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Medicine

염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

개의 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 미세유체 시스템의 통합은 인간 장 질환에 대한 관련 번역 모델을 제공합니다. 제시된 프로토콜은 장의 3D 형태 형성 및 동적 체외 모델링을 가능하게 하여 One Health를 통해 개와 인간의 장 질환에 대한 효과적인 치료법 개발을 지원합니다.

Abstract

개의 장은 해부학, 미생물학, 생리학적으로 인간과 유사하며, 개는 자연적으로 인간과 유사한 자발적 장 질환을 앓게 됩니다. 장 상피의 정점 표면에 접근하는 데 있어 3차원(3D) 오가노이드의 고유한 한계를 극복하기 위해 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 접근 가능한 내강 표면을 노출하는 2차원(2D) 단층 배양이 생성되었습니다. 이러한 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 in vitro 장 모델을 개발할 수 있게 되었습니다.

이 연구에서는 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 개에서 얻은 1차 장 조직 샘플을 사용하여 개 장 상피의 3D 형태 형성을 생성하는 프로토콜을 제시합니다. 또한 3D 장 오가노이드에서 파생된 세포를 사용하여 2D 단층 배양 및 장-온-a-칩 시스템을 생성하고 유지하기 위한 프로토콜에 대해서도 설명합니다. 이 연구에서 제시된 프로토콜은 반려견을 위해 특별히 설계된 미세유체 Gut-on-a-Chip 시스템을 구축하기 위한 기본 프레임워크 역할을 합니다. 이 혁신적인 접근 방식의 토대를 마련함으로써 우리는 One Health Initiative의 원칙에 따라 생물 의학 및 중개 연구에서 이러한 기술의 적용을 확대하는 것을 목표로 합니다. 이 접근법을 활용함으로써 우리는 개와 인간 모두의 장 생리학을 연구하기 위해 생리학적으로 더 관련성이 높은 동적 체외 모델을 개발할 수 있습니다. 이는 두 종 모두에서 장 질환에 대한 보다 효과적인 치료법 개발에 도움이 될 수 있기 때문에 생물 의학 및 제약 응용 분야에 중요한 영향을 미칩니다.

Introduction

장 상피 형태 형성은 주로 실험 동물 모델을 통해 연구되어 왔는데, 이는 비용이 많이 들고 시간이 많이 걸리며 인간 발달 과정을 정확하게 나타내지 못합니다1. 또한, 기존의 정적 2D 세포 배양 모델은 3D 상피 구조의 복잡한 공간 구성을 모방할 수 있는 능력이 부족하다2. 그 결과, 장 상피 구조에 대한 이해를 높이기 위해 인간 관련 동물 모델의 장 상피 세포를 사용하여 in vitro 3D 형태 형성을 유도하는 프로토콜이 필요합니다.

반려견은 가축화 과정에서 환경과 식단을 공유하기 때문에 인간과 매우 유사한 장내 해부학적 구조와 마이크로바이옴 구성을 발달시켰다3. 이러한 유사성 외에도 인간과 개는 장 건강에 기인하는 것으로 생각되는 다양한 만성 질환을 공유합니다. 개는 인간과 마찬가지로 비만, 인지 기능 장애, 당뇨병, 염증성 장 질환(IBD) 및 결장직장 선암과 같은 만성 질환이 자발적으로 발생할 수 있습니다 4,5,6,7,8,9,10. 이전의 Gut-on-a-Chip 연구 2,11,12,13,14에서 인간과 쥐 상피 세포의 개발 및 사용에도 불구하고 개 장 상피는 지금까지 활용되지 않았습니다. 3D 상피 형태 형성이 있는 동적 배양 시스템에서 개의 장 오가노이드 상피를 활용하는 당사의 새로운 접근 방식은 개와 인간 의학 모두에 중요한 영향을 미칩니다.

최근 장내 오가노이드 배양의 발전으로 개의 장 오가노이드 배양이 확립되었다15. 이 배양 시스템은 정의된 모르포겐 컨디셔닝 하에서 장 줄기세포를 배양하는 것을 포함하며, 그 결과 성체 줄기 세포로부터 유래된 자가 재생 특성을 갖는 3D 모델이 생성된다16. 그러나, 수송 분석 또는 숙주-마이크로바이옴 공동 배양을 수행하는 것은 장 내강(intestal lumen)의 밀폐된 특성 때문에 이 3D 모델에 어려움을 야기한다17. 이를 해결하기 위해 연구원들은 장 오가노이드에서 파생된 2D 단층을 생성하여 발광 표면18,19의 노출을 허용했습니다. 그러나 3D 오가노이드와 2D 단층 모두 정적인 조건에서 유지되기 때문에 장내 미세환경의 생체 내 생체 역학을 정확하게 반영하지 못합니다. 환자 유래 반려견 오가노이드 기술과 체외 3D 형태 형성을 결합하면 만성 다인자 질환에 대한 중개 연구의 기회를 얻을 수 있습니다. 이 접근 방식을 통해 연구자들은 인간과 개 모두에게 도움이 되는 보다 효과적인 치료법을 개발하고 인간, 동물 및 환경 건강의 상호 연결성을 인식하는 협력 접근 방식인 One Health Initiative에 따라 중개 연구를 더욱 발전시킬 수 있습니다. 복잡한 건강 문제를 해결하고 모두를 위한 최적의 건강 결과를 달성하기 위해 학제 간 협력을 촉진합니다. 이 이니셔티브는 인간, 동물 및 생태계 간의 상호 의존성을 이해함으로써 신종 전염병, 환경 악화 및 기타 공통된 건강 문제로 인한 위험을 완화하는 것을 목표로 합니다20,21,22.

이 프로토콜은 폴리디메틸실록산(PDMS) 기반 다공성 멤브레인이 있는 Gut-on-a-Chip 마이크로디바이스에서 환자 오가노이드에서 얻은 개의 장 상피 세포를 배양하는 포괄적인 방법을 설명합니다. 개의 장 오가노이드와 이 Gut-on-a-Chip 기술을 통합하여 3D 상피 형태 형성을 확립함으로써 장이 세포 조직과 줄기 세포 틈새를 어떻게 발달하고 유지하는지 연구할 수 있습니다. 이 플랫폼은 마이크로바이옴 군집이 장 건강에 미치는 영향을 조사하고 이러한 군집이 장 병태생리학에 기여하는 미생물 대사 산물을 생성하는 방법을 이해할 수 있는 귀중한 기회를 제공합니다14,23. 이러한 발전은 이제 개의 장 샘플로 확장되어 연구자들에게 장내 마이크로바이옴과 숙주 생리학 사이의 복잡한 관계를 탐구할 수 있는 기회를 제공할 수 있습니다. 이를 통해 장 병태생리학의 기본 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 얻고 개와 인간의 건강뿐만 아니라 다양한 질병 상태에서 미생물 대사 산물의 잠재적 역할을 이해할 수 있는 길이 열립니다. 개 Gut-on-a-Chip에 사용되는 프로토콜은 재현성이 뛰어나 이 접근법을 통해 개와 사람 모두에서 숙주-마이크로바이옴 상호 작용, 병원체 감염 및 프로바이오틱스 기반 치료 효과를 조사할 수 있으므로 비교 의학에 적합한 실험 모델입니다.

Protocol

이 연구는 워싱턴 주립 대학의 기관 동물 관리 및 사용 위원회(ASAF# 6993)에 따라 승인 및 수행되었습니다. 이 프로토콜에서는 사내에서 제작한 PDMS로 만든 잘 정립된 Gut-on-a-Chip 미세유체 장치를 활용했습니다2(그림 1D). Gut-on-a-Chip 마이크로 장치의 제조에 대한 자세한 방법은 이전 보고서 2,24에서 찾을 수 있습니다. 이 프로토콜은 장 오가노이드와 미세유체 시스템의 고유한 통합을 보여줍니다(그림 2).

1. PDMS로 만든 Gut-on-a-Chip의 표면 활성화

  1. 50mL 원뿔형 튜브에 있는 증류수 49mL에 50% PEI 용액 1mL를 첨가하여 1% 폴리에틸렌이민(PEI) 용액을 준비합니다. 튜브를 2-3회 뒤집어 용액을 잘 섞은 다음 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
    알림: 4 °C에서 보관하십시오.
  2. 50mL 원뿔형 튜브의 DI 49.9mL에 100μL의 50% GA 용액 100μL를 첨가하여 0.1% 글루타르알데히드(GA) 용액을 준비합니다. 튜브를 2-3회 뒤집어 용액을 잘 섞은 다음 0.2μm 주사기 필터를 사용하여 용액을 여과합니다.
    알림: 4 °C에서 보관하고 직사광선에 노출되지 않도록 보호하십시오.
  3. Gut-on-a-Chip 장치를 60°C로 설정된 건조 오븐에 넣고 남아 있는 수분을 제거하기 위해 최소 30분 동안 배양합니다.
  4. UV/오존 발생기를 사용하여 Gut-on-a-Chip 장치를 UV 및 오존 처리에 60분 동안 노출시킵니다.
    알림: 치료 중 PDMS 표면의 최적 활성화를 보장하려면 UV 램프와 장치 사이에 약 3cm 이하의 거리를 유지하십시오. 효율적인 표면 활성화를 달성하기 위해 발전기의 장치 과밀을 피하십시오.
  5. 바인더 클립을 사용하여 상부 마이크로채널의 입구, 바이패스 및 출구 튜브를 고정합니다.amp에드. 또한 clamp 하부 마이크로채널용 입구 튜브.
  6. 하부 마이크로채널의 배출 튜브를 분리합니다. 하부 마이크로채널의 바이패스 튜브가 열려 있는지 확인하십시오.
  7. P100 마이크로피펫을 사용하여 하부 마이크로채널의 출구 구멍을 통해 100μL의 1% PEI 용액을 주입합니다.
    알림: 장치가 UV/오존 노출로 인해 아직 따뜻할 때 이 프로세스를 수행하는 것이 좋습니다. PEI 용액이 마이크로 채널을 통해 흐르고 PEI 용액이 하부 마이크로 채널의 바이패스 튜브에서 나오기 위해 떨어지는 것을 관찰하십시오.
  8. 하단 마이크로채널용 배출 튜브를 다시 연결합니다.
  9. 바인더 클립을 사용하여 하부 마이크로채널의 입구, 바이패스 및 출구 튜브를 고정합니다.amp에드. 또한 clamp 상부 마이크로채널용 입구 튜브.
  10. 상부 마이크로채널의 배출 튜브를 분리합니다. 상부 마이크로채널의 바이패스 튜브가 열려 있는지 확인하십시오.
  11. P100 마이크로피펫을 사용하여 상부 마이크로채널의 출구 구멍을 통해 100μL의 1% PEI 용액을 주입합니다.
    알림: 마이크로 채널을 통해 흐르는 PEI 용액과 PEI 용액이 상부 마이크로 채널용 바이패스 튜브에서 떨어지면서 나오는 것을 관찰하십시오.
  12. 상부 마이크로 채널의 출구 튜브를 다시 부착합니다.
  13. 상부 및 하부 마이크로채널이 모두 1% PEI 용액으로 채워지면 장치를 실온(RT)에서 10분 동안 배양합니다.
  14. 1.5% GA 용액으로 1.12-0.1단계를 수행합니다.
  15. 상부 및 하부 마이크로채널이 모두 0.1% GA 용액으로 채워지면 장치를 RT에서 20분 동안 배양합니다.
  16. 탈이온수로 1.5-1.12단계를 수행하여 과도한 표면 활성화 용액을 제거합니다.
  17. 칩을 60°C의 건조 오븐에 넣고 밤새 건조시킵니다.
    알림: 튜브가 충돌하지 않도록 모든 튜브에서 바인더 클립을 제거해야 합니다. 이 건조 공정은 Gut-on-a-Chip12 내에서 마이크로채널의 균일한 표면 활성화에 매우 중요합니다.

2. Gut-on-a-Chip 배양을 위한 세포외 기질(ECM) 코팅 및 배양 배지 준비

  1. 콜라겐 I 및 마트리겔의 최종 농도가 각각 60μg/mL 및 2%(vol/vol)가 되도록 오가노이드 기저 배지로 ECM 혼합물을 준비합니다.
    참고: 내장 칩당 50μL의 ECM 혼합물을 준비합니다(즉, 각 상부 및 하부 마이크로채널에 대해 20μL의 ECM 혼합물과 10μL의 추가 혼합물). 사용 당일에 이것을 준비하고 이 용액을 4°C에서 보관하거나 사용할 준비가 될 때까지 얼음 위에 두십시오.
  2. 건조 오븐에서 UV/오존, PEI 및 GA로 처리된 Gut-on-a-Chip을 꺼냅니다.
    알림: 위상차 현미경으로 검사하여 잔류 수분이 있는지 확인합니다.
  3. Gut-on-a-Chip을 생물 안전 캐비닛에서 10분 동안 식히십시오.
  4. 바인더 클립을 사용하여 상부 마이크로채널의 입구, 바이패스 및 출구 튜브를 고정합니다.amp에드. 또한 clamp 하부 마이크로채널용 입구 튜브.
  5. 하부 마이크로채널의 배출 튜브를 분리합니다.
  6. P100 마이크로피펫을 사용하여 하부 마이크로채널의 출구 구멍을 통해 20μL의 ECM 혼합물을 주입합니다.
    알림: 기포 포착 없이 마이크로 채널을 통해 흐르는 ECM 혼합물을 관찰하십시오. 기포가 있는 경우 기포가 사라질 때까지 하부 마이크로채널에 추가 ECM 혼합물을 도입합니다.
  7. 하단 마이크로채널용 배출 튜브를 다시 부착합니다.
  8. 바인더 클립을 사용하여 하부 마이크로채널의 입구, 바이패스 및 출구 튜브를 고정합니다.amp에드. 또한 clamp 상부 마이크로채널용 입구 튜브.
  9. 상부 마이크로채널의 배출 튜브를 분리합니다.
  10. P100 마이크로피펫을 사용하여 상부 마이크로채널의 출구 구멍을 통해 20μL의 ECM 혼합물을 주입합니다.
  11. 상부 마이크로채널용 배출 튜브를 다시 부착합니다.
  12. 칩을 37°C에서 5% CO2가 있는 가습된CO2 인큐베이터에 1시간 동안 넣어 PEI 및 GA로 처리된 PDMS 멤브레인 위에 ECM 층을 형성합니다(그림 3A).
    알림: 모든 튜브가 cl인지 확인하십시오.amp배양 중에 ed.
  13. ECM 코팅을 배양하는 동안 인간 오가노이드 2에서 파생된 Gut-on-a-Chip에 이전에 보고된 바와 같이 A8301이 없지만 10μM Y-27632 및 2.5μM CHIR99021를 포함하는 오가노이드 배양 배지인 콜드 시딩 배지가 포함된 1mL 주사기2개를 준비합니다.
    참고: A8301은 이전에 보고된 바와 같이 코팅된 ECM에 대한 셀의 부착을 향상시키기 위해 배지에서 제거되었습니다2. Gut-on-a-Chip 배양 0일차에는 상부 마이크로채널 흐름만 필요합니다. 따라서 상부 채널에는 전체 주사기를 준비하고 하부 채널에는 최소 0.2mL를 준비합니다.
  14. ECM 코팅이 완료되면 인큐베이터에서 칩을 꺼내고 클램프를 하부 마이크로채널에 연결된 바이패스 튜브에 놓습니다.
  15. 파종 배지로 채워진 1mL 주사기를 Gut-on-a-Chip의 하부 마이크로 채널에 연결된 뭉툭한 바늘에 연결합니다. 파종 배지(~50μL)를 바이패스 튜브에 조심스럽게 도입합니다. 튜빙이 도입된 매체로 채워지면 바인더 클립으로 하부 마이크로채널에 연결된 바이패스 튜빙을 고정합니다.
  16. CL을 해제amp 하부 마이크로채널에 연결된 출구 튜브. 파종 매체를 하부 마이크로 채널에 조심스럽게 도입하여 시스템을 통해 원활하게 흐르도록 합니다. 관류 후 하부 마이크로채널에 연결된 출구 튜브를 바인더 클립으로 고정합니다.
  17. 그런 다음 상부 마이크로 채널에 연결된 바이패스 튜브를 엽니다.
  18. 파종 배지로 채워진 1mL 주사기를 Gut-on-a-Chip의 상부 마이크로 채널에 연결된 뭉툭한 바늘에 연결합니다. 파종 배지(~50μL)를 바이패스 튜브에 조심스럽게 도입합니다. 튜빙이 도입된 매체로 채워지면 바인더 클립으로 상부 마이크로 채널에 연결된 바이패스 튜빙을 고정합니다.
  19. 하부 마이크로채널에 연결된 배출 튜브를 풉니다. 파종 매체를 상부 마이크로 채널에 조심스럽게 도입하여 시스템을 통해 원활하게 흐르도록 합니다. 관류 후 상부 마이크로 채널에 연결된 출구 튜브를 바인더 클립으로 고정합니다.

3. 파종을 위한 개의 장 오가노이드 세포 준비

참고: Gut-on-a-Chip 모델을 생성하기 위해 IBD 환자 개에서 추출한 개 결장 오가노이드(대장 내장형이라고 함)가 이 프로토콜에 활용되었습니다. 이들 결장체는 이전에 보고된 방법15,18에 따라 생검된 결장 조직의 3 내지 5개의 작은 단편으로부터 유래하였다. 최적의 결과를 얻으려면 최소 3번의 배양 과정을 거친 개 대장체를 사용하여 체외 응용 분야에 적합한 안정적인 오가노이드를 확립하는 것이 중요합니다. 오가노이드 내에서 다중 계통 세포의 적절한 분화를 촉진하여 기능적 성숙도와 Gut-on-a-Chip 모델의 후속 실험에 대한 적합성을 보장하기 위해 최소 3-4일 동안 개 대장을 배양하는 것이 좋습니다. 이 작업에 대한 구절의 최대 한계는 20개 미만이며, 이는 20개의 연속 구절25에 걸쳐 변경되지 않은 표현형과 핵형을 입증한 이전 연구에서 알 수 있습니다. 이들 기증자의 신호는 보충표 S1에 제시되어 있다.

  1. 이전에 보고된 배지 15,26,27에서 변형된 재료 표에 나열된 오가노이드 배양 배지를 사용하여 Matrigel15,18의 30μL에 내장된 24웰 플레이트에서 개 결장체를 배양합니다. 조절된 배지는 Noggin1을 분비하도록 조작된 Rspo293 세포와 HEK28 세포를 배양하여 얻었다.
  2. 진공 흡입을 통해 오가노이드 배양 배지를 폐기하고 얼음처럼 차가운 온도에서 500μL의 세포 회수 용액을 각 웰에 주입합니다. 4 °C에서 30분간 배양합니다.
    참고: 일반적으로 성숙한 개의 장 오가노이드 24웰 플레이트 중 3개의 웰은 x10 배율에서 40-50개의 오가노이드/하나의 시야를 가진 단일 Gut-on-a-Chip 장치를 시드하기에 충분한 양의 해리된 세포를 제공합니다.
  3. P1000 마이크로피펫을 사용하여 Matrigel 돔을 5초 동안 기계적으로 파괴합니다. 그런 다음 오가노이드 현탁액을 15mL 원뿔형 튜브에 모은다.
  4. 원추형 튜브를 200× g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거합니다.
  5. 실온에서 1mL의 트립신 유사 프로테아제를 도입하고 10μM Y-27632를 보충하고 P1000 마이크로피펫을 사용하여 피펫팅하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다.
  6. 세포 현탁액을 37°C로 설정된 수조에 넣고 혼합물을 주기적으로 흔들면서 10분 동안 배양합니다.
  7. 5mL의 따뜻한 오가노이드 기저 배지를 도입하고 P1000 마이크로피펫을 사용하여 세포 응집이 보이지 않고 탁해질 때까지 세포 현탁액을 세게 피펫팅합니다.
  8. 세포 현탁액을 70μm 컷오프가 있는 세포 스트레이너에 통과시켜 Matrigel 파편과 큰 세포 클러스터를 제거합니다.
  9. 원뿔형 튜브를 200× g 및 4°C에서 5분 동안 원심분리한 다음 펠릿을 파종 배지에 다시 현탁시킵니다. 개의 Gut-on-a-Chip 장치 1개를 파종하는 경우 20μL의 파종 배지를 사용하여 세포 펠릿을 재현탁시킵니다(즉, 하나의 Gut-on-a-Chip 장치를 파종할 때 20μL의 파종 배지 사용).
  10. 이전에 보고된 바와 같이 파종 배지를 사용하여 생존 가능한 세포의 농도를 1 × 107 cells/mL로 수정합니다2. 세포 현탁액 10μL와 트리판 블루 10μL를 결합하여 혈구계를 사용하여 생존력 평가를 수행한 다음 현미경으로 세포를 관찰합니다.
    참고: 최적의 세포 부착과 칩 멤브레인에 균일한 단층 형성을 보장하기 위해 세포 농도를 적절하게 조정하는 것이 중요합니다. 초기 세포 수가 충분하지 않으면 합류 단층의 확립이 지연되거나 실패할 수 있습니다. 반대로, 세포 수가 과도하면 비부착 세포가 채널 내에서 덩어리로 응집되어 바람직하지 않은 농도 효과를 초래할 수 있습니다.

4. 2D 세포 단층의 파종 및 형성

  1. 상부 마이크로채널의 배출 튜브를 분리합니다. 상부 마이크로채널의 바이패스 튜브가 열려 있는지 확인하십시오. 바인더 클립을 사용하여 하단 마이크로채널의 입구와 출구를 모두 고정합니다.amp.
  2. P100 또는 P20 마이크로피펫을 사용하여 프로토콜 3의 셀 현탁액 20μL를 상부 마이크로채널의 출구 구멍에 도입합니다(그림 3B 시딩).
  3. 바인더 클립을 사용하여 상부 마이크로채널의 바이패스와 입구 튜브를 고정합니다.amp 그것. 그런 다음 출구 튜브를 상부 마이크로 채널의 출구 구멍에 다시 부착하여 상부 마이크로 채널에 압력이 가해지지 않도록 공정 전반에 걸쳐 튜브가 열린 상태로 유지되도록 합니다. 이 단계가 끝나면 바인더 클립을 사용하여 상부 채널의 출구 튜브를 천천히 고정하여 고정합니다.amp 그것.
  4. 현미경을 사용하여 세포가 상부 마이크로채널 전체에 고르게 분포되어 있는지 확인합니다.
    알림: 원하는 셀 부착이 완료될 때까지 안정적인 정적 조건을 허용하기 위해 채널 내에서 매체의 이동을 중지하는 튜브를 클램핑하는 것이 중요합니다.
  5. 칩을 37°C의 가습된 CO2 인큐베이터에 넣습니다.
    참고: 개의 장 오가노이드 세포가 ECM 코팅에 부착되는 데 약 3시간이 걸립니다(그림 3B 첨부).
  6. Gut-on-a-Chip의 상부 마이크로채널에 부착된 주사기를 CO2 인큐베이터 내에 있는 주사기 펌프에 연결합니다.
    알림: 주사기 펌프의 손잡이를 사용하여 매체를 마이크로 채널로 조심스럽게 세척하고 결합되지 않은 셀을 제거합니다. 현미경으로 칩을 검사하여 부착되지 않은 세포가 효과적으로 씻겨 나갔는지 확인합니다.
  7. 파종 배지를 사용하여 30μL/h에서 배양 배지의 흐름을 시작합니다. 이 연속 흐름은 처음에 Gut-on-a-Chip에 2D 단층이 설정될 때까지 상부 마이크로 채널에만 적용됩니다. 하단 마이크로채널의 경우 마이크로채널을 고정하고 매체를 플러시하지 않은 상태로 둡니다.
  8. 세포를 파종한 다음 날부터 배양 배지를 파종 배지에서 A8301을 포함하고 10μM Y-27632 및 2.5μM CHIR99021가 부족한 오가노이드 배양 배지로 변경합니다.
  9. 단층이 설정되면 하부 마이크로 채널로도 연속 매체 흐름을 시작합니다. 개의 장 오가노이드 상피 세포가 상피 단층을 형성하는 데 일반적으로 2-3일이 걸립니다(그림 3C).

5. 개 Gut-on-a-Chip의 3D 형태 형성 확립

참고: Gut-on-a-Chip에서 합류 단층이 형성된 후 상부 채널과 하부 채널 및 세포 변형의 중간 흐름이 도입되어 그림 2와 같이 2D 단층에 대한 3D 형태 형성을 시작했습니다.

  1. 오가노이드 배양 배지를 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 도입하여 Gut-on-a-Chip 시스템에서 3D 형태 형성 개발을 시작합니다. 기존 Gut-on-a-Chip 설계(즉, 500μm 높이의 마이크로채널)에서 0.02dyne/cm2 의 전단 응력을 달성하려면 유속을 50μL/h로 높입니다29.
  2. 10% 세포 변형률과 0.15Hz의 주파수를 2 이전에 권장된 대로 시험관 내에서 배양된 세포에 주기적 변형을 적용하는 컴퓨터 조절 바이오리액터를 사용합니다. 이 공정은 Gut-on-a-Chip 장치에 진공 흡입을 적용합니다.
  3. 이러한 배양 조건을 최소 2-3일 동안 유지합니다. 개 장 단층의 3D 형태 형성은 일반적으로 경막 채널 흐름과 진공 흡입이 시작된 후 2-3일 후에 발생합니다(그림 3C).

6. 개 Gut-on-a-Chip의 특성 분석

  1. 살아있는 세포 이미징
    1. 주사기 펌프를 사용하여 매체를 부드럽게 흐르게 하여 Gut-on-a-Chip의 기포를 제거합니다.
    2. 주사기 펌프에서 Gut-on-a-Chip 장치를 분리합니다.
      알림: Gut-on-a-Chip 내에서 압력을 가할 수 있는 조작을 피하십시오.
    3. 장치를 현미경에 올려 놓아 확립된 3D 상피의 이미지를 캡처합니다. 위상차를 사용하여 3D 상피층의 구조를 시각화하려면 10x 및 20x 대물렌즈를 사용하십시오(그림 3C).
  2. 면역형광 염색
    1. BSA 1g을 인산염 완충 식염수(PBS) 50mL에 용해시켜 차단 용액을 제조하여 2% BSA를 만듭니다. 여과를 위해 0.2μm의 주사기 필터에 용액을 통과시킵니다. 이 용액을 4°C에서 보관하십시오.
    2. 150 μL의 Triton X-100과 50 mL의 차단 용액을 결합하여 투과성 용액을 준비하여 0.3% Triton X-100의 최종 농도를 만듭니다. 여과를 위해 0.2μm의 주사기 필터에 용액을 통과시킵니다. 이 용액을 4°C에서 보관하십시오.
    3. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 100μL의 4% PFA를 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 주입하여 셀을 고정합니다.
    4. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 100μL의 PBS를 주입하여 세포를 헹굽니다.
    5. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 100μL의 0.3% Triton을 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 주입하여 세포의 투과화를 수행합니다. 장치를 30분 동안 RT에 둡니다.
    6. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 100μL의 PBS를 주입하여 세포를 헹굽니다.
    7. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 100μL의 2% BSA를 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 주입하여 비특이적 결합을 방지하기 위해 세포 차단을 수행합니다. 장치를 1시간 동안 RT에 두십시오.
    8. 2% BSA에 희석한 1차 항체 용액 20μL를 주입하고 상온에서 3시간 동안 방치한 후 4°C에서 하룻밤 동안 배양합니다.
      알림: 모든 튜브가 cl인지 확인하십시오.amp밤새 4°C에서 배양하는 동안 ed. 1차 항체의 농도는 단층 또는 3D 오가노이드 염색에 권장되는 농도보다 2-5배 높아야 합니다(보충 그림 S1).
    9. 2.4-2.11 단계에 설명된 대로 상부 및 하부 마이크로 채널 모두에 100μL의 PBS를 주입하여 세포를 헹굽니다.
    10. 2% BSA에 희석한 2차 항체 용액 20μL를 주입하고 상온에서 1시간 동안 둡니다.
      알림: 모든 튜브가 cl인지 확인하십시오.amp배양 중에 ed. 이 단계부터 광표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 장치 설정을 차폐해야 합니다.
    11. 2.4-2.11 단계에 설명된 대로 상부 및 하부 마이크로 채널 모두에 100μL의 PBS를 주입하여 세포를 헹굽니다.
    12. F-액틴과 DAPI(디아미디노-2-페닐린돌) 대조염색을 위한 복합 용액을 준비합니다. 20-2.4단계에 설명된 대로 결합된 용액 20μL를 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 주입합니다.
    13. 2.4-2.11단계에서 설명한 대로 상부 및 하부 마이크로채널 모두에 100μL의 PBS를 주입하여 세포를 헹굽니다.
      형광 현미경 또는 컨포칼 현미경을 사용하여 3D 상피 세포 구조의 형광 이미징을 수행합니다.

7. 상피 장벽 기능

  1. 주사기 펌프를 사용하여 매체를 부드럽게 흐르게 하여 Gut-on-a-Chip의 기포를 제거합니다. 측정하는 동안 모든 튜브가 열려 있는지 확인하십시오.
  2. 주사기 펌프에서 Gut-on-a-Chip을 제거하고 최소 10분 동안 상온에 둡니다.
  3. 70% EtOH 용액에서 Ag/AgCl 전극을 제거합니다.
  4. 두 개의 Ag/AgCl 전극을 각각 상부 입구와 하부 출구에 배치하여 멀티미터를 사용하여 상피층의 저항을 측정합니다.
  5. 두 개의 Ag/AgCl 전극을 각각 하부 입구와 상부 출구에 놓습니다. 이 두 값의 평균을 Gut-on-a-Chip에 대한 저항 값으로 보고합니다.
    알림: 블랭크 TEER은 상피 없이 ECM 코팅만 있는 Gut-on-a-Chip에서 측정해야 합니다.
  6. 경상피 전기 저항(TEER) 값(kΩ×cm2)을 계산하는 것은 수학식 1을 이용하여 계산할 수 있다.
    TEER = (Ωt -Ω 공백) × A (1)
    여기서, Ωt는 실험 시작 이후 특정 시점에 측정된 저항값이고,블랭크Ω 상피가 없는 시점에 측정된 저항값이고, A는 세포층으로 덮인 표면의 면적이다(이 Gut-on-a-Chip 설계(29)의 경우 대략 0.11cm2).
    1. 방정식 (2)를 사용하여 정규화 TEER을 계산합니다.
      티어 = Equation 1 (2)
      여기서 Ω0 은 이전에보고된 바와 같이 실험의 초기 판독 시점에서의 저항 값입니다(그림 4C).

Representative Results

이 프로토콜은 Gut-on-a-Chip 시스템에서 3D 장 형태 형성의 자발적인 발달을 안정적으로 촉진합니다. 이 접근법은 염증성 장 질환(IBD)에 걸린 개에서 유래한 장 오가노이드에서 얻은 개의 장 상피 세포를 활용합니다(그림 1B). 개 장 상피 세포의 3D 형태 형성의 간헐적인 클러스터링은 6-9일의 중간 흐름 후 마이크로채널 전체에서 관찰될 수 있습니다(그림 3C). 이러한 형태학적 변화는 위상차 기술을 사용하여 모니터링할 수 있습니다. 이 연구에서는 IBD 진단을 받은 두 마리의 개에서 추출한 오가노이드를 활용했습니다. 특히, 성공적인 3D 형태 형성은 두 개의 생물학적 복제에서 관찰되었으며, 각 복제는 두 개의 기술적 복제로 수행되었습니다. 이 연구의 결과는 다른 개 기증자로부터 유래한 장내 오가노이드와 관련된 향후 연구를 위한 기초를 제공합니다. 이러한 결과는 이전에 인간 샘플에서 보고된 실험적 접근 방식의 잠재적인 적용 가능성과 반복성을 보여줍니다. 이러한 발견은 Gut-on-a-Chip 기술이 이전에 인간의 장 상피 세포를 활용한 연구에서 보고된 바와 같이 개의 장 상피 세포에 적용할 수 있음을 추가로 확인시켜 줍니다2.

이 프로토콜은 기존의 형광 현미경을 사용하여 미세유체 칩에서 융모와 같은 구조를 형성한 오가노이드 유래 단층의 3D 구조를 평가하는 데 면역형광 염색을 사용할 수 있음을 보여주었습니다(그림 4 A,B). 이 프로토콜은 면역형광 염색을 통해 분화되고 공간적으로 조직화된 세포 표현형을 검증하도록 조정할 수 있습니다. Gut-on-a-Chip 내에서 3D 형태 형성의 시각화는 다양한 병리학적 상호작용 동안 숙주 반응을 조사할 수 있는 훌륭한 기회를 제공한다 14,23,31. 이전에 인간에서 기술된 바와 같이, 환자 기증자로부터 유래한 상피세포와 결합될 때, 이 기술은 장 질환의 개인화된 모델을 구축하는데 이용될 수 있다13. 형광 in situ hybridization과 같은 표적 RNA 시각화 기술과 면역형광 이미징의 통합을 통해 Gut-on-a-Chip 시스템 내에서 숙주의 전사체 및 단백질체를 시각적으로 분석할 수 있습니다.

장막의 무결성을 보존하는 것은 장 항상성을 유지하는 데 매우 중요하며, Gut-on-a-Chip 플랫폼은 이 중요한 기능을 정밀하게 모니터링하고 정량화할 수 있어 귀중한 이점을 제공합니다. Gut-on-a-Chip 기술을 사용한 TEER 측정은 몇 가지 이점을 제공합니다. 예를 들어, 이전 연구에서는 장 세포를 비병원성 및 프로바이오틱 박테리아(32)와 함께 공동 배양하는 동안, 그리고 장누수성 조건(leaky-gut-condition)에서 TEER을 성공적으로 평가했다23. 이를 통해 연구자들은 다양한 질환이 장 장벽 기능에 미치는 영향을 연구하고 장 건강을 증진하기 위한 잠재적인 개입을 식별할 수 있습니다.

Figure 1
그림 1: 환자 유래 반려견 IBD Gut-on-a-Chip의 확립. (A) 환자 유래 장 오가노이드와 Gut-on-a-Chip 플랫폼의 통합. 내시경 생검을 통해 장 크립트 세포를 분리하여 기증자 특이적 장 오가노이드를 개발할 수 있습니다. 상피 세포는 오가노이드에서 단일 세포로 해리된 다음 PDMS 기반 Gut-on-a-Chip에 파종하고 고유한 동적 미세환경에서 배양할 수 있습니다. (B) IBD 개의 콜로노이드 대표 이미지. 스케일 바 = 100 μm. (C) 이 회로도는 상부 및 하부 마이크로 채널 사이에 배치된 다공성 멤브레인으로 구성된 Gut-on-a-Chip 장치를 보여줍니다. 위쪽 마이크로 채널은 파란색 영역으로 표시되고 아래쪽 마이크로 채널은 빨간색 영역으로 표시됩니다. 진공 챔버는 마이크로 채널의 각 측면에 존재하며, 이는 다공성 막을 변형시켜 연동 운동(24)을 모방한다. (D) 송곳니 Gut-on-a-Chip의 설정에는 커버 슬립(2,24) 상에 배치되는 튜빙으로 조립된 PDMS 기반 Gut-on-a-Chip이 포함됩니다. 바이패스 튜빙은 취급(예: 주사기에 연결) 중에 마이크로채널 내에 압력이 축적되는 것을 방지하는 데 중요합니다. 바인더 클립은 튜브를 고정하는 데 사용됩니다. 부피에 민감한 물질은 상부 또는 하부 배출구의 열린 구멍을 통해 주입할 수 있습니다. 오가노이드 배양 배지는 주사기를 뭉툭한 끝 바늘에 연결하고 상부 및 하부 입구를 통해 흐르게 하여 주입할 수 있습니다. 약어: IBD = inflammatory bowel disease; PDMS = 폴리디메틸실록산. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 2
그림 2: 개 IBD Gut-on-a-Chip의 융모 유사 구조 형성. 해리된 상피 세포를 ECM으로 코팅된 Gut-on-a-Chip에 파종했습니다. 해리된 세포가 PDMS 멤브레인에 부착되면 3일(D0-D3) 동안 정점 흐름이 시작되었습니다. 합류 2D 단층이 형성되면(D3) 빈번한 스트레칭을 동반한 기저변 흐름이 시작됩니다(스트레칭, AP 및 BL 흐름). 2-3일의 이중 흐름 및 막 스트레칭 후 2D 단층은 3D 형태 형성을 시작하고 9일 배양 후 융모와 같은 구조가 형성됩니다(3D 형태 형성, D9-D12). 약어: ECM = 세포외 기질; PDMS = 폴리디메틸실록산; AP = 정점; BL = 기저변. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 3
그림 3: Gut-on-a-Chip의 개 장 오가노이드 파종 및 3D 형태 형성. (A) PDMS 기반 Gut-on-a-Chip에서 다공성 막의 표면 활성화를 위한 실험 단계. UV/오존 처리, PEI 및 GA 처리를 함께 사용하면 ECM 용액에 존재하는 아민의 가교가 촉진됩니다. 이 과정은 ECM 단백질을 다공성 막에 안정적으로 고정시킵니다. (B) 위상차 이미지는 파종 직후(왼쪽)와 파종 후 3-5시간(오른쪽)의 세포 형태를 보여줍니다. 파종 3시간 후 다공성 막은 단일 세포가 부착된 더 얇고 어두운 영역을 표시하여 부착 과정을 강조합니다. (C) 위상차 이미지는 Gut-on-a-Chip 시스템 내에서 장 단층의 3D 형태 형성을 묘사합니다. 이 단층은 IBD에 걸린 개에서 유래했으며 이러한 오가노이드 세포는 유체 흐름 및 스트레칭 동작을 포함하는 동적 조건에서 12일 동안 배양되었습니다. 척도 막대 = 50μm(B,C). 약어: IBD = inflammatory bowel disease; ECM = 세포외 기질; PDMS = 폴리디메틸실록산; PEI = 폴리에틸렌민; GA = 글루타르알데히드. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Figure 4
그림 4: 환자 유래 송곳니 Gut-on-a-Chip의 3D 형태학적 발달 평가. (A) 송곳니 IBD Gut-on-a-Chip의 면역형광 이미징, 형광 현미경으로 평가한 12일 배양 후 완전히 발달된 3D 상피의 하향식 보기를 보여줍니다. 밀착 접합 단백질(ZO-1)은 노란색으로 시각화됩니다. 브러시 테두리 막(F-actin)은 빨간색으로 나타납니다. 핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 나타납니다. (B) 장거리 렌즈가 장착된 컨포칼 현미경을 사용한 개 IBD Gut-on-a-Chip의 면역형광 이미징. 개략도에서 볼 수 있듯이 12일간의 배양 후 완전히 발달된 3D 상피의 융모와 같은 구조의 단면에 대한 형광 이미지가 표시됩니다. 또한 Z-스태킹은 3D 상피의 측면도를 보여주며, 이는 융모와 같은 구조의 형성을 보여줍니다. 브러시 경계막(F-actin)은 빨간색으로 나타나고 핵은 DAPI로 염색되어 파란색으로 나타납니다. (C) 장 장벽 기능은 환자 유래 개 Gut-on-a-Chips에서 TEER에 의해 평가 및 측정되었습니다. 안정적인 TEER 값은 Gut-on-a-Chip에서 배양 5일차에 도달했습니다. 오차 막대는 측정값의 SEM을 나타냅니다. TEER 값은 하나의 기술적 복제와 함께 두 개의 생물학적 복제물 사이에서 측정되었습니다. 스케일 바 = 50 μm(A), 25 μm(B). 약어: IBD = inflammatory bowel disease; DAPI = 4', 6- 디아 미디노 -2- 페닐 린돌; TEER = 경상피 전기 저항. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 그림 S1: 개 대장 유래 단층 및 Gut-on-a-Chip 장치에서 항-ZO-1 다클론 항체의 특성화. (A) 노란색의 ZO-1과 빨간색의 F-actin의 면역형광 염색 및 오버레이 이미지. 눈금 막대 = 25μm. (B) 'Leaky Gut Chips'에서 노란색으로 표시된 ZO-1의 면역형광 시각화는 프로바이오틱 박테리아(LGG + Cytokines 또는 VSL#3 + Cytokines)를 사용한 자극 및 프로바이오틱스 자극을 사용하지 않은 무균 대조군(Cytokines)을 포함한 다양한 조건에서 수행되었습니다. 눈금 막대 = 50μm. 이 그림은 Min et al.23에서 재현되었습니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

보충표 S1: 조직 기증자 정보 요약. 기증자의 연령, 성별, 품종, 조직병리학적 평가 및 개 IBD 활동 지수(CIBDAI) 점수의 요약표. CIBDAI는 개 IBD33의 임상적 중증도를 추론하는 데 사용되는 수치 채점 시스템입니다. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

이 연구는 개의 장 오가노이드와 개의 IBD Gut-on-a-Chip 모델 개발의 호환성을 선구적으로 입증한 것입니다. 장내 오가노이드와 오가노이드 유래 단층 배양을 미세유체 시스템(즉, Gut-on-a-Chip 시스템)에 통합함으로써 기술이 더욱 발전하여 생리학적 역학을 밀접하게 모방하고 생물학적 조건을 더 잘 대표하는 체외 장 모델을 만들 수 있게 되었습니다. 특히, 인간에게 IBD 유래 오가노이드를 사용한 Gut-on-a-Chip 배양에 대한 보고가 거의 없기 때문에, 개 IBD 유래 Gut-on-a-Chip을 사용한 이번 연구는 인간 IBD 연구에 대한 선도적인 통찰력을 제공할 수 있습니다.

Gut-on-a-Chip에서 개의 장 상피 3D 형태 형성을 성공적으로 개발하려면 몇 가지 중요한 단계에 세심한 주의를 기울여야 합니다. 첫째, PDMS 미세유체 채널의 소수성 표면은 ECM 접착 및 후속 셀 부착을 방해할 수 있으므로 ECM 코팅 및 셀 파종 전에 PDMS의 표면 활성화가 필요합니다(프로토콜 섹션 1 참조). 안정적인 단층 배양을 달성하려면 세포 부착 후 과도한 미부착 세포를 제거하는 것이 중요합니다(프로토콜 단계 4.6-4.7). 또한 일정한 배지 흐름 및 연동과 같은 진공 운동과 같은 동적 자극은 장 상피의 3D 형태 형성에 필요합니다(프로토콜 단계 5.2). Gut-on-a-Chip 배양의 모든 단계에서 마이크로채널의 기포를 방지하기 위해서는 신중한 취급이 필수적입니다.

Gut-on-a-Chip에 세포 파종이 불량한 경우 세포 수가 적거나 세포 부착이 불량하기 때문일 수 있습니다. 낮은 세포 수 문제를 해결하려면 Matrigel에서 성장을 관찰하여 준비된 장내 오가노이드의 상태를 검사하는 것이 중요합니다. 세포 해리 후 Trypan blue 염색으로 세포 생존율을 평가하여 세포의 20% 이상이 죽지 않도록 할 수 있습니다. 생존 가능한 세포 수가 충분하지 않은 경우 오가노이드 배지 조건을 최적화할 수 있습니다. 또 다른 가능성은 불완전한 오가노이드 해리로, 이로 인해 70μm보다 큰 세포 덩어리가 과도하게 발생하여 필터에 갇히게 됩니다. 이 문제를 해결하기 위한 한 가지 옵션은 세포 해리 중 피펫팅 기간을 연장하는 것입니다. 또는 15mL 코니컬 튜브를 트립신 유사 프로테아제로 치료하는 동안 매분마다 부드럽게 교반할 수 있습니다. Gut-on-a-Chip에 대한 세포 부착 불량은 부적절한 ECM 코팅으로 인한 것일 수 있습니다. 코팅 과정에서 기포의 존재 여부를 주의 깊게 확인하고 필요에 따라 코팅 용액을 부드럽게 추가하여 기포 형성을 방지하는 것이 좋습니다. 세포가 과밀화되고 부착되지 않은 세포를 씻어내지 못하면 초기 단층이 불충분해질 수 있습니다. 이 경우 주사기 플런저를 밀 때 약간의 펄스가 가해질 수 있습니다. 이러한 문제 해결 단계는 Gut-on-a-Chip 배양 프로세스 중에 문제를 식별하고 해결하는 데 도움이 될 수 있습니다.

이 Gut-on-a-Chip 플랫폼을 사용하면 물결 모양의 3D 상피층을 생성할 수 있지만, 장내 미세환경을 완전히 복제하기 위해서는 추가적인 생물학적 복잡성이 필요하다는 것을 알고 있습니다. 상피 세포와 중간엽 세포 간의 상호 작용, 3D 재생을 위한 ECM의 증착, 적절한 줄기 세포 틈새를 형성하는 크립트-융모 특성의 존재를 고려하는 것이 중요합니다. 섬유아세포(fibroblast)와 같은 기질 세포는 ECM 단백질의 생산과 장 형태형성(intestinal morphogenesis)의 조절에 중요한 역할을 한다34,35,36. 이 모델에 중간엽 세포를 포함하면 형태 형성과 세포 부착 효율성을 모두 향상시킬 수 있습니다. 모세혈관과 림프관을 포함하는 내피층은 분자 수송과 면역 세포의 모집을 조절하는 데 중요한 역할을 합니다37,38. 환자 유래 면역 세포의 포함은 선천성 면역과 적응 면역 사이의 상호 작용을 입증하고 조직 특이적 면역을 확립할 수 있기 때문에 장 질환 모델링에 필수적일 수 있습니다39. Gut-on-a-Chip에서 3D 형태 형성이 완료된 후 오가노이드 배양 배지를 오가노이드 분화 배지로 변형할 수 있습니다. 이는 실험 목표에 따라 추가적인 세포 분화를 유도하는 실행 가능한 접근 방식이 될 수 있습니다.

3D 마이크로아키텍처 를 in situ 이미징하는 것은 긴 작동 거리가 필요하기 때문에 까다로우며, 이는 장거리 대물렌즈로 극복할 수 있습니다. 또한 층별 미세 가공 및 접착 방법은 SEM으로 검사하기 위해 상층에 접근하기 어렵게 만듭니다. 현재 Gut-on-a-Chip 설계의 경우 Gut-on-a-Chip 마이크로 장치당 하나의 주사기 펌프가 필요하며, 이는CO2 인큐베이터 공간을 차지하고 대규모 실험을 방지합니다. 사용자 친화적인 플랫폼과 고처리량 스크리닝을 위해 확장성을 높이기 위해서는 혁신이 필요합니다.

이러한 현재 프로토콜은 체외에서 3D 상피층의 자발적인 개발을 가능하게 하여 기존 3D 오가노이드, 2D 단층 및 정적 마이크로디바이스 배양 시스템의 한계를 뛰어넘습니다. 이러한 역동적인 in vitro 장내 미세환경은 다양한 세포 유형의 공동 배양을 도입하여 제어할 수 있습니다. 이전 연구에서는 장내 마이크로바이옴(14,23) 및 말초 단핵 세포(30)를 공동 배양하는 것을 포함하여 Gut-on-a-Chip 미세환경을 조작하는 방법을 탐구했습니다. 이 재구성 된 미세 환경은 약물 테스트, 기초 기계 연구 및 질병 모델링을 포함하여 수많은 잠재적 응용 분야를 가지고 있습니다. 재구성된 미세환경은 약물 검사(23,40,41) 및 질병 모델링(12,13,14,30)과 같은 광범위한 응용뿐만 아니라 장 형태 형성(42)의 근본적인 기계론적 조사에 상당한 잠재력을 가지고 있다. 대사 산물(43)의 평가를 위한 상층액을 수집하거나, 게놈 검사(2,32)를 위한 세포를 수집하거나, 또는 후속 면역형광 이미징(23,44)을 위해 살아있는 세포 염료 또는 고정을 사용하여 세포를 육안으로 검사함으로써 다양한 분석을 수행할 수 있다.

이 연구는 Gut-on-a-Chip 플랫폼에서 개 장 상피층의 3D 형태 형성을 개발하기 위한 재현 가능한 프로토콜을 제시합니다. 그 결과 3D 상피 구조는 장내 미세환경을 보다 사실적으로 표현할 수 있으며, 이는 다양한 생물의학 연구에 응용할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다. 이 장 구조를 활용함으로써 우리는 더 많은 중개 연구를 수행하고 잠재적으로 유망한 결과를 얻을 수 있습니다.

Disclosures

저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgments

시민 과학자(환자 기증자)의 사례 모집 및 샘플 수집을 지원해 주신 WSU 소동물 내과 서비스(Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT)와 WSU VTH 임상 연구 코디네이터 Valorie Wiss에게 감사드립니다. 이 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health, K01OD030515 및 R21OD031903 to Y.M.A.) 소장실과 일본 과학 진흥 협회 젊은 연구자를 위한 해외 챌린지 프로그램(202280196 to I.N.)의 지원을 받았습니다. 그림 1A와 그림 3A는 BioRender.com 로 만들어졌습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

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References

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의학 204호
염증성 장 질환 환자에서 유래한 장 오가노이드를 사용한 개 장내 칩의 3차원 형태 형성
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Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini,… More

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

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