Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Tredimensionell morfogenes i hundtarm-på-ett chip med hjälp av tarmorganoider som härrör från patienter med inflammatorisk tarmsjukdom

Published: February 9, 2024 doi: 10.3791/65720
Automatic Translation
1,2, 1, 1
1Department of Veterinary Clinical Sciences, College of Veterinary Medicine, Washington State University, 2Department of Veterinary Internal Medicine, Graduate School of Agricultural and Life Sciences, The University of Tokyo

Summary

Integrering av hundens tarmorganoider och ett Gut-on-a-Chip mikrofluidiksystem erbjuder relevanta translationella modeller för mänskliga tarmsjukdomar. Protokoll som presenteras möjliggör 3D-morfogenes och dynamisk in vitro-modellering av tarmen, vilket bidrar till utvecklingen av effektiva behandlingar för tarmsjukdomar hos hundar och människor med One Health.

Abstract

Hundtarmar har likheter i anatomi, mikrobiologi och fysiologi med människors, och hundar utvecklar naturligt spontana tarmstörningar som liknar människors. Att övervinna den inneboende begränsningen av tredimensionella (3D) organoider när det gäller att komma åt den apikala ytan av tarmepitelet har lett till generering av tvådimensionella (2D) monolagerkulturer, som exponerar den tillgängliga luminala ytan med hjälp av celler som härrör från organoiderna. Integreringen av dessa organoider och organoid-härledda monolagerkulturer i ett mikrofluidiskt Gut-on-a-Chip-system har vidareutvecklat tekniken, vilket möjliggör utveckling av mer fysiologiskt relevanta dynamiska in vitro-tarmmodeller .

I denna studie presenterar vi ett protokoll för att generera 3D-morfogenes av hundens tarmepitel med hjälp av primära tarmvävnadsprover erhållna från hundar som drabbats av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD). Vi beskriver också ett protokoll för att generera och underhålla 2D-monolagerkulturer och intestine-on-a-chip-system med hjälp av celler som härrör från 3D-tarmorganoiderna. Protokollen som presenteras i denna studie fungerar som ett grundläggande ramverk för att etablera ett mikrofluidiskt Gut-on-a-Chip-system speciellt utformat för hundar. Genom att lägga grunden för detta innovativa tillvägagångssätt strävar vi efter att utöka tillämpningen av dessa tekniker inom biomedicinsk och translationell forskning, i linje med principerna för One Health-initiativet. Genom att använda detta tillvägagångssätt kan vi utveckla mer fysiologiskt relevanta dynamiska in vitro-modeller för att studera tarmfysiologi hos både hund och människa. Detta har betydande konsekvenser för biomedicinska och farmaceutiska tillämpningar, eftersom det kan bidra till utvecklingen av effektivare behandlingar för tarmsjukdomar hos båda arterna.

Introduction

Intestinal epitelial morfogenes har till stor del studerats genom försöksdjursmodeller, som är kostsamma, tidskrävande och inte korrekt representerar mänskliga utvecklingsprocesser1. Dessutom saknar konventionella statiska 2D-cellodlingsmodeller förmågan att efterlikna den komplexa rumsliga organisationen av en 3D-epitelarkitektur2. Som ett resultat finns det ett behov av ett protokoll för att inducera in vitro 3D-morfogenes med hjälp av tarmepitelceller från humana relevanta djurmodeller för att öka vår förståelse av tarmepitelarkitekturen.

Sällskapshundar har utvecklat tarmanatomi och mikrobiomsammansättningar som är anmärkningsvärt lika människor på grund av deras gemensamma miljö och kost under domesticeringen3. Utöver denna likhet delar både människor och hundar olika kroniska sjukdomar som tros tillskrivas tarmhälsan. Hundar, precis som människor, kan spontant utveckla kroniska tillstånd som fetma, kognitiv dysfunktion, diabetes mellitus, inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) och kolorektal adenocarcinom 4,5,6,7,8,9,10. Trots utveckling och användning av humana och murina epitelceller i tidigare Gut-on-a-Chip-studier 2,11,12,13,14, har hundens tarmepitel inte använts förrän nu. Vårt nya tillvägagångssätt, att använda hundtarmorganoidepitel i ett dynamiskt odlingssystem med en 3D-epitelmorfogenes, har betydande konsekvenser för både hund- och humanmedicin.

De senaste framstegen inom tarmorganoidkultur har lett till etableringen av tarmorganoidkulturför hundar 15. Detta odlingssystem innebär att man odlar stamceller från tarmen under definierad morfogenbetingning, vilket resulterar i en 3D-modell med självförnyande egenskaper som härrör från adulta stamceller16. Att genomföra transportanalyser eller värd-mikrobiom-samkulturer innebär dock svårigheter med denna 3D-modell på grund av den slutna karaktären hos tarmlumen17. För att ta itu med detta har forskare genererat ett 2D-monolager härlett från tarmorganoider, vilket möjliggör exponering av den luminala ytan18,19. Både 3D-organoider och 2D-monolager bibehålls dock under statiska förhållanden, vilket inte korrekt återspeglar biomekaniken in vivo i tarmmikromiljön. Att kombinera patientbaserad hundorganoidteknik med in vitro 3D-morfogenes ger en möjlighet till translationell forskning om kroniska multifaktoriella sjukdomar. Detta tillvägagångssätt gör det möjligt för forskare att utveckla effektivare behandlingar som gynnar både människor och hundar och ytterligare främja translationell forskning, i linje med One Health-initiativet, som är en samarbetsstrategi som erkänner sambandet mellan människors, djurs och miljöns hälsa. Det främjar tvärvetenskapligt samarbete för att ta itu med komplexa hälsoutmaningar och uppnå optimala hälsoresultat för alla. Genom att förstå det ömsesidiga beroendet mellan människor, djur och ekosystem syftar initiativet till att minska riskerna från nya infektionssjukdomar, miljöförstöring och andra gemensamma hälsoproblem20,21,22.

Detta protokoll beskriver omfattande metoder för odling av hundtarmepitelceller erhållna från patientorganoider på en Gut-on-a-Chip-mikroenhet med ett polydimetylsiloxan (PDMS)-baserat poröst membran. Genom att etablera 3D-epitelmorfogenesen genom att integrera hundens tarmorganoider och denna Gut-on-a-Chip-teknik kan vi studera hur tarmen utvecklas och upprätthåller sin cellulära organisation och stamcellsnisch. Denna plattform erbjuder en värdefull möjlighet att undersöka mikrobiomsamhällenas inverkan på tarmhälsan och förstå hur dessa samhällen genererar mikrobiella metaboliter som bidrar till tarmpatofysiologi14,23. Dessa framsteg kan nu utvidgas till hundtarmprover, vilket ger forskare möjligheter att utforska det intrikata förhållandet mellan tarmmikrobiomet och värdens fysiologi. Detta öppnar vägar för att få värdefulla insikter i de underliggande mekanismerna för tarmpatofysiologi och förstå den potentiella rollen för mikrobiella metaboliter i både hundens och människors hälsa, såväl som olika sjukdomstillstånd. Protokollet som används för hundens Gut-on-a-Chip är reproducerbart, vilket gör det till en lämplig experimentell modell för komparativ medicin, eftersom detta tillvägagångssätt möjliggör undersökning av värd-mikrobiominteraktioner, patogeninfektioner och probiotikabaserade terapeutiska effekter hos både hundar och människor.

Protocol

Studien godkändes och genomfördes i enlighet med Institutional Animal Care and Use Committee vid Washington State University (ASAF# 6993). I detta protokoll använde vi en väletablerad Gut-on-a-Chip mikrofluidisk enhet gjord av PDMS som tillverkades internt2 (Figur 1D). Detaljerade metoder för tillverkning av Gut-on-a-Chip-mikroenheten finns i tidigare rapporter 2,24. Detta protokoll demonstrerar en unik integration av tarmorganoider och ett mikrofluidiskt system (figur 2).

1. Ytaktivering av en Gut-on-a-Chip tillverkad av PDMS

  1. Bered 1 % polyetenimin (PEI) lösning genom att tillsätta 1 ml 50 % PEI-lösning till 49 ml destillerat (DI) vatten i ett 50 ml koniskt rör. Vänd upp och ner på röret två till tre gånger för att blanda lösningen väl och filtrera sedan lösningen med ett 0,2 μm sprutfilter.
    OBS: Förvara den vid 4 °C.
  2. Bered 0,1 % glutaraldehydlösning (GA) genom att tillsätta 100 μl 50 % GA-lösning till 49,9 ml DI i ett 50 ml koniskt rör. Vänd upp och ner på röret två till tre gånger för att blanda lösningen väl och filtrera sedan lösningen med ett 0,2 μm sprutfilter.
    OBS: Förvara den vid 4 °C och se till att skydda den från exponering för direkt ljus.
  3. Placera Gut-on-a-Chip-enheten i en torr ugn inställd på 60 °C och inkubera den i minst 30 minuter för att eliminera eventuell kvarvarande fukt.
  4. Utsätt Gut-on-a-Chip-enheten för UV- och ozonbehandling i 60 minuter med hjälp av en UV/ozongenerator.
    OBS: För att säkerställa optimal aktivering av PDMS-ytorna under behandlingen, håll ett avstånd på cirka 3 cm eller mindre mellan UV lamp och enheten. Undvik överbelastning av enheter i generatorn för att uppnå effektiv ytaktivering.
  5. Säkra den övre mikrokanalens inlopps-, bypass- och utloppsslang genom att använda bindemedelsklämmor för att clamp dem. Kläm även fast inloppsslangen för den nedre mikrokanalen.
  6. Koppla bort utloppsslangen för den nedre mikrokanalen. Se till att bypass-slangen på den nedre mikrokanalen förblir öppen.
  7. Använd en P100-mikropipett och för in 100 μL av en 1 % PEI-lösning genom utloppshålet på den nedre mikrokanalen.
    OBS: Det rekommenderas att utföra denna process medan enheten fortfarande är varm från UV/Ozonexponering. Observera PEI-lösningen som strömmar genom mikrokanalen och PEI-lösningen faller ut från bypass-slangen för den nedre mikrokanalen.
  8. Återanslut utloppsslangen för den nedre mikrokanalen.
  9. Säkra den nedre mikrokanalens inlopps-, bypass- och utloppsslang genom att använda bindemedelsklämmor för att clamp dem. Kläm även fast inloppsslangen för den övre mikrokanalen.
  10. Koppla bort utloppsslangen för den övre mikrokanalen. Se till att bypass-slangen på den övre mikrokanalen förblir öppen.
  11. Använd en P100-mikropipett och för in 100 μL av en 1 % PEI-lösning genom utloppshålet på den övre mikrokanalen.
    OBS: Observera PEI-lösningen som strömmar genom mikrokanalen och PEI-lösningen faller ut från bypass-slangen för den övre mikrokanalen.
  12. Sätt tillbaka utloppsslangen på den övre mikrokanalen.
  13. När både övre och nedre mikrokanalerna är fyllda med 1 % PEI-lösning, låt enheten inkubera vid rumstemperatur (RT) i 10 minuter.
  14. Utför steg 1.5-1.12 med 0.1 % GA-lösning.
  15. När både övre och nedre mikrokanalerna är fyllda med 0.1 % GA-lösning, låt enheten inkubera vid RT i 20 minuter.
  16. Utför steg 1.5-1.12 med DI-vatten för att ta bort överflödig ytaktiveringslösning.
  17. Placera pommes fritesen i en torr ugn vid 60 °C och låt den torka över natten.
    OBS: Se till att ta bort bindemedelsklämmorna från alla slangar för att undvika att slangen kommer i kläm. Denna torkningsprocess är avgörande för en jämn ytaktivering av mikrokanalen i Gut-on-a-Chip12.

2. Beläggning av extracellulär matris (ECM) och odlingsmedium för Gut-on-a-Chip-odling

  1. Bered en ECM-blandning med organoidbasalmedium så att den slutliga koncentrationen av kollagen I och matrigel är 60 μg/ml respektive 2 % (vol/vol).
    OBS: Förbered 50 μL ECM-blandning per tarmchips (dvs. 20 μL ECM-blandning för varje övre och nedre mikrokanal och 10 μL extra). Bered detta på användningsdagen och förvara denna lösning vid 4 °C eller lägg den på is tills den är klar att användas.
  2. Ta ut Gut-on-a-Chip som har behandlats med UV/Ozon, PEI och GA från den torra ugnen.
    OBS: Inspektera under ett faskontrastmikroskop för att se om det finns någon kvarvarande fukt.
  3. Låt Gut-on-a-Chip svalna i ett biosäkerhetsskåp i 10 minuter.
  4. Säkra den övre mikrokanalens inlopps-, bypass- och utloppsslang genom att använda bindemedelsklämmor för att clamp dem. Kläm även fast inloppsslangen för den nedre mikrokanalen.
  5. Koppla bort utloppsslangen för den nedre mikrokanalen.
  6. Använd en P100-mikropipett och för in 20 μL ECM-blandning genom utloppshålet på den nedre mikrokanalen.
    OBS: Observera ECM-blandningen som strömmar genom mikrokanalen utan att någon luftbubbla fastnar. Om det finns någon luftbubbla, tillsätt ytterligare ECM-blandning till den nedre mikrokanalen tills bubblan är borta.
  7. Sätt tillbaka utloppsslangen för den nedre mikrokanalen.
  8. Säkra den nedre mikrokanalens inlopps-, bypass- och utloppsslang genom att använda bindemedelsklämmor för att clamp dem. Kläm även fast inloppsslangen för den övre mikrokanalen.
  9. Koppla bort utloppsslangen för den övre mikrokanalen.
  10. Använd en P100-mikropipett och för in 20 μL ECM-blandning genom utloppshålet på den övre mikrokanalen.
  11. Sätt tillbaka utloppsslangen för den övre mikrokanalen.
  12. Placera chipet i en befuktad CO 2 -inkubator med 5 % CO2 vid 37 ° C i 1 timme för att bilda ECM-skiktet på PDMS-membranet behandlat med PEI och GA (figur 3A).
    OBS: Se till att alla slangar är clamped under inkubationen.
  13. Under inkubationen av ECM-beläggningen, förbered två 1 ml sprutor som innehåller kallt såddmedium, vilket är det organoidodlingsmedium som saknar A8301 men som innehåller 10 μM Y-27632 och 2,5 μM CHIR99021, som tidigare rapporterats i Gut-on-a-Chip som härrör från humana organoider2.
    OBS: A8301 togs bort från mediet för att förbättra vidhäftningen av celler till den belagda ECM som tidigare rapporterats2. Dag 0 av Gut-on-a-Chip-odling kräver endast övre mikrokanalflöde. Förbered därför en full spruta för den övre kanalen och minst 0,2 ml för den nedre kanalen.
  14. När ECM-beläggningen är klar, ta ut chipet ur inkubatorn och släpp clamp till bypass-slangen ansluten till den nedre mikrokanalen.
  15. Anslut en 1 ml spruta fylld med såmedel till den trubbiga nålen som är kopplad till den nedre mikrokanalen i Gut-on-a-Chip. För försiktigt in såmediet (~50 μL) i bypass-slangen. När slangen är fylld med det införda mediet, fäst bypass-slangen som är ansluten till den nedre mikrokanalen med en bindemedelsklämma.
  16. Lossa clamp av utloppsslangen ansluten till den nedre mikrokanalen. För försiktigt in såmediet i den nedre mikrokanalen så att det kan flöda smidigt genom systemet. Fäst utloppsslangen som är ansluten till den nedre mikrokanalen med en bindemedelsklämma efter perfusion.
  17. Öppna sedan bypass-slangen som är ansluten till den övre mikrokanalen.
  18. Anslut en 1 ml spruta fylld med såmedium till den trubbiga nålen som är kopplad till den övre mikrokanalen på Gut-on-a-Chip. För försiktigt in såmediet (~50 μL) i bypass-slangen. När slangen är fylld med det införda mediet, fäst bypass-slangen som är ansluten till den övre mikrokanalen med en bindemedelsklämma.
  19. Lossa utloppsslangen som är ansluten till den nedre mikrokanalen. För försiktigt in såmediet i den övre mikrokanalen så att det kan flöda smidigt genom systemet. Fäst utloppsslangen som är ansluten till den övre mikrokanalen med en bindemedelsklämma efter perfusion.

3. Förberedelse av organoidceller i hundens tarm för sådd

OBS: För att generera Gut-on-a-Chip-modellen användes hundens kolonorganoider (kallade kolonoider) som härrör från IBD-patienthundar i detta protokoll. Dessa kolonoider härleddes från tre till fem små fragment av biopsierad tarmvävnad, enligt en tidigare rapporterad metod15,18. För optimala resultat är det avgörande att använda hundkolonoider som har genomgått minst tre odlingspassager för att etablera stabila organoider som är lämpliga för in vitro-applikationer. Det rekommenderas att odla hundens kolonoider under en period av minst 3-4 dagar för att underlätta adekvat differentiering av celler med flera linjer inom organoiderna, vilket säkerställer deras funktionella mognad och lämplighet för efterföljande experiment i Gut-on-a-Chip-modellen. Den maximala passagen för detta arbete är mindre än 20, vilket indikeras av en tidigare studie som visade den oförändrade fenotypen och karyotypen under 20 på varandra följande passager25. Signalerna från dessa givare presenteras i tilläggstabell S1.

  1. Odla hundens kolonoider i 24-brunnars plattor inbäddade i 30 μL Matrigel 15,18 med organoidodlingsmedium som anges i materialtabellen, vilket är modifierat från tidigare rapporterat medium 15,26,27. Det konditionerade mediet erhölls genom att odla Rspo1-celler och HEK293-celler konstruerade för att utsöndra Noggin28.
  2. Kassera det organoida odlingsmediet genom vakuumsugning och tillsätt 500 μl cellåtervinningslösning vid iskall temperatur i varje brunn. Inkubera i 30 minuter vid 4 °C.
    OBS: Vanligtvis ger tre brunnar av en 24-brunnsplatta med mogna hundtarmorganoider en tillräcklig mängd dissocierade celler för att så en enda Gut-on-a-Chip-enhet med 40-50 organoider/ett synfält vid x10 förstoring.
  3. Bryt Matrigel-kupolerna mekaniskt i 5 s med hjälp av en P1000-mikropipett. Samla sedan organoidsuspensionen i ett 15 ml koniskt rör.
  4. Centrifugera det koniska röret vid 200 × g och 4 °C i 5 minuter, varefter supernatanten avlägsnas.
  5. Tillsätt 1 ml trypsinliknande proteas vid rumstemperatur, kompletterat med 10 μM Y-27632, och återsuspendera cellpelleten genom pipettering med en P1000-mikropipett.
  6. Placera cellsuspensionen i ett vattenbad vid 37 °C och inkubera den i 10 minuter medan blandningen skakas med jämna mellanrum.
  7. Tillsätt 5 ml varmt organoidbasalt medium och pipettera kraftigt cellsuspensionen med en P1000-mikropipett tills den blir grumlig, utan några synliga cellklumpar.
  8. För cellsuspensionen genom en cellsil med en cutoff på 70 μm för att eliminera eventuellt Matrigel-skräp och stora cellkluster.
  9. Centrifugera det koniska röret vid 200 × g och 4 °C i 5 minuter, följt av återsuspension av pelleten i såmedium. För sådd av en Gut-on-a-Chip-enhet för hundar, använd 20 μL såmedium för att återsuspendera cellpelleten (dvs. använd 20 μL såmedium vid sådd av en Gut-on-a-Chip-enhet).
  10. Ändra koncentrationen av livsdugliga celler till 1 × 107 celler/ml med såmedium som tidigare rapporterats2. Utför viabilitetsbedömning med hjälp av en hemocytometer genom att kombinera 10 μL av cellsuspensionen med 10 μL trypanblått och observera sedan cellerna under ett mikroskop.
    OBS: Det är viktigt att justera cellkoncentrationen på lämpligt sätt för att säkerställa optimal cellbindning och bildandet av ett enhetligt monolager på chipmembranet. Om det initiala antalet celler är otillräckligt kan det leda till försenad eller misslyckad etablering av ett konfluentt monolager. Omvänt, om antalet celler är för stort, kan icke-vidhäftande celler aggregera till klumpar i kanalen, vilket leder till oönskade koncentrationseffekter.

4. Sådd och bildning av ett 2D-cellmonolager

  1. Koppla bort utloppsslangen för den övre mikrokanalen. Se till att bypass-slangen på den övre mikrokanalen förblir öppen. Säkra både inloppet och utloppet på den nedre mikrokanalen genom att använda bindemedelsklämmor för att klämma fast dem.
  2. Använd en P100- eller P20-mikropipett för in 20 μL av cellsuspensionen från protokoll 3 till utloppshålet på den övre mikrokanalen (figur 3B Seeding).
  3. Fäst bypass- och inloppsslangen på den övre mikrokanalen med hjälp av bindemedelsklämmor för att klämma fast den. Sätt sedan tillbaka utloppsslangen i utloppshålet på den övre mikrokanalen och se till att slangen förblir öppen under hela processen för att undvika att tryck appliceras på den övre mikrokanalen. Efter detta steg, fäst utloppsslangen på den övre kanalen långsamt med en bindemedelsklämma för att clamp den.
  4. Kontrollera med hjälp av ett mikroskop att cellerna är jämnt fördelade i den övre mikrokanalen.
    OBS: Det är viktigt att clamp slangen för att stoppa mediets rörelse i kanalen för att möjliggöra stabila statiska förhållanden tills den önskvärda cellfästet uppnås.
  5. Placera chipet i en fuktad CO2 -inkubator vid 37 °C.
    OBS: Det tar cirka 3 timmar för hundtarmens organoidceller att fästa på ECM-beläggningen (Figur 3B Bilaga).
  6. Anslut sprutan som är fäst vid den övre mikrokanalen på Gut-on-a-Chip till en sprutpump placerad i en CO2 -inkubator.
    OBS: Spola försiktigt in mediet i mikrokanalen med hjälp av vredet på sprutpumpen och ta bort obundna celler. Undersök chipet i mikroskop för att säkerställa att eventuella celler som inte sitter fast effektivt har tvättats bort.
  7. Initiera flödet av odlingsmedium vid 30 μL/h med såmedium. Detta kontinuerliga flöde är endast för den övre mikrokanalen initialt fram till 2D-monolageretableringen på ett Gut-on-a-Chip. För den nedre mikrokanalen, låt mikrokanalerna vara fastspända och mediet ospolat.
  8. Från och med dagen efter att cellerna har såtts byts odlingsmediet till organoidodlingsmedium, som innehåller A8301 och saknar 10 μM Y-27632 och 2,5 μM CHIR99021, från såmediet.
  9. När monolagret är etablerat, initiera det kontinuerliga medieflödet till den nedre mikrokanalen också. Det tar vanligtvis 2 till 3 dagar för hundens tarmorganoidepitelceller att etablera epitelmonolager (Figur 3C).

5. Etablering av 3D-morfogenes i hundens Gut-on-a-Chip

OBS: Efter att de konfluenta monolagren har bildats i Gut-on-a-Chip, introducerades medelflöde av både den övre kanalen och den nedre kanalen och cellstammen för att initiera 3D-morfogenes till 2D-monolager som visas i figur 2.

  1. Introducera organoidodlingsmediet i både de övre och nedre mikrokanalerna för att initiera utvecklingen av 3D-morfogenes i ett Gut-on-a-Chip-system. För att uppnå en skjuvspänning på 0,02 dyn/cm2 i den befintliga Gut-on-a-Chip-designen (dvs. 500 μm höjd mikrokanal), öka flödeshastigheten till 50 μL/h29.
  2. Initiera 10 % av cellstammen och 0,15 Hz frekvens, enligt rekommendationerna före2, med hjälp av en datorreglerad bioreaktor som applicerar cyklisk töjning på celler odlade in vitro. Denna process skulle tillämpa vakuumsugning på Gut-on-a-Chip-enheten.
  3. Upprätthåll dessa odlingsförhållanden i minst 2 till 3 dagar. 3D-morfogenesen av hundens tarmmonolager inträffar vanligtvis 2 till 3 dagar efter att Duralkanalflöde och vakuumsugning har påbörjats (Figur 3C).

6. Karakterisering av hundens Gut-on-a-Chip

  1. Avbildning av levande celler
    1. Ta bort eventuella luftbubblor i Gut-on-a-Chip genom att försiktigt låta mediet flöda med hjälp av sprutpumpen.
    2. Koppla bort Gut-on-a-Chip-enheten från sprutpumpen.
      OBS: Undvik alla manövrar som kan utöva tryck i Gut-on-a-Chip.
    3. Placera enheten på ett mikroskop för att ta bilder av det etablerade 3D-epitelet. För att visualisera strukturen hos 3D-epitelskikten med faskontrast, använd 10x och 20x objektiv (figur 3C).
  2. Immunofluorescensfärgning
    1. Bered den blockerande lösningen genom att lösa upp 1 g BSA i 50 ml fosfatbuffertsaltlösning (PBS) för att göra 2 % BSA. Låt lösningen passera genom ett sprutfilter på 0,2 μm för filtrering. Förvara denna lösning vid 4 °C.
    2. Bered den permeabiliserande lösningen genom att kombinera 150 μL Triton X-100 med 50 ml blockerande lösning, vilket resulterar i en slutlig koncentration på 0,3 % Triton X-100. Låt lösningen passera genom ett sprutfilter på 0,2 μm för filtrering. Förvara denna lösning vid 4 °C.
    3. Utför fixering av cellerna genom att injicera 100 μL av en 4% PFA i både de övre och nedre mikrokanalerna enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    4. Skölj cellerna genom att injicera 100 μL PBS i både övre och nedre mikrokanaler enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    5. Utför permeabilisering av cellerna genom att injicera 100 μL 0,3 % Triton i både övre och nedre mikrokanaler enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11. Placera enheten på RT i 30 minuter.
    6. Skölj cellerna genom att injicera 100 μL PBS i både övre och nedre mikrokanaler enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    7. Utför blockering av cellerna för att förhindra ospecifik bindning genom att injicera 100 μL 2 % BSA till både övre och nedre mikrokanaler enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11. Placera enheten på RT i 1 timme.
    8. Injicera 20 μl av den primära antikroppslösningen utspädd med 2 % BSA och placera den vid RT i 3 timmar, följt av inkubation över natten vid 4 °C.
      OBS: Se till att alla slangar är clamped under inkubationen vid 4 °C över natten. Koncentrationen av en primär antikropp bör vara 2-5 gånger högre än den rekommenderade koncentrationen för enskikts- eller 3D-organoidfärgning (tilläggsfigur S1).
    9. Skölj cellerna genom att injicera 100 μL PBS i både övre och nedre mikrokanalerna enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    10. Injicera 20 μl av den sekundära antikroppslösningen utspädd i 2 % BSA och placera den vid RT i 1 timme.
      OBS: Se till att alla slangar är clamped under inkubationen. Från och med detta steg är det nödvändigt att skydda enhetsinställningen med aluminiumfolie för att förhindra fotoblekning.
    11. Skölj cellerna genom att injicera 100 μL PBS i både övre och nedre mikrokanalerna enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    12. Bered en kombinerad lösning för motfärgning av F-aktin och DAPI (diamidino-2-fenylindol). Injicera 20 μl av den kombinerade lösningen i både övre och nedre mikrokanalerna enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
    13. Skölj cellerna genom att injicera 100 μL PBS i både övre och nedre mikrokanaler enligt beskrivningen i steg 2.4-2.11.
      Utföra fluorescensavbildning av arkitekturen hos 3D-epitelcellerna med hjälp av ett fluorescensmikroskop eller ett konfokalmikroskop.

7. Epitelial barriärfunktion

  1. Ta bort eventuella luftbubblor i Gut-on-a-Chip genom att försiktigt låta mediet flöda med hjälp av sprutpumpen. Se till att alla slangar är öppna under mätningen.
  2. Ta bort Gut-on-a-Chip från sprutpumpen och placera den på RT i minst 10 minuter.
  3. Ta bort Ag/AgCl-elektroder från 70 % EtOH-lösning.
  4. Placera två Ag/AgCl-elektroder i det övre inloppet respektive det nedre utloppet för att mäta epitelskiktets motstånd med hjälp av en multimeter.
  5. Placera två Ag/AgCl-elektroder i det nedre inloppet respektive det övre utloppet. Rapportera medelvärdet av dessa två värden som ett motståndsvärde för Gut-on-a-Chip.
    OBS: Den tomma TEER bör mätas på en Gut-on-a-Chip med endast ECM-beläggning utan epitel.
  6. Beräkna transepitelial elektrisk resistans (TEER) värde (kΩ × cm2) kan beräknas med hjälp av ekvation (1).
    TEER = (Ωt - Ωtom) × A (1)
    Där Ωt är ett resistansvärde som uppmätts vid den specifika tidpunkt som uppmätts sedan experimentet inleddes, är Ωblank ett resistansvärde som uppmätts vid tidpunkten utan epitelet, och A är den yta av ytan som täcks av ett celskikt (cirka 0,11cm2 för denna Gut-on-a-Chip-design29).
    1. Beräkna normaliserad TEER med hjälp av ekvation (2).
      TEER = Equation 1 (2)
      Där Ω0 är ett resistansvärde vid den första avläsningstidpunkten för experimentet enligt tidigare rapportering30 (figur 4C).

Representative Results

Detta protokoll underlättar på ett tillförlitligt sätt den spontana utvecklingen av 3D-tarmmorfogenes i ett Gut-on-a-Chip-system. Detta tillvägagångssätt använder hundtarmepitelceller erhållna från tarmorganoider som härrör från hundar som drabbats av inflammatorisk tarmsjukdom (IBD) (Figur 1B). Tillfällig anhopning av 3D-morfogenes av hundens tarmepitelceller kan observeras i hela mikrokanalen efter 6-9 dagars medelflöde (Figur 3C). Dessa morfologiska förändringar kan övervakas med hjälp av faskontrasttekniker. I den här studien använde vi organoider från två hundar som diagnostiserats med IBD. Noterbart är att framgångsrik 3D-morfogenes observerades i två biologiska replikat, som var och en utfördes med två tekniska replikat. Resultaten från denna studie ger en grund för framtida undersökningar som involverar tarmorganoider som härrör från andra hunddonatorer. Dessa resultat visar den potentiella tillämpbarheten och repeterbarheten av vårt experimentella tillvägagångssätt, som tidigare har rapporterats i mänskliga prover. Dessa fynd ger ytterligare bekräftelse på att Gut-on-a-Chip-tekniken är tillämplig på hundens tarmepitelceller, vilket tidigare rapporterats i studierna med humana tarmepitelceller2.

Detta protokoll visade att immunofluorescensfärgning kan användas för att utvärdera 3D-strukturen hos organoid-härledda monolager som har bildat villus-liknande strukturer i mikrofluidiska chips med hjälp av konventionell fluorescensmikroskopi (Figur 4 A,B). Detta protokoll kan anpassas för att validera de differentierade och rumsligt organiserade cellulära fenotyperna genom immunofluorescensfärgning. Visualiseringen av en 3D-morfogenes i en Gut-on-a-Chip ger en utmärkt möjlighet att undersöka värdresponsen under olika patologiska interaktioner 14,23,31. I kombination med epitelceller från patientdonatorer, som tidigare beskrivits hos människor, kan denna teknik användas för att konstruera personliga modeller av tarmsjukdomar13. Genom att integrera immunofluorescensavbildning med riktade RNA-visualiseringstekniker som fluorescens in situ-hybridisering kan det vara möjligt att visuellt analysera värdens transkriptom och proteom i ett Gut-on-a-Chip-system.

Att bevara tarmmembranets integritet är avgörande för att upprätthålla tarmhomeostas, och Gut-on-a-Chip-plattformen ger en värdefull fördel genom att möjliggöra exakt övervakning och kvantifiering av denna viktiga funktion. Mätningen av TEER med hjälp av Gut-on-a-Chip-tekniken erbjuder flera fördelar. Till exempel har tidigare studier framgångsrikt utvärderat TEER vid samodling av tarmceller med icke-patogena och probiotiska bakterier32, såväl som under läckande tarmförhållanden23. Detta gör det möjligt för forskare att studera effekten av olika tillstånd på tarmens barriärfunktion och att identifiera potentiella interventioner för att främja tarmhälsan.

Figure 1
Figur 1: Etablering av IBD Gut-on-a-Chip för hundar som härstammar från patienter. (A) Integrering av de patient-deriverade tarmorganoiderna och Gut-on-a-Chip-plattformen. Endoskopibiopsi kan utföras för att isolera tarmkryptceller för att utveckla donatorspecifika tarmorganoider. Epitelceller kan dissocieras till enskilda celler från organoiderna, sedan sås in i en PDMS-baserad Gut-on-a-Chip och odlas i en unik dynamisk mikromiljö. (B) Representativa bilder av kolonoider från en IBD-hund. Skalstapel = 100 μm. (C) Detta schema illustrerar en Gut-on-a-Chip-enhet som består av ett poröst membran placerat mellan övre och nedre mikrokanaler. Den övre mikrokanalen indikeras av det blå området, medan den nedre mikrokanalen indikeras av det röda området. Vakuumkammare finns på varje sida av mikrokanalen, som deformerar det porösa membranet för att efterlikna peristaltisk rörelse24. (D) En uppsättning av hundens Gut-on-a-Chip inkluderar en PDMS-baserad Gut-on-a-Chip monterad med slang som placeras på en täckglas 2,24. Bypass-slangen är avgörande för att undvika att tryck byggs upp i mikrokanalen under hanteringen (dvs. anslutning till sprutor). Bindemedelsklämmor används för att klämma fast slangen. Volymkänsliga material kan infunderas via de öppna hålen i det övre eller nedre utloppet. Organoidodlingsmedium kan infunderas genom att ansluta sprutorna till de trubbiga ändnålarna och flödet genom det övre och nedre inloppet. Förkortningar: IBD = inflammatorisk tarmsjukdom; PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Bildning av villusliknande strukturer i hundens IBD Gut-on-a-Chip. De dissocierade epitelcellerna såddes i en ECM-belagd Gut-on-a-Chip. När de dissocierade cellerna var fästa vid PDMS-membranet initierades apikalt flöde i 3 dagar (D0-D3). När ett konfluent 2D-monolager bildas (D3) initieras basolateralt flöde med frekvent sträckning (Stretching, AP och BL Flow). Efter 2-3 dagar av dubbelflöde och membransträckning börjar 2D-monolagret utveckla 3D-morfogenes, och villusliknande strukturer bildas efter 9 dagars odling (3D-morfogenes, D9-D12). Förkortningar: ECM = extracellulär matris; PDMS = polydimetylsiloxan, AP = apikal; BL = basolateral. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Sådd av organoider i tarmen hos hund och 3D-morfogenes i en Gut-on-a-Chip. (A) De experimentella stegen för ytaktivering av ett poröst membran i ett PDMS-baserat Gut-on-a-Chip. Användningen av UV/ozonbehandling, PEI och GA-behandling tillsammans underlättar tvärbindningen av aminer som finns i ECM-lösningar. Denna process leder till en stabil immobilisering av ECM-proteiner på det porösa membranet. (B) Faskontrastbilderna visar cellernas morfologi omedelbart efter sådd (vänster) och 3-5 timmar efter sådd (höger). Det porösa membranet efter 3 timmars sådd visar tunnare och mörkare områden där enskilda celler har fäst, vilket framhäver fästprocessen. (C) Faskontrastbilderna visar 3D-morfogenesen av tarmmonolager i ett Gut-on-a-Chip-system. Dessa monolager härrörde från hundar som drabbats av IBD och dessa organoidceller odlades under en period av 12 dagar under dynamiska förhållanden, vilket involverade vätskeflöde och sträckningsrörelser. Skalstaplar = 50 μm (B,C). Förkortningar: IBD = inflammatorisk tarmsjukdom; ECM = extracellulär matris; PDMS = polydimetylsiloxan, PEI = polyetenimin; GA = glutaraldehyd. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: Utvärdering av den morfologiska 3D-utvecklingen i Gut-on-a-Chip hos hund som härstammar från patienter. (A) Immunofluorescensavbildning av en IBD Gut-on-a-Chip hos hund, som visar en top-down-vy av ett fullt utvecklat 3D-epitel efter 12 dagars odling, som utvärderas med ett fluorescensmikroskop. Tight junction-proteinet (ZO-1) visualiseras i gult; borstkantsmembranet (F-aktin) visas i rött; och kärnorna är färgade med DAPI och ser blå ut. (B) Immunofluorescensavbildning av en IBD Gut-on-a-Chip hos hund med hjälp av ett konfokalmikroskop med en långdistanslins. Som visas i schemat visas en fluorescerande bild av ett tvärsnitt av en villusliknande struktur av ett fullt utvecklat 3D-epitel efter 12 dagars odling. Dessutom visar Z-stapling en sidovy av 3D-epitelet, som avslöjar bildandet av villusliknande strukturer. Borstkantsmembranet (F-aktin) visas i rött, och kärnorna är färgade med DAPI och blå. (C) Tarmbarriärfunktionen utvärderades och mättes med TEER i Gut-on-a-Chips från patienter hos hundar. Stabila TEER-värden uppnåddes på dag 5 av odling på Gut-on-a-Chip. Felstaplar uttrycker SEM för mätningarna. TEER-värdet mättes mellan två biologiska replikat med ett tekniskt replikat. Skalstreck = 50 μm (A), 25 μm (B). Förkortningar: IBD = inflammatorisk tarmsjukdom; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol; TEER = transepitelial elektrisk resistans. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfigur S1: Karakterisering av anti-ZO-1 polyklonal antikropp i kolonoid-härledda monolager hos hund och på Gut-on-a-Chip-enheter. (A) Immunofluorescensfärgning av ZO-1 i gult med F-aktin i rött och deras överlagringsbild. Skalstapel = 25 μm. (B) Immunofluorescensvisualisering av ZO-1 i gult i "Leaky Gut Chips" utfördes under olika förhållanden, inklusive stimulering med probiotiska bakterier (LGG + Cytokiner eller VSL#3 + Cytokiner) och bakteriefria kontroller utan probiotisk stimulering (Cytokiner). Skalstapel = 50 μm. Denna figur är återgiven från Min et al.23. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggstabell S1: En sammanfattning av vävnadsdonatorernas information. En sammanfattande tabell över donatorernas ålder, kön, ras, histopatologisk utvärdering och IBD-aktivitetsindex (CIBDAI) för hundar. CIBDAI är ett numeriskt poängsystem som används för att härleda klinisk svårighetsgrad vid IBD33 hos hundar. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Denna studie markerar den banbrytande demonstrationen av kompatibiliteten hos hundens tarmorganoider med utvecklingen av en IBD Gut-on-a-Chip-modell för hundar. Integreringen av tarmorganoider och organoid-härledda monolagerkulturer i ett mikrofluidiskt system (dvs. Gut-on-a-Chip-system) har vidareutvecklat tekniken, vilket möjliggör skapandet av in vitro-tarmmodeller som nära efterliknar fysiologisk dynamik och är mer representativa för biologiska förhållanden. I synnerhet, eftersom det finns mycket få rapporter om Gut-on-a-Chip-kultur med IBD-härledda organoider hos människor, kan den aktuella studien med IBD-härledd Gut-on-a-Chip från hundar ge ledande insikter i studien av IBD hos människor.

Den framgångsrika utvecklingen av hundens tarmepitel 3D-morfogenes på ett Gut-on-a-Chip kräver noggrann uppmärksamhet på flera kritiska steg. För det första kan den hydrofoba ytan på PDMS-mikrofluidikkanaler hindra ECM-vidhäftning och efterföljande cellbindning, vilket kräver ytaktivering av PDMS före ECM-beläggning och cellsådd (se protokollavsnitt 1). För att uppnå en stabil monolagerodling är det viktigt att avlägsna överflödiga celler som inte är bundna efter cellbindning (protokollsteg 4.6-4.7). Dessutom är dynamisk stimulering, såsom konstant medieflöde och peristaltisk vakuumrörelse, nödvändig för 3D-morfogenes av tarmepitelet (protokollsteg 5.2). Noggrann hantering är avgörande för att undvika luftbubblor i mikrokanalen under alla steg i Gut-on-a-Chip-kulturen.

Om du stöter på dålig cellsådd i Gut-on-a-Chip kan det bero på ett lågt cellantal eller dålig cellfäste. För att felsöka lågt cellantal är det viktigt att inspektera hälsan hos beredda tarmorganoider genom att observera deras tillväxt i Matrigel. Cellviabiliteten kan bedömas genom Trypan-blåfärgning efter celldissociation för att säkerställa att inte mer än 20 % av cellerna är döda. Om antalet livskraftiga celler är otillräckligt kan man försöka optimera organoidmedieförhållandena. En annan möjlighet är ofullständig organoiddissociation, vilket resulterar i ett överskott av cellklumpar större än 70 μm som fångas av filtret. För att lösa detta är ett alternativ att förlänga pipetteringstiden under celldissociation. Alternativt kan den 15 ml koniska slangen försiktigt röras varje minut medan den behandlas med ett trypsinliknande proteas. Dålig cellfäste till Gut-on-a-Chip kan bero på felaktig ECM-beläggning. Under beläggningsprocessen rekommenderas det att noggrant kontrollera om det finns luftbubblor och förhindra att de bildas genom att försiktigt tillsätta mer beläggningslösning efter behov. Överbeläggning av celler och underlåtenhet att tvätta bort obundna celler kan resultera i ett otillräckligt initialt monolager. I ett sådant fall kan en mild pulsering appliceras när du trycker på sprutkolven. Dessa felsökningssteg kan hjälpa dig att identifiera och åtgärda problem under Gut-on-a-Chip-odlingsprocessen.

Även om denna Gut-on-a-Chip-plattform gör det möjligt att skapa böljande 3D-epitellager, inser vi behovet av ytterligare biologisk komplexitet för att replikera tarmmikromiljön fullt ut. Det är viktigt att ta hänsyn till interaktionerna mellan epitelceller och mesenkymala celler, deponeringen av ECM för 3D-regenerering och förekomsten av kryptvillusegenskaper som etablerar en lämplig stamcellsnisch. Stromaceller, såsom fibroblaster, spelar en viktig roll i produktionen av ECM-proteiner och regleringen av tarmmorfogenesen34,35,36. Inkluderingen av mesenkymala celler i denna modell har potential att förbättra både morfogenesen och effektiviteten av cellbindning. Endotellager, som omfattar kapillärkärl och lymfkärl, spelar en avgörande roll för att styra molekylär transport och rekrytering av immunceller37,38. Inkludering av immunceller från patienter kan vara avgörande för modellering av tarmsjukdomar eftersom det gör det möjligt att demonstrera samspelet mellan medfödd och adaptiv immunitet samt att etablera vävnadsspecifik immunitet39. Efter slutförandet av 3D-morfogenesen på Gut-on-a-Chip kan organoidodlingsmediet modifieras till ett organoiddifferentieringsmedium. Detta kan vara ett genomförbart tillvägagångssätt för att inducera ytterligare cellulär differentiering, beroende på de experimentella målen.

Att avbilda 3D-mikroarkitekturen på plats är utmanande på grund av det långa arbetsavstånd som krävs, vilket kan övervinnas med ett långdistansobjektiv. Dessutom gör lager-för-lager-mikrofabrikationen och bindningsmetoderna det svårt att komma åt de övre lagren för undersökning med SEM. För den nuvarande Gut-on-a-Chip-designen behövs en sprutpump per Gut-on-a-Chip-mikroenhet, vilket upptar CO2 -inkubatorns utrymme och förhindrar storskaliga experiment. Innovationer behövs för att öka skalbarheten för en användarvänlig plattform och screening med hög genomströmning.

Dessa nuvarande protokoll möjliggör spontan utveckling av 3D-epitelskikt in vitro, vilket överträffar begränsningarna hos traditionella 3D-organoider, 2D-monolager och statiska mikroenhetsodlingssystem. Denna dynamiska in vitro-mikromiljö i tarmen kan kontrolleras genom att introducera samodling av olika celltyper. Tidigare studier har undersökt metoder för att manipulera Gut-on-a-Chip-mikromiljön, inklusive samodling av tarmmikrobiom14,23 och perifera mononukleära celler30. Denna rekonstruerade mikromiljö har många potentiella tillämpningar, inklusive drogtester, grundläggande mekanistiska studier och sjukdomsmodellering. Den rekonstruerade mikromiljön har betydande potential för ett brett spektrum av tillämpningar, såsom läkemedelstestning 23,40,41 och sjukdomsmodellering 12,13,14,30, samt grundläggande mekanistiska undersökningar av tarmmorfogenes 42. En mängd olika analyser kan utföras antingen genom att samla in supernatanter för bedömning av metaboliter 43, genom att samla in celler för genomisk undersökning 2,32, eller genom att visuellt undersöka cellerna med hjälp av levande cellfärgämnen eller fixering för efterföljande immunofluorescensavbildning 23,44.

Denna studie presenterar ett reproducerbart protokoll för att utveckla 3D-morfogenes av hundens tarmepitellager i en Gut-on-a-Chip-plattform. Den resulterande 3D-epitelstrukturen ger en mer realistisk representation av tarmmikromiljön, vilket har en enorm potential för tillämpningar i olika biomedicinska studier. Genom att använda denna tarmarkitektur kan vi bedriva mer translationell forskning och potentiellt ge lovande resultat.

Disclosures

Författarna har ingen intressekonflikt att redovisa.

Acknowledgments

Vi vill tacka WSU Small Animal Internal Medicine Service (Dr. Jillian Haines, Dr. Sarah Guess, Shelley Ensign LVT) och WSU VTH Clinical Studies Coordinator Valorie Wiss för deras stöd vid fallrekrytering och provtagning från medborgarforskare (patientdonatorer). Detta arbete stöddes delvis av Office of The Director, National Institutes Of Health (K01OD030515 och R21OD031903 till Y.M.A.) och Japan Society for the Promotion of Science Overseas Challenge Program for Young Researchers (202280196 till I.N.). Figur 1A och figur 3A skapades med BioRender.com.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Organoid basal medium
Advanced DMEM/F12 Gibco 12634-010
GlutaMAX Gibco 35050-061 2 mM, glutamine substitute
1 M HEPES VWR Life Science J848-500ML 10 mM
100x penicillin–streptomycin Corning MT30009CI 1x
Organoids and organoid medium
A-83-01  PeproTech  9094360 500 nM
B27 supplement  Gibco 17504-044 1x
CHIR99021 Reprocell 04-0004-base 2.5 µM
HEK293 cells engineered to secrete Noggin  Baylor College of Medicine
Murine EGF PeproTech  315-09-1MG 50 ng/mL
Murine Wnt-3a PeproTech  315-20-10UG 100 ng/mL
N-Acetyl-L-cysteine Sigma A9165-25G 1 mM
N2 MAX Media supplement  Gibco 17502-048 1x 
Nicotinamide Sigma N0636-100G 10 mM
Noggin Conditioned Medium NA NA 10% vol/vol 
Primocin InvivoGen ant-pm-1 100 µg/ml
R-spondin1 (Rspo1) cells Trevigen 3710-001-01 Rspo1 cells
R-Spondin-1 Conditioned Medium NA NA 20% vol/vol 
SB202190 Sigma-Aldrich S7067-25MG  10 µM
Y-27632 StemCellTechnologies 72308 10 µM
[Leu15 ]-Gastrin I human  Sigma-Aldrich G9145-.5MG 10 nM
Reagents
4% Paraformaldehyde solution Fisher Scientific AAJ19943K2
Alexa Fluor 647 Phalloidin Thermo Fisher Scientific A22287 x250 dilution
Anti-Rabbit IgG H&L labeled with Alexa Fluor 555 Abcam ab150078 x1,000 dilution
Anti-ZO-1 polyclonal antibody Thermo Fisher Scientific 61-7300 x50 dilution
Cell Recovery Solution Corning 354253
Collagen I, Rat Tail 3 mg/mL Gibco A10483-01
Diamidino-2-phenylindole (DAPI) Thermo Fisher Scientific 62248 x1,000 dilution
EMS Glutaraldehyde Aqueous 50% Electron Microscopy Sciences 16320
Matrigel Matrix Corning 356255
Poly(ethyleneimine) solution Sigma 408700-250ML
TrypLE Express Gibco 12604-021
Materials and Equipment
24-well culture plates Corning 3524
87V Industrial Multimeter Fluke Corporation
Centrifuge Eppendorf 5910R
CO2 incubator Eppendorf C170i
DMi8 fluorescence microscope Leica microsystems DMi8
Dry oven Fisher Scientific 15-103-0519
FlexCell FX-5000 Tension system Flexcell International Corporation
Inverted phase-contrast microscope Leica microsystems DMi1
SP8-X inverted confocal microscope Leica microsystems SP8-X
Syringe pump Braintree Scientific model no. BS-8000 120V
Syringe, 3 mL sterile BD Biosciences 14-823-435
Syringes, 1 mL sterile BD Biosciences 14-823-434
UV/ozone generator Jelight Company model no. 30
Software
LAS X imaging software  Leica microsystems

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Shanks, N., Greek, R., Greek, J. Are animal models predictive for humans. Philosophy, ethics, and humanities in medicine: PEHM. 4, 2 (2009).
  2. Shin, W., Kim, H. J. 3D in vitro morphogenesis of human intestinal epithelium in a gut-on-a-chip or a hybrid chip with a cell culture insert. Nature protocols. 17 (3), 910-939 (2022).
  3. Coelho, L. P., et al. Similarity of the dog and human gut microbiomes in gene content and response to diet. BMC Biome. 6 (72), 1-11 (2018).
  4. German, A. J. The growing problem of obesity in dogs and cats. The Journal of Nutrition. 136, 1940-1946 (1940).
  5. Patronek, G. J., Waters, D. J., Glickman, L. T. Comparative longevity of pet dogs and humans: Implications for gerontology research. Journals of Gerontology - Series A Biological Sciences and Medical Sciences. 52 (3), B171-B178 (1997).
  6. Lutz, T. A. Mammalian models of diabetes mellitus, with a focus on type 2 diabetes mellitus. Nature reviews. Endocrinology. 19 (6), 350-360 (2023).
  7. Allenspach, K., Culverwell, C., Chan, D. Long-term outcome in dogs with chronic enteropathies: 203 cases. Veterinary Record. 178 (15), 368 (2016).
  8. Patnaik, A. K., Hurvitz, A. I., Johnson, G. F. Canine gastrointestinal neoplasms. Veterinary Pathology. 14 (6), 547-555 (1977).
  9. Saito, T., et al. Immunohistochemical analysis of beta-catenin, e-cadherin and p53 in canine gastrointestinal epithelial tumors. Journal of Veterinary Medical Science. 82 (9), 1277-1286 (2020).
  10. Kopper, J. J., et al. Harnessing the biology of canine intestinal organoids to heighten understanding of inflammatory bowel disease pathogenesis and accelerate drug discovery: A One Health approach. Frontiers in Toxicology. 3, 1-13 (2021).
  11. Jalili-firoozinezhad, S., et al. A complex human gut microbiome cultured in an anaerobic intestine-on-a-chip. Nature Biomedical Engineering. 3 (7), 520-531 (2019).
  12. Shin, W., et al. Robust formation of an epithelial layer of human intestinal organoids in a polydimethylsiloxane-based Gut-on-a-Chip microdevice. Frontiers in Medical Technology. 2, (2020).
  13. Shin, Y. C., et al. Three-dimensional regeneration of patient-derived intestinal organoid epithelium in a physiodynamic mucosal Interface-on-a-Chip. Micromachines. 11 (7), 663 (2020).
  14. Tovaglieri, A., et al. Species-specific enhancement of enterohemorrhagic E. coli pathogenesis mediated by microbiome metabolites. Microbiome. 7 (1), 43 (2019).
  15. Chandra, L., et al. Derivation of adult canine intestinal organoids for translational research in gastroenterology. BMC Biology. 17 (1), 1-21 (2019).
  16. Sato, T., et al. Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium. Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).
  17. Wilson, S. S., Tocchi, A., Holly, M. K., Parks, W. C., Smith, J. G. A small intestinal organoid model of non-invasive enteric pathogen-epithelial cell interactions. Mucosal Immunology. 8 (2), 352-361 (2015).
  18. Ambrosini, Y. M., et al. Recapitulation of the accessible interface of biopsy-derived canine intestinal organoids to study epithelial-luminal interactions. PLoS ONE. 15 (4), 1-17 (2020).
  19. Gabriel, V., et al. Canine intestinal organoids in a dual-chamber permeable support system. Journal of Visualized Experiments. 2 (181), 1-24 (2022).
  20. Yamada, A., et al. Confronting emerging zoonoses: the one health paradigm. Confronting Emerging Zoonoses: The One Health Paradigm. , 1 (2014).
  21. Lerner, H., Berg, C. The concept of health in One Health and some practical implications for research and education: what is One Health. Infection Ecology & Epidemiology. 5 (1), 25300 (2015).
  22. Garcia, S. N., Osburn, B. I., Jay-Russell, M. T. One Health for food safety, food security, and sustainable food production. Frontiers in Sustainable Food Systems. 4, 1-9 (2020).
  23. Min, S., et al. Live probiotic bacteria administered in a pathomimetic Leaky Gut Chip ameliorate impaired epithelial barrier and mucosal inflammation. Scientific Reports. 12 (1), 22641 (2022).
  24. Kim, H. J., Huh, D., Hamilton, G., Ingber, D. E. Human gut-on-a-chip inhabited by microbial flora that experiences intestinal peristalsis-like motions and flow. Lab on a Chip. 12 (12), 2165-2174 (2012).
  25. Qu, M., et al. Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration. Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).
  26. Sahoo, D. K., et al. Differential transcriptomic profiles following stimulation with lipopolysaccharide in intestinal organoids from dogs with inflammatory bowel disease and intestinal mast cell tumor. Cancers. 14 (14), 3525 (2022).
  27. Gabriel, V., et al. Standardization and maintenance of 3D canine hepatic and intestinal organoid cultures for use in biomedical research. Journal of Visualized Experiments. (179), 1-28 (2022).
  28. Heijmans, J., et al. ER stress causes rapid loss of intestinal epithelial stemness through activation of the unfolded protein response. Cell reports. 3 (4), 1128-1139 (2013).
  29. Shin, W., et al. A robust longitudinal co-culture of obligate anaerobic gut microbiome with human intestinal epithelium in an anoxic-oxic interface-on-a-chip. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 7, 1-13 (2019).
  30. Shin, W., Kim, H. J. Intestinal barrier dysfunction orchestrates the onset of inflammatory host-microbiome cross-talk in a human gut inflammation-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (45), E10539-E10547 (2018).
  31. Park, G. S., et al. Emulating host-microbiome ecosystem of human gastrointestinal tract in vitro. Stem Cell Reviews and Reports. 13 (3), 321-334 (2017).
  32. Kim, H. J., Li, H., Collins, J. J., Ingber, D. E. Contributions of microbiome and mechanical deformation to intestinal bacterial overgrowth and inflammation in a human gut-on-a-chip. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (1), E7-E15 (2016).
  33. Jergens, A. E., et al. A scoring index for disease activity in canine inflammatory bowel disease. Journal of Veterinary Internal Medicine. 17 (3), 291-297 (2003).
  34. Roulis, M., Flavell, R. A. Fibroblasts and myofibroblasts of the intestinal lamina propria in physiology and disease. Differentiation; research in biological diversity. 92 (3), 116-131 (2016).
  35. Göke, M., Kanai, M., Podolsky, D. K. Intestinal fibroblasts regulate intestinal epithelial cell proliferation via hepatocyte growth factor. The American Journal of Physiology. 274 (5), G809-G818 (1998).
  36. Powell, D. W., Pinchuk, I. V., Saada, J. I., Chen, X., Mifflin, R. C. Mesenchymal cells of the intestinal lamina propria. Annual Review of Physiology. 73, 213-237 (2011).
  37. Pappenheimer, J. R., Michel, C. C. Role of villus microcirculation in intestinal absorption of glucose: coupling of epithelial with endothelial transport. The Journal of Physiology. 553, 561-574 (2003).
  38. Agace, W. W. T-cell recruitment to the intestinal mucosa. Trends in Immunology. 29 (11), 514-522 (2008).
  39. Ambrosini, Y. M., Shin, W., Min, S., Kim, H. J. Microphysiological engineering of immune responses in intestinal inflammation. Immune Network. 20 (2), 13 (2020).
  40. Kasendra, M., et al. Development of a primary human Small Intestine-on-a-Chip using biopsy-derived organoids. Scientific Reports. 8 (1), 1-14 (2018).
  41. Sontheimer-Phelps, A., et al. Human Colon-on-a-Chip enables continuous in vitro analysis of colon mucus layer accumulation and physiology. Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (3), 507-526 (2020).
  42. Shin, W., et al. Human intestinal morphogenesis controlled by transepithelial morphogen gradient and flow- dependent physical cues in a microengineered Gut-on-a-Chip. iScience. 15, 391-406 (2019).
  43. Gijzen, L., et al. An Intestine-on-a-Chip model of plug-and-play modularity to study inflammatory processes. SLAS Technology. 25 (6), 585-597 (2020).
  44. Kim, H. J., Lee, J., Choi, J. H., Bahinski, A., Ingber, D. E. Co-culture of living microbiome with microengineered human intestinal villi in a gut-on-a-chip microfluidic device. Journal of Visualized Experiments. (114), 3-9 (2016).

Tags

Medicin utgåva 204
Tredimensionell morfogenes i hundtarm-på-ett chip med hjälp av tarmorganoider som härrör från patienter med inflammatorisk tarmsjukdom
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini,… More

Nagao, I., Nakazawa, M., Ambrosini, Y. M. Three-Dimensional Morphogenesis in Canine Gut-on-a-Chip Using Intestinal Organoids Derived from Inflammatory Bowel Disease Patients. J. Vis. Exp. (204), e65720, doi:10.3791/65720 (2024).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter