Summary
人膜转运蛋白的结构和生化研究需要毫克量的稳定、完整和均匀的蛋白质。在这里，我们描述了使用密码子优化基因筛选、表达和纯化人类溶质载体转运蛋白的可扩展方法。
Abstract
溶质载体 （SLC） 是膜转运蛋白，可导入和输出一系列内源性和外源性底物，包括离子、营养物质、代谢物、神经递质和药物。尽管这组蛋白质已成为有吸引力的治疗靶点和疾病标志物，但目前的药物仍然相对不足。这些转运蛋白的药物发现项目受到有限的结构、功能和生理知识的阻碍，最终是由于这类膜包埋蛋白的表达和纯化困难。在这里，我们展示了使用密码子优化基因序列获得高纯度、毫克量的人SLC转运蛋白的方法。结合对构建体设计和高通量表达的系统探索，这些方案确保了靶蛋白的结构完整性和生化活性的保存。我们还重点介绍了这些蛋白质的真核细胞表达、亲和纯化和尺寸排阻色谱的关键步骤。最终，该工作流程可产生纯净、功能活性和稳定的蛋白质制剂，适用于高分辨率结构测定、转运研究、小分子结合测定和高通量 体外 筛选。
Introduction
长期以来，膜蛋白一直是研究人员和制药行业的目标。其中，溶质载体 （SLC） 是一个由人类基因组中编码的 400 多个次级转运蛋白基因组成的家族1。这些转运蛋白参与许多分子的进出口，包括离子2、神经递质3、脂质4、5、6、7、氨基酸8、营养素9、10、11 和药物 12。由于底物如此广泛，这些蛋白质还通过毒素 13 的转运、滥用药物14、15 的转运和抑制或有害突变16 与一系列病理生理学有关。细菌同源物已成为几个SLC家族17,18,19,20,21,22,23,24,25的基本运输机制的原型。与人类蛋白质相比，原核直系同源物通常在众所周知的大肠杆菌表达系统26,27 中表达得更好，并且在较小的去污剂中更稳定，这些去污剂产生用于 X 射线晶体学的有序晶体28。然而，序列和功能差异使这些远缘相关蛋白质用于药物发现变得复杂29,30。因此，通常需要对人类蛋白质进行直接研究，以破译靶向 SLC31、32、33、34、35 的药物的作用机制。虽然冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 的最新进展使得在更天然的类似条件下对 SLC 进行结构表征36,37，但表达和纯化这些蛋白质的困难仍然是开发靶向治疗和诊断的挑战。
为了缓解这一挑战，RESOLUTE联盟（re-solute.eu）开发了用于大规模表达和纯化人SLC家族蛋白的资源和方案38。从密码子优化基因开始，我们开发了用于SLC构建体的高通量克隆和筛选方法。这些方法被系统地应用于整个SLC家族，将基因克隆到BacMam病毒表达系统中，并基于先前描述的高通量克隆和表达测试方法40，在人类细胞系39中测试蛋白质表达。总之，SLC 基因从 pDONR221 质粒克隆到 pHTBV1.1 载体中。该构建体随后用于将目的基因转置到用于转染昆虫细胞的杆粒载体中，其中包括用于在哺乳动物细胞中表达的巨细胞病毒启动子和增强子元件。所得杆状病毒可用于转导哺乳动物细胞以表达靶标SLC蛋白。
我们进一步开发了用于大规模表达和稳定纯化选定SLC的标准化方法（图1）。该协议包括多个检查点，以促进有效的故障排除并最大限度地减少实验之间的差异。值得注意的是，链球菌和绿色荧光蛋白 （GFP） 标签41,42 有助于蛋白质表达和定位的常规监测，以及单个靶标纯化条件的小规模优化。
最终，这些化学纯度和结构均质的蛋白质样品可用于通过 X 射线晶体学或冷冻电子显微镜 （Cryo-EM） 进行结构测定、生化靶标结合测定、免疫以生成粘合剂，以及通过复溶到化学定义的脂质体中进行无细胞功能研究。
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Protocol
注：所有密码子优化的RESOLUTE SLC基因均已沉积在AddGene43中，其链接可在RESOLUTE公共试剂44列表中找到。这些基因已被克隆到 pDONR221 质粒中，并允许使用重组克隆45 将基因直接克隆到目标载体中。为了最大限度地提高平行性，细菌，昆虫和哺乳动物细胞以块形式生长，分别用于杆粒生产（第3节），杆状病毒扩增（第5节）和表达测试（第6节）。对于这些步骤，需要微表情振荡器以确保充分的混合和通气。
1. 将SLCs（高通量）克隆到pHTBV1.1杆粒中
注：克隆步骤使用重组克隆方案进行高效克隆，并使用热休克方法46转化为大肠杆菌（大肠杆菌）。该方案专为多个靶标或构建体的高通量和并行克隆而设计，但可以很容易地适应较小的规模。
- 在 96 孔板中，加入 150 ng pDONR221 SLC 克隆和 100 ng pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW 载体。用 10 mM Tris pH 8.0 将反应体积调至 8 μL，然后加入 2 μL 重组酶混合物。
- 在室温下孵育1小时，加入1μL蛋白酶K，并在37°C下孵育30分钟。
- 使用 4 μL 反应混合物使用热休克法46 和 SOC 培养基转化 50 μL 化学感受态大肠杆菌 MACH-1 细胞以进行回收。平板到含有 5% 蔗糖或 SOC 琼脂的 LB 琼脂上，补充有 100 μg/mL 氨苄青霉素。
- 使用适当的引物（见表1）和菌落PCR47的标准方案，鉴定含有SLC基因插入片段的pHTBV1.1载体的菌落。
- 使用质粒小量制备试剂盒从具有目的基因的单个菌落中纯化重组质粒。
2. 换位
注：以下步骤用于将 SLC 基因从 pHTBV1.1 载体转置到杆粒中，以便在 Sf9 细胞中产生 BacMam 杆状病毒。使用热休克方法46，将pHTBV1.1载体转化为DH10Bac感受 态大肠杆菌 细胞，其含有具有lacZ-mini-attTn7融合的亲本杆粒。在辅助质粒48 提供的转座蛋白存在的情况下，在 pHTBV1.1 载体的元件和亲本杆粒之间发生转座。有关该协议中使用的溶液的组成，请参见 表2 。
- 使用 3 μL 100-200 ng/μL 纯化的 pHTBV1.1 载体 DNA，在 96 孔 PCR 板中使用热休克法转化 DH10Bac。通过在37°C下在回收培养基中孵育4-5小时，同时在微表达振荡器中以700rpm振荡来恢复细胞。
- 将 50 μL 转化细胞铺布到 DH10Bac 选择板上。将板在37°C孵育48小时，并用箔覆盖。
- 选择单个白色菌落（含有重组 DNA）并划线稀释。在37°C孵育过夜。
3. 高通量杆粒生产
注：该方案描述了使用96孔杆粒纯化试剂盒提取杆粒的步骤。
- 将单个白色菌落（从条纹到稀释板中分离）接种到含有 1 mL 2x LB 培养基的 96 深孔块的孔中（表 2）。
- 盖上多孔密封件，在37°C下以700rpm在微表情振荡器中孵育过夜。
- 通过在微量滴定板中将120μL培养物与30μL60%甘油混合并储存在-80°C来制备细胞的甘油储备液。
- 将深孔块以2,600× g 离心30分钟。将上清液倒入合适的容器中进行去污。倒置积木并轻轻敲击纸巾。使用多通道移液器向模块的每个孔中加入 250 μL 溶液 1。
- 重悬颗粒;如有必要，请使用多通道移液器。
- 向每个孔中加入 250 μL 溶液 2，并用硅胶垫密封。轻轻倒置 5 次，并在室温下孵育 10 分钟。非常短暂地旋转。
- 加入 300 μL 溶液 3 并用硅胶垫密封。轻轻但彻底地混合，倒置 5 倍。
- 将样品置于冰上20分钟，然后在4°C下以2,600× g 离心30分钟。
- 将透明上清液转移到新鲜的 96 孔块中。在4°C下再次以2,600× g 离心30分钟。
- 在新鲜的 96 深孔模块中，每孔分配 0.8 mL 100% 异丙醇。从相应的孔中加入 0.8 mL 上清液。
- 使用移液管轻轻地上下移液，然后在冰上孵育30分钟或在4°C下孵育过夜以产生更多的杆粒。
- 在4°C下以2,600× g 离心30分钟。
- 在生物安全柜内，用70%乙醇喷洒块体的外部，打开块体，丢弃上清液。
- 向每个孔中加入 500 μL 70% 乙醇 （v/v），轻轻敲击块以洗涤沉淀。盖上粘性塑料密封件，并在4°C下以2,600× g 离心30分钟。
- 在生物安全柜内，打开块并丢弃上清液。在纸巾上轻轻敲击块以去除乙醇。让块在罩内干燥1-2小时或在50°C烘箱中干燥。
- 加入 50 μL 无菌 TE 缓冲液以重悬杆粒 DNA，并使用粘合剂塑料密封密封。将内容物转移到 V 形底微量滴定板中。将杆粒DNA储存在4°C直至试验纯化完成，然后将其储存在-20°C。
注：虽然不常规测量，但通常可预期 500 至 2,000 ng/μL 杆粒 DNA。 - 使用标准菌落PCR方法47和以下载体引物筛选成功掺入靶基因的杆菌：
pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
注意：扩增子将比靶基因大约 700 bp。
4. 转染
注意：这些步骤用于用产生的杆粒转染 Sf9 昆虫细胞，这会导致昆虫细胞产生杆状病毒颗粒 （P0）。
- 在无血清昆虫培养基中将 Sf9 细胞培养至 2.0-2.4 × 106 个细胞/mL 的密度。在无血清昆虫培养基中将细胞稀释至 2 ×10 个 5 个细胞/mL，并将 1 mL 稀释的细胞分配到 24 孔组织培养板孔中。包括仅 转染试剂 和 仅细胞对 照。将板在27°C的加湿培养箱中孵育1小时，以使细胞附着。
- 将每孔 38 μL 无血清昆虫培养基与每孔 2 μL 转染试剂混合。将 40 μL 混合物分装到 96 孔无菌平底微量滴定板中。加入 2 μL 0.5-2.0 μg/μL 的重组杆粒 DNA，盖上板，在微生物安全柜内孵育 15 分钟。
- 将 160 μL 无血清昆虫培养基加入含有 DNA 转染试剂混合物的微量滴定板的每个孔中。
- 在步骤4.1中从细胞中吸出培养基。轻轻地将200μL杆粒转染试剂 - 培养基混合物加入细胞上，盖上板，并在27°C的加湿培养箱中孵育4小时。
- 向每个孔中加入 400 μL 补充有 2% FBS 的无血清昆虫培养基。为减少蒸发，请将板转移到干净的塑料袋中，但不要密封。将板在27°C下在加湿培养箱中孵育72小时。
- 3天后，将培养基从板转移到无菌的96深孔块中，并在室温下以1,500× g 离心20分钟。将含有P0杆状病毒的澄清上清液转移到无菌的96深孔块中，并储存在4°C，远离光。
5. BacMam 杆状病毒扩增
注意：以下步骤用于将初始 P0 杆状病毒扩增为更高滴度的病毒储备;即 P1、P2 和 P3。最终的 P3 滴度适用于转导和蛋白表达。为了提高效率和并行性，该协议使用固定的体积比进行病毒扩增，该病毒扩增已经过经验优化。然而，如果随后转导的细胞未通过显微镜显示GFP荧光和细胞直径增加，或者如果蛋白质表达失败（参见第6节和第8节），则在定量杆状病毒滴度49,50,51,52后，应重新优化杆状病毒扩增，以便在每个步骤中降低感染的多重性，并通过GFP荧光显微镜监测感染并增加细胞直径53。
- 通过在无血清昆虫培养基中将 Sf9 细胞培养至 2 × 10 个6 个 细胞/mL 的密度来制备 P1 病毒储备液，加入 2% FBS，并将细胞接种在 24 深孔块中，最终体积为每孔 3 mL。向细胞中加入 120 μL P0 病毒原液。
- 将块在27°C孵育，同时在微表情振荡器中以450rpm振荡66-72小时。在室温下以1,500× g 离心块20分钟，并将上清液收获到96深孔块中。作为P1病毒原液储存在远离光的4°C下。
- 通过感染 50 mL Sf9 细胞（2 ×10 个 6 个 细胞/mL 细胞密度）来制备 P2 病毒储备物，这些细胞在补充有 2% FBS 的无血清昆虫培养基中生长，并含有 250 μL P1 病毒储备液。将细胞在27°C下孵育，并以110rpm振荡。
- 在66-72小时后收获P2病毒储备液，以1,500 ×克 离心20分钟，并在远离光的4°C下储存。
- 通过用 1：200 （v/v） P2 病毒储备液感染所需体积的 Sf9 细胞（2 × 10 个6 个细胞/mL 细胞密度）来制备 P3 病毒储备物。将细胞在27°C下孵育，并以110rpm振荡。
- 66-72小时后，以1,500× g 离心20分钟，并通过收集上清液收获P3病毒，并储存在4°C，避光保存。
6. 转导表达检测
注：以下部分描述了小规模表达测试，可以进行修改，以便使用深孔模块对多个构建体进行并行测试。
- 通过将 200 g PEG 10,000 和 12 g NaCl 溶解在 600 mL 双蒸 H2O 中来制备 20% （w/v） 聚乙二醇溶液，搅拌至最终体积为 1,000 mL。高压灭菌溶液。
- 将 300 μL 收获的 P1 病毒加入 24 深孔区块的孔中，向每个孔中加入 75 μL PEG 溶液。将块在18°C的微表情振荡器中孵育，同时以300rpm振荡5分钟，并将块在4°C下储存过夜。
- 在18°C下以300rpm再次摇动块30分钟，并以3,000× g 离心块45分钟。使用移液管在微生物安全柜中丢弃上清液。
- 在密度为 2 × 106 个细胞 /mL 的 HEK293 培养基中制备悬浮适应的 HEK293 细胞，并将 3 mL 接种到每个含有病毒沉淀的孔中，补充 5 mM 丁酸钠。
- 将块在30°C下与8%CO2 孵育，同时以200-250rpm振荡72小时。
注：对于悬浮适应和祖先 HEK293 细胞系，供应商推荐的细胞培养过程中的 CO2 浓度不同，分别为 8% 和 5%。 - 通过以 900 × g 离心 20 分钟收获细胞，并用 1 mL PBS 洗涤每个孔。
注：吸出 10 μL 重悬细胞，并在荧光显微镜下用与 GFP 兼容的滤光片立方体观察细胞，以评估蛋白质表达和定位。吸出 10-15 μL 重悬细胞，并运行全细胞 SDS-PAGE 凝胶进行凝胶内 GFP 荧光检测54。 - 再次以900× g 离心20分钟。将沉淀冷冻在-80°C。
7. 高通量小规模测试纯化
注：以下步骤描述了 24 孔模块格式的快速测试纯化工作流程，用于筛选单个 SLC 的表达水平。有关该协议中使用的溶液的组成，请参见 表2 。
- 向收获的细胞的每个孔中加入 1 mL HT 裂解缓冲液，并使用 24 头探针在 24 孔块中继续在冰上超声处理总长度 4 分钟（以 3 秒开启/15 秒关闭循环）。
- 将内容物转移到 96 深的孔块中，加入 125 μL 洗涤剂原液，并用硅密封密封。在4°C下轻轻旋转块1小时。或者，将十二烷基麦芽糖苷（DDM）和胆固醇半琥珀酸酯（CHS）直接添加到24孔块中，并将它们置于4°C的摇杆上。
- 在4°C下以2600× g 离心块20分钟，并将上清液转移到新的96深孔块中。
- 制备 50% 用裂解缓冲液预平衡的高容量链球菌蛋白树脂储备液。
- 向每个孔中加入 100 μL 重悬树脂原液。
- 用硅密封盖住块并在4°C下旋转2小时，然后非常短暂地离心（至200 ×g）以除去粘附在盖子上的液体。
- 将 96 孔滤板放在空块的顶部，并将树脂/上清液混合物转移到滤板中。用 800 μL HT 洗涤缓冲液冲洗深孔块的孔，并转移到过滤块中以收集最大量树脂。
- 让缓冲液滴入或以 200 × g 短暂离心并收集流出物。将滤板放在新的洗涤块上，并用 800 μL HT 洗涤缓冲液洗涤树脂，让缓冲液滴落（或短暂离心）。再重复洗涤步骤两次，并以500 ×g 离心块3分钟以除去残留的HT洗涤缓冲液。
- 将滤板放在 96 孔微量滴定板的顶部。加入 50 μL HT 洗脱缓冲液，在室温下摇动孵育 10 分钟。通过以500× g 离心3分钟洗脱样品。
- 在 Coomassie 染色的 SDS-PAGE 凝胶上运行 15 μL 洗脱的样品以检查蛋白表达。将剩余的洗脱液样品加载到尺寸排阻色谱 （SEC） 或荧光检测尺寸排阻色谱 （FSEC） 系统上，以评估 DDM/CHS 中的蛋白质单分散性。
8. 大规模表达的转导
注：以下步骤是SLC表达的标准RESOLUTE协议。单个靶标需要进一步优化丁酸钠的表达时间、孵育温度和浓度。此外，我们通过在小规模实验中测试用于感染悬浮适应 HEK293 细胞的 P3 病毒的各种体积比来常规优化杆状病毒感染的多样性。这节省了时间，使用手头已有的技术和设备，并直接评估所需的实验结果。然而，这种经验方法需要对 P3 病毒的每次扩增进行重新优化，并且可以使用其他方法来量化杆状病毒颗粒 49,50,51,52。
- 在 HEK293 培养基中放大悬浮适应 HEK293 细胞的所需体积。
- 将悬浮适应的HEK293细胞稀释至1×10个6 个细胞/mL并生长24小时（2 L滚瓶为170rpm，3 L滚瓶为105rpm）。
- 每升细胞加入 30 mL P3 病毒，并加入 5 mM 丁酸钠。将细胞在37°C孵育48小时或在30°C孵育72小时。
- 在孵育期间和之后， 关键步骤 是使用明场显微镜检查细胞，以检查微生物污染和细胞活力。使用荧光显微镜和与GFP兼容的滤光片立方体评估蛋白质表达和定位。
- 通过以900× g 离心20分钟收获细胞。
- 通过将细胞沉淀重悬于每升细胞培养物 10-15 mL PBS 中来洗涤细胞沉淀，然后再次以 900 × g 沉淀 20 分钟。
- 将细胞沉淀在液氮中快速冷冻并储存在-80°C。
9. 蛋白质纯化
注：以下是用于 5 L 细胞培养物 SLC 纯化的标准 RESOLUTE 方法。对于每个 SLC 目标，必须根据经验确定最佳洗涤剂。提前准备基础缓冲液、去污剂储备液、洗涤液、洗脱液和 SEC 缓冲液（表 2）。有关测试的标准洗涤剂列表，请参阅 表 3。洗涤缓冲液中的 ATP 和 MgCl2 可减少热休克蛋白的污染。
- 第1天
- 在设置为室温的水浴中解冻冷冻细胞沉淀。
- 用 135 mL 基础缓冲液和三种蛋白酶抑制剂混合物片剂制备增溶缓冲液。让片剂溶解。
- 用增溶缓冲液重悬解冻的沉淀。每 10-15 g 细胞沉淀使用 27 mL 增溶缓冲液，加入 DNase，然后倒入冰冷的 Dounce 匀浆机中。通过上下移动柱塞约 20 倍来均质化溶液，将均质器保持在冰上。
注意：重悬体积需要根据靶蛋白和细胞沉淀质量进行优化，这将因收获时的细胞密度而变化。可以根据制造商的说明添加商业 DNase。DNase也可以使用既定的方案55在内部表达和纯化。 - 加入洗涤剂储备溶液至1%终浓度。
注：优化蛋白质纯化的 一个关键步骤 是确定用于 SLC 溶解和纯化的最佳去污剂，这必须根据经验进行确定。我们经常使用各种洗涤剂;每种药物单独使用并与琥珀酸半胆固醇酯联合使用，使洗涤剂与CHS的质量比保持在10：1。 - 将增溶混合物转移到 50 mL 锥形管中。在4°C下缓慢旋转1小时。
- 将溶液在4°C下以50,000× g 离心30分钟。 收集上清液。
- 用基础缓冲液平衡 4-6 mL 床体积的链球菌蛋白树脂。
- 将平衡的树脂加入溶解的上清液中，并在4°C下旋转2小时。
- 将溶液倒入重力流柱中，让溶液流过。
- 用 30 倍床体积的链球菌洗涤缓冲液以 3 个相等体积的步骤洗涤树脂。
- 加入 3-5 mL 洗脱缓冲液，孵育 15 分钟，并收集洗脱液。再重复此步骤四次，分别收集每个洗脱部分。
注意： 关键步骤 是从链球菌蛋白树脂中洗脱蛋白质，每次添加洗脱缓冲液后孵育 15 分钟很重要。通常，由于残留洗涤缓冲液稀释洗脱缓冲液，第一洗脱液馏分含有较低浓度的蛋白质。因此，如果需要更高的最终蛋白质浓度，可以丢弃第一个洗脱液部分。或者，也可以使用SDS-PAGE分析所有连续洗脱液中的蛋白质浓度，以优化方案。 - 通过紫外吸光度光谱法测量蛋白质浓度，合并所需的洗脱馏分，并以 1：5 （w/w） 至 1：10 （w/w） 的比例加入 3C 蛋白酶。
- 在4°C下缓慢旋转过夜。
注意：仅当需要删除 GFP 标签时，才需要步骤 9.1.12 和 9.1.13。如果不需要删除标签，请直接执行步骤 9.2.4。或者，蛋白质可以在4°C下保持过夜，以便第二天继续。此外，对于稳定性降低的SLC，可能需要优化蛋白酶浓度、孵育期和温度。3C 蛋白酶在很宽的温度范围内具有活性，可实现最适合各种 SLC 的优化。
- 第2天
- 用 SEC 缓冲液平衡 2-4 mL 床体积的钴金属亲和树脂。
- 将平衡的钴金属亲和树脂加入过夜的3C反应混合物中，并在4°C下旋转1小时。
- 将溶液倒入重力流柱中并收集流出物。
- 通过在4°C下以3,000× g 旋转，将流出物浓缩在100kDa截止离心过滤器中，每5分钟轻轻混合一次样品，直到达到所需的SEC进样体积。
- 使用 SEC 缓冲液平衡基于葡聚糖琼脂糖的尺寸排阻色谱柱。SEC程序应在4°C（冷却室或冷室）下进行。
注： 关键步骤：根据SLC的寡聚状态，可以使用不同的色谱柱（例如基于琼脂糖的尺寸排阻色谱柱）进行SEC。 - 将样品注入样品回路并运行SEC程序，其流速使色谱柱压力低于色谱柱制造商的规格。使用馏分收集器，在整个 SEC 运行中自动收集 0.3 mL 馏分。
- 汇集峰馏分，测量UV吸光度，并通过在4°C下以3,000 × g 旋转，在100 kDa截留离心浓缩器中浓缩至所需的体积/浓度。
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Representative Results
SLC基因可以从RESOLUTE pDONR质粒克隆到BacMam载体中，用于哺乳动物表达
所描述的克隆、表达和纯化方案已被证明对跨多个蛋白质折叠的许多 SLC 转运蛋白是成功的。然而，这些程序包括几个用于监测进展的检查点，允许优化以考虑表达、蛋白质折叠、脂质和去污剂依赖性稳定性以及对缓冲液条件的敏感性的差异。
SLC克隆和小规模表达过程中的检查点
在克隆步骤中，应使用琼脂糖凝胶电泳来确保PCR和酶切产物的正确大小。同样，Gateway和转座反应可以通过集落PCR反应进行验证（图2A，B）。杆状病毒的产生可以根据需要使用标准技术进行监测 49,50,51,52。初始表达应在小规模下进行，通过SDS-PAGE评估蛋白质产量（图2B）。同样，应使用荧光显微镜记录绿色荧光细胞的比例、总蛋白表达和蛋白质定位（图 2C，D）。应根据细胞类型、温度、时间以及共表达伴侣或复杂伴侣的必要性来优化蛋白质表达。基于二级结构预测56,57,58，通过修改构建体以截断无序的 N 端和 C 端，并测试亲和标签的类型和位置，可以进一步优化表达。应通过FSEC（图2E），基于SEC的热位移测定（SEC-Ts）和DSF 41,42,59,60,61,62在小范围内评估蛋白质稳定性。考虑到蛋白质的功能和天然亚细胞环境以及相应修改的后续纯化缓冲液，应测试小分子，例如底物和抑制剂、去污剂、胆固醇半琥珀酸酯、脂质和 pH 值，以提高蛋白质稳定性。在小规模和大规模表达构建中，都应使用显微镜监测细胞的活力和污染。
大规模转运蛋白纯化优化
大规模蛋白质纯化的每个步骤都应通过SDS-PAGE进行评估，包括凝胶内荧光以特异性监测GFP标记的蛋白质和酶去除该标签。在实践中，GFP标记的表达SLC的细胞呈黄绿色。双链球菌标签色谱洗脱后，含有纯化蛋白的洗脱液在白光下呈荧光霓虹绿色。在尺寸排阻色谱过程中，化学和结构均一的蛋白质应产生单个单分散A280峰（图2F，G），并且应在SDS-PAGE上显示单个条带。应使用胰蛋白酶消化质谱分析与预期 SLC 相对应的 SDS-PAGE 条带以及任何意外条带。SDS-PAGE凝胶上的多个条带表明蛋白水解降解、污染蛋白质或SDS抗性低聚物。可以通过增加增溶缓冲液的 NaCl 浓度或改变亲和标签来去除污染蛋白。可以通过提高蛋白质的纯度来限制蛋白水解，确保所有步骤都在4°C或冰上完成，并优化方案以最大限度地减少每个步骤的时间。如果SEC图谱具有宽峰、多个峰或较大的空隙峰（如图2F的紫色迹线），则应使用FSEC、SEC-Ts或DSF 41、42、59、60、61、62在小范围内优化构建和纯化条件。
图1：用于SLC表达和纯化的RESOLUTE工作流程示意图。 重组克隆、BacMam 杆状病毒制备、蛋白表达和纯化以及下游应用的分步说明。缩写：SLC = 溶质载体;冷冻电镜 = 冷冻电子显微镜;SEC = 尺寸排阻色谱。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 2：SLC 表达和纯化的代表性结果 。 （A） 将高通量 SLC 克隆到 pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW 中的集落 PCR。（B） 24 种不同全长 SLC 的单个小规模平行表达测试的 Coomassie 染色 SDS-PAGE。 （C） 主要定位于质膜的 GFP 标记 SLC 的细胞内荧光。（D） 具有显着细胞内定位的 GFP 标记 SLC 的细胞内荧光。（E） 在亲水性、中性二氧化硅基UHPLC色谱柱上分离的四个SLC的代表性FSEC迹线。在 （F） 葡聚糖-琼脂糖或 （G） 琼脂糖尺寸排阻色谱柱上纯化的 6 种 SLC 的代表性 SEC 迹线。SLC复合物和用于纯化的去污剂的分子量在已通过实验确定的低聚物状态中标明。缩写：SLC = 溶质载体;GFP = 绿色荧光蛋白;FSEC = 荧光检测尺寸排阻色谱。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：纯化 SLC 的下游应用 。 （A） SLC1A1 在洗涤剂中的显微照片。（B） 洗涤剂中 SLC1A1 的 2D 类平均值。（C） 与各种浓度的牛磺酸胆酸 3-硫酸盐孵育的SLC10A6的 CPM 热变性测定的原始荧光。（D） SLC10A6 CPM热变性的一阶导数。在120μM牛磺胆酸3-硫酸盐存在下，SLC10A6的熔解温度升高了10 °C。缩写：SLC = 溶质载体;CPM = N-[4-（7-二乙氨基-4-甲基-3-香豆酰基）苯基]马来酰亚胺。 请点击这里查看此图的较大版本.
| 向量名称 | 抗生素标志物 | 净化标签 | 筛选引物 | PCR期间添加的bp | ||
| pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW | 放大器R | C 端子 | PHTBV-F （CTATAGACTCTATAGGCACACC） | ~350 | ||
| 3C蛋白酶位点GFP | ||||||
| 双链球菌 | GFP-R （CTGTCGTACAGATGAACTTCTCAAGGTC） | |||||
| 他的10 | ||||||
| pDONR221型 | 菅直人 | 没有 | M13 前锋 | ~190 | ||
| M13 反转 | ||||||
表1：用于RESOLUTE克隆和BacMam生成的质粒。
| 溶液 | 组成 |
| DH10Bac选择板 | 含有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素、7μg/mL 庆大霉素、40 μg/mL IPTG 和 100 μg/mL bluo-gal 的 LB-琼脂平板 |
| 2x LB培养基（含抗生素） | 含有 50 μg/mL 卡那霉素、10 μg/mL 四环素和 7 μg/mL 庆大霉素的 2x LB 肉汤 |
| HT裂解缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,250 mM NaCl，5%甘油，不含EDTA的蛋白酶抑制剂 |
| HT 洗涤缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,250 mM NaCl，5% 甘油，0.03% DDM/0.003% CHS |
| HT 洗脱缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,250 mM NaCl，5% 甘油，0.03% DDM/0.003% CHS，100 mM D-生物素 |
| 基础缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,150 mM NaCl |
| 洗涤剂储备溶液 | 10% （w/v） 洗涤剂，酌情含或不含 1% CHS。在4°C混合过夜，并在-20°C下储存。 |
| 链球菌洗涤缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,150 mM NaCl，3 倍 CMC 去污剂，10 mM MgCl2,1 mM ATP |
| 链球菌洗脱缓冲液 | 50 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,150 mM NaCl，100 mM D-生物素，3 倍 CMC 的去垢剂 |
| 尺寸排阻色谱 （SEC） 缓冲液 | 20 mM HEPES-NaOH，pH 7.5,150 mM NaCl，2 倍 CMC 的去污剂。通过0.22μM膜过滤。 |
| 丁酸钠 | DPBS中的1M溶液，储存在-20°C下以供长期使用。 |
表2：该协议中使用的溶液列表及其组成。
| 洗涤剂系统 | 萃取浓度 | 纯化浓度 （% w/v） |
| DDM内存 | 1% | 0.03% |
| DDM + CHS | 1% + 0.1% | 0.03% + 0.003% |
| 分米 | 1% | 0.25% |
| DM+CHS的 | 1% + 0.1% | 0.25% + 0.025% |
| 议员 | 1% | 0.60% |
| OG公司 | 1.5% | 1.50% |
| LDAO公司 | 1% | 0.07% |
| LDAO + CHS | 1% + 0.1% | 0.07% + 0.007% |
| 分子式：C12E8 | 1% | 0.015% |
| 分子式：C12E8 + CHS | 1% + 0.1% | 0.015% + 0.0015% |
| 分子式：C12E9 + CHS | 1% + 0.1% | 0.01 + 0.001% |
| CYMAL-5型 | 1% | 0.40% |
| LMNG型 | 1% | 0.005% |
| LMNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.005% + 0.0005% |
| GDN公司 | 1% | 0.02% |
| 洋地黄皂苷 | 0.05% | |
| OGNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.18% + 0.018% |
| C12E10 + 热电偶 | 1% + 0.1% | 0.04% + 0.004% |
| Fos 胆碱-12 | 1% | 0.14% |
表 3：用于测试膜溶解和 SLC 单分散性和稳定性的标准去污剂。
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Discussion
由于缺乏对转运蛋白功能的系统表征，SLC靶向疗法的开发仍然受到阻碍。这导致相对于 GPCR 和离子通道63 靶向该蛋白质类别的药物不成比例地减少，尽管它们在正常和病理生理过程中具有许多作用。RESOLUTE是一个国际联盟，旨在开发尖端的研究技术和工具，以加速和改进当前的SLC研究。作为RESOLUTE的一部分，我们开发了这些方案，用于人类SLC的高效克隆、构建体筛选以及大规模表达和纯化。
在这里，我们描述了可扩展的SLC克隆和表达方法，这些方法成功地用于系统地探索人类SLC转运蛋白，包括推定的和孤立的SLC。 值得注意的是，以这种方式纯化的SLC已成功用于转运蛋白结构，生物化学，功能，结合剂生成和小分子结合的后续研究。我们经常采用这种方法来纯化毫克量的各种SLC，在最佳条件下，整个方案，包括克隆和组织培养步骤，可以在4-5周内完成。
我们的方法针对经济性和并行性进行了优化，可以系统地评估多个目标。然而，这种高通量方法也很容易适应通过使用不同的克隆引物或载体来并行生成具有各种截断或标签的单个靶标的构建体。这类似于针对靶标64 优化多个构建体的方法，尽管我们的方案通过平行克隆、杆状病毒生成和表达测试提供了进一步的效率。转染通过放弃杆状病毒第65 代，缩短了构建体克隆和表达之间的时间，但对于大规模表达来说，成本和费力要大得多。相比之下，稳定细胞系对于大规模表达66 来说可能更便宜，但生成高表达克隆细胞系可能需要更多的时间和专业资源。最后，虽然该方案使用人类细胞系进行蛋白质生产，但昆虫细胞系（例如来自草地贪夜蛾和Trichoplusia ni）的细胞系也已成功用于大规模SLC表达5,31,64。在人细胞系中的表达会增加培养基成本，但提供更多的天然样翻译后修饰和脂质环境39,67。
虽然该方案可以适应不同的膜转运蛋白和实验需求，但有几个因素会影响纯化蛋白质样品的质量和产量。虽然研究全长蛋白质是理想的选择，但可能需要一定程度的序列截断才能获得更好的表达、纯化和重构产量。所有RESOLUTE SLC构建体均标有可裂解GFP，在监测SLC表达、细胞定位和纯化方面很有价值。这些实验中使用的悬浮适应 HEK293 细胞表达系统带来了更高的产量，因此值得推荐，尽管我们通常也通过悬浮适应的 HEK293 GnTl- 细胞系生产没有复杂糖基化的蛋白质。转导细胞表达蛋白质的孵育温度和长度应针对每个靶标进行优化，尽管我们发现在30°C下72小时是一个很好的默认值。
所有蛋白质纯化步骤应在冰上或4°C下进行，一旦纯化的蛋白质被快速冷冻，应避免冻融循环。膜增溶和纯化缓冲液中使用的去污剂的类型和用量至关重要，应根据经验确定每个SLC。
用这种方法纯化的SLCs可产生均质且结构和功能完整的样品，可用于各种生化和生物物理研究。通过阴性染色和冷冻电镜观察溶解和纯化的SLC蛋白的单个离散颗粒（图3A，B）有望用于后续结构测定37。洗涤剂中纯化的SLC可用于生物物理测定，如热稳定性测定（图3C，D），以研究蛋白质与小分子（如底物、抑制剂或脂质）的相互作用59,62。最后，在生化测定中使用该方案纯化的SLC可以重组为脂质体或纳米盘，用于功能测定68，并用于抗体和纳米抗体的产生和选择69,70。虽然使这些方法适应发现新的SLC靶向小分子所需的通量仍然是一个挑战1，但在体外高通量筛选技术领域已经取得了有希望的进展71,72,73,74。
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Disclosures
提交人声明没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
这项工作是在RESOLUTE项目中完成的。RESOLUTE已根据第777372号赠款协议从创新药物倡议2联合承诺中获得资金。这项联合承诺得到了欧盟地平线2020研究和创新计划以及EFPIA的支持。本文仅反映作者的观点，IMI 、欧盟和 EFPIA 均不对其中所含信息的任何使用负责。pHTBV质粒由Frederick Boyce教授（哈佛大学）友情提供。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3C protease | Produced in-house | ||
| 50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
| Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
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