を防ぐことをお勧めします。細胞が過密状態になり、付着していない細胞を洗い流すことができないと、初期単層が不十分になる可能性があります。このような場合、シリンジプランジャーを押すときに穏やかなパルスを加えることができます。これらのトラブルシューティング手順は、Gut-on-a-Chip培養プロセス中の問題を特定して対処するのに役立ちます。
このGut-on-a-Chipプラットフォームは、起伏のある3D上皮層の作成を可能にしますが、腸内微小環境を完全に再現するには、生物学的な複雑さがさらに必要であることを認識しています。上皮細胞と間葉系細胞の相互作用、3D再生のためのECMの沈着、および適切な幹細胞ニッチを確立する陰窩絨毛特性の存在を考慮することが重要です。線維芽細胞などの間質細胞は、ECMタンパク質の産生と腸の形態形成の調節に重要な役割を果たします34,35,36。このモデルに間葉系細胞を含めることで、形態形成と細胞接着の効率の両方を高める可能性があります。毛細血管系とリンパ管を含む内皮層は、分子輸送と免疫細胞の動員を支配する上で重要な役割を果たします37,38。患者由来の免疫細胞を含めることは、自然免疫と獲得免疫の相互作用の実証と組織特異的免疫の確立を可能にするため、腸疾患のモデル化に不可欠である可能性があります39。Gut-on-a-Chip上での3D形態形成の完了に続いて、オルガノイド培養培地をオルガノイド分化培地に修飾することができる。これは、実験の目的に応じて、追加の細胞分化を誘導するための実行可能なアプローチになる可能性があります。
3Dマイクロアーキテクチャを その場 でイメージングすることは、長い作動距離が必要なため困難ですが、長距離対物レンズで克服できます。さらに、層ごとの微細加工と接合の方法により、SEMで検査するために上層にアクセスすることが困難になります。現在のGut-on-a-Chip設計では、Gut-on-a-Chipマイクロデバイスごとに1つのシリンジポンプが必要であり、CO2 インキュベーターのスペースを占有し、大規模な実験を妨げています。ユーザーフレンドリーなプラットフォームとハイスループットスクリーニングのための拡張性を高めるには、イノベーションが必要です。
これらの現行のプロトコルにより、in vitroでの3D上皮層の自発的な発生が可能になり、従来の3Dオルガノイド、2D単層、および静的マイクロデバイス培養システムの限界を超えています。このダイナミックなin vitro腸微小環境は、多様な細胞タイプの共培養を導入することで制御できます。これまでの研究では、腸内細菌叢14,23や末梢単核細胞30の共培養など、Gut-on-a-Chip微小環境を操作する方法が検討されてきた。この再構成された微小環境は、薬物試験、基礎的な機構研究、疾患モデリングなど、多くの応用の可能性を秘めています。再構築された微小環境は、薬物検査23,40,41や疾患モデリング12,13,14,30、腸管形態形成の基本的な機構研究42など、幅広い応用に大きな可能性を秘めている。様々なアッセイは、代謝産物の評価のために上清を採取することによって43、ゲノム検査のために細胞を採取することによって2,32、または生細胞色素を用いて細胞を目視検査することによって、またはその後の免疫蛍光イメージングのために固定することによって行うことができる23,44。
この研究は、Gut-on-a-Chipプラットフォームで犬の腸上皮層の3D形態形成を開発するための再現性のあるプロトコルを提示します。その結果、3D上皮構造は腸内微小環境をよりリアルに表現することができ、さまざまな生物医学研究への応用に大きな可能性を秘めています。この腸の構造を活用することで、より多くのトランスレーショナルリサーチを行い、有望な結果をもたらす可能性があります。
Disclosures
著者は、宣言すべき利益相反を持っていません。
Acknowledgments
WSU小動物内科サービス(ジリアン・ヘインズ博士、サラ・ゲス博士、シェリー少尉LVT)とWSU VTH臨床研究コーディネーターのValorie Wiss氏に、市民科学者(患者ドナー)からの症例募集とサンプル収集のサポートに感謝します。本研究の一部は、米国国立衛生研究所所長室(K01OD030515・R21OD031903・Y.M.A.)および日本学術振興会若手研究者海外チャレンジプログラム(202280196 to I.N.)の支援を受けて行われました。図1Aと図3Aは BioRender.com で作成しました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Organoid basal medium | |||
| Advanced DMEM/F12 | Gibco | 12634-010 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050-061 | 2 mM, glutamine substitute |
| 1 M HEPES | VWR Life Science | J848-500ML | 10 mM |
| 100x penicillin–streptomycin | Corning | MT30009CI | 1x |
| Organoids and organoid medium | |||
| A-83-01 | PeproTech | 9094360 | 500 nM |
| B27 supplement | Gibco | 17504-044 | 1x |
| CHIR99021 | Reprocell | 04-0004-base | 2.5 µM |
| HEK293 cells engineered to secrete Noggin | Baylor College of Medicine | ||
| Murine EGF | PeproTech | 315-09-1MG | 50 ng/mL |
| Murine Wnt-3a | PeproTech | 315-20-10UG | 100 ng/mL |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma | A9165-25G | 1 mM |
| N2 MAX Media supplement | Gibco | 17502-048 | 1x |
| Nicotinamide | Sigma | N0636-100G | 10 mM |
| Noggin Conditioned Medium | NA | NA | 10% vol/vol |
| Primocin | InvivoGen | ant-pm-1 | 100 µg/ml |
| R-spondin1 (Rspo1) cells | Trevigen | 3710-001-01 | Rspo1 cells |
| R-Spondin-1 Conditioned Medium | NA | NA | 20% vol/vol |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067-25MG | 10 µM |
| Y-27632 | StemCellTechnologies | 72308 | 10 µM |
| [Leu15 ]-Gastrin I human | Sigma-Aldrich | G9145-.5MG | 10 nM |
| Reagents | |||
| 4% Paraformaldehyde solution | Fisher Scientific | AAJ19943K2 | |
| Alexa Fluor 647 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A22287 | x250 dilution |
| Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 | Abcam | ab150078 | x1,000 dilution |
| Anti-ZO-1 polyclonal antibody | Thermo Fisher Scientific | 61-7300 | x50 dilution |
| Cell Recovery Solution | Corning | 354253 | |
| Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL | Gibco | A10483-01 | |
| Diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | 62248 | x1,000 dilution |
| EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% | Electron Microscopy Sciences | 16320 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 356255 | |
| Poly(ethyleneimine) solution | Sigma | 408700-250ML | |
| TrypLE Express | Gibco | 12604-021 | |
| Materials and Equipment | |||
| 24-well culture plates | Corning | 3524 | |
| 87V Industrial Multimeter | Fluke Corporation | ||
| Centrifuge | Eppendorf | 5910R | |
| CO2 incubator | Eppendorf | C170i | |
| DMi8 fluorescence microscope | Leica microsystems | DMi8 | |
| Dry oven | Fisher Scientific | 15-103-0519 | |
| FlexCell FX-5000 Tension system | Flexcell International Corporation | ||
| Inverted phase-contrast microscope | Leica microsystems | DMi1 | |
| SP8-X inverted confocal microscope | Leica microsystems | SP8-X | |
| Syringe pump | Braintree Scientific | model no. BS-8000 120V | |
| Syringe, 3 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-435 | |
| Syringes, 1 mL sterile | BD Biosciences | 14-823-434 | |
| UV/ozone generator | Jelight Company | model no. 30 | |
| Software | |||
| LAS X imaging software | Leica microsystems |
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