Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Высокопроизводительная экспрессия и очистка носителей растворенных веществ человека для структурных и биохимических исследований

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Структурные и биохимические исследования мембранных транспортеров человека требуют миллиграммовых количеств стабильного, интактного и однородного белка. В этой статье мы опишем масштабируемые методы скрининга, экспрессии и очистки переносчиков растворенных веществ человека с использованием генов, оптимизированных для кодонов.

Abstract

Носители растворенных веществ (SLC) — это мембранные транспортеры, которые импортируют и экспортируют ряд эндогенных и экзогенных субстратов, включая ионы, питательные вещества, метаболиты, нейротрансмиттеры и фармацевтические препараты. Несмотря на то, что они стали привлекательными терапевтическими мишенями и маркерами заболеваний, эта группа белков все еще относительно недооценена современными фармацевтическими препаратами. Проекты по разработке лекарств для этих переносчиков затруднены из-за ограниченных структурных, функциональных и физиологических знаний, в конечном счете, из-за трудностей в экспрессии и очистке этого класса белков, встроенных в мембраны. В этой статье мы демонстрируем методы получения высокочистых, миллиграммовых количеств белков-переносчиков SLC человека с использованием кодон-оптимизированных последовательностей генов. В сочетании с систематическим изучением конструкционного дизайна и высокопроизводительной экспрессии, эти протоколы обеспечивают сохранение структурной целостности и биохимической активности белков-мишеней. Мы также выделяем важнейшие этапы экспрессии эукариотических клеток, аффинной очистки и хроматографии с исключением размера этих белков. В конечном счете, этот рабочий процесс позволяет получить чистые, функционально активные и стабильные белковые препараты, пригодные для определения структуры с высоким разрешением, исследований переноса, анализа вовлечения малых молекул и высокопроизводительного скрининга in vitro .

Introduction

Мембранные белки уже давно являются мишенью как для исследователей, так и для фармацевтической промышленности. Из них растворенные носители (SLC) представляют собой семейство из более чем 400 вторичных генов-переносчиков, закодированных в геноме человека1. Эти переносчики участвуют в импорте и экспорте многочисленных молекул, включая ионы2, нейротрансмиттеры3, липиды 4,5,6,7, аминокислоты8, питательные вещества 9,10,11 и фармацевтические препараты 12. При такой широте субстратов эти белки также вовлечены в целый ряд патофизиологий через транспорт токсинов13, транспорт и ингибирование наркотиками 14,15 или вредные мутации16. Бактериальные гомологи послужили прототипами фундаментального транспортного механизма нескольких семейств SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. В отличие от белков человека, прокариотические ортологи часто лучше экспрессируются в хорошо изученной системе экспрессии Escherichia coli 26,27 и более стабильны в более мелких детергентах, которые дают хорошо упорядоченные кристаллы для рентгеновской кристаллографии28. Однако последовательности и функциональные различия затрудняют использование этих отдаленно родственных белков для разработки лекарств29,30. Следовательно, для расшифровки механизма действия препаратов, нацеленных на SLC 31,32,33,34,35, часто требуется непосредственное изучение белка человека. Несмотря на то, что недавние достижения в области криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ) позволили охарактеризовать структурные СЛК в условиях, приближенных к нативным36,37, трудности с экспрессией и очисткой этих белков остаются проблемой для разработки таргетной терапии и диагностики.

Чтобы решить эту проблему, консорциум RESOLUTE (re-solute.eu) разработал ресурсы и протоколы для крупномасштабной экспрессии и очистки белков семейства SLCчеловека 38. Начав с кодон-оптимизированных генов, мы разработали методы высокопроизводительного клонирования и скрининга SLC-конструкций. Эти методы систематически применялись ко всему семейству SLC, гены клонировались в систему вирусной экспрессии BacMam, а экспрессия белка тестировалась на клеточных линиях человека39 на основе ранее описанных методов высокопроизводительного клонирования и тестирования экспрессии40. Таким образом, ген SLC клонируется из плазмиды pDONR221 в вектор pHTBV1.1. Эта конструкция впоследствии используется для транспонирования интересующего гена в бакмидный вектор для трансфекции клеток насекомых, который включает промотор цитомегаловируса и элементы энхансера для экспрессии в клетках млекопитающих. Полученный бакуловирус может быть использован для трансдукции клеток млекопитающих для экспрессии белка-мишени SLC.

Кроме того, мы разработали стандартизированные методы для крупномасштабной экспрессии и стабильной очистки выбранных SLC (рис. 1). Этот протокол включает в себя несколько контрольных точек, что облегчает эффективное устранение неполадок и сводит к минимуму вариативность между экспериментами. В частности, рутинный мониторинг экспрессии и локализации белков, а также мелкомасштабная оптимизация условий очистки для отдельных мишеней были поддержаны метками стрептококка и зеленого флуоресцентного белка (GFP)41,42.

В конечном счете, эти химически чистые и структурно однородные образцы белков могут быть использованы для структурного определения с помощью рентгеновской кристаллографии или криоэлектронной микроскопии (Крио-ЭМ), биохимических анализов взаимодействия с мишенями, иммунизации для генерации связующего и внеклеточных функциональных исследований путем восстановления в химически определенные липосомы.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Все кодон-оптимизированные гены RESOLUTE SLC были депонированы в AddGene43, ссылки на который доступны в списке общедоступных реагентов RESOLUTE44. Эти гены были клонированы в плазмиду pDONR221 и позволяют напрямую клонировать гены в целевой вектор с помощью рекомбинационного клонирования45. Чтобы максимизировать параллелизм, бактериальные клетки, клетки насекомых и млекопитающих выращивают в блочном формате для производства бакмидов (раздел 3), амплификации бакуловируса (раздел 5) и тестирования экспрессии (раздел 6) соответственно. Для этих этапов требуется встряхиватель с микроэкспрессией, чтобы обеспечить достаточное перемешивание и аэрацию.

1. (Высокопроизводительное) клонирование SLC в бакмид pHTBV1.1

ПРИМЕЧАНИЕ: На этапе клонирования используется протокол рекомбинационного клонирования для эффективного клонирования и трансформации в Escherichia coli (E. coli) с использованием метода теплового шока46. Протокол предназначен для высокопроизводительного и параллельного клонирования нескольких целей или конструкций, но может быть легко адаптирован к меньшим масштабам.

  1. В 96-луночный планшет добавьте 150 нг клона pDONR221 SLC и 100 нг вектора pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Доведите объем реакции до 8 мкл с 10 мМ Tris pH 8,0, а затем добавьте 2 мкл смеси рекомбинационных ферментов.
  2. Инкубируют при комнатной температуре в течение 1 ч, добавляют 1 мкл протеиназы К и инкубируют в течение 30 мин при 37 °C.
  3. Используют 4 мкл реакционной смеси для трансформации 50 мкл химически компетентных клеток E. coli MACH-1 с использованием метода теплового шока46 и среды SOC для восстановления. Наносят на LB-агар, содержащий 5% сахарозы, или SOC-агар, дополненный ампициллином в дозе 100 мкг/мл.
  4. Идентификация колоний, содержащих вектор pHTBV1.1 со вставкой гена SLC , с использованием соответствующих праймеров (см. таблицу 1) и стандартных протоколов для ПЦР47 колоний.
  5. Очистите рекомбинантную плазмиду от единичных колоний с интересующим геном с помощью набора для минипреп плазмид.

2. Транспонирование

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используются для транспонирования генов SLC из вектора pHTBV1.1 в бакмид для генерации бакуловируса BacMam в клетках Sf9. С помощью метода теплового шока46 вектор pHTBV1.1 трансформируют в DH10Bac-компетентные клетки E. coli , которые содержат родительский бакмид со слиянием lacZ-mini-attTn7. Транспозиция происходит между элементами вектора pHTBV1.1 и родительским бакмидом в присутствии транспозиционных белков, обеспечиваемых вспомогательной плазмидой48. Состав растворов, используемых в данном протоколе, приведен в таблице 2 .

  1. Используя 3 мкл очищенной векторной ДНК pHTBV1.1 в концентрации 100-200 нг/мкл, трансформируют DH10Bac методом теплового шока в 96-луночном ПЦР-планшете. Восстановите клетки, инкубируя их в восстановительной среде в течение 4-5 ч при 37 °C при встряхивании при 700 об/мин в шейкере с микроэкспрессией.
  2. Распределите 50 мкл трансформированных клеток на селекционных планшетах DH10Bac. Выдерживают при температуре 37 °C в течение 48 ч, накрыв фольгой.
  3. Выберите одну белую колонию (содержащую рекомбинантную ДНК) и протрите до разбавления. Выдерживают при температуре 37 °C в течение ночи.

3. Высокопроизводительное производство бакмида

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол описывает этапы экстракции бакмидов с помощью набора для очистки бакмидов на 96 лунок.

  1. Отдельные белые колонии (изолированные от полосатых до разбавляемых планшетов) высевают в лунки 96-луночного блока, содержащие 1 мл среды 2x LB (табл. 2).
  2. Накройте пористым уплотнением и инкубируйте при 37 °C в течение ночи при 700 об/мин в шейкере с микроэкспрессией.
  3. Приготовьте запас глицерина для клеток, смешав 120 мкл культуры с 30 мкл 60% глицерина в микротитровой пробирке, и храните при -80 °C.
  4. Центрифугируйте блок глубоких лунок при давлении 2 600 × г в течение 30 мин. Сцедите надосадочную жидкость в подходящую емкость для обеззараживания. Переверните блок и осторожно постучите по бумажному полотенце. Добавьте 250 мкл раствора 1 в каждую лунку блока с помощью многоканальной пипетки.
  5. Ресуспендируйте гранулы; При необходимости используйте многоканальную пипетку.
  6. Добавьте 250 мкл раствора 2 в каждую лунку и загерметизируйте силиконовым ковриком. Осторожно переверните 5 раз и выдержите при комнатной температуре 10 мин. Крутите очень недолго.
  7. Добавьте 300 мкл раствора 3 и запечатайте силиконовым ковриком. Осторожно, но тщательно перемешайте, перевернув 5 раз.
  8. Поместите образец на лед на 20 мин, затем центрифугируйте при 2 600 × г в течение 30 мин при 4 °C.
  9. Перенесите прозрачную надосадочную жидкость в свежий 96-луночный блок. Снова центрифугу при 2 600 × г в течение 30 мин при 4 °C.
  10. В свежем блоке глубиной 96 лунок дозируйте 0,8 мл 100% изопропанола на лунку. Добавьте 0,8 мл надосадочной жидкости из соответствующих лунок.
  11. Осторожно покрутите пипеткой вверх и вниз с помощью пипетки, затем инкубируйте на льду в течение 30 минут или в течение ночи при температуре 4 °C, чтобы получить больше бакмида.
  12. Центрифуга при 2 600 × г в течение 30 мин при 4 °C.
  13. Внутри шкафа биологической безопасности опрыскайте внешнюю часть блока 70% этанолом, откройте блок и выбросьте надосадочную жидкость.
  14. Добавьте 500 мкл 70% этанола (v/v) в каждую лунку и осторожно постучите по блоку, чтобы промыть гранулу. Накройте клейкой пластиковой пломбой и центрифугируйте при 2 600 × г в течение 30 мин при 4 °C.
  15. Внутри шкафа биологической безопасности откройте блок и выбросьте надосадочную жидкость. Очень осторожно постучите блоком по бумажному полотенце, чтобы удалить этанол. Дайте блоку высохнуть в вытяжке в течение 1-2 часов или в духовке при температуре 50 °C.
  16. Добавьте 50 мкл стерильного TE-буфера для ресуспендирования бакмидной ДНК и запечатайте с помощью клейкой пластиковой пломбы. Перенесите содержимое на микротитровую пластину с V-образным дном. Бакмидную ДНК хранят при температуре 4 °C до завершения тестовой очистки, а затем хранят при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несмотря на то, что это не является обычным измерением, обычно можно ожидать выхода от 500 до 2000 нг/мкл бакмидной ДНК.
  17. Используйте стандартные методы ПЦР колоний47 и следующие векторные праймеры для скрининга бакмидов, успешно включающих целевой ген:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    ПРИМЕЧАНИЕ: Ампликон будет примерно на 700 п.н. больше, чем ген-мишень.

4. Трансфекция

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти этапы используются для трансфекции клеток насекомых Sf9 продуцируемым бакмидом, который заставляет клетки насекомых генерировать частицы бакуловируса (P0).

  1. Выращивание клеток Sf9 в среде насекомых без сыворотки до плотности 2,0-2,4 ×10,6 клеток/мл. Разбавляют клетки до 2 × 105 клеток/мл в безсывороточной среде для насекомых и дозируют 1 мл разбавленных клеток в 24-луночный планшет для культуры тканей. Включите реагент только для трансфекции , а также контрольную группу, содержащую только клетки . Инкубируйте планшет в увлажненном инкубаторе при температуре 27 °C в течение 1 ч, чтобы обеспечить прикрепление клеток.
  2. Смешайте 38 мкл на лунку безсывороточной среды для насекомых с 2 мкл реагента для трансфекции. Дозируйте 40 мкл смеси в стерильную микропланшет с плоским дном на 96 лунок. Добавьте 2 мкл рекомбинантной бакмидной ДНК в концентрации 0,5-2,0 мкг/мкл, накройте планшет и инкубируйте в шкафу микробиологической безопасности в течение 15 минут.
  3. Добавьте 160 мкл безсывороточной среды от насекомых в каждую лунку микротитровой пластины, содержащую смесь реагентов для ДНК-трансфекции.
  4. Отсасывайте среду из клеток на шаге 4.1. Осторожно добавьте 200 мкл смеси реагента и среды бакмид-трансфекции на клетки, накройте планшет и инкубируйте в течение 4 ч во влажном инкубаторе при 27 °C.
  5. Добавьте в каждую лунку 400 мкл безсывороточной среды для насекомых с добавлением 2% FBS. Чтобы уменьшить испарение, переложите тарелку в чистый полиэтиленовый пакет, но не закрывайте его. Инкубируют планшет при 27 °C в течение 72 ч в увлажненном инкубаторе.
  6. Через 3 дня переложите среду из планшета в стерильный блок глубиной 96 лунок и центрифугируйте при 1 500 × г в течение 20 мин при комнатной температуре. Переложите осветленную надосадочную жидкость, содержащую бакуловирус P0, в стерильный блок глубиной 96 лунок и храните при температуре 4 °C вдали от света.

5. Амплификация бакуловируса BacMam

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги используются для амплификации исходного бакуловируса P0 до вирусных запасов с более высоким титром; а именно P1, P2 и P3. Окончательный титр P3 подходит для трансдукции и экспрессии белка. Для эффективности и параллелизма этот протокол использует фиксированные объемные соотношения для вирусной амплификации, которые были эмпирически оптимизированы. Однако, если впоследствии трансдуцированные клетки не показывают флуоресценции GFP и увеличения диаметра клеток с помощью микроскопии, или если экспрессия белка не достигается (см. разделы 6 и 8), амплификация бакуловируса должна быть повторно оптимизирована для низкой множественности инфекции на каждом этапе после количественного определения титра бакуловируса 49,50,51,52 и инфекции, контролируемой с помощью флуоресцентной микроскопии GFP и увеличения диаметра клеток 53.

  1. Подготавливают запас вируса Р1, выращивая клетки Sf9 в среде насекомых без сыворотки крови до плотности 2 × 106 клеток/мл, добавляют 2% FBS и засеивают клетки в блок из 24 глубоких лунок в конечном объеме 3 мл на лунку. Добавьте в клетки 120 мкл вируса P0.
  2. Инкубируйте блок при 27 °C при встряхивании при 450 об/мин в шейкере с микроэкспрессией в течение 66-72 ч. Центрифугируйте блок при 1 500 × г в течение 20 минут при комнатной температуре и собирайте надосадочную жидкость в блоки глубиной 96 лунок. Хранить в качестве запаса вируса P1 при 4 °C вдали от света.
  3. Подготавливают запас вируса Р2 путем инфицирования 50 мл клеток Sf9 (плотность клеток 2 ×10 6 клеток/мл), выращенных в безсывороточной среде насекомых с добавлением 2% FBS, с 250 мкл запаса вируса Р1. Инкубируют клетки при температуре 27 °C при встряхивании при 110 об/мин.
  4. Запас вируса Р2 собирают через 66-72 ч центрифугированием при 1 500 × г в течение 20 мин и хранят при 4 °C вдали от света.
  5. Подготавливают запас вируса P3, инфицируя желаемый объем клеток Sf9 (плотность клеток 2 ×10 6 клеток/мл) вирусным запасом P2 в соотношении 1:200 (v/v). Инкубируют клетки при температуре 27 °C при встряхивании при 110 об/мин.
  6. Через 66-72 ч центрифугу при 1500 × г в течение 20 мин собирают вирус Р3, собирая надосадочную жидкость, и хранят при 4 °C в защищенном от света месте.

6. Трансдукция для тестирования экспрессии

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описывается мелкомасштабное тестирование выражений, которое может быть модифицировано для параллельного тестирования нескольких конструкций с использованием блоков глубоких скважин.

  1. Приготовьте 20%-ный (массовый) раствор полиэтиленгликоля, растворив 200 г ПЭГ 10 000 и 12 г NaCl в 600 мл дважды дистиллированного H2O. Перемешайте и доведите до конечного объема 1 000 мл. Автоклавируйте раствор.
  2. Добавьте 300 мкл собранного вируса P1 в лунки блока из 24 глубоких лунок и 75 мкл раствора ПЭГ в каждую лунку. Инкубируйте блок в шейкере для микроэкспрессии при температуре 18 °C при встряхивании при 300 об/мин в течение 5 минут и храните блок при температуре 4 °C в течение ночи.
  3. Снова встряхните блок при 300 об/мин в течение 30 минут при 18 °C и центрифугируйте блок при 3 000 × г в течение 45 минут. Выбросьте надосадочную жидкость с помощью пипетки в шкафу микробиологической безопасности.
  4. Приготовьте адаптированные к суспензии клетки HEK293 в среде HEK293 до плотности 2 × 106 клеток/мл и высевайте по 3 мл в каждую лунку, содержащую вирусную гранулу, добавив 5 мМ бутирата натрия.
  5. Выдерживают блок при 30 °C с 8%СО2 при встряхивании при 200-250 об/мин в течение 72 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуемые производителем концентрацииСО2 во время культивирования клеток различаются для адаптированных к суспензии и исходных клеточных линий HEK293 и составляют 8% и 5% соответственно.
  6. Собирают клетки центрифугированием при 900 × г в течение 20 мин и промывают каждую лунку 1 мл PBS.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Аспирируйте 10 мкл ресуспендированных клеток и просматривайте клетки под флуоресцентным микроскопом с GFP-совместимым фильтрующим кубом для оценки экспрессии и локализации белка. Аспирируют 10-15 мкл ресуспендированных клеток и запускают цельноклеточный гель SDS-PAGE для обнаружения флуоресценции GFP в геле54.
  7. Снова центрифугируйте при 900 × г в течение 20 мин. Заморозьте гранулы при температуре -80 °C.

7. Высокопроизводительная мелкомасштабная тестовая очистка

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги описывают рабочий процесс быстрой очистки теста в формате 24-луночного блока для скрининга уровней экспрессии отдельных SLC. Состав растворов, используемых в данном протоколе, приведен в таблице 2 .

  1. Добавьте 1 мл буфера для лизиса HT в каждую лунку собранных клеток и приступайте к ультразвуковому воздействию на льду в течение общей продолжительности 4 мин (циклический цикл через 3 с включения/15 с выключением) в 24-луночных блоках с использованием зонда с 24 головками.
  2. Перелейте содержимое в блок глубиной 96 лунок, добавьте 125 мкл моющего средства и загерметизируйте силиконовым уплотнением. Осторожно вращайте блок при температуре 4 °C в течение 1 часа. В качестве альтернативы добавьте додецилмальтозид (ДДМ) и гемисукцинат холестерина (CHS) непосредственно в 24-луночные блоки и поместите их на встряхиватель при температуре 4 °C.
  3. Центрифугируют блок при 2600 × г в течение 20 мин при 4 °C и переносят надосадочную жидкость в новый блок глубиной 96 лунок.
  4. Приготовьте 50%-ный запас высокоемкой стрептококково-тактиновой смолы, предварительно уравновешенной лизисным буфером.
  5. Добавьте 100 мкл повторно взвешенной смолы в каждую лунку.
  6. Накройте блок силиконовым уплотнением и вращайте при 4 °C в течение 2 ч, а затем очень коротко центрифугируйте (до 200 × г), чтобы удалить жидкость, прилипающую к крышке.
  7. Поместите 96-луночную фильтрующую пластину поверх пустого блока и перенесите смесь смолы и надосадочной жидкости в фильтрующую пластину. Промойте лунки блока глубоких скважин 800 мкл промывочного буфера HT и перенесите в блок фильтров для сбора максимального количества смолы.
  8. Дайте буферу просочиться или ненадолго центрифугируйте при 200 × г и соберите поток. Поместите фильтрующую пластину поверх нового промывочного блока и промойте смолу 800 мкл промывочного буфера HT, позволяя буферу стекать (или ненадолго центрифугировать). Повторите этап промывки еще дважды и центрифугируйте блок при 500 × г в течение 3 минут, чтобы удалить остаточный буфер промывки HT.
  9. Поместите фильтрующую пластину поверх 96-луночной микротитровой пластины. Добавьте 50 мкл элюирующего буфера HT и инкубируйте при встряхивании при комнатной температуре в течение 10 мин. Элюируют образцы центрифугированием при 500 × г в течение 3 мин.
  10. Намочите 15 мкл элюированного образца на геле SDS-PAGE, окрашенном по методу Кумасси, чтобы проверить экспрессию белка. Загрузите оставшиеся образцы элюента в систему эксклюзионной хроматографии (SEC) или флуоресцентной эксклюзионной хроматографии (FSEC) для оценки монодисперсности белка в DDM/CHS.

8. Трансдукция для крупномасштабной экспрессии

ПРИМЕЧАНИЕ: Следующие шаги являются стандартным протоколом RESOLUTE для выражения SLC. Индивидуальные мишени потребуют дальнейшей оптимизации времени сцеживания, температуры инкубации и концентрации бутирата натрия. Кроме того, мы регулярно оптимизируем множественность инфекции бакуловируса, тестируя различные объемные соотношения вируса P3, используемого для заражения адаптированных к суспензии клеток HEK293 в небольших экспериментах. Это позволяет экономить время, использовать уже имеющиеся методы и оборудование, а также непосредственно оценивать желаемые экспериментальные результаты. Однако этот эмпирический метод требует повторной оптимизации с каждой амплификацией вируса Р3, и существуют другие методы количественной оценки частиц бакуловируса 49,50,51,52.

  1. Масштабирование необходимого объема адаптированных к суспензии ячеек HEK293 в среде HEK293.
  2. Разбавляют адаптированные к суспензии клетки HEK293 до 1 × 106 клеток/мл и выращивают в течение 24 ч (при 170 об/мин для роликовых бутылок объемом 2 л и 105 об/мин для бутылок с роликами объемом 3 л).
  3. Добавьте 30 мл вируса Р3 на литр клеток и добавьте 5 мМ бутирата натрия. Инкубируют клетки при 37 °C в течение 48 ч или при 30 °C в течение 72 ч.
  4. Во время и после инкубационного периода ключевым этапом является исследование клеток с помощью светлопольной микроскопии для проверки микробного загрязнения и жизнеспособности клеток. Оцените экспрессию и локализацию белка с помощью флуоресцентной микроскопии с GFP-совместимым фильтрующим кубом.
  5. Собирают клетки центрифугированием при 900 × г в течение 20 мин.
  6. Промывают клеточную гранулу, суспендировав ее в 10-15 мл PBS на литр клеточной культуры, и снова гранулируют при 900 × г в течение 20 мин.
  7. Мгновенно замораживайте гранулы клеток в жидком азоте и храните их при температуре -80 °C.

9. Очистка белка

ПРИМЕЧАНИЕ: Ниже приведен стандартный метод RESOLUTE для очистки SLC для 5 л клеточной культуры. Для каждой цели SLC необходимо эмпирически определить оптимальное моющее средство. Заранее подготовьте базовый буфер, исходный раствор моющего средства, буферы для промывки, элюирования и SEC (Таблица 2). Список протестированных стандартных моющих средств приведен в таблице 3. АТФ и MgCl2в промывочном буфере уменьшают загрязнение белками теплового шока.

  1. День 1
    1. Разморозьте замороженные клеточные гранулы на водяной бане, установленной до комнатной температуры.
    2. Приготовьте буфер для солюбилизации со 135 мл базового буфера и тремя таблетками коктейля ингибитора протеазы. Дайте таблеткам раствориться.
    3. Ресуспендируйте размороженную гранулу с помощью буфера для солюбилизации. Используйте 27 мл растворизационного буфера на 10-15 г клеточной гранулы, добавьте ДНКазу и перелейте в ледяной гомогенизатор Dounce. Гомогенизируйте раствор, перемещая поршень вверх и вниз примерно 20 раз, удерживая гомогенизатор на льду.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем ресуспензии должен быть оптимизирован в зависимости от целевого белка и массы клеточных гранул, которые будут варьироваться в зависимости от плотности клеток при сборе. Коммерческую ДНКазу можно добавлять в соответствии с инструкциями производителя. ДНКаза также может быть экспрессирована и очищена на месте с использованием установленных протоколов55.
    4. Добавьте исходный раствор моющего средства до 1% конечной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым шагом к оптимизации очистки белка является определение оптимального детергента для солюбилизации и очистки SLC, которое должно быть определено опытным путем. Мы регулярно используем различные моющие средства; каждый по отдельности и в сочетании с холестерилгемиссукцинатом, сохраняя массовое соотношение детергента и CHS на уровне 10:1.
    5. Перелейте растворизационную смесь в конические пробирки объемом 50 мл. Медленно вращайте в течение 1 ч при температуре 4 °C.
    6. Центрифугируют раствор при 50 000 × г в течение 30 мин при 4 °C. Соберите надосадочную жидкость.
    7. Уравновешивают 4-6 мл слоя стрептококково-тактиновой смолы с базовым буфером.
    8. Добавьте уравновешенную смолу в растворимую надосадочную жидкость и вращайте в течение 2 ч при 4 °C.
    9. Вылейте раствор в самотечную колонну и дайте раствору стечь.
    10. Промойте смолу в 30 раз большим объемом слоя буфера для промывки стрептококка в 3 равных по объему приема.
    11. Добавьте 3-5 мл элюирующего буфера, инкубируйте в течение 15 минут и соберите элюат. Повторите этот шаг еще четыре раза, собирая каждую фракцию элюирования отдельно.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевым этапом является элюирование белка из смолы Strep-Tactin, где важно инкубировать в течение 15 минут после каждого добавления элюирующего буфера. Как правило, первая фракция элюата содержит меньшую концентрацию белка из-за разбавления элюирующего буфера остаточным буфером промывки. Таким образом, первая фракция элюата может быть отброшена, если требуется более высокая конечная концентрация белка. Кроме того, концентрация белка во всех последовательных элюциях также может быть проанализирована с помощью SDS-PAGE для оптимизации протокола.
    12. Измерьте концентрацию белка с помощью УФ-спектроскопии поглощения, объедините желаемые фракции элюирования и добавьте 3С-протеазу в соотношении 1:5 (по массе) до 1:10 (по массе).
    13. Медленно вращайте в течение ночи при температуре 4 °C.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Шаги 9.1.12 и 9.1.13 необходимы только в том случае, если тег GFP нуждается в удалении. Если удаление тега не требуется, перейдите непосредственно к шагу 9.2.4. Кроме того, белок можно держать при температуре 4 °C в течение ночи, чтобы продолжить прием на следующий день. Кроме того, для SLC с пониженной стабильностью может потребоваться оптимизация концентрации протеазы, инкубационного периода и температуры. Протеаза 3C активна в широком диапазоне температур и позволяет оптимизировать ее для различных SLC.
  2. День 2
    1. Уравновешивают 2-4 мл объема слоя аффинной смолы металла кобальта с буфером SEC.
    2. Добавьте в реакционную смесь при температуре 3C уравновешенную металлическую смолу кобальта и вращайте в течение 1 ч при 4 °C.
    3. Залейте раствор в самотечную колонну и соберите проточный.
    4. Концентрируйте проточный фильтр в центробежном фильтре с отсечкой 100 кДа, вращая его при 3 000 × g при 4 °C, и осторожно перемешивайте пробу каждые 5 мин до достижения желаемого объема впрыска SEC.
    5. Уравновешивание колонки эксклюзионной хроматографии на основе декстран-агарозы с помощью буфера SEC. Процедуру SEC следует проводить при 4 °C (охлаждаемая камера или холодильная камера).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Ключевой этап: В зависимости от олигомерного состояния SLC, для выполнения SEC может использоваться другая колонка, например, колонка эксклюзионной хроматографии на основе агарозы.
    6. Введите пробу в пробоотборный контур и запустите программу SEC с таким расходом, чтобы давление в колонне было ниже спецификаций производителя колонны. Используя сборщик фракций, автоматически собирайте фракции объемом 0,3 мл в течение всего цикла SEC.
    7. Объединяют пиковые фракции, измеряют поглощение УФ-излучения и концентрируют в центробежном концентраторе с отсечкой 100 кДа до требуемого объема/концентрации путем отжима при 3 000 × g при 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Гены SLC могут быть клонированы из плазмид RESOLUTE pDONR в векторы BacMam для экспрессии млекопитающих
Описанные протоколы клонирования, экспрессии и очистки оказались успешными для многих переносчиков SLC в нескольких белковых складках. Тем не менее, процедуры включают в себя несколько контрольных точек для мониторинга прогресса, что позволяет оптимизировать их для учета различий в экспрессии, сворачивании белков, стабильности, зависящей от липидов и детергентов, а также чувствительности к буферным условиям.

Контрольные точки при клонировании SLC и мелкомасштабном выражении
На этапах клонирования следует использовать электрофорез в агарозном геле, чтобы обеспечить правильный размер продуктов ПЦР и пищеварения. Аналогичным образом, реакции шлюза и транспозиции могут быть подтверждены с помощью ПЦР-реакции колонии (рис. 2A, B). Генерация бакуловируса может быть проконтролирована с помощью стандартных методов по мере необходимости 49,50,51,52. Первоначальное сцеживание следует проводить в небольшом масштабе, оценивая выход белка с помощью SDS-PAGE (рис. 2B). Аналогичным образом, с помощью флуоресцентной микроскопии следует отмечать долю зеленых флуоресцентных клеток, общую экспрессию белка и локализацию белка (рис. 2C, D). Экспрессия белка должна быть оптимизирована в зависимости от типа клетки, температуры, времени и необходимости совместной экспрессии шаперонов или сложных партнеров. Выражение может быть дополнительно оптимизировано путем модификации конструкции для усечения неупорядоченных N- и C-концов на основе предсказания вторичной структуры56,57,58 и тестирования типов и размещения тегов сходства. Стабильность белка должна быть оценена в небольшом масштабе с помощью FSEC (рис. 2E), анализа теплового сдвига на основе SEC (SEC-TS) и DSF41,42,59,60,61,62. Малые молекулы, такие как субстраты и ингибиторы, детергенты, гемисукцинат холестерина, липиды и pH, должны быть протестированы для улучшения стабильности белка с учетом функции белка и нативной субклеточной среды, а также последующей модификации буферов очистки. Как в малых, так и в больших масштабах экспрессии клетки должны контролироваться с помощью микроскопии на предмет жизнеспособности и контаминации.

Оптимизация очистки транспортера в больших масштабах
Каждый этап крупномасштабной очистки белка должен быть оценен с помощью SDS-PAGE, включая флуоресценцию в геле для специфического мониторинга белка, меченного GFP, и ферментативное удаление этой метки. На практике помеченные GFP SLC-экспрессирующие клетки выглядят желтовато-зелеными. После хроматографического элюирования с помощью двойной стрептококковой метки элюент, содержащий очищенный белок, выглядит флуоресцентным неоново-зеленым в белом свете. Химически и структурно однородный белок должен давать один монодисперсный пик A280 во время эксклюзионной хроматографии (рис. 2F, G) и должен иметь одну полосу на SDS-PAGE. Полоса SDS-PAGE, соответствующая ожидаемому SLC, и любые неожиданные полосы должны быть проанализированы с помощью масс-спектрометрии триптического разложения. Множественные полосы на геле SDS-PAGE указывают либо на протеолитическую деградацию, либо на загрязняющие белки, либо на SDS-резистентные олигомеры. Загрязняющие белки могут быть удалены путем увеличения концентрации NaCl буфера солюбилизации или изменения аффинной метки. Протеолиз можно ограничить, улучшив чистоту белка, обеспечив, чтобы все этапы выполнялись при 4 °C или на льду, и оптимизировав протокол для минимизации времени каждого этапа. Если профиль SEC имеет широкий пик, несколько пиков или большой пустотный пик (например, фиолетовый след на рисунке 2F), конструкт и условия очистки должны быть оптимизированы в небольшом масштабе с использованием FSEC, SEC-Ts или DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
Рисунок 1: Схема рабочего процесса RESOLUTE для экспрессии и очистки SLC. Пошаговая иллюстрация рекомбинационного клонирования, подготовки бакуловируса BacMam, экспрессии и очистки белков, а также последующих применений. Сокращения: SLC = носитель растворенного вещества; Крио-ЭМ = криоэлектронная микроскопия; SEC = эксклюзионная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Репрезентативные результаты экспрессии и очистки SLC. (A) ПЦР колонии высокопроизводительного клонирования SLC в pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) SDS-PAGE, окрашенный по Кумасси, одиночный мелкомасштабный параллельный тест экспрессии 24 различных полноразмерных SLC. (C) Внутриклеточная флуоресценция СЗК, помеченной GFP, локализующейся в основном на плазматической мембране. (D) Внутриклеточная флуоресценция GFP-меченого SLC со значительной внутриклеточной локализацией. (E) Репрезентативные трассы FSEC для четырех SLC, разрешенные на гидрофильной колонке UHPLC на основе нейтрального диоксида кремния. Репрезентативные следы SEC для шести SLC, очищенных на дисквалификационных хроматографических колонках размера (F) декстрана или (G) агарозы. Молекулярные массы комплекса SLC и детергента, используемого для очистки, указаны там, где экспериментально определено олигомерное состояние. Сокращения: SLC = носитель растворенного вещества; GFP = зеленый флуоресцентный белок; FSEC = флуоресцентная эксклюзионная хроматография. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Последующее применение очищенных SLC . (A) Микрофотография SLC1A1 в моющем средстве. (B) Среднее значение SLC1A1 в моющем средстве по классу 2D. (C) Сырая флуоресценция термического денатурационного анализа CPM SLC10A6, инкубированных с различными концентрациями 3-сульфата тауролитохолевой кислоты. (D) Первая производная термической денатурации CPM SLC10A6. Температура плавления SLC10A6 увеличилась на 10 °C в присутствии 120 мкМ 3-сульфата тауролитохолевой кислоты. Сокращения: SLC = носитель растворенного вещества; CPM = N-[4-(7-диэтиламино-4-метил-3-кумаринил)фенил]малеимид. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Имя вектора Маркеры антибиотиков Метки для очищения Трафарирующие грунтовки ад добавлено во время ПЦР
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW УсилительR С-терминал pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
Сайт протеазы 3C GFP
Твин-стрептококк GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Его10
pDONR221 Кан Р никакой M13 Передний ход ~190
M13 задний ход

Таблица 1: Плазмиды, используемые для клонирования RESOLUTE и генерации BacMam.

Решение Состав
Селекционные пластины DH10Bac LB-агаровые пластины, содержащие 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина, 7 мкг/мл гентамицина, 40 мкг/мл IPTG и 100 мкг/мл блуо-гал
2x LB medium (с антибиотиками) 2x LB бульон, содержащий 50 мкг/мл канамицина, 10 мкг/мл тетрациклина и 7 мкг/мл гентамицина
Буфер для лизиса HT 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 мМ NaCl, 5% глицерин, ингибитор протеазы без ЭДТА
Буфер промывки HT 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 мМ NaCl, 5% глицерина, 0,03% DDM/0,003% CHS
Элюирующий буфер HT 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 мМ NaCl, 5% глицерина, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 мМ D-биотина
Базовый буфер 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 мМ NaCl
Складской раствор моющего средства 10% (с массой) моющим средством, с 1% CHS или без него, в зависимости от ситуации. Перемешайте при 4 °C в течение ночи и храните при -20 °C.
Буфер для стрептококковой промывки 50 мМ HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 мМ NaCl, моющее средство при 3-кратном КМЦ, 10 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ
Буфер для удаления стрептококка 50 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 150 мМ NaCl, 100 мМ D-биотина, моющее средство при 3-кратном КМЦ
Размерный буфер для эксклюзионной хроматографии (SEC) 20 мМ HEPES-NaOH, рН 7,5, 150 мМ NaCl, моющее средство при 2-кратном КМЦ. Фильтр через мембрану 0,22 мкМ.
Бутират натрия 1 М раствор в DPBS, хранить при -20 °C для длительного использования.

Таблица 2: Перечень решений, используемых в данном протоколе, и их состав.

Система моющих средств Экстракционная концентрация Концентрация очистки (% по массе)
ДДМ 1% 0.03%
ДДМ + СНС 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
ДМ 1% 0.25%
ДМ+СНС 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
НГ 1% 0.60%
ОГ 1.5% 1.50%
ЛДАО 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
С12Э8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
С12Э9 + СНС 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
ЦИМАЛ-5 1% 0.40%
ЛМНГ 1% 0.005%
ЛМНГ + СНС 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
КМС 1% 0.02%
Дигитонин 0.05%
ОГНГ + СНС 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
К12Э10 + ЧС 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Фос Холин-12 1% 0.14%

Таблица 3: Стандартные моющие средства, используемые для тестирования солюбилизации мембран и монодисперсности и стабильности SLC.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Разработка SLC-таргетной терапии по-прежнему затруднена из-за отсутствия систематической характеристики функции транспортера. Это привело к непропорционально меньшему количеству препаратов, нацеленных на этот класс белков по сравнению с GPCR и ионными каналами63, несмотря на их многочисленные роли в нормальных и патофизиологических процессах. RESOLUTE – это международный консорциум, целью которого является разработка передовых исследовательских методов и инструментов для ускорения и улучшения текущих исследований SLC. В рамках RESOLUTE мы разработали эти протоколы для эффективного клонирования, скрининга конструкций, а также крупномасштабной экспрессии и очистки SLC человека.

В этой статье мы описываем масштабируемые методы клонирования и экспрессии SLC, которые были успешно использованы для систематического изучения переносчиков SLC человека, включая предполагаемые и орфанные SLC. Примечательно, что очищенные таким образом SLC были успешно использованы в последующих исследованиях структуры транспортера, биохимии, функции, генерации связующего и связывания малых молекул. Мы регулярно используем этот метод для очистки миллиграммовых количеств различных SLC, и при оптимальных условиях весь протокол, включая этапы клонирования и культивирования тканей, может быть завершен за 4-5 недель.

Наш метод оптимизирован для экономии и параллелизма для систематической оценки нескольких целей. Тем не менее, этот высокопроизводительный метод также легко адаптируется к параллельной генерации конструкций для одной цели с различными усечениями или тегами с использованием различных праймеров или векторов клонирования. Это похоже на методы, которые также оптимизируют несколько конструкций для target64, хотя наш протокол предлагает дополнительную эффективность за счет параллельного клонирования, генерации бакуловируса и тестирования экспрессии. Трансфекция обеспечивает более короткое время между клонированием конструкции и экспрессией за счет отказа от бакуловируса65-го поколения, но значительно дороже и трудоемка для крупномасштабной экспрессии. Напротив, стабильные клеточные линии, вероятно, дешевле для крупномасштабной экспрессии66, но создание клональных клеточных линий с высокой экспрессией может потребовать больше времени и специализированных ресурсов. Наконец, в то время как этот протокол использует человеческие клеточные линии для производства белка, линии клеток насекомых, такие как Spodoptera frugiperda и Trichoplusia ni, также успешно используются для крупномасштабной экспрессии SLC5,31,64. Экспрессия в клеточных линиях человека увеличивает затраты на носители, но обеспечивает более естественные модификации после трансляции и липидную среду39,67.

Несмотря на то, что протокол может быть адаптирован для различных мембранных транспортеров и экспериментальных нужд, на качество и выход очищенных белковых образцов влияют несколько факторов. Несмотря на то, что он идеально подходит для изучения полноразмерных белков, для достижения лучшей экспрессии, очистки и восстановления может потребоваться некоторая степень усечения последовательности. Все конструкции RESOLUTE SLC помечены расщепляемым GFP, что полезно для мониторинга экспрессии SLC, локализации и очистки клеток. Адаптированная к суспензии система клеточной экспрессии HEK293, используемая в этих экспериментах, привела к превосходным выходам и рекомендуется, хотя мы обычно также производим белки без сложного гликозилирования с помощью адаптированной к суспензии клеточной линии HEK293 GnTl-. Температура инкубации и продолжительность экспрессии белка трансдуцированными клетками должны быть оптимизированы для каждой мишени, хотя мы обнаружили, что 72 ч при 30 °C являются хорошим значением по умолчанию.

Все этапы очистки белка следует проводить на льду или при температуре 4 °C, а после того, как очищенный белок был заморожен, следует избегать циклов замораживания-оттаивания. Тип и количество моющих средств, используемых в буферах для солюбилизации и очистки мембран, имеют решающее значение и должны быть определены для каждого SLC опытным путем.

Очищенные этим методом СЛК дают однородные и структурно и функционально неповрежденные образцы, которые могут быть использованы для различных биохимических и биофизических исследований. Наблюдение одиночных, дискретных частиц солюбилизированного и очищенного белка SLC с помощью отрицательного окрашивания и крио-ЭМ (рис. 3A, B) может быть перспективным для последующего определения структуры37. Очищенный SLC в моющем средстве может быть использован для биофизических анализов, таких как анализ термической стабильности (рис. 3C, D), для исследования взаимодействия белков с малыми молекулами, такими как субстраты, ингибиторы или липиды59,62. Наконец, SLC, очищенные с использованием этого протокола в биохимических анализах, могут быть восстановлены в липосомы или нанодиски для функциональных анализов68 и использованы для генерации и отбора антител и нанотел69,70. Несмотря на то, что адаптация этих методов к производительности, необходимой для открытия новых малых молекул, нацеленных на SLC, остается сложной задачей, многообещающие успехи были достигнуты в области высокопроизводительных технологий скрининга in vitro 71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих финансовых интересов.

Acknowledgments

Эта работа была выполнена в рамках проекта RESOLUTE. Компания RESOLUTE получила финансирование от Совместного предприятия «Инициатива по инновационным лекарственным средствам 2» в рамках грантового соглашения No 777372. Это совместное предприятие получает поддержку от программы исследований и инноваций Европейского Союза «Горизонт 2020» и EFPIA. Эта статья отражает только точку зрения авторов, и ни ИМИ, ни Европейский Союз, ни EFPIA не несут ответственности за любое использование содержащейся в ней информации. Плазмида pHTBV была любезно предоставлена профессором Фредериком Бойсом (Frederick Boyce) из Гарварда.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Высокопроизводительная экспрессия Очистка Носители растворенных веществ человека Структурные исследования Биохимические исследования Мембранные транспортеры Эндогенные субстраты Экзогенные субстраты Терапевтические мишени Маркеры заболеваний Фармацевтика Проекты по разработке лекарств Ограниченные структурные знания Ограниченные функциональные знания Ограниченные физиологические знания Трудности экспрессии и очистки Миллиграммовые количества Кодон-оптимизированные последовательности генов Конструкционный дизайн Высокопроизводительная экспрессия Сохранение структурной целостности сохранение биохимической активности экспрессия эукариотических клеток аффинная очистка эксклюзионная хроматография определение структуры с высоким разрешением транспортные исследования, Анализ вовлечения малых молекул высокопроизводительный скрининг in vitro
Высокопроизводительная экспрессия и очистка носителей растворенных веществ человека для структурных и биохимических исследований
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter