Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tredimensjonal morfogenese i hundens tarm-on-a-chip ved bruk av intestinale organoider avledet fra pasienter med inflammatorisk tarmsykdom

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

Integrering av tarmorganoider hos hunder og et mikrofluidisk system fra Gut-on-a-Chip tilbyr relevante translasjonsmodeller for tarmsykdommer hos mennesker. Protokoller presentert tillater 3D-morfogenese og dynamisk in vitro-modellering av tarmen, og hjelper til med utvikling av effektive behandlinger for tarmsykdommer hos hunder og mennesker med One Health.

Abstract

Hundens tarmer har likheter i anatomi, mikrobiologi og fysiologi til mennesker, og hunder utvikler naturlig spontane tarmsykdommer som ligner på mennesker. Å overvinne den iboende begrensningen av tredimensjonale (3D) organoider ved tilgang til den apikale overflaten av tarmepitelet har ført til generering av todimensjonale (2D) monolagskulturer, som eksponerer den tilgjengelige luminaloverflaten ved hjelp av celler avledet fra organoider. Integreringen av disse organoider og organoid-avledede monolagskulturer i et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system har videreutviklet teknologien, noe som muliggjør utvikling av mer fysiologisk relevant dynamisk in vitro tarmmodeller.

I denne studien presenterer vi en protokoll for generering av 3D-morfogenese av hundens tarmepitel ved bruk av primære intestinale vevsprøver hentet fra hunder som er rammet av inflammatorisk tarmsykdom (IBD). Vi skisserer også en protokoll for generering og vedlikehold av 2D-monolagskulturer og tarm-på-en-brikke-systemer ved bruk av celler avledet fra 3D-intestinale organoider. Protokollene som presenteres i denne studien tjener som et grunnleggende rammeverk for å etablere et mikrofluidisk Gut-on-a-Chip-system spesielt utviklet for hjørnetenner. Ved å legge grunnlaget for denne innovative tilnærmingen, tar vi sikte på å utvide anvendelsen av disse teknikkene i biomedisinsk og translasjonsforskning, i tråd med prinsippene i One Health Initiative. Ved å benytte denne tilnærmingen kan vi utvikle mer fysiologisk relevante dynamiske in vitro-modeller for å studere tarmfysiologi hos både hunder og mennesker. Dette har betydelige implikasjoner for biomedisinske og farmasøytiske applikasjoner, da det kan hjelpe til med å utvikle mer effektive behandlinger for tarmsykdommer i begge arter.

Introduction

Intestinal epitelial morfogenese har i stor grad blitt studert gjennom laboratoriedyrmodeller, som er kostbare, tidkrevende og ikke nøyaktig representerer menneskelige utviklingsprosesser1. Videre mangler konvensjonelle statiske 2D-cellekulturmodeller muligheten til å etterligne den komplekse romlige organisasjonen til en 3D-epitelarkitektur2. Som et resultat er det behov for en protokoll for å indusere in vitro 3D-morfogenese ved bruk av tarmepitelceller fra menneskerelevante dyremodeller for å fremme vår forståelse av tarmepitelarkitektur.

Selskapshunder har utviklet tarmanatomi og mikrobiomsammensetninger som er bemerkelsesverdig lik mennesker på grunn av deres delte miljø og kosthold under domestisering3. I tillegg til denne likheten deler både mennesker og hunder ulike kroniske sykeligheter som antas å tilskrives tarmhelsen. Hunder, som mennesker, kan spontant utvikle kroniske tilstander som fedme, kognitiv dysfunksjon, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsykdom (IBD) og kolorektalt adenokarsinom 4,5,6,7,8,9,10. Til tross for utvikling og bruk av humane og murine epitelceller i tidligere Gut-on-a-Chip-studier 2,11,12,13,14, har hundens tarmepitel ikke blitt brukt til nå. Vår nye tilnærming, som bruker hundens tarmorganoidepitel i et dynamisk kultursystem med en 3D-epitelial morfogenese, har betydelige implikasjoner for både hund og humanmedisin.

Nylige fremskritt i intestinal organoidkultur har ført til etablering av hundens intestinale organoidkultur15. Dette kultursystemet innebærer dyrking av intestinale stamceller under definert morfogenkondisjonering, noe som resulterer i en 3D-modell med selvfornyende egenskaper avledet fra voksne stamceller16. Imidlertid utgjør gjennomføring av transportanalyser eller vertsmikrobiom-kokulturer vanskeligheter med denne 3D-modellen på grunn av den lukkede naturen til tarmlumen17. For å løse dette har forskere generert et 2D-monolag avledet fra intestinale organoider, noe som muliggjør eksponering av luminaloverflaten18,19. Imidlertid opprettholdes både 3D-organoider og 2D-monolag under statiske forhold, som ikke nøyaktig reflekterer in vivo-biomekanikken i tarmmikromiljøet. Kombinere pasientavledede hundeorganoider teknologi med in vitro 3D morfogenese gir en mulighet for translasjonsforskning på kroniske multifaktorielle sykdommer. Denne tilnærmingen gjør det mulig for forskere å utvikle mer effektive behandlinger som gagner både mennesker og hunder og videre fremme translasjonsforskning, i tråd med One Health Initiative, som er en samarbeidstilnærming som anerkjenner sammenhengen mellom menneskers, dyrs og miljømessige helse. Det fremmer tverrfaglig samarbeid for å løse komplekse helseutfordringer og oppnå optimale helseutfall for alle. Ved å forstå den gjensidige avhengigheten mellom mennesker, dyr og økosystemer, tar initiativet sikte på å redusere risikoen fra nye smittsomme sykdommer, miljøforringelse og andre felles helseproblemer20,21,22.

Denne protokollen skisserer omfattende metoder for dyrking av tarmepitelceller fra hunder oppnådd fra pasientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhet med en polydimetylsiloksan (PDMS) -basert porøs membran. Etablering av 3D-epitelial morfogenese ved å integrere hundens intestinale organoider og denne Gut-on-a-Chip-teknologien gjør det mulig for oss å studere hvordan tarmen utvikler og opprettholder sin cellulære organisasjon og stamcellenisje. Denne plattformen gir en verdifull mulighet til å undersøke virkningen av mikrobiomsamfunn på tarmhelsen og forstå hvordan disse samfunnene genererer mikrobielle metabolitter som bidrar til intestinal patofysiologi14,23. Disse fremskrittene kan nå utvides til hundens tarmprøver, noe som gir forskere muligheter til å utforske det intrikate forholdet mellom tarmmikrobiomet og vertsfysiologien. Dette åpner muligheter for å få verdifull innsikt i de underliggende mekanismene i tarmpatofysiologi og forstå den potensielle rollen til mikrobielle metabolitter i både hundens og menneskers helse, samt ulike sykdomsforhold. Protokollen som brukes til hundens Gut-on-a-Chip er reproduserbar, noe som gjør den til en egnet eksperimentell modell for komparativ medisin, da denne tilnærmingen muliggjør undersøkelse av vertsmikrobiominteraksjoner, patogeninfeksjoner og probiotisk-baserte terapeutiske effekter hos både hunder og mennesker.

Protocol

Studien ble godkjent og gjennomført i samsvar med Institutional Animal Care and Use Committee of Washington State University (ASAF # 6993). I denne protokollen benyttet vi en veletablert Gut-on-a-Chip mikrofluidisk enhet laget av PDMS som ble produsert internt2 (figur 1D). Detaljerte metoder for fremstilling av Gut-on-a-Chip-mikroenheten finnes i tidligere rapporter 2,24. Denne protokollen demonstrerer en unik integrasjon av intestinale organoider og et mikrofluidisk system (figur 2).

1. Overflateaktivering av en Gut-on-a-Chip laget av PDMS

  1. Forbered 1% polyetylenimin (PEI) oppløsning ved å tilsette 1 ml 50% PEI-oppløsning i 49 ml destillert (DI) vann i et 50 ml konisk rør. Snu røret to til tre ganger for å blande oppløsningen godt, og filtrer deretter løsningen med et 0,2 μm sprøytefilter.
    MERK: Oppbevares ved 4 °C.
  2. Forbered 0,1% glutaraldehyd (GA) oppløsning ved å tilsette 100 μL 50% GA-oppløsning i 49,9 ml DI i et 50 ml konisk rør. Snu røret to til tre ganger for å blande oppløsningen godt, og filtrer deretter løsningen med et 0,2 μm sprøytefilter.
    MERK: Oppbevar den ved 4 °C og sørg for å beskytte den mot eksponering for direkte lys.
  3. Sett Gut-on-a-Chip-enheten i en tørr ovn satt til 60 °C og inkuber den i minst 30 minutter for å eliminere eventuell gjenværende fuktighet.
  4. Utsett Gut-on-a-Chip-enheten for UV- og ozonbehandling i 60 minutter ved hjelp av en UV / ozongenerator.
    MERK: For å sikre optimal aktivering av PDMS-overflatene under behandlingen, må du opprettholde en avstand på ca. 3 cm eller mindre mellom UV-lampen og enheten. Unngå overbefolkning av enheter i generatoren for å oppnå effektiv overflateaktivering.
  5. Fest innløpet, bypass- og utløpsslangen i den øvre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme dem. Klem også innløpsslangen for den nedre mikrokanalen.
  6. Koble fra utløpsslangen for den nedre mikrokanalen. Forsikre deg om at bypass-slangen til den nedre mikrokanalen forblir åpen.
  7. Bruk en P100-mikropipette til å introdusere 100 μL av en 1 % PEI-løsning gjennom utløpshullet til den nedre mikrokanalen.
    MERK: Det anbefales å utføre denne prosessen mens enheten fortsatt er varm fra UV / ozoneksponering. Vær oppmerksom på PEI-løsningen som strømmer gjennom mikrokanalen, og PEI-oppløsningen faller for å komme ut fra bypass-slangen for den nedre mikrokanalen.
  8. Koble til utløpsslangen for den nedre mikrokanalen.
  9. Fest innløps-, bypass- og utløpsrøret i den nedre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme dem. Klem også innløpsslangen for den øvre mikrokanalen.
  10. Koble fra utløpsslangen til den øvre mikrokanalen. Forsikre deg om at bypass-slangen til den øvre mikrokanalen forblir åpen.
  11. Bruk en P100-mikropipette til å introdusere 100 μL av en 1 % PEI-løsning gjennom utløpshullet til den øvre mikrokanalen.
    MERK: Vær oppmerksom på at PEI-løsningen strømmer gjennom mikrokanalen, og PEI-oppløsningen faller for å komme ut fra bypass-slangen for den øvre mikrokanalen.
  12. Fest utløpsslangen til den øvre mikrokanalen igjen.
  13. Når både øvre og nedre mikrokanaler er fylt med 1% PEI-løsning, la enheten inkubere ved romtemperatur (RT) i 10 minutter.
  14. Utfør trinn 1,5-1,12 med 0,1% GA-løsning.
  15. Når både øvre og nedre mikrokanaler er fylt med 0,1% GA-løsning, la enheten inkubere ved RT i 20 minutter.
  16. Utfør trinn 1.5-1.12 med DI-vann for å fjerne overflødig overflateaktiveringsløsning.
  17. Sett brikken i tørr ovn ved 60 °C og la den tørke over natten.
    MERK: Sørg for å fjerne bindeklipsene fra alle slangene for å unngå påvirkning av slangen. Denne tørkeprosessen er avgjørende for jevn overflateaktivering av mikrokanalen i Gut-on-a-Chip12.

2. Ekstracellulær matriks (ECM) belegg og kultur medium forberedelse for Gut-on-a-Chip kultur

  1. Tilbered en ECM-blanding med organoid basalmedium slik at den endelige konsentrasjonen av kollagen I og Matrigel er henholdsvis 60 μg/ml og 2 % (vol/vol).
    MERK: Forbered 50 μL ECM-blanding per tarmbrikke (dvs. 20 μL ECM-blanding for hver øvre og nedre mikrokanal og 10 μL ekstra). Tilbered oppløsningen på bruksdagen og oppbevar den ved 4 °C eller legg den på is til den er klar til bruk.
  2. Ta ut Gut-on-a-Chip som har blitt behandlet med UV / Ozon, PEI og GA fra tørrovnen.
    MERK: Inspiser under et fasekontrastmikroskop for å se om det er gjenværende fuktighet.
  3. La Gut-on-a-Chip avkjøles i et biosikkerhetsskap i 10 minutter.
  4. Fest innløpet, bypass- og utløpsslangen i den øvre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme dem. Klem også innløpsslangen for den nedre mikrokanalen.
  5. Koble fra utløpsslangen for den nedre mikrokanalen.
  6. Bruk en P100-mikropipette til å introdusere 20 μL ECM-blanding gjennom utløpshullet til den nedre mikrokanalen.
    MERK: Vær oppmerksom på at ECM-blandingen strømmer gjennom mikrokanalen uten at luftbobler fanges inn. Hvis det er luftbobler tilstede, introduser ytterligere ECM-blanding til den nedre mikrokanalen til boblen er borte.
  7. Fest utløpsslangen til den nedre mikrokanalen igjen.
  8. Fest innløps-, bypass- og utløpsrøret i den nedre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme dem. Klem også innløpsslangen for den øvre mikrokanalen.
  9. Koble fra utløpsslangen til den øvre mikrokanalen.
  10. Bruk en P100-mikropipette til å introdusere 20 μL ECM-blanding gjennom utløpshullet til den øvre mikrokanalen.
  11. Fest utløpsslangen til den øvre mikrokanalen igjen.
  12. Plasser brikken i en fuktet CO 2 -inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C i 1 time for å danne ECM-laget på PDMS-membranen behandlet med PEI og GA (figur 3A).
    MERK: Forsikre deg om at alle slangene er klemmet under inkubasjonen.
  13. Under inkuberingen av ECM-belegget, klargjør to 1 ml sprøyter som inneholder kaldt såmedium, som er organoidkulturmediet som mangler A8301, men inneholder 10 μM Y-27632 og 2,5 μM CHIR99021, som tidligere rapportert i Gut-on-a-Chip avledet fra humane organoider2.
    MERK: A8301 ble fjernet fra mediet for å forbedre festingen av celler til den belagte ECM som tidligere rapportert2. Dag 0 av Gut-on-a-Chip-kulturen krever bare øvre mikrokanalstrøm. Klargjør derfor en full sprøyte for den øvre kanalen mens minst 0,2 ml for den nedre kanalen.
  14. Når ECM-belegget er fullført, tar du brikken ut av inkubatoren og slipper klemmen til bypass-slangen som er koblet til den nedre mikrokanalen.
  15. Koble en 1 ml sprøyte fylt med såmedium til den butte enden nålen som er koblet til den nedre mikrokanalen til Gut-on-a-Chip. Innfør såmediet (~50 μL) forsiktig til bypass-slangen. Når slangen er fylt med det introduserte mediet, fest bypass-slangen som er koblet til den nedre mikrokanalen med en bindeklips.
  16. Løsne klemmen på utløpsslangen som er koblet til den nedre mikrokanalen. Innfør såmediet forsiktig i den nedre mikrokanalen, slik at det kan strømme jevnt gjennom systemet. Fest utløpsslangen som er koblet til den nedre mikrokanalen med en bindeklips etter perfusjon.
  17. Deretter åpner du bypass-slangen som er koblet til den øvre mikrokanalen.
  18. Koble en 1 ml sprøyte fylt med såmedium til den butte enden nålen som er koblet til den øvre mikrokanalen til Gut-on-a-Chip. Innfør såmediet (~50 μL) forsiktig til bypass-slangen. Når slangen er fylt med det introduserte mediet, fest bypass-slangen som er koblet til den øvre mikrokanalen med en bindeklips.
  19. Slipp utløpsslangen som er koblet til den nedre mikrokanalen. Forsiktig introdusere såmediet i den øvre mikrokanalen, slik at den kan strømme jevnt gjennom systemet. Fest utløpsslangen som er koblet til den øvre mikrokanalen med en bindeklips etter perfusjon.

3. Forberedelse av organoidceller hos hunder for såing

MERK: For å generere Gut-on-a-Chip-modellen ble hundens kolonorganoider (referert til som kolonoider) avledet fra IBD-pasienthunder benyttet i denne protokollen. Disse kolonoidene ble avledet fra tre til fem små fragmenter av biopsert kolonvev, etter en tidligere rapportert metode15,18. For optimale resultater er det avgjørende å bruke hundekolonoider som har gjennomgått minst tre kulturpassasjer for å etablere stabile organoider egnet for in vitro-applikasjoner. Det anbefales å dyrke hundens kolonoider i en varighet på minst 3-4 dager for å lette tilstrekkelig differensiering av flerlinjede celler i organoider, og sikre deres funksjonelle modenhet og egnethet for påfølgende eksperimenter i Gut-on-a-Chip-modellen. Maksimumsgrensen for passasjen for dette arbeidet er færre enn 20, som indikert av en tidligere studie som viste uendret fenotype og karyotype gjennom 20 påfølgende passasjer25. Signaleringen fra disse donorene er presentert i tilleggstabell S1.

  1. Kultur hundekolonioidene i 24-brønnsplater innebygd i 30 μL Matrigel 15,18 med organoidkulturmedium oppført i materialfortegnelsen, som er modifisert fra tidligere rapportert medium 15,26,27. Det kondisjonerte mediet ble oppnådd ved å dyrke Rspo1-celler og HEK293-celler konstruert for å utskille Noggin28.
  2. Kast organoidkulturmediet gjennom vakuumsug og innfør 500 μL cellegjenvinningsløsning ved en iskald temperatur i hver brønn. Inkuber i 30 minutter ved 4 °C.
    MERK: Vanligvis gir tre brønner ut av en 24 brønnplate av modne canine intestinal organoider en tilstrekkelig mengde dissosierte celler til å frø en enkelt Gut-on-a-Chip-enhet med 40-50 organoider / ett synsfelt ved x10 forstørrelse.
  3. Forstyrr Matrigel kuplene mekanisk i 5 s ved hjelp av en P1000 mikropipette. Deretter samles organoidsuspensjonen i et 15 ml konisk rør.
  4. Sentrifuger det koniske røret ved 200 × g og 4 °C i 5 minutter, etterfulgt av fjerning av supernatanten.
  5. Introduser 1 ml trypsinlignende protease ved romtemperatur, supplert med 10 μM Y-27632, og resuspender cellepelleten ved pipettering med en P1000-mikropipette.
  6. Plasser cellesuspensjonen i et vannbad ved 37 °C og inkuber den i 10 minutter mens blandingen ristes med jevne mellomrom.
  7. Innfør 5 ml varmt organoid basalmedium og pipetter cellesuspensjonen kraftig med en P1000-mikropipette til den blir uklar, uten synlige celleklumper.
  8. Før cellesuspensjonen gjennom en cellesil med en 70 μm cutoff for å eliminere Matrigel rusk og store celleklynger.
  9. Sentrifuger det koniske røret ved 200 × g og 4 °C i 5 minutter, etterfulgt av resuspendering av pelleten i såmedium. For såing av en hundens Gut-on-a-Chip-enhet, bruk 20 μL såmedium for å resuspendere cellepelleten (dvs. bruk 20 μL såingsmedium når du såer en Gut-on-a-Chip-enhet).
  10. Endre konsentrasjonen av levedyktige celler til 1 × 107 celler/ml med såmedium som tidligere rapportert2. Utfør levedyktighetsvurdering ved hjelp av et hemocytometer ved å kombinere 10 μL av cellesuspensjonen med 10 μL Trypan-blått, og observer deretter cellene under et mikroskop.
    MERK: Det er avgjørende å justere cellekonsentrasjonen på riktig måte for å sikre optimal cellefeste og dannelsen av et jevnt monolag på chipmembranen. Hvis det opprinnelige antallet celler er utilstrekkelig, kan det føre til forsinket eller mislykket etablering av et konfluent monolag. Omvendt, hvis antall celler er overdreven, kan ikke-adherente celler aggregere i klumper i kanalen, noe som fører til uønskede konsentrasjonseffekter.

4. Såing og dannelse av et 2D-cellemonolag

  1. Koble fra utløpsslangen til den øvre mikrokanalen. Forsikre deg om at bypass-slangen til den øvre mikrokanalen forblir åpen. Fest både innløpet og utløpet til den nedre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme dem.
  2. Bruk en P100- eller P20-mikropipette til å innføre 20 μL av cellesuspensjonen fra protokoll 3 til utløpshullet til den øvre mikrokanalen (figur 3B-såing ).
  3. Fest bypass- og innløpsslangen til den øvre mikrokanalen ved å bruke bindeklips for å klemme den. Fest deretter utløpsslangen til utløpshullet på den øvre mikrokanalen, slik at slangen forblir åpen gjennom hele prosessen for å unngå at trykk påføres den øvre mikrokanalen. Etter dette trinnet, fest utløpsslangen til den øvre kanalen sakte ved hjelp av en bindeklips for å klemme den.
  4. Kontroller ved hjelp av et mikroskop at cellene er jevnt fordelt over hele den øvre mikrokanalen.
    MERK: Det er viktig å klemme slangen for å stoppe bevegelsen av mediet i kanalen for å tillate stabile statiske forhold til ønsket cellefeste er oppnådd.
  5. Plasser brikken i en fuktet CO2 -inkubator ved 37 ° C.
    MERK: Det tar omtrent 3 timer for hundens intestinale organoidceller å feste seg til ECM-belegget (figur 3B Vedlegg).
  6. Koble sprøyten festet til den øvre mikrokanalen til Gut-on-a-Chip til en sprøytepumpe plassert i en CO2 -inkubator.
    MERK: Skyll mediet forsiktig inn i mikrokanalen med knappen på sprøytepumpen og fjern ubundne celler. Undersøk brikken under et mikroskop for å sikre at eventuelle ufestede celler har blitt effektivt vasket bort.
  7. Start strømmen av kulturmedium ved 30 μL / t med såmedium. Denne kontinuerlige strømmen er bare for den øvre mikrokanalen i utgangspunktet til 2D-monolagsetableringen på en Gut-on-a-Chip. For den nedre mikrokanalen, la mikrokanalene klemmes og mediet skylles.
  8. Fra dagen etter at cellene er sådd, bytt kulturmedium til organoid kulturmedium, som inneholder A8301 og mangler 10 μM Y-27632 og 2,5 μM CHIR99021, fra såmediet.
  9. Når monolaget er etablert, start også den kontinuerlige mediestrømmen til den nedre mikrokanalen. Det tar vanligvis 2 til 3 dager for hundens intestinale organoide epitelceller å etablere epitelmonolag (figur 3C).

5. Etablering av 3D-morfogenese i hundens Gut-on-a-Chip

MERK: Etter at de konfluente monolagene er dannet i Gut-on-a-Chip, ble mediumstrøm av både øvre kanal og nedre kanal og cellestamme introdusert for å initiere 3D-morfogenese til 2D monolag som presentert i figur 2.

  1. Introduser organoidkulturmediet i både øvre og nedre mikrokanaler for å starte utviklingen av 3D-morfogenese i et Gut-on-a-Chip-system. For å oppnå skjærspenning på 0,02 dyne/cm2 i den eksisterende Gut-on-a-Chip-designen (dvs. mikrokanal med 500 μm høyde), øk strømningshastigheten til 50 μL/t29.
  2. Start 10% av cellestammen og 0,15 Hz frekvens, som anbefalt før2, ved hjelp av en datamaskinregulert bioreaktor som påfører syklisk belastning på celler dyrket in vitro. Denne prosessen vil bruke vakuumsug på Gut-on-a-Chip-enheten.
  3. Opprettholde disse kulturforholdene i minst 2 til 3 dager. 3D-morfogenesen til hundens intestinale monolag oppstår vanligvis 2 til 3 dager etter at Dural kanalstrøm og vakuumsug er startet (figur 3C).

6. Karakterisering av hundens Gut-on-a-Chip

  1. Levende celleavbildning
    1. Fjern eventuelle luftbobler i Gut-on-a-Chip ved å forsiktig strømme mediet med sprøytepumpen.
    2. Koble Gut-on-a-Chip-enheten fra sprøytepumpen.
      MERK: Unngå enhver manøver som kan legge press i Gut-on-a-Chip.
    3. Plasser enheten på et mikroskop for å ta bilder av det etablerte 3D-epitelet. For å visualisere strukturen til 3D-epitellagene ved hjelp av fasekontrast, bruk 10x og 20x mål (figur 3C).
  2. Farging av immunfluorescens
    1. Forbered blokkeringsløsningen ved å oppløse 1 g BSA i 50 ml fosfatbuffersaltvann (PBS) for å lage 2% BSA. Før løsningen gjennom et sprøytefilter på 0,2 μm for filtrering. Oppbevar denne oppløsningen ved 4 °C.
    2. Forbered permeabiliseringsløsningen ved å kombinere 150 μL Triton X-100 med 50 ml blokkeringsløsning, noe som resulterer i en endelig konsentrasjon på 0,3% Triton X-100. Før løsningen gjennom et sprøytefilter på 0,2 μm for filtrering. Oppbevar denne oppløsningen ved 4 °C.
    3. Utfør fiksering av cellene ved å injisere 100 μL av en 4% PFA i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    4. Skyll cellene ved å injisere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    5. Utfør permeabilisering av cellene ved å injisere 100 μL 0,3% Triton i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11. Plasser enheten på RT i 30 minutter.
    6. Skyll cellene ved å injisere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    7. Utfør blokkering av cellene for å forhindre uspesifikk binding ved å injisere 100 μL av 2 % BSA til både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11. Plasser enheten på RT i 1 time.
    8. Injiser 20 mikrol av den primære antistoffoppløsningen fortynnet i 2 % BSA og legg den ved RT i 3 timer, etterfulgt av inkubasjon over natten ved 4 °C.
      MERK: Forsikre deg om at alle slangene er klemt fast under inkubasjonen ved 4 °C for over natten. Konsentrasjonen av et primært antistoff bør være 2-5 ganger høyere enn anbefalt konsentrasjon for monolags- eller 3D-organoidfarging (tilleggsfigur S1).
    9. Skyll cellene ved å injisere 100 mikroliter PBS til både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    10. Injiser 20 μL av den sekundære antistoffoppløsningen fortynnet i 2% BSA og sett den ved RT i 1 time.
      MERK: Forsikre deg om at alle slangene er klemmet under inkubasjonen. Fra og med dette trinnet er det nødvendig å skjerme enhetsoppsettet med aluminiumsfolie for å forhindre fotobleking.
    11. Skyll cellene ved å injisere 100 mikroliter PBS til både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    12. Forbered en kombinert løsning for motfarging av F-aktin og DAPI (diamidino-2-fenylindol). Injiser 20 mikrol av den kombinerte oppløsningen i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
    13. Skyll cellene ved å injisere 100 μL PBS i både øvre og nedre mikrokanaler som beskrevet i trinn 2.4-2.11.
      Utfør fluorescensavbildning av arkitekturen til 3D-epitelceller ved hjelp av et fluorescensmikroskop eller et konfokalmikroskop.

7. Epitelbarrierefunksjon

  1. Fjern eventuelle luftbobler i Gut-on-a-Chip ved å forsiktig strømme mediet med sprøytepumpen. Forsikre deg om at alle slangene er åpne under målingen.
  2. Fjern Gut-on-a-Chip fra sprøytepumpen og sett den på RT i minst 10 minutter.
  3. Fjern Ag / AgCl-elektroder fra 70% EtOH-løsning.
  4. Plasser to Ag / AgCl-elektroder i henholdsvis øvre innløp og nedre utløp for å måle motstanden til epitellaget ved hjelp av et multimeter.
  5. Plasser to Ag / AgCl-elektroder i henholdsvis nedre innløp og øvre utløp. Rapporter gjennomsnittet av disse to verdiene som en motstandsverdi for Gut-on-a-Chip.
    MERK: Den blanke TEER skal måles på en Gut-on-a-Chip med bare ECM-belegg uten epitelet.
  6. Beregn transepitelial elektrisk motstand (TEER) verdi (kΩ × cm2) kan beregnes ved hjelp av ligning (1).
    TEER = (Ωt - Ωblank) × A (1)
    Hvor Ωt er en motstandsverdi målt på det spesifikke tidspunktet siden starten av eksperimentet, erΩ emne en motstandsverdi målt på tidspunktet uten epitelet, og A er arealet av overflaten dekket av et cellelag (ca. 0,11 cm2 for denne Gut-on-a-Chip-designen29).
    1. Beregn normalisert TEER ved hjelp av ligning (2).
      TEER = Equation 1 (2)
      DerΩ 0 er en motstandsverdi ved eksperimentets opprinnelige avlesningstidspunkt som rapportert tidligere30 (figur 4C).

Representative Results

Denne protokollen letter pålitelig spontan utvikling av 3D intestinal morfogenese i et Gut-on-a-Chip-system. Denne tilnærmingen benytter canine intestinal epitelceller hentet fra intestinale organoider avledet fra hunder rammet av inflammatorisk tarmsykdom (IBD) (figur 1B). Sporadisk klynging av 3D-morfogenese av tarmepitelceller hos hunder kan observeres gjennom hele mikrokanalen etter 6-9 dager med medium flow (figur 3C). Disse morfologiske endringene kan overvåkes ved hjelp av fasekontrastteknikker. I denne studien benyttet vi organoider avledet fra to hunder diagnostisert med IBD. Spesielt ble vellykket 3D-morfogenese observert i to biologiske replikater, som hver ble utført med to tekniske replikater. Funnene fra denne studien gir grunnlag for fremtidige undersøkelser som involverer tarmorganoider avledet fra andre hundedonorer. Disse resultatene demonstrerer den potensielle anvendeligheten og repeterbarheten av vår eksperimentelle tilnærming, som tidligere har blitt rapportert i humane prøver. Disse funnene gir ytterligere bekreftelse på at Gut-on-a-Chip-teknologien gjelder for hundens tarmepitelceller som tidligere rapportert med studiene som bruker humane tarmepitelceller2.

Denne protokollen viste at immunfluorescensfarging kan brukes til å evaluere 3D-strukturen til organoidavledede monolag som har dannet villuslignende strukturer i mikrofluidiske chips ved bruk av konvensjonell fluorescensmikroskopi (figur 4 A, B). Denne protokollen kan tilpasses for å validere de differensierte og romlig organiserte cellulære fenotypene gjennom immunfluorescensfarging. Visualiseringen av en 3D-morfogenese i en Gut-on-a-Chip gir en utmerket mulighet til å undersøke vertsresponsen under ulike patologiske interaksjoner 14,23,31. Når den kombineres med epitelceller avledet fra pasientdonorer, som tidligere beskrevet hos mennesker, kan denne teknologien brukes til å konstruere personlige modeller av tarmsykdommer13. Gjennom integrering av immunfluorescensavbildning med målrettede RNA-visualiseringsteknikker som fluorescens in situ-hybridisering, kan det være mulig å visuelt analysere transkriptomene og proteomene til verten i et Gut-on-a-Chip-system.

Bevaring av integriteten til tarmmembranen er avgjørende for å opprettholde intestinal homeostase, og Gut-on-a-Chip-plattformen gir en verdifull fordel ved å muliggjøre presis overvåking og kvantifisering av denne viktige funksjonen. Måling av TEER ved hjelp av Gut-on-a-Chip-teknologien gir flere fordeler. For eksempel har tidligere studier vellykket evaluert TEER mens de dyrker tarmceller sammen med ikke-patogene og probiotiske bakterier32, så vel som under lekkende tarmforhold23. Dette gjør det mulig for forskere å studere virkningen av ulike forhold på tarmbarrierefunksjonen og identifisere potensielle tiltak for å fremme tarmhelsen.

Figure 1
Figur 1: Etablering av pasientavledet hund IBD Gut-on-a-Chip. (A) Integrering av pasientavledede intestinale organoider og Gut-on-a-Chip-plattformen. Endoskopi biopsi kan utføres for å isolere tarmkryptceller for å utvikle donorspesifikke tarmorganoider. Epitelceller kan dissosieres til enkeltceller fra organoider, deretter sådd inn i en PDMS-basert Gut-on-a-Chip og dyrket i et unikt dynamisk mikromiljø. (B) Representative bilder av kolonoider fra en IBD-hund. Skala bar = 100 μm. (C) Dette skjemaet illustrerer en Gut-on-a-Chip-enhet som består av en porøs membran plassert mellom øvre og nedre mikrokanaler. Den øvre mikrokanalen er indikert med det blå området, mens den nedre mikrokanalen er indikert med det røde området. Vakuumkamre er tilstede på hver side av mikrokanalen, som deformerer den porøse membranen for å etterligne peristaltisk bevegelse24. (D) Et oppsett av hundens Gut-on-a-Chip inkluderer en PDMS-basert Gut-on-a-Chip montert med slanger som er plassert på en dekselseddel 2,24. Bypass-slangen er kritisk for å unngå trykkoppbygging i mikrokanalen under håndtering (dvs. tilkobling til sprøyter). Bindeklips brukes til å klemme slangen. Volumfølsomme materialer kan infunderes via de åpne hullene i øvre eller nedre utløp. Organoid kulturmedium kan infunderes ved å koble sprøytene til de stumpe ennålene og strømmen gjennom øvre og nedre innløp. Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsykdom; PDMS = polydimetylsiloksan. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 2
Figur 2: Dannelse av villus-lignende strukturer i hundens IBD Gut-on-a-Chip. De dissosierte epitelcellene ble sådd i en ECM-belagt Gut-on-a-Chip. Når de dissosierte cellene var festet til PDMS-membranen, ble apikal strømning initiert i 3 dager (D0-D3). Når et konfluent 2D-monolag dannes (D3), initieres basolateral strømning med hyppig strekking (Stretching, AP og BL Flow). Etter 2-3 dager med dobbel strømning og membranstrekking begynner 2D-monolaget å utvikle 3D-morfogenese, og villuslignende strukturer dannes etter 9 dager med kultur (3D-morfogenese, D9-D12). Forkortelser: ECM = ekstracellulær matrise; PDMS = polydimetylsiloksan; AP = apikal; BL = basolateral. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 3
Figur 3: Organoidsåing hos hunder og 3D-morfogenese i en Gut-on-a-Chip. (A) De eksperimentelle trinnene for overflateaktivering av en porøs membran i en PDMS-basert Gut-on-a-Chip. Bruken av UV / ozonbehandling, PEI og GA-behandling i forbindelse letter kryssbindingen av aminer som er tilstede i ECM-løsninger. Denne prosessen fører til stabil immobilisering av ECM-proteiner på den porøse membranen. (B) Fasekontrastbildene viser morfologien til celler umiddelbart etter såing (venstre) og 3-5 timer etter såing (høyre). Den porøse membranen etter 3 timers såing viser tynnere og mørkere områder der enkeltceller har festet seg, og fremhever festeprosessen. (C) Fasekontrastbildene skildrer 3D-morfogenesen av intestinale monolayers i et Gut-on-a-Chip-system. Disse monolayers ble avledet fra hunder rammet av IBD, og disse organoidcellene ble dyrket i en periode på 12 dager under dynamiske forhold, som involverte væskestrøm og strekkbevegelser. Skalastenger = 50 μm (B,C). Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsykdom; ECM = ekstracellulær matrise; PDMS = polydimetylsiloksan; PEI = polyetylenimin; GA = glutaraldehyd. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Figure 4
Figur 4: Evaluering av 3D-morfologisk utvikling i pasientavledet hundens Gut-on-a-Chip. (A) Immunfluorescensavbildning av en hund IBD Gut-on-a-Chip, som viser et ovenfra og ned-bilde av et fullt utviklet 3D-epitel etter 12 dager med kultur, som evalueres av et fluorescensmikroskop. Det stramme kryssproteinet (ZO-1) er visualisert i gult; børstekantmembranen (F-aktin) vises i rødt; og kjernene er farget med DAPI og vises blå. (B) Immunfluorescensavbildning av en hund IBD Gut-on-a-Chip ved hjelp av et konfokalmikroskop med en langdistanselinse. Som vist i skjemaet, vises et fluorescerende bilde av et tverrsnitt av en villus-lignende struktur av et fullt utviklet 3D-epitel etter 12 dager med kultur. I tillegg viser Z-stabling et sidebilde av 3D-epitelet, som avslører dannelsen av villuslignende strukturer. Den børstekantede membranen (F-aktin) vises i rødt, og kjernene er farget med DAPI og ser blå ut. (C) Tarmbarrierefunksjonen ble evaluert og målt av TEER i pasientavledet hundens Gut-on-a-Chips. Stabile TEER-verdier ble nådd på dag 5 av kulturen på Gut-on-a-Chip. Feilfelt uttrykker SEM for målingene. TEER-verdi ble målt mellom to biologiske replikater med en teknisk replikat. Skalastenger = 50 μm (A), 25 μm (B). Forkortelser: IBD = inflammatorisk tarmsykdom; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TEER = transepitelial elektrisk motstand. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Tilleggsfigur S1: Karakterisering av anti-ZO-1 polyklonalt antistoff i monooidavledede monolag fra hunder og på Gut-on-a-Chip-enheter. (A) Immunfluorescensfarging av ZO-1 i gult med F-aktin i rødt og deres overleggsbilde. Skala bar = 25 μm. (B) Immunfluorescensvisualisering av ZO-1 i gult i 'Leaky Gut Chips' ble utført under forskjellige forhold, inkludert stimulering med probiotiske bakterier (LGG + cytokiner eller VSL#3 + cytokiner) og bakteriefrie kontroller uten probiotisk stimulering (cytokiner). Skala bar = 50 μm. Dette tallet er gjengitt fra Min et al.23. Klikk her for å laste ned denne filen.

Tilleggstabell S1: Et sammendrag av opplysninger om vevsdonorer. En oppsummeringstabell over donorenes alder, kjønn, rase, histopatologisk evaluering og hundens IBD-aktivitetsindeks (CIBDAI) score. CIBDAI er et numerisk skåringssystem som brukes til å utlede klinisk alvorlighetsgrad i hundens IBD33. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Denne studien markerer den banebrytende demonstrasjonen av kompatibiliteten til hundens tarmorganoider med utviklingen av en hundens IBD Gut-on-a-Chip-modell. Integrasjonen av intestinale organoider og organoidavledede monolagskulturer i et mikrofluidisk system (dvs. Gut-on-a-Chip-system) har videreutviklet teknologien, noe som gjør det mulig å skape in vitro intestinale modeller som nøye etterligner fysiologisk dynamikk og er mer representative for biologiske forhold. Spesielt, siden det er svært få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur ved bruk av IBD-avledede organoider hos mennesker, kan den nåværende studien ved bruk av hundens IBD-avledede Gut-on-a-Chip gi ledende innsikt i studiet av IBD hos mennesker.

Den vellykkede utviklingen av hundens tarmepitelial 3D-morfogenese på en Gut-on-a-Chip krever nøye oppmerksomhet til flere kritiske trinn. For det første kan den hydrofobe overflaten til PDMS mikrofluidiske kanaler hindre ECM-adhesjon og påfølgende cellefeste, noe som nødvendiggjør overflateaktivering av PDMS før ECM-belegg og cellesåing (se protokollavsnitt 1). For å oppnå en stabil monolagskultur er fjerning av overflødige ikke-festede celler avgjørende etter cellevedlegg (protokolltrinn 4.6-4.7). I tillegg er dynamisk stimulering, som konstant mediumstrøm og peristaltisk-lignende vakuumbevegelse, nødvendig for 3D-morfogenese i tarmepitelet (protokolltrinn 5.2). Forsiktig håndtering er viktig for å unngå luftbobler i mikrokanalen under alle trinn i Gut-on-a-Chip-kulturen.

Hvis du støter på dårlig cellesåing i Gut-on-a-Chip, kan det skyldes lavt cellenummer eller dårlig cellefeste. For å feilsøke lave celletall, er det viktig å inspisere helsen til preparerte tarmorganoider ved å observere veksten i Matrigel. Cellens levedyktighet kan vurderes ved Trypan-blåfarging etter celledissosiasjon for å sikre at ikke mer enn 20% av cellene er døde. Hvis levedyktige celletall er utilstrekkelige, kan optimalisering av organoide mediumforhold forsøkes. En annen mulighet er ufullstendig organoid dissosiasjon, noe som resulterer i et overskudd av celleklumper større enn 70 μm som blir fanget av filteret. For å løse dette er ett alternativ å forlenge varigheten av pipettering under celledissosiasjon. Alternativt kan det koniske røret på 15 ml omrøres forsiktig hvert minutt mens det behandles med en trypsinlignende protease. Dårlig cellefeste til Gut-on-a-Chip kan skyldes feil ECM-belegg. Under belegningsprosessen anbefales det å nøye kontrollere tilstedeværelsen av luftbobler og forhindre dannelse av dem ved forsiktig å legge til mer beleggløsning etter behov. Overbefolkning av celler og manglende evne til å vaske bort ufestede celler kan resultere i et utilstrekkelig innledende monolayer. I et slikt tilfelle kan en mild pulserende påføres når du skyver sprøytestempelet. Disse feilsøkingstrinnene kan bidra til å identifisere og løse problemer under Gut-on-a-Chip-kulturprosessen.

Mens denne Gut-on-a-Chip-plattformen muliggjør opprettelse av bølgete 3D-epitellag, anerkjenner vi behovet for ytterligere biologisk kompleksitet for å replikere tarmmikromiljøet fullt ut. Det er avgjørende å vurdere samspillet mellom epitel- og mesenkymale celler, avsetning av ECM for 3D-regenerering og tilstedeværelsen av krypt-villus-egenskaper som etablerer en egnet stamcellenisje. Stromale celler, som fibroblaster, spiller en viktig rolle i produksjonen av ECM-proteiner og reguleringen av intestinal morfogenese34,35,36. Inkludering av mesenkymale celler i denne modellen har potensial til å forbedre både morfogenese og effektiviteten av cellevedlegg. Endotellag, som omfatter kapillærvaskulatur og lymfekar, spiller en avgjørende rolle for å styre molekylær transport og rekruttering av immunceller37,38. Inkludering av pasientavledede immunceller kan være avgjørende for modellering av tarmsykdommer, da det muliggjør demonstrasjon av samspillet mellom medfødt og adaptiv immunitet, samt etablering av vevsspesifikk immunitet39. Etter fullføring av 3D-morfogenese på Gut-on-a-Chip, kan organoidkulturmediet modifiseres til et organoid differensieringsmedium. Dette kan være en levedyktig tilnærming for å indusere ytterligere cellulær differensiering, avhengig av eksperimentelle mål.

Avbildning av 3D-mikroarkitekturen in situ er utfordrende på grunn av den lange arbeidsavstanden som kreves, som kan overvinnes med et langdistansemål. I tillegg gjør lag-for-lag mikrofabrikasjons- og bindingsmetodene det vanskelig å få tilgang til øvre lag for undersøkelse med SEM. For den nåværende Gut-on-a-Chip-designen er det nødvendig med en sprøytepumpe per Gut-on-a-Chip-mikroenhet, som opptar CO2 -inkubatorplass og forhindrer store eksperimenter. Innovasjoner er nødvendig for å øke skalerbarheten for en brukervennlig plattform og screening med høy gjennomstrømning.

Disse nåværende protokollene tillater spontan utvikling av 3D-epitellag in vitro, og overgår begrensningene til tradisjonelle 3D-organoider, 2D-monolag og statiske mikroenhetskultursystemer. Dette dynamiske in vitro intestinale mikromiljøet kan styres ved å introdusere samkultur av forskjellige celletyper. Tidligere studier har utforsket metoder for å manipulere Gut-on-a-Chip-mikromiljøet, inkludert co-dyrking av intestinal mikrobiom14,23 og perifere mononukleære celler30. Dette rekonstituerte mikromiljøet har mange potensielle anvendelser, inkludert narkotikatesting, grunnleggende mekanistiske studier og sykdomsmodellering. Det rekonstruerte mikromiljøet har betydelig potensial for et bredt spekter av applikasjoner, for eksempel narkotikatesting 23,40,41 og sykdomsmodellering 12,13,14,30, samt grunnleggende mekanistiske undersøkelser av intestinal morfogenese 42. En rekke analyser kan utføres ved enten å samle supernatanter for vurdering av metabolitter 43, ved å samle celler for genomisk undersøkelse 2,32, eller ved å visuelt undersøke cellene ved hjelp av levende cellefarger eller fiksering for påfølgende immunfluorescensavbildning 23,44.

Denne studien presenterer en reproduserbar protokoll for å utvikle 3D-morfogenese av hundens tarmepitellag i en Gut-on-a-Chip-plattform. Den resulterende 3D-epitelstrukturen gir en mer realistisk representasjon av tarmmikromiljøet, som har et enormt potensial for anvendelser i ulike biomedisinske studier. Ved å utnytte denne tarmarkitekturen kan vi utføre mer translasjonsforskning og potensielt gi lovende resultater.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikt å oppgi.

Acknowledgments

Vi vil gjerne takke WSU Small Animal Internal Medicine-tjenesten (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) og WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss for deres støtte i saksrekruttering og prøveinnsamling fra borgerforskere (pasientdonorer). Dette arbeidet ble støttet delvis av kontoret til direktøren, National Institutes of Health (K01OD030515 og R21OD031903 til YMA) og Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 til I.N.). Figur 1A og figur 3A ble laget med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2 (2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368 (2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663 (2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1 (2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300 (2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641 (2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525 (2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13 (2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Tags

Medisin utgave 204
Tredimensjonal morfogenese i hundens tarm-on-a-chip ved bruk av intestinale organoider avledet fra pasienter med inflammatorisk tarmsykdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini,… More

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter