Summary
Estudos estruturais e bioquímicos de transportadores de membrana humana requerem quantidades de miligramas de proteína estável, intacta e homogênea. Aqui descrevemos métodos escaláveis para selecionar, expressar e purificar transportadores de solutos humanos usando genes otimizados para códons.
Abstract
Transportadores de solutos (SLCs) são transportadores de membrana que importam e exportam uma gama de substratos endógenos e exógenos, incluindo íons, nutrientes, metabólitos, neurotransmissores e produtos farmacêuticos. Apesar de ter emergido como alvos terapêuticos atraentes e marcadores de doença, esse grupo de proteínas ainda é relativamente subdrogado pelos fármacos atuais. Projetos de descoberta de fármacos para esses transportadores são impedidos por limitados conhecimentos estruturais, funcionais e fisiológicos, em última análise, devido às dificuldades na expressão e purificação dessa classe de proteínas embutidas em membrana. Aqui, demonstramos métodos para obter quantidades de miligramas de alta pureza de proteínas transportadoras de SLC humanas usando sequências gênicas otimizadas para códons. Em conjunto com uma exploração sistemática do projeto de construção e expressão de alto rendimento, esses protocolos garantem a preservação da integridade estrutural e da atividade bioquímica das proteínas-alvo. Também destacamos etapas críticas na expressão de células eucarióticas, purificação de afinidade e cromatografia de exclusão de tamanho dessas proteínas. Em última análise, esse fluxo de trabalho produz preparações proteicas puras, funcionalmente ativas e estáveis adequadas para determinação de estrutura de alta resolução, estudos de transporte, ensaios de engajamento de moléculas pequenas e triagem in vitro de alto rendimento.
Introduction
As proteínas de membrana têm sido alvos de pesquisadores e indústrias farmacêuticas. Destes, os portadores de solutos (SLCs) são uma família de mais de 400 genes transportadores secundários codificados dentro do genoma humano1. Esses transportadores estão envolvidos na importação e exportação de inúmeras moléculas, incluindo íons2, neurotransmissores3, lipídios 4,5,6,7,aminoácidos8, nutrientes 9,10,11 e fármacos 12. Com tamanha amplitude de substratos, essas proteínas também estão implicadas em uma série de fisiopatologias através do transporte de toxinas13, transporte e inibição por drogas de abuso 14,15 ou mutações deletérias16. Homólogos bacterianos têm servido como protótipos para o mecanismo de transporte fundamental de várias famílias de SLC17,18,19,20,21,22,23,24,25. Em contraste com as proteínas humanas, os ortólogos procarióticos são frequentemente melhor expressos no bem compreendido sistema de expressão de Escherichia coli 26,27 e são mais estáveis nos detergentes menores, que produzem cristais bem ordenados para cristalografia de raios X 28. Entretanto, diferenças de sequência e funcionais dificultam o uso dessas proteínas distantes para a descoberta de fármacos29,30. Consequentemente, o estudo direto da proteína humana é frequentemente necessário para decifrar o mecanismo de ação de drogas direcionadas àsSLCs 31,32,33,34,35. Embora os recentes avanços na Microscopia Crioeletrônica (Cryo-EM) tenham permitido a caracterização estrutural de SLCs em condições mais nativas36,37, a dificuldade em expressar e purificar essas proteínas continua sendo um desafio para o desenvolvimento de terapêuticas e diagnósticos direcionados.
Para amenizar esse desafio, o consórcio RESOLUTE (re-solute.eu) desenvolveu recursos e protocolos para a expressão e purificação em larga escala de proteínas humanas da família SLC38. Começando com genes otimizados para códons, desenvolvemos métodos para clonagem de alto rendimento e triagem de construções SLC. Esses métodos foram sistematicamente aplicados a toda a família de SLCs, os genes foram clonados no sistema de expressão viral BacMam e a expressão da proteína foi testada em linhagens celulares humanas39 com base em métodos previamente descritos para clonagem de alto rendimento e testes de expressão40. Em resumo, o gene SLC é clonado do plasmídeo pDONR221 em um vetor pHTBV1.1. Este construto é posteriormente usado para transpor o gene de interesse para um vetor bacmid para transfecção de células de insetos, que inclui um promotor de citomegalovírus e elementos potencializadores para expressão em células de mamíferos. O baculovírus resultante pode ser usado para transduzir células de mamíferos para a expressão da proteína alvo SLC.
Desenvolvemos ainda métodos padronizados para expressão em larga escala e purificação estável de SLCs selecionadas (Figura 1). Esse protocolo inclui vários pontos de verificação para facilitar a solução de problemas eficaz e minimizar a variabilidade entre os experimentos. Notavelmente, o monitoramento rotineiro da expressão e localização de proteínas, bem como a otimização em pequena escala das condições de purificação para alvos individuais, foram auxiliados por etiquetas Strep e Green Fluorescent Protein (GFP)41,42.
Em última análise, essas amostras de proteínas quimicamente puras e estruturalmente homogêneas podem ser usadas para determinação estrutural por cristalografia de raios X ou microscopia crioeletrônica (Cryo-EM), ensaios bioquímicos de engajamento de alvos, imunização para geração de ligantes e estudos funcionais livres de células via reconstituição em lipossomas quimicamente definidos.
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Protocol
NOTA: Todos os genes RESOLUTE SLC otimizados para códons foram depositados no AddGene43, cujos links estão disponíveis na lista de reagentes públicos RESOLUTE44. Esses genes foram clonados no plasmídeo pDONR221 e permitem a clonagem direta dos genes no vetor de destino usando clonagem de recombinação45. Para maximizar o paralelismo, células bacterianas, de insetos e de mamíferos são cultivadas em formato de bloco para produção de bacmid (seção 3), amplificação de baculovírus (seção 5) e teste de expressão (seção 6), respectivamente. Para estas etapas, é necessário um agitador de microexpressão para garantir mistura e aeração suficientes.
1. Clonagem (de alto rendimento) de SLCs em pHTBV1.1 bacmid
NOTA: A etapa de clonagem utiliza um protocolo de clonagem de recombinação para clonagem e transformação eficientes em Escherichia coli (E. coli) usando o método de choque térmico46. O protocolo é projetado para clonagem paralela e de alto rendimento de vários alvos ou construções, mas pode ser prontamente adaptado a escalas menores.
- Em uma placa de 96 poços, adicione 150 ng do clone pDONR221 SLC e 100 ng do vetor pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. Levar o volume de reação para 8 μL com 10 mM Tris pH 8,0 e, em seguida, adicionar 2 μL da mistura enzimática de recombinação.
- Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, adicionar 1 μL de proteinase K e incubar durante 30 minutos a 37 °C.
- Use 4 μL da mistura de reação para transformar 50 μL de células MACH-1 de E. coli quimicamente competentes usando o método de choque térmico46 e meio SOC para recuperação. Placa em ágar-LB contendo 5% de sacarose, ou ágar SOC, suplementado com 100 μg/mL de ampicilina.
- Identificar colônias que abrigam o vetor pHTBV1.1 com a inserção do gene SLC usando primers apropriados (ver Tabela 1) e protocolos padrão para PCR de colônias47.
- Purificar o plasmídeo recombinante de colônias únicas com o gene de interesse usando um kit de minipreparação de plasmídeos.
2. Transposição
NOTA: As etapas a seguir são usadas para transpor os genes SLC do vetor pHTBV1.1 em um bacmid para a geração de baculovírus BacMam em células Sf9. Usando o método de choque térmico46, o vetor pHTBV1.1 é transformado em células de E. coli competentes DH10Bac, que contêm um bacmid pai com uma fusão lacZ-mini-attTn7. A transposição ocorre entre os elementos do vetor pHTBV1.1 e o bacmid de origem na presença das proteínas de transposição fornecidas por um plasmídeo auxiliar48. Veja a Tabela 2 para a composição das soluções utilizadas neste protocolo.
- Usando 3 μL de 100-200 ng/μL purificado de DNA vetorial pHTBV1.1, transforme DH10Bac usando o método de choque térmico em uma placa de PCR de 96 poços. Recuperar as células incubando-as em meio de recuperação por 4-5 h a 37 °C enquanto agitam a 700 rpm em um agitador de microexpressão.
- Espalhe 50 μL de células transformadas em placas de seleção DH10Bac. Incubar as placas a 37 °C durante 48 h cobertas com papel alumínio.
- Escolha uma única colônia branca (contendo o DNA recombinante) e estrie até a diluição. Incubar a 37 °C durante a noite.
3. Produção de bacmid de alto rendimento
NOTA: O protocolo descreve as etapas para extrair bacmids usando um kit de purificação de bacmid de 96 poços.
- Inocular colônias brancas individuais (isoladas das placas raiadas a diluídas) em poços de um bloco de 96 poços profundos, contendo 1 mL de meio 2x LB (Tabela 2).
- Cobrir com um selo poroso e incubar a 37 °C durante a noite a 700 rpm num agitador de microexpressão.
- Preparar um estoque de glicerol das células misturando 120 μL da cultura com 30 μL de glicerol 60% em uma placa de microtitulação e armazenar a -80 °C.
- Centrifugar o bloco do poço profundo a 2.600 × g por 30 min. Decantar o sobrenadante em um recipiente adequado para descontaminação. Inverta o bloco e bata suavemente em um papel toalha. Adicionar 250 μL da Solução 1 a cada poço do bloco utilizando uma pipeta multicanal.
- Ressuspender os pellets; Se necessário, use uma pipeta multicanal.
- Adicionar 250 μL de Solução 2 a cada poço e selar com uma manta de silicone. Inverter suavemente 5x e incubar à temperatura ambiente durante 10 min. Gire muito brevemente.
- Adicionar 300 μL da Solução 3 e selar com um tapete de silicone. Misture delicadamente, mas completamente, invertendo 5x.
- Colocar a amostra no gelo durante 20 minutos e, em seguida, centrifugar a 2.600 × g durante 30 minutos a 4 °C.
- Transfira o sobrenadante transparente para um bloco fresco de 96 poços. Centrifugar novamente a 2.600 × g por 30 min a 4 °C.
- Em um bloco fresco de 96 poços profundos, dispensar 0,8 mL de isopropanol a 100% por poço. Adicionar 0,8 mL de sobrenadantes dos poços correspondentes.
- Pipetar suavemente para cima e para baixo usando uma pipeta, em seguida, incubar no gelo por 30 min ou durante a noite a 4 °C para produzir mais bacmid.
- Centrifugar a 2.600 × g por 30 min a 4 °C.
- Dentro de um armário de segurança biológica, borrife a parte externa do bloco com etanol 70%, abra o bloco e descarte o sobrenadante.
- Adicione 500 μL de etanol a 70% (v/v) em cada poço e bata suavemente no bloco para lavar o pellet. Cubra com um selo plástico adesivo e centrífuga a 2.600 × g por 30 min a 4 °C.
- Dentro de um Gabinete de Segurança Biológica, abra o bloco e descarte o sobrenadante. Bata o bloco muito suavemente em um papel toalha para remover o etanol. Deixe o bloco secar dentro da coifa por 1-2 h ou em forno a 50 °C.
- Adicionar 50 μL de tampão TE estéril para ressuspender o DNA bacmid e selar usando um selo plástico adesivo. Transfira o conteúdo para uma placa de microtitulação com fundo em V. Conservar o ADN bacmid a 4 °C até que a purificação do ensaio esteja concluída e, em seguida, armazená-lo a -20 °C.
NOTA: Embora não seja medido rotineiramente, geralmente um rendimento de 500 a 2.000 ng/μL de DNA bacmid pode ser esperado. - Use os métodos padrão de PCR de colônias47 e os seguintes primers vetoriais para rastrear bacmidas incorporando com sucesso o gene alvo:
pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
NOTA: O amplicon será aproximadamente 700 pb maior que o gene alvo.
4. Transfecção
NOTA: Estas etapas são usadas para transfectar células de insetos Sf9 com o bacmid produzido, o que faz com que as células do inseto gerem partículas de baculovírus (P0).
- Cultivar células Sf9 em meio de inseto livre de soro a uma densidade de 2,0-2,4 × 106 células/mL. Diluir as células para 2 × 105 células/mL em meio de inseto livre de soro e distribuir 1 mL das células diluídas em um poço de placa de cultura de tecidos de 24 poços. Inclua um controle somente de transfecção de reagentes , bem como um controle somente de células . Incubar a placa numa estufa humidificada a 27 °C durante 1 h para permitir a fixação celular.
- Misturar 38 μL por poço de meio de inseto sem soro com 2 μL por poço do reagente de transfecção. Distribuir 40 μL da mistura em uma placa de microtitulação de fundo plano estéril de 96 poços. Adicionar 2 μL de DNA bacmid recombinante a 0,5-2,0 μg/μL, cobrir a placa e incubar dentro do gabinete de segurança microbiológica por 15 min.
- Adicionar 160 μL de meio de insecto isento de soro em cada poço da placa de microtitulação contendo a mistura de reagentes de transfecção de ADN.
- Aspirar meio das células na etapa 4.1. Adicione suavemente os 200 μL da mistura reagente-meio bacmid-transfecção sobre as células, cubra a placa e incube por 4 h em uma estufa umidificada a 27 °C.
- Adicionar 400 μL de meio de inseto sem soro suplementado com 2% de SFB a cada poço. Para reduzir a evaporação, transfira a placa para um saco plástico limpo, mas não a lacre. Incubar a placa a 27 °C durante 72 h numa estufa humidificada.
- Após 3 dias, transferir o meio da placa para um bloco estéril de 96 poços profundos e centrifugar a 1.500 × g por 20 min à temperatura ambiente. Transfira o sobrenadante clarificado contendo o baculovírus P0 para um bloco estéril de 96 poços profundos e armazene a 4 °C longe da luz.
5. Amplificação do baculovírus BacMam
NOTA: As etapas a seguir são usadas para amplificar o baculovírus P0 inicial para estoques virais de títulos mais altos; a saber, P1, P2 e P3. O título final de P3 é apropriado para transdução e expressão proteica. Para eficiência e paralelismo, este protocolo utiliza razões volumétricas fixas para amplificação viral, que foram empiricamente otimizadas. No entanto, se as células subsequentemente transduzidas não mostrarem fluorescência de GFP e aumento do diâmetro celular por microscopia ou se a expressão de proteínas falhar (ver secções 6 e 8), a amplificação do baculovírus deve ser reotimizada para uma baixa multiplicidade de infeção em cada passo após quantificar o título de baculovírus 49,50,51,52, e a infeção monitorizada por microscopia de fluorescência de GFP e aumento do diâmetro celular 53.
- Preparar o estoque de vírus P1 cultivando células Sf9 em meio de inseto livre de soro a uma densidade de 2 × 106 células/mL, adicionar 2% de FBS e semear as células em um bloco de 24 poços profundos em um volume final de 3 mL por poço. Adicionar 120 μL de estoque de vírus P0 às células.
- Incubar o bloco a 27 °C enquanto agita a 450 rpm num agitador de microexpressão durante 66-72 horas. Centrifugar o bloco a 1.500 × g por 20 min à temperatura ambiente e colher o sobrenadante em blocos de poço de 96 profundidades. Conservar como stock de vírus P1 a 4 °C longe da luz.
- Preparar o estoque de vírus P2 infectando 50 mL de células Sf9 (2 × 106 células/mL de densidade celular), cultivadas em meio de inseto livre de soro suplementado com 2% de FBS, com 250 μL de estoque de vírus P1. Incubar as células a 27 °C com agitação a 110 rpm.
- Colher o estoque de vírus P2 após 66-72 h por centrifugação a 1.500 × g por 20 min e armazenar a 4 °C longe da luz.
- Preparar o estoque de vírus P3 infectando o volume desejado de células Sf9 (2 × 106 células/mL densidade celular) com 1:200 (v/v) estoque viral P2. Incubar as células a 27 °C com agitação a 110 rpm.
- Após 66-72 h, centrifugar a 1.500 × g por 20 min e colher o vírus P3 coletando o sobrenadante e armazenar a 4 °C, protegido da luz.
6. Transdução para teste de expressão
Observação : a seção a seguir descreve o teste de expressão em pequena escala e pode ser modificado para teste paralelo de várias construções usando blocos de poço profundo.
- Preparar uma solução de polietilenoglicol a 20% (p/v) dissolvendo 200 g de PEG 10.000 e 12 g de NaCl em 600 mL de H2O. Mexer e levar a um volume final de 1.000 mL. Autoclave a solução.
- Adicionar 300 μL do vírus P1 colhido nos poços de um bloco de 24 poços profundos e 75 μL da solução de PEG em cada poço. Incubar o bloco num agitador de microexpressão a 18 °C enquanto agita a 300 rpm durante 5 min e armazenar o bloco a 4 °C durante a noite.
- Agitar o bloco novamente a 300 rpm por 30 min a 18 °C e centrifugar o bloco a 3.000 × g por 45 min. Descarte o sobrenadante usando uma pipeta em um armário de segurança microbiológica.
- Preparar células HEK293 adaptadas à suspensão em meio HEK293 a uma densidade de 2 × 106 células/mL e semear 3 mL em cada poço contendo a pastilha do vírus, suplementando com 5 mM de butirato de sódio.
- Incubar o bloco a 30 °C com 8% de CO2 enquanto agita a 200-250 rpm durante 72 horas.
NOTA: As concentrações de CO2 recomendadas pelo fornecedor durante a cultura celular são diferentes para linhagens celulares HEK293 adaptadas à suspensão e ancestrais, em 8% e 5%, respectivamente. - Colher as células por centrifugação a 900 × g por 20 min e lavar cada poço com 1 mL de PBS.
NOTA: Aspirar 10 μL de células ressuspensas e visualizar as células sob um microscópio de fluorescência com um cubo de filtro compatível com GFP para avaliar a expressão e localização de proteínas. Aspirar 10-15 μL de células ressuspensas e executar um gel SDS-PAGE de célula inteira para detecção de fluorescência de GFP em gel54. - Centrifugar novamente a 900 × g por 20 min. Congelar os pellets a -80 °C.
7. Purificação de teste de alto rendimento em pequena escala
Observação : as etapas a seguir descrevem um fluxo de trabalho de purificação de teste rápido em um formato de bloco de 24 poços para triagem dos níveis de expressão de SLCs individuais. Veja a Tabela 2 para a composição das soluções utilizadas neste protocolo.
- Adicionar 1 mL de tampão de lise HT a cada poço de células colhidas e proceder ao sonicate no gelo por um comprimento total de 4 min (ciclagem a 3 s on/15 s off) em blocos de 24 poços usando uma sonda de 24 cabeças.
- Transfira o conteúdo para um bloco de poço de 96 profundidades, adicione 125 μL de caldo detergente e sele com um selo de silicone. Gire o bloco suavemente a 4 °C durante 1 h. Alternativamente, adicione dodecilmaltosídeo (DDM) e hemisuccinato de colesterol (CHS) diretamente aos blocos de 24 poços e coloque-os em um balancim a 4 °C.
- Centrifugar o bloco a 2600 × g durante 20 min a 4 °C e transferir o sobrenadante para um novo bloco de 96 poços profundos.
- Preparar um estoque de 50% de resina Strep-Tactin de alta capacidade pré-equilibrada com tampão de lise.
- Adicionar 100 μL de caldo de resina ressuspendida a cada poço.
- Cubra o bloco com um selo de silicone e gire a 4 °C durante 2 h e, em seguida, centrifugar muito brevemente (até 200 × g) para remover o líquido que adere à tampa.
- Coloque uma placa de filtro de 96 poços em cima de um bloco vazio e transfira a mistura resina/sobrenadante para a placa de filtro. Enxaguar os orifícios do bloco de poço profundo com 800 μL de tampão de lavagem HT e transferir para o bloco filtrante para coletar a quantidade máxima de resina.
- Deixe o tampão escorrer ou centrifugar brevemente a 200 × g e colete o fluxo. Coloque a placa filtrante em cima de um novo bloco de lavagem e lave a resina com 800 μL de tampão de lavagem HT, permitindo que o tampão escorra (ou centrifugue brevemente). Repita o passo de lavagem mais duas vezes e centrifugar o bloco a 500 × g durante 3 minutos para remover o tampão de lavagem HT residual.
- Coloque a placa de filtro em cima de uma placa de microtitulação de 96 poços. Adicionar 50 μL de tampão de eluição HT e incubar agitando à temperatura ambiente durante 10 minutos. Eluir amostras por centrifugação a 500 × g por 3 min.
- Executar 15 μL da amostra eluída em gel SDS-PAGE corado por Coomassie para verificar a expressão proteica. Coloque as amostras restantes de eluente em um sistema de Cromatografia de Exclusão de Tamanho (SEC) ou Cromatografia de Exclusão de Tamanho com Detecção de Fluorescência (FSEC) para avaliar a monodispersidade de proteínas em DDM/CHS.
8. Transdução para expressão em larga escala
Observação : as etapas a seguir são o protocolo RESOLUTE padrão para expressão SLC. Alvos individuais exigirão otimização adicional para o tempo de expressão, temperatura de incubação e concentração de butirato de sódio. Além disso, otimizamos rotineiramente a multiplicidade de baculovírus da infecção testando várias razões volumétricas do vírus P3 usado para infectar as células HEK293 adaptadas à suspensão em experimentos de pequena escala. Este é eficiente em termos de tempo, utiliza técnicas e equipamentos já disponíveis e avalia diretamente o resultado experimental desejado. Entretanto, este método empírico requer reotimização a cada amplificação do vírus P3, e outros métodos estão disponíveis para quantificar as partículas de baculovírus 49,50,51,52.
- Aumente o volume necessário de células HEK293 adaptadas à suspensão em meio HEK293.
- Diluir as células HEK293 adaptadas à suspensão para 1 × 106 células/mL e crescer por 24 h (a 170 rpm para garrafas de rolo de 2 L e 105 rpm para garrafas de rolo de 3 L).
- Adicionar 30 mL de vírus P3 por litro de células e adicionar 5 mM de butirato de sódio. Incubar as células a 37 °C durante 48 h ou a 30 °C durante 72 h.
- Durante e após o período de incubação, um passo chave é examinar as células usando microscopia de campo claro para verificar a contaminação microbiana e a viabilidade celular. Avaliar a expressão e localização de proteínas usando microscopia de fluorescência com um cubo de filtro compatível com GFP.
- Colher as células por centrifugação a 900 × g por 20 min.
- Lavar o pellet de célula ressuspendendo-o em 10-15 mL de PBS por litro de cultura celular e novamente a 900 × g por 20 min.
- Congelar rapidamente os pellets de células em azoto líquido e armazená-los a -80 °C.
9. Purificação de proteínas
NOTA: O seguinte é o método RESOLUTE padrão para purificação SLC para 5 L de cultura celular. Para cada alvo SLC, o detergente ideal deve ser determinado empiricamente. Preparar buffer de base, solução de estoque de detergente, lavagem, eluição e buffers SEC com antecedência (Tabela 2). Para uma lista dos detergentes padrão testados, ver quadro 3. ATP e MgCl2 no tampão de lavagem reduzem a contaminação por proteínas de choque térmico.
- Dia 1
- Descongele o pellet de célula congelada em banho-maria ajustado à temperatura ambiente.
- Preparar tampão de solubilização com 135 mL de tampão base e três comprimidos de Protease Inhibitor Cocktail comprimidos. Deixe os comprimidos dissolverem.
- Ressuspender o pellet descongelado com tampão de solubilização. Use 27 mL de tampão de solubilização por 10-15 g de pellet celular, adicione DNase e despeje em um homogeneizador Dounce gelado. Homogeneizar a solução movendo o êmbolo para cima e para baixo aproximadamente 20x, mantendo o homogeneizador sobre gelo.
NOTA: O volume de ressuspensão precisará ser otimizado com base na proteína alvo e na massa da pelota celular, que variará devido à densidade celular na colheita. DNase comercial pode ser adicionado de acordo com as instruções do fabricante. A DNase também pode ser expressa e purificada internamente usando protocolos estabelecidos55. - Adicionar a solução-mãe de detergente à concentração final a 1%.
NOTA: Um passo fundamental para otimizar a purificação de proteínas é identificar o detergente ideal para solubilização e purificação de SLC, que deve ser identificado empiricamente. Temos utilizado regularmente vários detergentes; cada um isoladamente e em combinação com hemisuccinato de colesteril, mantendo a relação massa/CHS em 10:1. - Transfira a mistura de solubilização para tubos cônicos de 50 mL. Gire lentamente durante 1 h a 4 °C.
- Centrifugar a solução a 50.000 × g durante 30 min a 4 °C. Colete o sobrenadante.
- Equilibrar 4-6 mL de volume leito de resina Strep-Tactin com o tampão base.
- Adicionar resina equilibrada ao sobrenadante solubilizado e rodar durante 2 h a 4 °C.
- Despeje a solução em uma coluna de fluxo por gravidade e deixe a solução fluir.
- Lave a resina com 30x o volume da cama do tampão de lavagem Strep em 3 passos de volume igual.
- Adicionar 3-5 mL de tampão de eluição, incubar por 15 min e coletar o eluato. Repita esta etapa mais quatro vezes, coletando cada fração de eluição separadamente.
NOTA: Uma etapa chave é a eluição de proteínas da resina Strep-Tactina, onde é importante incubar por 15 minutos após cada adição do tampão de eluição. Normalmente, a primeira fração de eluato contém uma menor concentração de proteína devido à diluição do tampão de eluição pelo tampão de lavagem residual. Portanto, a primeira fração de eluato pode ser descartada se uma maior concentração de proteína final for desejada. Alternativamente, a concentração de proteína em todas as eluções seriadas também pode ser analisada usando SDS-PAGE para otimizar o protocolo. - Medir a concentração de proteínas por espectroscopia de absorbância UV, combinar as frações de eluição desejadas e adicionar protease 3C na proporção de 1:5 (p/p) para 1:10 (p/p).
- Gire lentamente durante a noite a 4 °C.
NOTA: As etapas 9.1.12 e 9.1.13 só são necessárias se a tag GFP precisar de remoção. Se a remoção da tag não for necessária, vá para a Etapa 9.2.4 diretamente. Alternativamente, a proteína pode ser mantida a 4 °C durante a noite para continuar no dia seguinte. Além disso, para SLCs com estabilidade diminuída, a concentração de protease, o período de incubação e a temperatura podem necessitar de otimização. A protease 3C é ativa em uma ampla faixa de temperaturas e permite a otimização mais adequada para vários SLCs.
- Dia 2
- Equilibrar 2-4 mL de volume de leito de resina de afinidade por metal cobalto com tampão SEC.
- Adicione a resina de afinidade metálica de cobalto equilibrada à mistura de reação 3C durante a noite e gire por 1 h a 4 °C.
- Despeje a solução em uma coluna de fluxo por gravidade e colete o fluxo.
- Concentrar o fluxo num filtro centrífugo de corte de 100 kDa, girando a 3.000 × g a 4 °C e misturar suavemente a amostra a cada 5 minutos até atingir o volume de injeção SEC desejado.
- Equilibre uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho à base de dextran-agarose usando buffer SEC. O procedimento SEC deve ser realizado a 4 °C (câmara refrigerada ou câmara fria).
NOTA: Etapa chave: Dependendo do estado oligomérico do SLC, uma coluna diferente, como uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho baseada em agarose, pode ser usada para executar SEC. - Injete a amostra no loop de amostra e execute o programa SEC, com uma taxa de fluxo tal que a pressão da coluna esteja abaixo das especificações do fabricante da coluna. Usando um coletor de frações, colete automaticamente frações de 0,3 mL durante toda a execução do SEC.
- Agrupe as frações de pico, meça a absorbância UV e concentre-se em um concentrador centrífugo de corte de 100 kDa até o volume/concentração requerido girando a 3.000 × g a 4 °C.
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Representative Results
Genes SLC podem ser clonados de plasmídeos resolutos pDONR em vetores BacMam para expressão em mamíferos
Os protocolos descritos para clonagem, expressão e purificação provaram ser bem-sucedidos para muitos transportadores SLC em múltiplas dobras proteicas. No entanto, os procedimentos incluem vários pontos de verificação para monitorar o progresso, permitindo a otimização para levar em conta as diferenças na expressão, enovelamento de proteínas, estabilidade dependente de lipídios e detergentes e sensibilidade às condições de tampão.
Pontos de verificação durante a clonagem de SLC e expressão em pequena escala
Nas etapas de clonagem, a eletroforese em gel de agarose deve ser usada para garantir o tamanho correto da PCR e dos produtos de digestão. Da mesma forma, as reações de Gateway e transposição podem ser validadas com uma reação de PCR de colônia (Figura 2A,B). A geração de baculovírus pode ser monitorada por meio de técnicas padronizadas, conforme necessário 49,50,51,52. A expressão inicial deve ser feita em pequena escala, avaliando-se o rendimento proteico por SDS-PAGE (Figura 2B). Da mesma forma, a fração de células fluorescentes verdes, a expressão de proteínas totais e a localização de proteínas devem ser observadas usando microscopia de fluorescência (Figura 2C,D). A expressão de proteínas deve ser otimizada para o tipo celular, temperatura, tempo e necessidade de co-expressar chaperonas ou parceiros complexos. A expressão pode ser ainda mais otimizada modificando o construto para truncar N- e C-termini desordenados, com base na predição de estrutura secundária56,57,58, e testando os tipos e a colocação de tags de afinidade. A estabilidade da proteína deve ser avaliada em pequena escala por FSEC (Figura 2E), ensaio de deslocamento térmico baseado em SEC (SEC-Ts) e DSF 41,42,59,60,61,62. Pequenas moléculas, como substratos e inibidores, detergentes, hemisuccinato de colesterol, lipídios e pH devem ser testadas para melhorar a estabilidade da proteína, considerando a função da proteína e o ambiente subcelular nativo e subsequentes tampões de purificação modificados de acordo. Em ambientes de expressão em pequena e grande escala, as células devem ser monitoradas por microscopia quanto à viabilidade e contaminação.
Otimização da purificação do transportador em larga escala
Cada etapa da purificação da proteína em larga escala deve ser avaliada por SDS-PAGE, incluindo fluorescência em gel para monitorar especificamente a proteína marcada com GFP e remoção enzimática dessa marcação. Na prática, as células que expressam SLC marcadas com GFP aparecem verde-amareladas. Após a eluição cromatográfica Twin-Strep-tag, o eluente contendo a proteína purificada aparece verde-néon fluorescente sob luz branca. A proteína química e estruturalmente homogênea deve produzir um único pico monodisperso A280 durante a cromatografia de exclusão de tamanho (Figura 2F,G), e deve mostrar uma única banda em SDS-PAGE. A banda SDS-PAGE correspondente à SLC esperada, e quaisquer bandas inesperadas, devem ser analisadas por espectrometria de massa de digestão tríptica. Várias bandas no gel SDS-PAGE indicam degradação proteolítica, proteínas contaminantes ou oligômeros resistentes a SDS. As proteínas contaminantes podem ser removidas aumentando a concentração de NaCl do tampão de solubilização ou alterando a etiqueta de afinidade. A proteólise pode ser limitada melhorando a pureza da proteína, garantindo que todas as etapas sejam feitas a 4 °C ou no gelo, e otimizando o protocolo para minimizar o tempo de cada etapa. Se o perfil SEC tiver um pico amplo, vários picos ou um grande pico vazio (como o traço roxo da Figura 2F), as condições de construção e purificação devem ser otimizadas em pequena escala usando FSEC, SEC-Ts ou DSF 41,42,59,60,61,62.
Figura 1: Esquema do fluxo de trabalho RESOLUTE para expressão e purificação de SLC. Ilustração passo a passo da clonagem de recombinação, preparação de baculovírus BacMam, expressão e purificação de proteínas e aplicações a jusante. Abreviações: SLC = portador de soluto; Crio-EM = microscopia crio-eletrônica; SEC = cromatografia de exclusão de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Resultados representativos para expressão e purificação de SLC. (A) PCR de colônia de clonagem de SLC de alto rendimento em pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) SDS-PAGE corado por Coomassie de teste de expressão paralela em pequena escala de 24 SLCs de comprimento total diferentes. (C) Fluorescência intracelular de uma SLC marcada com GFP localizando-se principalmente na membrana plasmática. (D) Fluorescência intracelular de um SLC marcado com GFP com localização intracelular significativa. (E) Traços representativos de FSEC para quatro SLCs resolvidos em uma coluna UHPLC hidrofílica à base de sílica neutra. Traços SEC representativos para seis SLCs purificados em colunas de cromatografia de exclusão de tamanho (F) dextran-agarose ou (G). Os pesos moleculares do complexo SLC e do detergente utilizados para purificação são indicados onde o estado oligomérico foi determinado experimentalmente. Abreviações: SLC = portador de soluto; GFP = proteína fluorescente verde; FSEC = cromatografia de exclusão por tamanho de detecção de fluorescência. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Aplicações a jusante de SLCs purificados. (A) Micrografia de SLC1A1 em detergente. (B) Médias da classe 2D de SLC1A1 em detergente. (C) Fluorescência bruta do ensaio de desnaturação térmica CPM de SLC10A6 incubado com várias concentrações de ácido taurolithocólico 3-sulfato. (D) Primeiro derivado da desnaturação térmica CPM de SLC10A6. A temperatura de fusão do SLC10A6 aumentou em 10 °C na presença de 3-sulfato de ácido taurolitocólico 120 μM. Abreviações: SLC = portador de soluto; CPM = N-[4-(7-dietilamino-4-metil-3-cumarinil)fenil]maleimida. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome do vetor | Marcadores de antibióticos | Tags para Purificação | Cartilhas de Triagem | pb adicionado durante a PCR | ||
| pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW | AmpèreR | C-terminal | pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) | ~350 | ||
| 3C protease sítio GFP | ||||||
| Twin-Strep | GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC) | |||||
| Seus10 | ||||||
| pDONR221 | KanR • | nenhum | M13 para a frente | ~190 | ||
| M13 Reverso | ||||||
Tabela 1: Plasmídeos utilizados para clonagem RESOLUTE e geração de BacMam.
| Solução | Composição |
| Placas de seleção DH10Bac | Placas de ágar-LB contendo 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina, 7 μg/mL de gentamicina, 40 μg/mL de IPTG e 100 μg/mL de bluo-gal |
| 2x LB médio (com antibióticos) | 2x caldo LB contendo 50 μg/mL de canamicina, 10 μg/mL de tetraciclina e 7 μg/mL de gentamicina |
| Buffer de lise HT | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glicerol, inibidor de protease livre de EDTA |
| Buffer de lavagem HT | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glicerol, 0,03% DDM/0,003% CHS |
| Buffer de eluição HT | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glicerol, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 mM D-Biotina |
| Buffer de base | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl |
| Solução-mãe de detergente | Detergente a 10% (p/v), com ou sem CHS a 1%, conforme apropriado. Misture a 4 °C durante a noite e armazene a -20 °C. |
| Buffer de lavagem Strep | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, detergente a 3 vezes CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP |
| Buffer de eluição Strep | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotina, detergente a 3 vezes CMC |
| Buffer de cromatografia de exclusão de tamanho (SEC) | 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, detergente a 2 vezes CMC. Filtrar através de uma membrana de 0,22 μM. |
| Butirato de sódio | Solução de 1 M em DPBS, conservar a -20 °C para utilização a longo prazo. |
Tabela 2: Lista das soluções utilizadas neste protocolo e sua composição.
| Sistema de detergente | Concentração de extração | Concentração de purificação (% p/v) |
| DDM | 1% | 0.03% |
| DDM + CHS | 1% + 0.1% | 0.03% + 0.003% |
| DECÍMETRO | 1% | 0.25% |
| DM+CHS | 1% + 0.1% | 0.25% + 0.025% |
| NG | 1% | 0.60% |
| OG | 1.5% | 1.50% |
| LDAO | 1% | 0.07% |
| LDAO + CHS | 1% + 0.1% | 0.07% + 0.007% |
| C12E8 | 1% | 0.015% |
| C12E8 + CHS | 1% + 0.1% | 0.015% + 0.0015% |
| C12E9 + CHS | 1% + 0.1% | 0.01 + 0.001% |
| CIMAL-5 | 1% | 0.40% |
| GNL | 1% | 0.005% |
| LMNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.005% + 0.0005% |
| GDN | 1% | 0.02% |
| Digitonina | 0.05% | |
| OGNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.18% + 0.018% |
| C12E10 + CHS | 1% + 0.1% | 0.04% + 0.004% |
| Fos colina-12 | 1% | 0.14% |
Tabela 3: Detergentes padrão usados para testar a solubilização da membrana e a monodispersidade e estabilidade da SLC.
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Discussion
O desenvolvimento de terapias direcionadas para SLC tem permanecido dificultado devido à ausência de caracterização sistemática da função do transportador. Isso levou a um número desproporcionalmente menor de drogas direcionadas a essa classe de proteínas em relação aos GPCRs e canais iônicos63, apesar de seus inúmeros papéis em processos normais e fisiopatológicos. RESOLUTE é um consórcio internacional que visa desenvolver técnicas e ferramentas de pesquisa de ponta para acelerar e melhorar a pesquisa atual da SLC. Como parte do RESOLUTE, desenvolvemos esses protocolos para clonagem eficiente, triagem de construção e expressão e purificação em larga escala de SLCs humanos.
Aqui descrevemos métodos escaláveis de clonagem e expressão de SLC que foram usados com sucesso para explorar sistematicamente os transportadores SLC humanos, incluindo SLCs putativas e órfãs. Notavelmente, SLCs purificadas dessa maneira têm sido usadas com sucesso em estudos subsequentes de estrutura de transportadores, bioquímica, função, geração de ligantes e ligação de pequenas moléculas. Empregamos regularmente este método para purificar quantidades de miligramas de várias SLCs e, sob condições ideais, todo o protocolo, incluindo as etapas de clonagem e cultura de tecidos, pode ser concluído em 4-5 semanas.
Nosso método é otimizado para economia e paralelismo para avaliar sistematicamente múltiplos alvos. No entanto, esse método de alto rendimento também é prontamente adaptado à geração paralela de construções para um único destino com vários truncamentos ou tags usando primers ou vetores de clonagem distintos. Isso é semelhante aos métodos que também otimizam várias construções para um alvo64, embora nosso protocolo ofereça mais eficiências com clonagem paralela, geração de baculovírus e testes de expressão. A transfecção oferece um tempo mais curto entre a clonagem do construto e a expressão, renunciando à geração65 do baculovírus, mas é significativamente mais cara e trabalhosa para a expressão em larga escala. Em contraste, linhagens celulares estáveis são provavelmente menos dispendiosas para expressão em larga escala66, mas a geração de linhagens clonais de alta expressão pode exigir mais tempo e recursos especializados. Finalmente, enquanto este protocolo utiliza linhagens celulares humanas para a produção de proteínas, linhagens de células de insetos como Spodoptera frugiperda e Trichoplusia ni também têm sido utilizadas com sucesso para expressão em larga escala de CLS 5,31,64. A expressão em linhagens celulares humanas aumenta os custos dos meios, mas oferece mais modificações pós-tradução nativas e ambiente lipídico39,67.
Embora o protocolo possa ser adaptado para diferentes transportadores de membrana e necessidades experimentais, vários fatores influenciam a qualidade e o rendimento das amostras de proteína purificada. Embora seja ideal estudar proteínas de comprimento total, algum grau de truncamento de sequência pode ser necessário para alcançar melhores rendimentos de expressão, purificação e reconstituição. Todas as construções de SLC RESOLUTE foram marcadas com uma GFP clivável, que é valiosa no monitoramento da expressão de SLC, localização celular e purificação. O sistema de expressão celular HEK293 adaptado à suspensão usado nesses experimentos levou a rendimentos superiores e é recomendado, embora rotineiramente também produzamos proteínas sem glicosilação complexa através da linhagem celular HEK293 GnTl- adaptada à suspensão. A temperatura de incubação e o comprimento para a expressão de proteínas pelas células transduzidas devem ser otimizados para cada alvo, embora tenhamos encontrado 72 h a 30 °C como um bom padrão.
Todas as etapas de purificação de proteínas devem ser realizadas em gelo ou a 4 °C e, uma vez que a proteína purificada tenha sido congelada rapidamente, ciclos de congelamento e descongelamento devem ser evitados. O tipo e a quantidade de detergentes utilizados nos tampões de solubilização e purificação de membranas são críticos e devem ser determinados empiricamente para cada SLC.
As SLCs purificadas com este método produzem amostras homogêneas e estrutural e funcionalmente intactas, que podem ser usadas para uma variedade de estudos bioquímicos e biofísicos. A observação de partículas únicas e discretas da proteína SLC solubilizada e purificada por coloração negativa e crio-EM (Figura 3A,B) pode ser promissora para posterior determinação da estrutura37. A SLC purificada em detergente pode ser utilizada para ensaios biofísicos, como o ensaio de estabilidade térmica (Figura 3C,D), para investigar as interações proteicas com pequenas moléculas, como substratos, inibidores ou lipídios 59,62. Finalmente, as SLCs purificadas usando este protocolo em ensaios bioquímicos podem ser reconstituídas em lipossomas ou nanodiscos para ensaios funcionais68 e usadas para geração e seleção de anticorpos e nanocorpos69,70. Embora continue sendo um desafio adaptar esses métodos ao rendimento necessário para a descoberta de novas moléculas pequenas direcionadas para SLC 1, avanços promissores têm sido feitos no campo das tecnologias de triagem in vitro de alto rendimento71,72,73,74.
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Disclosures
Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.
Acknowledgments
Este trabalho foi realizado dentro do projeto RESOLUTE. A RESOLUTE recebeu financiamento da Empresa Comum Iniciativa para os Medicamentos Inovadores 2 ao abrigo do acordo de subvenção n.º 777372. Esta Empresa Comum recebe apoio do programa de investigação e inovação Horizonte 2020 da União Europeia e da EFPIA. Este artigo reflecte apenas a opinião dos autores e nem o IMI, nem a União Europeia e a EFPIA são responsáveis por qualquer utilização que possa ser feita da informação nele contida. O plasmídeo pHTBV foi gentilmente cedido pelo Prof. Frederick Boyce (Harvard).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3C protease | Produced in-house | ||
| 50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
| Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
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