Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

מחקרים מבניים וביוכימיים של מובילי ממברנות אנושיים דורשים כמויות מיליגרם של חלבון יציב, שלם והומוגני. כאן אנו מתארים שיטות ניתנות להרחבה לסינון, ביטוי וטיהור מובילי מומסים אנושיים באמצעות גנים ממוטבים לקודון.

Abstract

נשאי מומסים (SLC) הם מובילי ממברנות המייבאים ומייצאים מגוון מצעים אנדוגניים ואקסוגניים, כולל יונים, חומרים מזינים, מטבוליטים, מוליכים עצביים ותרופות. למרות שהתגלו כמטרות טיפוליות אטרקטיביות וסמנים של מחלות, קבוצה זו של חלבונים עדיין מסוממת יחסית על ידי התרופות הנוכחיות. פרויקטים של גילוי תרופות עבור טרנספורטרים אלה מעוכבים על ידי ידע מבני, פונקציונלי ופיזיולוגי מוגבל, בסופו של דבר בשל הקשיים בביטוי וטיהור של סוג זה של חלבונים משובצים בקרום. כאן, אנו מדגימים שיטות להשגת כמויות מיליגרם טהורות במיוחד של חלבוני טרנספורטר SLC אנושיים באמצעות רצפי גנים ממוטבים לקודון. בשילוב עם חקירה שיטתית של תכנון מבנים וביטוי תפוקה גבוהה, פרוטוקולים אלה מבטיחים את שימור השלמות המבנית והפעילות הביוכימית של חלבוני המטרה. אנו גם מדגישים שלבים קריטיים בביטוי תאים אאוקריוטיים, טיהור זיקה וכרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל של חלבונים אלה. בסופו של דבר, תהליך עבודה זה מניב תכשירי חלבון טהורים, פעילים פונקציונלית ויציבים המתאימים לקביעת מבנה ברזולוציה גבוהה, מחקרי הובלה, מבחני מעורבות מולקולות קטנות וסינון במבחנה בתפוקה גבוהה.

Introduction

חלבוני ממברנה הם כבר זמן רב מטרות לחוקרים ולתעשיות התרופות כאחד. מתוכם, נשאי המומסים (SLCs) הם משפחה של למעלה מ-400 גנים טרנספורטרים משניים המקודדים בתוך הגנום האנושי1. מובילים אלה מעורבים ביבוא וייצוא של מולקולות רבות, כולל יונים2, מוליכים עצביים3, שומנים 4,5,6,7, חומצות אמינו 8, חומרים מזינים 9,10,11, ותרופות 12. עם רוחב כזה של מצעים, חלבונים אלה מעורבים גם במגוון של פתופיזיולוגיות באמצעות הובלת רעלים13, הובלה ועיכוב על ידי סמים של התעללות 14,15, או מוטציות מזיקות16. הומולוגים חיידקיים שימשו כאבות-טיפוס למנגנון ההובלה הבסיסי של מספר משפחות SLC 17,18,19,20,21,22,23,24,25. בניגוד לחלבונים אנושיים, אורתולוגים פרוקריוטים לרוב באים לידי ביטוי טוב יותר במערכת הביטוי Escherichia coli 26,27 המובנת היטב והם יציבים יותר בדטרגנטים הקטנים יותר המניבים גבישים מסודרים היטב לקריסטלוגרפיה של קרני רנטגן 28. עם זאת, רצף והבדלים פונקציונליים מסבכים את השימוש בחלבונים מרוחקים אלה לגילוי תרופות29,30. כתוצאה מכך, מחקר ישיר של החלבון האנושי נדרש לעתים קרובות כדי לפענח את מנגנון הפעולה של תרופות המכוונות SLCs 31,32,33,34,35. בעוד שההתקדמות האחרונה במיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים (Cryo-EM) אפשרה אפיון מבני של SLCs בתנאים דומים יותר לילידים36,37, קושי לבטא ולטהר חלבונים אלה נותר אתגר לפיתוח טיפולים ואבחון ממוקדים.

כדי להקל על אתגר זה, קונסורציום RESOLUTE (re-solute.eu) פיתח משאבים ופרוטוקולים לביטוי וטיהור בקנה מידה גדול של חלבונים אנושיים ממשפחת SLC38. החל מגנים המותאמים לקודון, פיתחנו שיטות לשיבוט וסינון בעלי תפוקה גבוהה של מבני SLC. שיטות אלה יושמו באופן שיטתי על כל משפחת SLCs, הגנים שובטו למערכת הביטוי הנגיפי BacMam, וביטוי החלבונים נבדק בקווי תאים אנושיים39 בהתבסס על שיטות שתוארו קודם לכן לשיבוט בתפוקה גבוהה ובדיקת ביטוי40. לסיכום, הגן SLC משובט מפלסמיד pDONR221 לווקטור pHTBV1.1. מבנה זה משמש לאחר מכן לטרנספורמציה של הגן המעניין לווקטור bacmid להעברת תאי חרקים, הכולל מקדם ציטומגלווירוס ואלמנטים משפרים לביטוי בתאי יונקים. הבקולווירוס המתקבל יכול לשמש להתמרה של תאי יונקים לביטוי של חלבון SLC המטרה.

בהמשך פיתחנו שיטות סטנדרטיות לביטוי בקנה מידה גדול וטיהור יציב של SLCs נבחרים (איור 1). פרוטוקול זה כולל נקודות ביקורת מרובות כדי להקל על פתרון בעיות יעיל ולמזער את השונות בין ניסויים. יש לציין כי ניטור שגרתי של ביטוי ולוקליזציה של חלבונים, כמו גם אופטימיזציה בקנה מידה קטן של תנאי טיהור עבור מטרות בודדות, נעזרו בתגי Strep וחלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP)41,42.

בסופו של דבר, דגימות חלבון טהורות כימית והומוגניות מבחינה מבנית אלה יכולות לשמש לקביעה מבנית על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או מיקרוסקופ אלקטרונים Cryo-Electron (Cryo-EM), בדיקות ביוכימיות של מעורבות מטרות, חיסון ליצירת קלסרים, ומחקרים פונקציונליים ללא תאים באמצעות בנייה מחדש לליפוזומים מוגדרים כימית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הערה: כל הגנים RESOLUTE SLC הממוטבים לקודון הופקדו ב- AddGene43, שהקישורים אליהם זמינים ברשימת הריאגנטים הציבוריים של RESOLUTE44. גנים אלה שובטו לתוך פלסמיד pDONR221 ומאפשרים שיבוט ישיר של הגנים לווקטור היעד באמצעות שיבוט רקומבינציה45. כדי למקסם את המקביליות, תאים חיידקיים, חרקים ויונקים גדלים בפורמט בלוק לייצור bacmid (סעיף 3), הגברת baculovirus (סעיף 5), ובדיקת ביטוי (סעיף 6), בהתאמה. עבור שלבים אלה, נדרש שייקר מיקרו-ביטוי כדי להבטיח ערבוב ואוורור מספיקים.

1. שיבוט (תפוקה גבוהה) של SLCs לתוך pHTBV1.1 bacmid

הערה: שלב השיבוט משתמש בפרוטוקול שיבוט רקומבינציה לשיבוט יעיל וטרנספורמציה ל-Escherichia coli (E. coli) בשיטת הלם חום46. הפרוטוקול מיועד לשיבוט מקבילי בתפוקה גבוהה של מטרות או מבנים מרובים, אך ניתן להתאים אותו בקלות לקני מידה קטנים יותר.

  1. בצלחת של 96 בארות, הוסף 150 ng של שיבוט pDONR221 SLC ו- 100 ng של וקטור pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. הבא את נפח התגובה ל 8 μL עם 10 mM Tris pH 8.0, ולאחר מכן להוסיף 2 μL של תערובת אנזימי רקומבינציה.
  2. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, להוסיף 1 מיקרוליטר של פרוטאינאז K ולדגור במשך 30 דקות ב-37°C.
  3. השתמש 4 μL של תערובת התגובה כדי להפוך 50 μL של תאי E. coli MACH-1 מוכשרים כימית באמצעות שיטת הלם חום46 ו SOC בינוני להתאוששות. צלחת על LB-אגר המכיל 5% סוכרוז, או אגר SOC, בתוספת 100 מיקרוגרם / מ"ל אמפיצילין.
  4. זהה מושבות המכילות את וקטור pHTBV1.1 עם תוספת הגן SLC באמצעות פריימרים מתאימים (ראה טבלה 1) ופרוטוקולים סטנדרטיים עבור מושבה PCR47.
  5. לטהר את פלסמיד רקומביננטי ממושבות בודדות עם הגן של עניין באמצעות ערכת פלסמיד miniprep.

2. טרנספוזיציה

הערה: השלבים הבאים משמשים לטרנספורמציה של הגנים SLC מווקטור pHTBV1.1 לבקמיד לייצור BacMam baculovirus בתאי Sf9. באמצעות שיטת הלם חום46, וקטור pHTBV1.1 הופך לתאי E. coli מוכשרים DH10Bac, המכילים bacmid הורה עם היתוך lacZ-mini-attTn7. טרנספוזיציה מתרחשת בין האלמנטים של וקטור pHTBV1.1 לבין bacmid האב בנוכחות חלבוני טרנספוזיציה שסופקו על ידי פלסמיד עוזר48. ראה טבלה 2 להרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. באמצעות 3 μL של 100-200 ng/μL מטוהר pHTBV1.1 DNA וקטורי, להפוך DH10Bac באמצעות שיטת הלם חום בלוח PCR 96 באר. לשחזר את התאים על ידי דגירה אותם במדיום התאוששות במשך 4-5 שעות ב 37 ° C תוך רעד ב 700 סל"ד בשייקר מיקרו ביטוי.
  2. פזרו 50 μL של תאים שעברו טרנספורמציה על לוחות בחירה DH10Bac. לדגור את הצלחות ב 37 ° C במשך 48 שעות מכוסה בנייר כסף.
  3. בוחרים מושבה לבנה אחת (המכילה את הדנ"א הרקומביננטי) ומפסים לדילול. לדגור ב 37 °C (77 °F) במשך הלילה.

3. ייצור bacmid בתפוקה גבוהה

הערה: הפרוטוקול מתאר את השלבים לחילוץ bacmids באמצעות ערכת טיהור bacmid 96-well.

  1. חסן מושבות לבנות בודדות (מבודדות מהלוחות המפוספסים לדילול) לבארות של גוש באר בעומק 96, המכיל 1 מ"ל של 2x LB בינוני (טבלה 2).
  2. יש לכסות באטם נקבובי ולדגור ב-37°C למשך הלילה ב-700 סל"ד בשייקר מיקרו-הבעה.
  3. הכן מלאי גליצרול של התאים על ידי ערבוב 120 μL של התרבית עם 30 μL של 60% גליצרול בצלחת microtiter ולאחסן ב -80 ° C.
  4. צנטריפוגה את גוש הבאר העמוק ב 2,600 × גרם למשך 30 דקות. דקרו את הסופרנאטנט למיכל מתאים לטיהור. הפוך את הבלוק והקש בעדינות על מגבת נייר. הוסף 250 μL של תמיסה 1 לכל באר של הבלוק באמצעות פיפטה רב ערוצית.
  5. להשעות מחדש את הכדורים; במידת הצורך, השתמש בפיפט רב ערוצי.
  6. הוסיפו 250 μL של תמיסה 2 לכל באר ואטמו בשטיחון סיליקון. יש להפוך בעדינות פי 5 ולדגור בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ספין בקצרה מאוד.
  7. יש להוסיף 300 μL של תמיסה 3 ולאטום עם משטח סיליקון. מערבבים בעדינות אך ביסודיות על ידי היפוך פי 5.
  8. הניחו את הדגימה על קרח למשך 20 דקות, ולאחר מכן צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,600 × גרם למשך 30 דקות בטמפרטורה של 4°C.
  9. מעבירים את הסופרנאטנט השקוף לבלוק טרי של 96 בארות. צנטריפוגה שוב ב 2,600 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C.
  10. בבלוק באר טרי 96 עמוק, להוציא 0.8 מ"ל של 100% isopropanol לכל באר. הוסף 0.8 מ"ל של supernatants מן הבארות המתאימות.
  11. יש לטפט בעדינות למעלה ולמטה באמצעות פיפטה, ולאחר מכן לדגור על קרח במשך 30 דקות או לילה בטמפרטורה של 4°C כדי להניב יותר בקמיד.
  12. צנטריפוגה ב-2,600 × גרם למשך 30 דקות ב-4°C.
  13. בתוך ארון בטיחות ביולוגי, רססו את החלק החיצוני של הבלוק באתנול 70%, פתחו את הבלוק והשליכו את הסופרנטנט.
  14. הוסף 500 μL של 70% אתנול (v/v) לכל באר והקש על הבלוק בעדינות כדי לשטוף את הכדור. יש לכסות באטם פלסטיק דביק ובצנטריפוגה בטמפרטורה של 2,600 × למשך 30 דקות ב-4°C.
  15. בתוך ארון בטיחות ביולוגי, פתחו את הבלוק והשליכו את הסופרנטנט. הקש על הבלוק בעדינות רבה על מגבת נייר כדי להסיר את האתנול. הניחו לבלוק להתייבש בתוך מכסה המנוע למשך 1-2 שעות או בתנור של 50°C.
  16. הוסף 50 μL של חיץ TE סטרילי כדי להשעות מחדש את ה- DNA bacmid ולאטום באמצעות אטם פלסטיק דביק. מעבירים את התוכן לצלחת מיקרוטיטר בעלת תחתית V. אחסן את ה- DNA bacmid ב -4 ° C עד לטיהור הבדיקה הושלם ולאחר מכן לאחסן אותו ב -20 ° C.
    הערה: אמנם לא נמדד באופן שגרתי, אבל בדרך כלל ניתן לצפות לתפוקה של 500 עד 2,000 ננוגרם/מיקרוליטר דנ"א בקמיד.
  17. השתמש בשיטות PCR סטנדרטיות של מושבה47, ובפריימרים הווקטוריים הבאים כדי לסנן חיידקים המשלבים בהצלחה את גן המטרה:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    הערה: האמפליקון יהיה גדול בכ-700 bp מגן המטרה.

4. טרנספקציה

הערה: שלבים אלה משמשים כדי להדביק תאי חרקים Sf9 עם bacmid המיוצר, אשר גורם לתאי החרק לייצר חלקיקי baculovirus (P0).

  1. לגדל תאי Sf9 בתווך חרקים ללא סרום לצפיפות של 2.0-2.4 × 106 תאים / מ"ל. לדלל את התאים ל 2 × 105 תאים / מ"ל בתווך חרקים ללא סרום ולהוציא 1 מ"ל של התאים המדוללים לתוך צלחת תרבית רקמה 24 באר היטב. כלול מגיב טרנספקציה בלבד וכן פקד תאים בלבד . לדגור את הצלחת באינקובטור לח ב 27 ° C במשך 1 שעה כדי לאפשר חיבור התא.
  2. מערבבים 38 μL לכל באר של מדיום חרקים ללא סרום עם 2 μL לכל באר של מגיב transfection. מוציאים 40 μL מהתערובת לצלחת מיקרוטיטר סטרילית בעלת תחתית שטוחה בעלת 96 בארות. הוסף 2 μL של DNA bacmid רקומביננטי ב 0.5-2.0 מיקרוגרם / μL, לכסות את הצלחת, ולדגור בתוך ארון הבטיחות המיקרוביולוגי במשך 15 דקות.
  3. הוסף 160 μL של מדיום חרקים ללא סרום לכל באר של צלחת microtiter המכילה את תערובת מגיב transfection DNA.
  4. שאפו תווך מהתאים בשלב 4.1. בעדינות, להוסיף את 200 μL של תערובת bacmid-transfection מגיב בינוני על התאים, לכסות את הצלחת, לדגור במשך 4 שעות באינקובטור לח ב 27 ° C.
  5. הוסף 400 μL של מדיום חרקים ללא סרום בתוספת 2% FBS לכל באר. כדי להפחית את האידוי, העבירו את הצלחת לשקית ניילון נקייה אך אל תאטמו אותה. לדגור את הצלחת ב 27 ° C במשך 72 שעות באינקובטור לח.
  6. לאחר 3 ימים, מעבירים את המדיה מהצלחת לבלוק סטרילי בעומק 96 בארות וצנטריפוגה ב 1,500 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. מעבירים את הסופרנאטנט המזוקק המכיל P0 baculovirus לבלוק סטרילי בעומק 96 ומאחסנים בטמפרטורה של 4°C הרחק מהאור.

5. הגברה BacMam baculovirus

הערה: השלבים הבאים משמשים להגברת הבקולווירוס P0 הראשוני למניות נגיפי טיטר גבוהות יותר; כלומר P1, P2 ו-P3. טיטר P3 הסופי מתאים להתמרה ולביטוי חלבונים. עבור יעילות ומקביליות, פרוטוקול זה משתמש ביחסים נפחיים קבועים להגברה ויראלית, אשר עברו אופטימיזציה אמפירית. עם זאת, אם התאים המומרים לאחר מכן אינם מראים פלואורסצנטיות GFP וקוטר תא מוגבר במיקרוסקופיה, או אם ביטוי החלבונים נכשל (ראה סעיפים 6 ו -8), הגברה baculovirus צריך להיות מותאם מחדש עבור ריבוי נמוך של זיהום בכל שלב לאחר כימות titer baculovirus 49,50,51,52, זיהום מנוטר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי GFP וקוטר התא גדל 53.

  1. הכינו את מלאי וירוס P1 על ידי גידול תאי Sf9 בתווך חרקים ללא סרום לצפיפות של 2 × 106 תאים / מ"ל, הוסיפו 2% FBS, וזרעו את התאים בבלוק באר 24 עמוק בנפח סופי של 3 מ"ל לכל באר. הוסף 120 μL של מלאי וירוס P0 לתאים.
  2. יש לדגור על הבלוק בטמפרטורה של 27°C תוך כדי ניעור ב-450 סל"ד בשייקר מיקרו-ביטוי למשך 66-72 שעות. צנטריפוגו את הבלוק במשקל של 1,500 × גרם למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר וקצרו את הסופרנאטנט לבלוקים של 96 בארות עמוקות. יש לאחסן כמלאי וירוס P1 בטמפרטורה של 4°C הרחק מהאור.
  3. הכן מלאי וירוס P2 על ידי הדבקת 50 מ"ל של תאי Sf9 (2 × 106 תאים / צפיפות תאים מ"ל), גדל בתווך חרקים ללא סרום בתוספת 2% FBS, עם 250 μL של מלאי וירוס P1. לדגור על התאים ב 27 ° C עם רעד ב 110 סל"ד.
  4. קצור מלאי וירוס P2 לאחר 66-72 שעות על ידי צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 20 דקות ולאחסן ב 4 ° C הרחק מאור.
  5. הכן מלאי וירוס P3 על ידי הדבקת הנפח הרצוי של תאי Sf9 (2 × 10,6 תאים/מ"ל צפיפות תאים) עם 1:200 (v/v) P2 ויראלי. לדגור על התאים ב 27 ° C עם רעד ב 110 סל"ד.
  6. לאחר 66-72 שעות, צנטריפוגה ב 1,500 × גרם במשך 20 דקות ולקצור את וירוס P3 על ידי איסוף supernatant ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור.

6. התמרה לבדיקת ביטוי

הערה: הסעיף הבא מתאר בדיקות ביטוי בקנה מידה קטן וניתן לשנות אותו לצורך בדיקה מקבילית של מבנים מרובים באמצעות בלוקים עמוקים של בארות.

  1. הכינו תמיסת פוליאתילן גליקול 20% (w/v) על ידי המסת 200 גרם PEG 10,000 ו-12 גרם NaCl ב-600 מ"ל H2O. ערבבו והביאו לנפח סופי של 1,000 מ"ל. Autoclave את הפתרון.
  2. הוסף 300 μL של וירוס P1 שנקצר לבארות של בלוק באר 24 עמוק ו 75 μL של תמיסת PEG לכל באר. יש לדגור על הבלוק בשייקר מיקרו-ביטוי ב-18°C תוך כדי טלטול ב-300 סל"ד למשך 5 דקות ולאחסן את הבלוק ב-4°C למשך הלילה.
  3. נערו את הבלוק שוב ב-300 סל"ד למשך 30 דקות ב-18°C וצנטריפוגו את הבלוק ב-3,000 × גרם למשך 45 דקות. השליכו את הסופרנאטנט בעזרת פיפטה בארון בטיחות מיקרוביולוגי.
  4. הכינו תאי HEK293 מותאמים להשעיה במדיום HEK293 לצפיפות של 2 ×10 6 תאים/מ"ל, וזרעו 3 מ"ל לכל באר המכילה את גלולת הנגיף, בתוספת 5 מילימ"ר נתרן בוטיראט.
  5. יש לדגור על הבלוק ב-30°C עם 8% CO2 תוך כדי ניעור ב-200-250 סל"ד במשך 72 שעות.
    הערה: ריכוזיCO2 המומלצים על ידי הספק במהלך תרבית תאים שונים עבור קווי תאים HEK293 המותאמים לתרחיף וקווי תאים קדמונים, ב- 8% ו- 5%, בהתאמה.
  6. קצור את התאים על ידי צנטריפוגה ב 900 × גרם במשך 20 דקות ולשטוף כל באר עם 1 מ"ל של PBS.
    הערה: שאפו 10 מיקרוליטר של תאים מרחפים וצפו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם קוביית מסנן תואמת GFP כדי להעריך ביטוי של חלבונים ולוקליזציה. שאפו 10-15 μL של תאים מרחפים והפעילו ג'ל SDS-PAGE של כל התא לזיהוי פלואורסצנטיות GFP בג'ל54.
  7. צנטריפוגה שוב ב 900 × גרם במשך 20 דקות. מקפיאים את הכדוריות ב -80 מעלות צלזיוס.

7. טיהור בדיקות בקנה מידה קטן בתפוקה גבוהה

הערה: השלבים הבאים מתארים זרימת עבודה של טיהור בדיקות מהיר בתבנית בלוק של 24 בארות לסינון רמות הביטוי של SLC בודדים. ראה טבלה 2 להרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.

  1. הוסף 1 מ"ל של חיץ ליזיס HT לכל באר של תאים שנקטפו והמשך לסוניק על קרח לאורך כולל של 4 דקות (רכיבה על אופניים ב -3 שניות על / 15 שניות כבוי) בבלוקים של 24 בארות באמצעות בדיקה של 24 ראשים.
  2. מעבירים את התכולה לגוש באר בעומק 96, מוסיפים 125 μL של חומר ניקוי ואוטמים באטם סיליקון. סובבו את הגוש בעדינות בטמפרטורה של 4°C למשך שעה אחת. לחלופין, הוסיפו דודצילמלטוזיד (DDM) והמיסוקסינט כולסטרול (CHS) ישירות לבלוקים של 24 בארות והניחו אותם על נדנדה-שייקר בטמפרטורה של 4°C.
  3. צנטריפוגה את הבלוק ב 2600 × גרם במשך 20 דקות ב 4 ° C ולהעביר את supernatant לתוך בלוק חדש 96 באר עמוק.
  4. הכינו מלאי של 50% של שרף Strep-Tactin בעל קיבולת גבוהה המאוזן מראש עם חיץ ליזיס.
  5. הוסף 100 μL של מלאי שרף מרחף לכל באר.
  6. מכסים את הבלוק באטם סיליקון ומסובבים ב-4°C למשך שעתיים ולאחר מכן צנטריפוגות לזמן קצר מאוד (עד 200 × גרם) כדי להסיר נוזלים שנדבקים לכיסוי.
  7. מניחים צלחת סינון של 96 בארות על גבי גוש ריק ומעבירים את תערובת השרף/סופרנאטנט לצלחת המסנן. שטפו את הבארות של בלוק הבאר העמוק עם 800 μL של חיץ שטיפה HT והעבירו לבלוק המסנן כדי לאסוף את כמות השרף המקסימלית.
  8. אפשר למאגר לטפטף דרך או לצנטריפוגה לזמן קצר ב 200 × גרם ולאסוף את הזרימה. הניחו את צלחת המסנן על גבי גוש כביסה חדש ושטפו את השרף עם 800 μL של מאגר שטיפה HT, המאפשר למאגר לטפטף דרכו (או לצנטריפוגה לזמן קצר). חזור על שלב השטיפה פעמיים נוספות וצנטריפוץ את הבלוק ב 500 × גרם למשך 3 דקות כדי להסיר את מאגר השטיפה HT השיורי.
  9. הניחו את צלחת המסנן על גבי צלחת מיקרוטיטר בעלת 96 בארות. יש להוסיף 50 μL של חיץ אלוציה HT ולדגור עם רעד בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. דגימות lute על ידי צנטריפוגה ב 500 × גרם במשך 3 דקות.
  10. יש להריץ 15 μL של הדגימה המדוללת על ג'ל SDS-PAGE מוכתם בקומאסי כדי לבדוק את ביטוי החלבון. טען את הדגימות הנותרות של eluent למערכת הכרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) או זיהוי פלואורסצנטיות של כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (FSEC) כדי להעריך חד-פיזור חלבונים ב- DDM/CHS.

8. התמרה לביטוי בקנה מידה גדול

הערה: השלבים הבאים הם פרוטוקול RESOLUTE הסטנדרטי עבור ביטוי SLC. מטרות בודדות ידרשו אופטימיזציה נוספת עבור זמן הביטוי, טמפרטורת הדגירה וריכוז הנתרן בוטיראט. יתר על כן, אנו מייעלים באופן שגרתי את ריבוי הבקולו-וירוס של זיהום על ידי בדיקת יחסים נפחיים שונים של נגיף P3 המשמש להדבקת תאי HEK293 המותאמים לתרחיף בניסויים בקנה מידה קטן. זה חסכוני בזמן, משתמש בטכניקות ובציוד שכבר נמצאים בהישג יד, ומעריך ישירות את תפוקת הניסוי הרצויה. עם זאת, שיטה אמפירית זו דורשת אופטימיזציה מחדש עם כל הגברה של וירוס P3, ושיטות אחרות זמינות לכימות חלקיקי baculovirus 49,50,51,52.

  1. הרחב את הנפח הנדרש של תאי HEK293 המותאמים לתרחיף בתווך HEK293.
  2. יש לדלל תאי HEK293 המותאמים לתרחיף ל-1 × 106 תאים/מ"ל ולגדול במשך 24 שעות (ב-170 סל"ד עבור בקבוקי גלילים בנפח 2 ליטר ו-105 סל"ד בבקבוקי גלילים בנפח 3 ליטר).
  3. הוסף 30 מ"ל של וירוס P3 לליטר תאים והוסף 5 mM נתרן בוטיראט. לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 48 שעות או ב 30 ° C במשך 72 שעות.
  4. במהלך תקופת הדגירה ולאחריה, שלב מפתח הוא לבחון את התאים באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר כדי לבדוק זיהום מיקרוביאלי וכדאיות התא. הערך ביטוי ולוקליזציה של חלבונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי עם קוביית מסנן תואמת GFP.
  5. קצרו את התאים בצנטריפוגה ב 900 × גרם במשך 20 דקות.
  6. לשטוף את גלולת התא על ידי השעייתו מחדש ב 10-15 מ"ל של PBS לליטר של תרבית תאים גלולה שוב ב 900 × גרם במשך 20 דקות.
  7. יש להקפיא את כדורי התא בחנקן נוזלי ולאחסן אותם בטמפרטורה של -80°C.

9. טיהור חלבון

הערה: להלן השיטה הסטנדרטית RESOLUTE לטיהור SLC עבור 5 ליטר של תרבית תאים. עבור כל יעד SLC, יש לקבוע אמפירית את חומר הניקוי האופטימלי. הכינו מראש מאגר בסיס, תמיסת מלאי חומרי ניקוי, שטיפה, הדבקה ומאגרי SEC (טבלה 2). לרשימת חומרי הניקוי הסטנדרטיים שנבדקו, ראו טבלה 3. ATP ו-MgCl2 במאגר השטיפה מפחיתים את הזיהום על ידי חלבוני הלם חום.

  1. יום 1
    1. הפשירו את גלולת התא הקפואה באמבט מים המכוון לטמפרטורת החדר.
    2. הכינו חיץ מסיסות עם 135 מ"ל של חיץ בסיס ושלוש טבליות קוקטייל מעכב פרוטאז. הניחו לטבליות להתמוסס.
    3. השהה מחדש את הגלולה המופשרת עם חיץ מסיסות. השתמש 27 מ"ל של מאגר מסיסות לכל 10-15 גרם של גלולת התא, להוסיף DNase, ויוצקים לתוך הומוגנייזר Dounce קר כקרח. הומוגניזציה של התמיסה על ידי הזזת הבוכנה למעלה ולמטה בערך פי 20, שמירה על הומוגנייזר על קרח.
      הערה: נפח התרחיף יצטרך להיות מותאם בהתבסס על חלבון המטרה ומסת כדורי התא, אשר ישתנו בהתאם לצפיפות התא בעת הקציר. ניתן להוסיף DNase מסחרי בהתאם להוראות היצרן. DNase יכול גם לבוא לידי ביטוי ולטהר בתוך החברה באמצעות פרוטוקולים מבוססים55.
    4. הוסף את תמיסת נייר חומרי הניקוי לריכוז סופי של 1%.
      הערה: שלב מפתח לאופטימיזציה של טיהור חלבונים הוא זיהוי חומר הניקוי האופטימלי למסיסות וטיהור SLC, אותו יש לזהות באופן אמפירי. השתמשנו באופן קבוע בדטרגנטים שונים; כל אחד מהם בנפרד ובשילוב עם כולסטריל המיסוקצינאט, תוך שמירה על יחס המסה של חומר הניקוי ל-CHS ביחס של 10:1.
    5. מעבירים את תערובת המסיסות לצינורות חרוטיים של 50 מ"ל. סובב באיטיות במשך שעה אחת ב- 4°C.
    6. צנטריפוגה את התמיסה ב 50,000 × גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C. לאסוף את supernatant.
    7. יש לאזן נפח מיטה של 4-6 מ"ל של שרף Strep-Tactin עם חיץ הבסיס.
    8. הוסיפו שרף מאוזן לסופרנאטנט המסיס וסובבו במשך שעתיים ב-4°C.
    9. יוצקים את התמיסה לעמודת זרימת כבידה ומאפשרים לתמיסה לזרום דרכה.
    10. שטפו את השרף עם נפח מיטה גדול פי 30 מנפח המיטה של חיץ שטיפת Strep ב-3 שלבים שווים בנפח.
    11. מוסיפים 3-5 מ"ל של חיץ אלוציה, דוגרים במשך 15 דקות, ואוספים את הפולט. חזור על שלב זה ארבע פעמים נוספות, ואסוף כל שבר אלוציה בנפרד.
      הערה: שלב מפתח הוא אלוציה של חלבון משרף הסטרפ-טקטין (Strep-Tactin), שם חשוב לדגור במשך 15 דקות לאחר כל הוספה של מאגר האלוטין. בדרך כלל, החלק הראשון מכיל ריכוז נמוך יותר של חלבון עקב דילול חיץ האלוציה על ידי חיץ השטיפה השיורי. לכן, ניתן להשליך את החלק הראשון של הפולט אם רוצים ריכוז חלבון סופי גבוה יותר. לחלופין, ניתן לנתח את ריכוז החלבון בכל האלוטציות הסדרתיות גם באמצעות SDS-PAGE כדי לייעל את הפרוטוקול.
    12. מדדו את ריכוז החלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית ספיגת UV, שלבו את שברי האלוציה הרצויים והוסיפו פרוטאז 3C ביחס של 1:5 (w/w) ל-1:10 (w/w).
    13. סובב באיטיות במשך הלילה ב 4 °C.
      הערה: שלבים 9.1.12 ו- 9.1.13 נחוצים רק אם תג GFP זקוק להסרה. אם הסרת התגים אינה נדרשת, המשך לשלב 9.2.4 ישירות. לחלופין, ניתן לשמור את החלבון בטמפרטורה של 4°C למשך הלילה כדי להמשיך למחרת. יתר על כן, עבור SLCs עם יציבות מופחתת, ריכוז הפרוטאז, תקופת הדגירה והטמפרטורה עשויים להזדקק לאופטימיזציה. פרוטאז 3C פעיל בטווח רחב של טמפרטורות ומאפשר אופטימיזציה המתאימה ביותר עבור SLCs שונים.
  2. יום 2
    1. שיווי משקל של 2-4 מ"ל נפח המיטה של שרף זיקה מתכתי קובלט עם חיץ SEC.
    2. הוסף שרף זיקה מתכתי קובלט שווה משקל לתערובת התגובה 3C למשך הלילה וסובב במשך שעה אחת ב- 4 ° C.
    3. יוצקים את התמיסה לעמודת זרימת כבידה ואוספים את הזרימה.
    4. רכז את הזרימה במסנן צנטריפוגלי חתוך של 100 kDa על ידי סיבוב ב- 3,000 × גרם ב- 4 ° C וערבב בעדינות את הדגימה כל 5 דקות עד שתגיע לנפח הזרקת SEC הרצוי.
    5. איזון עמודת כרומטוגרפיית אי-הכללת גודל מבוססת דקסטרן-אגרוז באמצעות מאגר SEC. הליך SEC צריך להתבצע ב 4 °C (חדר מקורר או חדר קר).
      הערה: שלב מפתח: בהתאם למצב האוליגומרי של SLC, ניתן להשתמש בעמודה אחרת, כגון עמודת כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל מבוססת אגרוז, לביצוע SEC.
    6. הזריקו את הדגימה ללולאת הדגימה והפעילו את תוכנית ה-SEC, עם קצב זרימה כך שלחץ העמודה נמוך מהמפרט של יצרן העמודה. באמצעות אוסף שברים, אסוף באופן אוטומטי שברים של 0.3 מ"ל לאורך כל ריצת ה- SEC.
    7. בריכת שברים שיא, למדוד ספיגת UV, ולהתרכז ברכז צנטריפוגלי לחתוך 100 kDa לנפח/ריכוז הנדרש על ידי סיבוב ב 3,000 × גרם ב 4 ° C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

ניתן לשכפל גנים SLC מפלסמידים pDONR נחושים לווקטורים BacMam לביטוי יונקים
הפרוטוקולים המתוארים לשיבוט, ביטוי וטיהור הוכיחו את עצמם כמוצלחים עבור מובילי SLC רבים על פני קפלי חלבון מרובים. עם זאת, הנהלים כוללים מספר נקודות ביקורת לניטור ההתקדמות, המאפשרים אופטימיזציה כדי להסביר הבדלים בביטוי, קיפול חלבונים, יציבות תלוית שומנים ודטרגנטים, ורגישות לתנאי חיץ.

מחסומים במהלך שכפול SLC וביטוי בקנה מידה קטן
בשלבי השיבוט, אלקטרופורזה ג'ל agarose יש להשתמש כדי להבטיח את הגודל הנכון של מוצרי PCR ועיכול. באופן דומה, ניתן לאמת את תגובות השער והטרנספוזיציה באמצעות תגובת PCR של מושבה (איור 2A,B). יצירת Baculovirus ניתן לפקח באמצעות טכניקות סטנדרטיות לפי הצורך 49,50,51,52. הביטוי הראשוני צריך להיעשות בקנה מידה קטן, הערכת תפוקת החלבון על-ידי SDS-PAGE (איור 2B). באופן דומה, יש לציין את החלק של תאים פלואורסצנטיים ירוקים, ביטוי חלבון כולל ולוקליזציה של חלבונים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (איור 2C,D). ביטוי חלבונים צריך להיות מותאם לסוג התא, טמפרטורה, זמן, ואת הצורך של שיתוף מלווים או שותפים מורכבים. ניתן למטב את הביטוי עוד יותר על ידי שינוי המבנה כך שיחתוך N- ו- C-termini לא מסודרים, בהתבסס על חיזוי מבנה משני56,57,58, ובדיקת הסוגים והמיקום של תגי זיקה. יש להעריך את יציבות החלבונים בקנה מידה קטן על-ידי FSEC (איור 2E), בדיקת שינוי תרמי מבוססת SEC (SEC-Ts) ו-DSF 41,42,59,60,61,62. מולקולות קטנות, כגון מצעים ומעכבים, דטרגנטים, כולסטרול המיסוקצינאט, שומנים ו- pH צריכות להיבדק לשיפור יציבות החלבון בהתחשב בתפקוד החלבון והסביבה התת-תאית הטבעית ובמאגרי הטיהור הבאים המותאמים בהתאם. במערכי ביטוי בקנה מידה קטן וגדול, יש לנטר תאים באמצעות מיקרוסקופ לצורך קיום וזיהום.

אופטימיזציה של טיהור טרנספורטר בקנה מידה גדול
כל שלב של טיהור חלבון בקנה מידה גדול צריך להיות מוערך על ידי SDS-PAGE, כולל פלואורסצנטיות בג'ל כדי לפקח באופן ספציפי על החלבון המתויג GFP והסרה אנזימטית של תג זה. בפועל, התאים המבטאים SLC המתויגים ב-GFP נראים צהבהבים-ירוקים. לאחר הדבקה כרומטוגרפית של תג Twin-Strep, ה- eluent המכיל את החלבון המטוהר מופיע בצבע ירוק ניאון פלואורסצנטי תחת אור לבן. חלבון הומוגני מבחינה כימית ומבנית אמור להניב חד-פיזור יחיד A280 שיא במהלך כרומטוגרפיה של אי-הכללת גודל (איור 2F,G), ולהציג פס יחיד ב-SDS-PAGE. יש לנתח את רצועת SDS-PAGE המתאימה ל-SLC הצפוי, ואת כל הפסים הבלתי צפויים, באמצעות ספקטרומטריית מסה של עיכול טריפטי. רצועות מרובות בג'ל SDS-PAGE מצביעות על פירוק פרוטאוליטי, חלבונים מזהמים או אוליגומרים עמידים ל-SDS. ניתן להסיר חלבונים מזהמים על ידי הגדלת ריכוז NaCl של מאגר המסיסות או שינוי תג הזיקה. ניתן להגביל את הפרוטאוליזה על ידי שיפור טוהר החלבון, הבטחת כל השלבים בטמפרטורה של 4°C או על קרח, ומיטוב הפרוטוקול כדי למזער את הזמן של כל שלב. אם לפרופיל SEC יש שיא רחב, פסגות מרובות או שיא ריק גדול (כמו למשל העקבות הסגולות של איור 2F), יש למטב את תנאי הבנייה והטיהור בקנה מידה קטן באמצעות FSEC, SEC-Ts או DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
איור 1: סכמה של זרימת עבודה נחושה עבור ביטוי וטיהור SLC. איור שלב אחר שלב של שיבוט רקומבינציה, הכנת BacMam baculovirus, ביטוי וטיהור חלבונים, ויישומים במורד הזרם. קיצורים: SLC = נשא מומס; Cryo-EM = מיקרוסקופ אלקטרונים קריו-אלקטרונים; SEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 2
איור 2: תוצאות מייצגות עבור ביטוי וטיהור SLC. (A) PCR מושבה של שיבוט SLC בתפוקה גבוהה לתוך pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) SDS-PAGE מוכתם בקומאסי של מבחן ביטוי מקבילי יחיד בקנה מידה קטן של 24 SLC שונים באורך מלא. (C) פלואורסצנטיות בתוך התא של SLC מתויג GFP המותאם בעיקר לקרום הפלזמה. (D) פלואורסצנטיות בתוך התא של SLC מתויג GFP עם לוקליזציה תוך-תאית משמעותית. (E) עקבות FSEC מייצגים עבור ארבעה SLCs שנפתרו על עמודת UHPLC הידרופילית, נייטרלית מבוססת סיליקה. מעקב SEC מייצג עבור שישה SLCs מטוהרים על עמודות כרומטוגרפיה בגודל (F) dextran-agarose או (G) גודל agarose. משקלים מולקולריים של קומפלקס SLC ודטרגנט המשמש לטיהור מסומנים היכן נקבע המצב האוליגומרי בניסוי. קיצורים: SLC = נשא מומס; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; FSEC = כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל זיהוי פלואורסצנטי. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

Figure 3
איור 3: יישומים במורד הזרם של SLCs מטוהרים . (A) מיקרוגרף של SLC1A1 בדטרגנטים. (B) ממוצעים דו-ממדיים של SLC1A1 בחומר ניקוי. (C) פלואורסצנטיות גולמית של בדיקת דנטורציה תרמית CPM של SLC10A6 מודגרת עם ריכוזים שונים של חומצה Taurolithocholic 3-סולפט. (D) נגזרת ראשונה של דנטורציה תרמית CPM של SLC10A6. טמפרטורת ההתכה של SLC10A6 עלתה ב -10 מעלות צלזיוס בנוכחות 120 מיקרומטר חומצה Taurolithocholic 3-סולפט. קיצורים: SLC = נשא מומס; CPM = N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimide. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.

שם וקטורי סמנים אנטיביוטיים תגיות עבור Purif פריימרים להקרנה bp נוסף במהלך PCR
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW אמפרR טרמינל C PHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
3C פרוטאז האתר GFP
סטרפ טווין GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
שלו10
pDONR221 כאןר ללא M13 קדימה ~190
M13 הפוך

טבלה 1: פלסמידים המשמשים לשיבוט RESOLUTE וליצירת BacMam.

תמיסה הרכב
צלחות בחירה DH10Bac לוחות LB-אגר המכילים קנמיצין 50 מיקרוגרם/מ"ל, טטרציקלין 10 מיקרוגרם/מ"ל, גנטמיצין 7 מיקרוגרם/מ"ל, IPTG 40 מיקרוגרם/מ"ל ו-100 מיקרוגרם/מ"ל בלואו-גל
2x LB בינוני (עם אנטיביוטיקה) 2x ציר LB המכיל 50 מיקרוגרם / מ"ל קנמיצין, 10 מיקרוגרם / מ"ל טטרציקלין, ו 7 מיקרוגרם / מ"ל gentamycin
חיץ ליזיס HT 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5% גליצרול, מעכב פרוטאז ללא EDTA
חיץ HT Wash 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5% גליצרול, 0.03% DDM/0.003% CHS
חיץ HT Elution 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 250 mM NaCl, 5% גליצרול, 0.03% DDM/0.003% CHS, 100 mM D-ביוטין
מאגר בסיס 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 150 mM NaCl
תמיסת מלאי חומרי ניקוי 10% (w/v) חומר ניקוי, עם או בלי 1% CHS לפי הצורך. יש לערבב ב-4°C למשך הלילה ולאחסן בטמפרטורה של -20°C.
חיץ כביסה Strep 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, חומר ניקוי ב-CMC פי 3, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP
חיץ אלוציה Strep 50 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotin, חומר ניקוי ב-CMC פי 3
מאגר כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל (SEC) 20 mM HEPES-NaOH, pH 7.5, 150 mM NaCl, חומר ניקוי ב-CMC פי 2. סנן דרך קרום 0.22 מיקרומטר.
נתרן בוטיראט 1 M פתרון DPBS, לאחסן ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך.

טבלה 2: רשימת הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה והרכבם.

מערכת חומרי ניקוי ריכוז מיצוי ריכוז טיהור (% w/v)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
דצימטר 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
גז טבעי 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
צימל-5 1% 0.40%
LMNG 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
דיגיטונין 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos כולין-12 1% 0.14%

טבלה 3: דטרגנטים סטנדרטיים המשמשים לבדיקת מסיסות הממברנה וחד-פיזור SLC ויציבות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

הפיתוח של טיפולים ממוקדי SLC נותר מעוכב בשל היעדר אפיון שיטתי של תפקוד הטרנספורטר. זה הוביל לפחות תרופות באופן לא פרופורציונלי המכוונות לקבוצת חלבונים זו ביחס ל- GPCRs ותעלות יונים63, למרות תפקידיהן הרבים בתהליכים נורמליים ופתופיזיולוגיים. RESOLUTE הוא קונסורציום בינלאומי שמטרתו לפתח טכניקות מחקר חדשניות וכלים כדי להאיץ ולשפר את המחקר הנוכחי SLC. כחלק מ-RESOLUTE, פיתחנו פרוטוקולים אלה לשיבוט יעיל, סינון מבנים וביטוי וטיהור בקנה מידה גדול של SLCs אנושיים.

כאן אנו מתארים שיטות שיבוט וביטוי SLC ניתנות להרחבה ששימשו בהצלחה לחקירה שיטתית של מובילי SLC אנושיים, כולל SLCs פוטנציאליים ויתומים. יש לציין כי SLCs שטוהרו באופן זה שימשו בהצלחה במחקרים מאוחרים יותר של מבנה טרנספורטרים, ביוכימיה, תפקוד, יצירת קשירה וקשירת מולקולות קטנות. אנו משתמשים בשיטה זו באופן קבוע כדי לטהר כמויות מיליגרם של SLC שונים ובתנאים אופטימליים, ניתן להשלים את הפרוטוקול כולו, כולל שלבי השיבוט ותרבית הרקמה, תוך 4-5 שבועות.

השיטה שלנו מותאמת לכלכלה ולמקביליות להערכה שיטתית של יעדים מרובים. עם זאת, שיטה זו בעלת תפוקה גבוהה מותאמת בקלות גם ליצירה מקבילה של מבנים עבור מטרה בודדת עם חתכים או תגים שונים באמצעות פריימרים או וקטורים משוכפלים נפרדים. זה דומה לשיטות שגם מייעלות מבנים מרובים עבור יעד64, אם כי הפרוטוקול שלנו מציע יעילות נוספת עם שיבוט מקבילי, יצירת baculovirus ובדיקות ביטוי. טרנספקציה מציעה זמן קצר יותר בין בנייה, שיבוט והבעה על ידי ויתור על דור הבקולווירוס65, אך היא משמעותית יקרה יותר ומייגעת לביטוי בקנה מידה גדול. לעומת זאת, קווי תאים יציבים הם ככל הנראה זולים יותר עבור ביטוי בקנה מידה גדול66, אך יצירת קווי תאים שבטיים בעלי ביטוי גבוה יכולה לדרוש יותר זמן ומשאבים מיוחדים. לבסוף, בעוד פרוטוקול זה משתמש בקווי תאים אנושיים לייצור חלבונים, קו תאי חרקים כגון מ Spodoptera frugiperda ו Trichoplusia ni שימשו בהצלחה גם עבור ביטוי SLC בקנה מידה גדול 5,31,64. ביטוי בקווי תאים אנושיים מגדיל את עלויות המדיה אך מציע יותר שינויים דמויי שפת אם לאחר התרגום וסביבת שומנים39,67.

בעוד שניתן להתאים את הפרוטוקול למובילי ממברנות שונים ולצרכים ניסיוניים, מספר גורמים משפיעים על האיכות והתשואה של דגימות החלבון המטוהרים. למרות שזה אידיאלי לחקור חלבונים באורך מלא, ייתכן שתידרש מידה מסוימת של חיתוך רצף כדי להשיג ביטוי טוב יותר, טיהור ותשואות הרכבה מחדש. כל מבני ה-SLC של RESOLUTE תויגו ב-GFP מחוכם, שהוא בעל ערך בניטור ביטוי SLC, לוקליזציה תאית וטיהור. מערכת ביטוי תאי HEK293 המותאמת להשעיה המשמשת בניסויים אלה הובילה לתפוקות מעולות ומומלצת, אם כי אנו מייצרים באופן שגרתי גם חלבונים ללא גליקוזילציה מורכבת באמצעות קו תאי HEK293 GnTL המותאם לתרחיף. טמפרטורת הדגירה ואורך ביטוי החלבונים על ידי תאים מותמרים צריכים להיות אופטימליים עבור כל מטרה, אם כי מצאנו 72 שעות ב 30 ° C כברירת מחדל טובה.

כל שלבי טיהור החלבון צריכים להתבצע על קרח או בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ולאחר שהחלבון המטוהר הוקפא בזק, יש להימנע ממחזורי הקפאה-הפשרה. סוג וכמות הדטרגנטים המשמשים במאגרי ממברנות וטיהור הם קריטיים ויש לקבוע אותם עבור כל SLC באופן אמפירי.

ה-SLCs שטוהרו בשיטה זו מניבים דגימות הומוגניות ושלמות מבחינה מבנית ותפקודית, אשר יכולות לשמש למגוון מחקרים ביוכימיים וביופיזיקליים. התבוננות בחלקיקים בודדים ובדידים של חלבון SLC המסיס והמטוהר על-ידי כתם שלילי ו-Cryo-EM (איור 3A,B) יכולה להיות מבטיחה לקביעת מבנה37 לאחר מכן. SLC מטוהר בדטרגנט יכול לשמש לבדיקות ביופיזיקליות כגון בדיקת יציבות תרמית (איור 3C,D) כדי לחקור את אינטראקציות החלבונים עם מולקולות קטנות כגון מצעים, מעכבים או שומנים 59,62. לבסוף, SLCs שטוהרו באמצעות פרוטוקול זה בבדיקות ביוכימיות יכולים להיות מורכבים מחדש לליפוזומים או ננו-דיסקים עבור בדיקות פונקציונליות68 ומשמשים לייצור נוגדנים וננוניםוברירה 69,70. בעוד שנותר אתגר להתאים שיטות אלה לתפוקה הדרושה לגילוי מולקולות קטנות חדשות ממוקדות SLC 1, התקדמות מבטיחה נעשתה בתחום טכנולוגיות סינון במבחנה בתפוקה גבוהה71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgments

עבודה זו בוצעה במסגרת פרויקט RESOLUTE. RESOLUTE קיבלה מימון מההתחייבות המשותפת Innovative Medicines Initiative 2 במסגרת הסכם מענק מספר 777372. התחייבות משותפת זו מקבלת תמיכה מתוכנית המחקר והחדשנות Horizon 2020 של האיחוד האירופי ומ- EFPIA. מאמר זה משקף רק את עמדות המחברים ולא תעש ולא האיחוד האירופי ו-EFPIA אחראים לכל שימוש שעשוי להיעשות במידע הכלול בו. פלסמיד pHTBV סופק באדיבות על ידי פרופ' פרדריק בויס (הרווארד).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

ביטוי בתפוקה גבוהה טיהור נשאי מומסים אנושיים מחקרים מבניים מחקרים ביוכימיים מובילי ממברנה מצעים אנדוגניים מצעים אקסוגניים מטרות טיפוליות סמני מחלות תרופות פרויקטים לגילוי תרופות ידע מבני מוגבל ידע פונקציונלי מוגבל ידע פיזיולוגי מוגבל קשיי ביטוי וטיהור כמויות מיליגרם רצפי גנים מותאמים לקודון תכנון מבנה ביטוי בתפוקה גבוהה שימור שלמות מבנית שימור פעילות ביוכימית ביטוי תאים אאוקריוטיים טיהור זיקה כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל קביעת מבנה ברזולוציה גבוהה מחקרי תחבורה, מבחני מעורבות במולקולות קטנות סינון במבחנה בתפוקה גבוהה
ביטוי וטיהור בתפוקה גבוהה של נשאי מומסים אנושיים למחקרים מבניים וביוכימיים
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter