Summary
Structurele en biochemische studies van menselijke membraantransporters vereisen milligramhoeveelheden stabiel, intact en homogeen eiwit. Hier beschrijven we schaalbare methoden om transporteurs van menselijke opgeloste stoffen te screenen, tot expressie te brengen en te zuiveren met behulp van codon-geoptimaliseerde genen.
Abstract
Opgeloste stoffen (SLC's) zijn membraantransporters die een reeks endogene en exogene substraten importeren en exporteren, waaronder ionen, voedingsstoffen, metabolieten, neurotransmitters en geneesmiddelen. Ondanks het feit dat deze groep eiwitten naar voren is gekomen als aantrekkelijke therapeutische doelwitten en markers van ziekte, is deze groep eiwitten nog steeds relatief ondergewaardeerd door de huidige geneesmiddelen. Projecten voor het ontdekken van geneesmiddelen voor deze transporters worden belemmerd door beperkte structurele, functionele en fysiologische kennis, uiteindelijk als gevolg van de moeilijkheden bij de expressie en zuivering van deze klasse van in membraan ingebedde eiwitten. Hier demonstreren we methoden om zeer zuivere milligrammen humane SLC-transporteiwitten te verkrijgen met behulp van codon-geoptimaliseerde gensequenties. In combinatie met een systematische verkenning van constructontwerp en high-throughput expressie, zorgen deze protocollen voor het behoud van de structurele integriteit en biochemische activiteit van de doeleiwitten. We belichten ook kritieke stappen in de eukaryote celexpressie, affiniteitszuivering en grootte-uitsluitingschromatografie van deze eiwitten. Uiteindelijk levert deze workflow zuivere, functioneel actieve en stabiele eiwitpreparaten op die geschikt zijn voor structuurbepaling met hoge resolutie, transportstudies, betrokkenheidstests voor kleine moleculen en in-vitroscreening met hoge doorvoer.
Introduction
Membraaneiwitten zijn al lang het doelwit van zowel onderzoekers als de farmaceutische industrie. Hiervan zijn de opgeloste stoffen (SLC's) een familie van meer dan 400 secundaire transportergenen die gecodeerd zijn in het menselijk genoom1. Deze transporters zijn betrokken bij de import en export van tal van moleculen, waaronder ionen2, neurotransmitters3, lipiden 4,5,6,7, aminozuren8, voedingsstoffen 9,10,11 en geneesmiddelen 12. Met zo'n breed scala aan substraten zijn deze eiwitten ook betrokken bij een reeks pathofysiologieën door het transport van toxines13, transport van en remming door drugs van misbruik 14,15 of schadelijke mutaties16. Bacteriële homologen hebben gediend als prototypes voor het fundamentele transportmechanisme van verschillende SLC-families 17,18,19,20,21,22,23,24,25. In tegenstelling tot menselijke eiwitten komen prokaryote orthologen vaak beter tot expressie in het goed begrepen Escherichia coli-expressiesysteem 26,27 en zijn ze stabieler in de kleinere reinigingsmiddelen die goed geordende kristallen opleveren voor röntgenkristallografie28. Sequentie- en functionele verschillen bemoeilijken echter het gebruik van deze ver verwante eiwitten voor het ontdekken van geneesmiddelen29,30. Bijgevolg is directe studie van het menselijke eiwit vaak nodig om het werkingsmechanisme te ontcijferen van geneesmiddelen die gericht zijn op SLC's 31,32,33,34,35. Hoewel de recente ontwikkelingen op het gebied van cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM) structurele karakterisering van SLC's in meer native-achtige omstandigheden mogelijk hebben gemaakt36,37, blijft de moeilijkheid om deze eiwitten tot expressie te brengen en te zuiveren een uitdaging voor het ontwikkelen van gerichte therapieën en diagnostiek.
Om deze uitdaging het hoofd te bieden, heeft het RESOLUTE-consortium (re-solute.eu) middelen en protocollen ontwikkeld voor de grootschalige expressie en zuivering van menselijke eiwitten uit de SLC-familie38. Beginnend met codon-geoptimaliseerde genen, hebben we methoden ontwikkeld voor het high-throughput klonen en screenen van SLC-constructen. Deze methoden werden systematisch toegepast op de hele familie van SLC's, de genen werden gekloond in het BacMam-virale expressiesysteem en de eiwitexpressie werd getest in menselijke cellijnen39 op basis van eerder beschreven methoden voor klonen en expressietesten met hoge doorvoer40. Samengevat wordt het SLC-gen gekloond van het pDONR221-plasmide in een pHTBV1.1-vector. Dit construct wordt vervolgens gebruikt om het gen van belang te transponeren in een bacmidevector voor het transfecteren van insectencellen, die een cytomegaloviruspromotor en enhancer-elementen voor expressie in zoogdiercellen bevat. Het resulterende baculovirus kan worden gebruikt om zoogdiercellen te transduceren voor de expressie van het doel-SLC-eiwit.
We ontwikkelden verder gestandaardiseerde methoden voor grootschalige expressie en stabiele zuivering van geselecteerde SLC's (Figuur 1). Dit protocol bevat meerdere controlepunten om effectieve probleemoplossing te vergemakkelijken en de variabiliteit tussen experimenten te minimaliseren. Met name routinematige monitoring van eiwitexpressie en lokalisatie, evenals kleinschalige optimalisatie van zuiveringsomstandigheden voor individuele doelen, werden geholpen door Strep en Green Fluorescent Protein (GFP) tags41,42.
Uiteindelijk kunnen deze chemisch zuivere en structureel homogene eiwitmonsters worden gebruikt voor structurele bepaling door middel van röntgenkristallografie of cryo-elektronenmicroscopie (Cryo-EM), biochemische target-engagement-assays, immunisatie voor het genereren van bindmiddelen en celvrije functionele studies via reconstitutie tot chemisch gedefinieerde liposomen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle voor codon geoptimaliseerde RESOLUTE SLC-genen zijn gedeponeerd in AddGene43, waarvan de links beschikbaar zijn op de lijst van RESOLUTE publieke reagentia44. Deze genen zijn gekloond in het pDONR221-plasmide en maken het mogelijk om de genen direct te klonen in de bestemmingsvector met behulp van recombinatieklonen45. Om parallellisme te maximaliseren, worden bacteriële, insecten- en zoogdiercellen gekweekt in blokformaat voor respectievelijk bacmideproductie (sectie 3), baculovirusamplificatie (sectie 5) en expressietesten (sectie 6). Voor deze stappen is een micro-expressieschudder nodig om voldoende menging en beluchting te garanderen.
1. (High-throughput) klonen van SLC's in pHTBV1.1 bacmide
OPMERKING: De kloonstap maakt gebruik van een recombinatie-kloonprotocol voor efficiënt klonen en omzetten in Escherichia coli (E. coli) met behulp van de hitteschokmethode46. Het protocol is ontworpen voor high-throughput en parallel klonen van meerdere doelen of constructies, maar kan gemakkelijk worden aangepast aan kleinere schalen.
- Voeg in een plaat met 96 putjes 150 ng van de pDONR221 SLC-kloon en 100 ng van de pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-vector toe. Breng het reactievolume op 8 μL met 10 mM Tris pH 8,0 en voeg vervolgens 2 μL van het recombinatie-enzymmengsel toe.
- Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, voeg 1 μL proteïnase K toe en incubeer gedurende 30 minuten bij 37 °C.
- Gebruik 4 μl van het reactiemengsel om 50 μl chemisch competente E. coli MACH-1-cellen om te zetten met behulp van de hitteschokmethode46 en SOC-medium voor terugwinning. Plaat op LB-agar met 5% sucrose, of SOC-agar, aangevuld met 100 μg/ml ampicilline.
- Identificeer kolonies die de pHTBV1.1-vector herbergen met behulp van het SLC-geninzetstuk met behulp van geschikte primers (zie tabel 1) en standaardprotocollen voor kolonie-PCR47.
- Zuiver het recombinante plasmide uit afzonderlijke kolonies met het gen van belang met behulp van een plasmide-miniprep-kit.
2. Omzetting
OPMERKING: De volgende stappen worden gebruikt om de SLC-genen van de pHTBV1.1-vector te transponeren naar een bacmide voor het genereren van BacMam-baculovirus in Sf9-cellen. Met behulp van de hitteschokmethode46 wordt de pHTBV1.1-vector omgezet in DH10Bac-competente E. coli-cellen , die een ouderbacmide bevatten met een lacZ-mini-attTn7-fusie. Transpositie vindt plaats tussen de elementen van de pHTBV1.1-vector en het ouderbacmide in aanwezigheid van de transpositie-eiwitten die worden geleverd door een helperplasmide48. Zie tabel 2 voor de samenstelling van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
- Gebruik 3 μL 100-200 ng/μL gezuiverd pHTBV1.1-vector-DNA om DH10Bac te transformeren met behulp van de hitteschokmethode in een PCR-plaat met 96 putjes. Recupereer de cellen door ze 4-5 uur bij 37 °C te incuberen in herstelmedium en schud ze met 700 tpm in een micro-expressieschudder.
- Verdeel 50 μL getransformeerde cellen over DH10Bac-selectieplaten. Incubeer de platen gedurende 48 uur bij 37 °C, afgedekt met folie.
- Kies een enkele witte kolonie (die het recombinant-DNA bevat) en streep naar verdunning. Incubeer bij 37 °C gedurende een nacht.
3. Productie van bacmiden met hoge doorvoer
OPMERKING: Het protocol beschrijft de stappen voor het extraheren van bacmiden met behulp van een bacmid-zuiveringskit met 96 putjes.
- Inoculeer individuele witte kolonies (geïsoleerd uit de gestreepte tot verdunningsplaten) in putjes van een blok met 96 diepe putten, dat 1 ml 2x LB-medium bevat (tabel 2).
- Dek af met een poreuze afdichting en incubeer bij 37 °C gedurende een nacht bij 700 tpm in een micro-expressieshaker.
- Bereid een glycerolvoorraad van de cellen door 120 μl van de kweek te mengen met 30 μl 60% glycerol in een microtiterplaat en bewaar bij -80 °C.
- Centrifugeer het boorputblok bij 2.600 × g gedurende 30 minuten. Giet het supernatans in een geschikte container voor ontsmetting. Keer het blok om en tik zachtjes op keukenpapier. Voeg 250 μL oplossing 1 toe aan elk putje van het blok met behulp van een meerkanaalspipet.
- Resuspendeer de pellets; Gebruik indien nodig een meerkanaalspipet.
- Voeg 250 μL oplossing 2 toe aan elk putje en sluit af met een siliconenmat. Keer 5x voorzichtig om en incubeer 10 minuten bij kamertemperatuur. Draai heel kort.
- Voeg 300 μL oplossing 3 toe en sluit af met een siliconenmat. Meng voorzichtig maar grondig door 5x om te keren.
- Leg het monster 20 minuten op ijs en centrifugeer vervolgens gedurende 30 minuten bij 4 °C bij 2.600 × g .
- Breng het heldere supernatans over naar een vers blok met 96 putjes. Centrifugeer opnieuw bij 2.600 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Doseer in een vers blok met 96 diepe putten 0,8 ml 100% isopropanol per putje. Voeg 0,8 ml supernatanten uit de bijbehorende putjes toe.
- Pipetteer voorzichtig op en neer met een pipet en incubeer vervolgens 30 minuten of een nacht op ijs bij 4 °C om meer baamide te verkrijgen.
- Centrifugeer bij 2.600 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Spuit in een biologische veiligheidskast de buitenkant van het blok in met 70% ethanol, open het blok en gooi het supernatant weg.
- Voeg 500 μL 70% ethanol (v/v) toe aan elk putje en tik zachtjes op het blok om de pellet te wassen. Dek af met een zelfklevende plastic afdichting en centrifugeer bij 2.600 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C.
- Open het blok in een biologische veiligheidskast en gooi het supernatant weg. Tik het blok heel zachtjes op keukenpapier om de ethanol te verwijderen. Laat het blok 1-2 uur drogen in de afzuigkap of in een oven van 50 °C.
- Voeg 50 μL steriele TE-buffer toe om het bacmide-DNA te resuspenderen en sluit af met een zelfklevende plastic afdichting. Breng de inhoud over naar een V-bodem microtiterplaat. Bewaar het bacmide-DNA bij 4 °C totdat de testzuivering is voltooid en bewaar het vervolgens bij -20 °C.
OPMERKING: Hoewel het niet routinematig wordt gemeten, kan over het algemeen een opbrengst van 500 tot 2.000 ng/μL bacmide-DNA worden verwacht. - Gebruik standaard kolonie-PCR-methoden47 en de volgende vectorprimers om te screenen op bacmiden die met succes het doelgen bevatten:
pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
OPMERKING: Het amplicon zal ongeveer 700 bp groter zijn dan het doelgen.
4. Transfectie
OPMERKING: Deze stappen worden gebruikt om Sf9-insectencellen te transfecteren met de geproduceerde bacmide, waardoor de insectencellen baculovirusdeeltjes (P0) genereren.
- Kweek Sf9-cellen in serumvrij insectenmedium tot een dichtheid van 2,0-2,4 × 106 cellen/ml. Verdun de cellen tot 2 × 105 cellen/ml in serumvrij insectenmedium en doseer 1 ml van de verdunde cellen in een weefselkweekplaatputje met 24 putjes. Voeg een transfectie-reagens-only-en een cells-only-controle toe. Incubeer de plaat gedurende 1 uur in een bevochtigde incubator bij 27 °C om celhechting mogelijk te maken.
- Meng 38 μL per putje serumvrij insectenmedium met 2 μL per putje van het transfectiereagens. Doseer 40 μl van het mengsel in een steriele microtiterplaat met 96 putjes en platte bodem. Voeg 2 μL recombinant bacmide-DNA toe in een verhouding van 0,5-2,0 μg/μL, dek de plaat af en incubeer gedurende 15 minuten in de microbiologische veiligheidskast.
- Voeg 160 μL serumvrij insectenmedium toe aan elk putje van de microtiterplaat die het DNA-transfectiereagensmengsel bevat.
- Zuig het medium uit de cellen in stap 4.1. Voeg voorzichtig het mengsel van 200 μl bacmid-transfectie-reagens-medium toe aan de cellen, dek de plaat af en incubeer gedurende 4 uur in een bevochtigde incubator bij 27 °C.
- Voeg 400 μL serumvrij insectenmedium aangevuld met 2% FBS toe aan elk putje. Om verdamping te verminderen, doet u de plaat in een schone plastic zak, maar sluit u deze niet af. Incubeer de plaat bij 27 °C gedurende 72 uur in een bevochtigde incubator.
- Breng na 3 dagen het medium van de plaat over in een steriel blok met 96 diepe putten en centrifugeer het gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur bij 1.500 × g . Breng het geklaarde supernatans met P0-baculovirus over in een steriel blok met 96 diepe putten en bewaar het bij 4 °C uit de buurt van licht.
5. BacMam baculovirus amplificatie
OPMERKING: De volgende stappen worden gebruikt om het initiële P0-baculovirus te amplificeren tot virale voorraden met een hogere titer; namelijk P1, P2 en P3. De uiteindelijke P3-titer is geschikt voor transductie en eiwitexpressie. Voor efficiëntie en parallellisme maakt dit protocol gebruik van vaste volumetrische verhoudingen voor virale amplificatie, die empirisch zijn geoptimaliseerd. Als de vervolgens getransduceerde cellen echter geen GFP-fluorescentie en een grotere celdiameter vertonen door microscopie of als eiwitexpressie faalt (zie rubrieken 6 en 8), moet baculovirusamplificatie opnieuw worden geoptimaliseerd voor een lage multipliciteit van infectie bij elke stap na kwantificering van de baculovirustiter 49,50,51,52, en infectie gecontroleerd door GFP-fluorescentiemicroscopie en verhoogde celdiameter 53.
- Bereid de P1-virusvoorraad voor door Sf9-cellen in serumvrij insectenmedium te kweken tot een dichtheid van 2 × 106 cellen/ml, voeg 2% FBS toe en zaai de cellen in een blok van 24 diepe putjes in een eindvolume van 3 ml per putje. Voeg 120 μL P0-virusvoorraad toe aan de cellen.
- Incubeer het blok bij 27 °C terwijl het bij 450 tpm schudt in een micro-expressie shaker gedurende 66-72 uur. Centrifugeer het blok bij 1.500 × g gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur en oogst het supernatans in blokken met 96 diepe putten. Bewaren als P1-virusvoorraad bij 4 °C uit de buurt van licht.
- Bereid P2-virusvoorraad voor door 50 ml Sf9-cellen (2 × 106 cellen/ml celdichtheid), gekweekt in serumvrij insectenmedium aangevuld met 2% FBS, te infecteren met 250 μL P1-virusvoorraad. Incubeer de cellen bij 27 °C en schud bij 110 omw/min.
- Oogst de P2-virusvoorraad na 66-72 uur door centrifugeren bij 1.500 × g gedurende 20 minuten en bewaar bij 4 °C uit de buurt van licht.
- Bereid P3-virusvoorraad voor door het gewenste volume Sf9-cellen (2 × 106 cellen/ml celdichtheid) te infecteren met 1:200 (v/v) P2-virusvoorraad. Incubeer de cellen bij 27 °C en schud bij 110 omw/min.
- Centrifugeer na 66-72 uur gedurende 20 minuten bij 1.500 × g en oogst het P3-virus door het supernatans op te vangen en bewaar bij 4 °C, beschermd tegen licht.
6. Transductie voor expressietesten
OPMERKING: In de volgende sectie worden kleinschalige expressietests beschreven en deze kunnen worden aangepast voor parallelle tests van meerdere constructies met behulp van deepwell-blokken.
- Bereid een polyethyleenglycoloplossing van 20% (m/v) door 200 g PEG 10.000 en 12 g NaCl op te lossen in 600 ml dubbel gedistilleerd H2O. Roer en breng tot een eindvolume van 1.000 ml. Autoclaaf de oplossing.
- Voeg 300 μL geoogst P1-virus toe aan de putjes van een blok met 24 diepe putten en 75 μl van de PEG-oplossing aan elk putje. Incubeer het blok in een micro-expressieschudder bij 18 °C terwijl het gedurende 5 minuten bij 300 tpm schudt en bewaar het blok een nacht bij 4 °C.
- Schud het blok opnieuw bij 300 tpm gedurende 30 min bij 18 °C en centrifugeer het blok bij 3.000 × g gedurende 45 min. Gooi het supernatans weg met behulp van een pipet in een microbiologische veiligheidskast.
- Bereid aan suspensie aangepaste HEK293-cellen in HEK293-medium tot een dichtheid van 2 × 106 cellen/ml en zaai 3 ml in elk putje dat de viruspellet bevat, aangevuld met 5 mM natriumbutyraat.
- Incubeer het blok bij 30 °C met 8% CO2 terwijl het gedurende 72 uur schudt bij 200-250 tpm.
OPMERKING: De door de leverancier aanbevolen CO2 -concentraties tijdens celkweek zijn verschillend voor aan suspensie aangepaste en voorouderlijke HEK293-cellijnen, respectievelijk 8% en 5%. - Oogst de cellen door centrifugeren bij 900 × g gedurende 20 minuten en was elk putje met 1 ml PBS.
OPMERKING: Zuig 10 μL geresuspendeerde cellen op en bekijk de cellen onder een fluorescentiemicroscoop met een GFP-compatibele filterkubus om de eiwitexpressie en lokalisatie te beoordelen. Zuig 10-15 μL geresuspendeerde cellen op en voer een SDS-PAGE-gel met hele cellen uit voor GFP-fluorescentiedetectie in de gel54. - Centrifugeer opnieuw bij 900 × g gedurende 20 min. Vries de pellets in bij -80 °C.
7. Kleinschalige testzuivering met hoge doorvoer
OPMERKING: De volgende stappen beschrijven een workflow voor het opschonen van snelle tests in een blokindeling met 24 putjes voor het screenen van de expressieniveaus van individuele SLC's. Zie tabel 2 voor de samenstelling van de oplossingen die in dit protocol worden gebruikt.
- Voeg 1 ml HT-lysisbuffer toe aan elk putje geoogste cellen en sonificeer vervolgens op ijs gedurende een totale lengte van 4 minuten (fietsen met 3 s aan/15 s uit) in blokken met 24 putjes met behulp van een sonde met 24 koppen.
- Breng de inhoud over naar een putje van 96 diep, voeg 125 μL wasmiddelvoorraad toe en sluit af met een siliconenafdichting. Draai het blok voorzichtig rond op 4 °C gedurende 1 uur. U kunt ook dodecylmaltoside (DDM) en cholesterolhemisuccinaat (CHS) rechtstreeks aan de blokken met 24 putjes toevoegen en deze op een rocker-shaker bij 4 °C plaatsen.
- Centrifugeer het blok bij 2600 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C en breng het supernatans over in een nieuw blok met 96 diepe putjes.
- Bereid een voorraad van 50% Strep-Tactin-hars met hoge capaciteit voor, vooraf in evenwicht gebracht met lysisbuffer.
- Voeg 100 μL geresuspendeerde harsvoorraad toe aan elk putje.
- Bedek het blok met een siliconen afdichting en draai het gedurende 2 uur op 4 °C en centrifugeer vervolgens zeer kort (tot 200 × g) om vloeistof te verwijderen die aan het deksel blijft kleven.
- Plaats een filterplaat met 96 putjes op een leeg blok en breng het mengsel van hars en supernatans over in de filterplaat. Spoel de putjes van het deepwell-blok met 800 μL HT-wasbuffer en breng ze over naar het filterblok om de maximale hoeveelheid hars op te vangen.
- Laat de buffer doordruppelen of centrifugeer kort bij 200 × g en vang de doorstroming op. Plaats de filterplaat op een nieuw wasblok en was de hars met 800 μL HT-wasbuffer, zodat de buffer erdoorheen kan druppelen (of kort centrifugeren). Herhaal de wasstap nog twee keer en centrifugeer het blok gedurende 3 minuten op 500 × g om de resterende HT-wasbuffer te verwijderen.
- Plaats de filterplaat op een microtiterplaat met 96 putjes. Voeg 50 μL HT-elutiebuffer toe en incubeer met schudden bij kamertemperatuur gedurende 10 minuten. Eliteer monsters door centrifugeren bij 500 × g gedurende 3 min.
- Laat 15 μL van het geëlueerde monster op een met Coomassie gekleurde SDS-PAGE-gel lopen om de eiwitexpressie te controleren. Laad de resterende monsters van eluent op een Size Exclusion Chromatography (SEC) of Fluorescentie-detectie Size Exclusion Chromatography (FSEC)-systeem om de eiwitmonodispersiteit in DDM/CHS te evalueren.
8. Transductie voor expressie op grote schaal
OPMERKING: De volgende stappen zijn het standaard RESOLUTE-protocol voor SLC-expressie. Individuele doelen vereisen verdere optimalisatie voor de expressietijd, incubatietemperatuur en concentratie van natriumbutyraat. Verder optimaliseren we routinematig de multipliciteit van infectie met het baculovirus door verschillende volumetrische verhoudingen van het P3-virus te testen die worden gebruikt om de aan suspensie aangepaste HEK293-cellen te infecteren in kleinschalige experimenten. Dit is tijdbesparend, maakt gebruik van technieken en apparatuur die al voorhanden zijn en evalueert direct de gewenste experimentele output. Deze empirische methode vereist echter heroptimalisatie bij elke amplificatie van het P3-virus, en er zijn andere methoden beschikbaar om de baculovirusdeeltjeste kwantificeren 49,50,51,52.
- Schaal het vereiste volume van aan suspensie aangepaste HEK293-cellen in HEK293-medium op.
- Verdun aan suspensie aangepaste HEK293-cellen tot 1 × 106 cellen/ml en laat ze gedurende 24 uur groeien (bij 170 tpm voor rolflessen van 2 liter en 105 omw/min voor rolflessen van 3 liter).
- Voeg 30 ml P3-virus per liter cellen toe en voeg 5 mM natriumbutyraat toe. Incubeer cellen bij 37 °C gedurende 48 uur of bij 30 °C gedurende 72 uur.
- Tijdens en na de incubatieperiode is een belangrijke stap het onderzoeken van de cellen met behulp van helderveldmicroscopie om te controleren op microbiële besmetting en levensvatbaarheid van de cel. Beoordeel eiwitexpressie en lokalisatie met behulp van fluorescentiemicroscopie met een GFP-compatibele filterkubus.
- Oogst de cellen door centrifugeren bij 900 × g gedurende 20 min.
- Was de celpellet door deze te resuspenderen in 10-15 ml PBS per liter celkweek en pellet opnieuw op 900 × g gedurende 20 minuten.
- Vries de celpellets snel in vloeibare stikstof in en bewaar ze bij -80 °C.
9. Eiwit zuivering
OPMERKING: Het volgende is de standaard RESOLUTE-methode voor SLC-zuivering voor 5 L celkweek. Voor elk SLC-doel moet empirisch het optimale wasmiddel worden bepaald. Bereid van tevoren de basisbuffer, de wasmiddelvoorraadoplossing, de was-, elutie- en SEC-buffers voor (tabel 2). Voor een lijst van de standaard geteste wasmiddelen, zie tabel 3. ATP en MgCl2 in de wasbuffer verminderen verontreiniging door heat-shock eiwitten.
- Dag 1
- Ontdooi de bevroren celpellet in een waterbad dat op kamertemperatuur is ingesteld.
- Bereid de oplosbuffer voor met 135 ml basisbuffer en drie proteaseremmercocktailtabletten. Laat de tabletten oplossen.
- Resuspendeer de ontdooide pellet met oplosbuffer. Gebruik 27 ml oplosbaarheidsbuffer per 10-15 g celpellet, voeg DNase toe en giet in een ijskoude Dounce-homogenisator. Homogeniseer de oplossing door de zuiger ongeveer 20x op en neer te bewegen, waarbij de homogenisator op ijs blijft.
OPMERKING: Het resuspensievolume moet worden geoptimaliseerd op basis van het doeleiwit en de massa van de celpellets, die zal variëren als gevolg van de celdichtheid bij de oogst. Commerciële DNase kan worden toegevoegd volgens de instructies van de fabrikant. DNase kan ook intern tot expressie worden gebracht en gezuiverd met behulp van vastgestelde protocollen55. - Voeg de wasmiddelvoorraadoplossing toe tot de eindconcentratie van 1%.
OPMERKING: Een belangrijke stap voor het optimaliseren van eiwitzuivering is het identificeren van het optimale reinigingsmiddel voor SLC-solubilisatie en -zuivering, dat empirisch moet worden geïdentificeerd. We hebben regelmatig verschillende wasmiddelen gebruikt; elk afzonderlijk en in combinatie met cholesteryl hemisuccinaat, waarbij de verhouding tussen wasmiddel en CHS-massa op 10:1 wordt gehouden. - Breng het oplosmengsel over in conische buizen van 50 ml. Draai langzaam gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Centrifugeer de oplossing bij 50.000 × g gedurende 30 minuten bij 4 °C. Verzamel de supernatant.
- Breng 4-6 ml bedvolume Strep-Tactin-hars in evenwicht met de basisbuffer.
- Voeg evenwichtshars toe aan het opgeloste supernatans en draai gedurende 2 uur bij 4 °C.
- Giet de oplossing in een zwaartekrachtstroomkolom en laat de oplossing erdoorheen stromen.
- Was de hars met 30x het bedvolume van Strep wash buffer in 3 stappen van gelijk volume.
- Voeg 3-5 ml elutiebuffer toe, incubeer gedurende 15 minuten en vang het eluaat op. Herhaal deze stap nog vier keer, waarbij u elke elutiefractie afzonderlijk verzamelt.
OPMERKING: Een belangrijke stap is eiwitelutie uit de Strep-Tactin-hars, waarbij het belangrijk is om 15 minuten te incuberen na elke toevoeging van de elutiebuffer. Doorgaans bevat de eerste eluaatfractie een lagere eiwitconcentratie als gevolg van de verdunning van de elutiebuffer door de resterende wasbuffer. Daarom kan de eerste eluaatfractie worden weggegooid als een hogere uiteindelijke eiwitconcentratie gewenst is. Als alternatief kan de eiwitconcentratie in alle seriële eluties ook worden geanalyseerd met behulp van SDS-PAGE om het protocol te optimaliseren. - Meet de eiwitconcentratie met behulp van UV-absorptiespectroscopie, combineer de gewenste elutiefracties en voeg 3C-protease toe in een verhouding van 1:5 (w/w) tot 1:10 (w/w).
- Draai 's nachts langzaam rond bij 4 °C.
OPMERKING: Stappen 9.1.12 en 9.1.13 zijn alleen nodig als de GFP-tag moet worden verwijderd. Als het verwijderen van de tag niet nodig is, gaat u rechtstreeks verder met stap 9.2.4. Als alternatief kan het eiwit 's nachts op 4 °C worden gehouden om de volgende dag door te gaan. Bovendien moeten voor SLC's met verminderde stabiliteit de proteaseconcentratie, incubatietijd en temperatuur mogelijk worden geoptimaliseerd. De 3C-protease is actief over een breed temperatuurbereik en maakt optimalisatie mogelijk die het meest geschikt is voor verschillende SLC's.
- Dag 2
- Breng 2-4 ml bedvolume kobaltmetaalaffiniteitshars in evenwicht met SEC-buffer.
- Voeg gebalanceerde kobaltmetaalaffiniteitshars toe aan het nachtelijke 3C-reactiemengsel en draai gedurende 1 uur bij 4 °C.
- Giet de oplossing in een zwaartekrachtstroomkolom en vang de doorstroming op.
- Concentreer de doorstroming in een centrifugaalfilter met een cut-off-centrifugaalfilter van 100 kDa door te centrifugeren bij 3.000 × g bij 4 °C en meng het monster voorzichtig om de 5 minuten totdat het gewenste SEC-injectievolume is bereikt.
- Breng een dextran-agarose-gebaseerde grootte-uitsluitingschromatografiekolom in evenwicht met behulp van SEC-buffer. De SEC-procedure moet worden uitgevoerd bij 4 °C (gekoelde kamer of koelkamer).
OPMERKING: Belangrijkste stap: Afhankelijk van de oligomere toestand van de SLC, kan een andere kolom, zoals een op agarose gebaseerde kolom voor het uitsluiten van grootte, worden gebruikt om SEC uit te voeren. - Injecteer het monster in de monsterlus en voer het SEC-programma uit, met een debiet dat de kolomdruk onder de specificaties van de kolomfabrikant ligt. Verzamel met behulp van een fractieverzamelaar automatisch fracties van 0,3 ml gedurende de gehele SEC-run.
- Dompel piekfracties samen, meet de UV-absorptie en concentreer in een centrifugaalconcentrator met een cut-off van 100 kDa het vereiste volume/concentratie door te centrifugeren bij 3.000 × g bij 4 °C.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SLC-genen kunnen worden gekloond van RESOLUTE pDONR-plasmiden naar BacMam-vectoren voor expressie van zoogdieren
De beschreven protocollen voor klonen, expressie en zuivering zijn succesvol gebleken voor veel SLC-transporters over meerdere eiwitvouwen. Desalniettemin bevatten de procedures verschillende controlepunten voor het bewaken van de voortgang, waardoor optimalisatie mogelijk is om rekening te houden met verschillen in expressie, eiwitvouwing, lipide- en wasmiddelafhankelijke stabiliteit en gevoeligheid voor bufferomstandigheden.
Controlepunten tijdens SLC-klonen en expressie op kleine schaal
In de kloneringsstappen moet agarosegelelektroforese worden gebruikt om de juiste grootte van de PCR- en verteringsproducten te garanderen. Op dezelfde manier kunnen de Gateway- en transpositiereacties worden gevalideerd met een kolonie-PCR-reactie (Figuur 2A,B). De aanmaak van baculovirussen kan indien nodig worden gecontroleerd met behulp van standaardtechnieken 49,50,51,52. De eerste expressie moet op kleine schaal worden gedaan, waarbij de eiwitopbrengst wordt geëvalueerd door SDS-PAGE (Figuur 2B). Evenzo moeten de fractie van groene fluorescerende cellen, de totale eiwitexpressie en de eiwitlokalisatie worden genoteerd met behulp van fluorescentiemicroscopie (Figuur 2C,D). Eiwitexpressie moet worden geoptimaliseerd voor celtype, temperatuur, tijd en de noodzaak om chaperonnes of complexe partners samen tot expressie te brengen. De expressie kan verder worden geoptimaliseerd door het construct aan te passen om ongeordende N- en C-termini af te kappen, op basis van secundaire structuurvoorspelling56,57,58, en de typen en plaatsing van affiniteitstags te testen. De stabiliteit van eiwitten moet op kleine schaal worden geëvalueerd door middel van FSEC (Figuur 2E), SEC-gebaseerde thermische verschuivingstest (SEC-Ts) en DSF 41,42,59,60,61,62. Kleine moleculen, zoals substraten en remmers, wasmiddelen, cholesterolhemisuccinaat, lipiden en pH moeten worden getest op het verbeteren van de eiwitstabiliteit, rekening houdend met de functie van het eiwit en de oorspronkelijke subcellulaire omgeving en de daaropvolgende zuiveringsbuffers die dienovereenkomstig worden aangepast. In zowel kleinschalige als grootschalige expressieopstellingen moeten cellen met behulp van microscopie worden gecontroleerd op levensvatbaarheid en contaminatie.
Optimalisatie van de zuivering van transporters op grote schaal
Elke stap van grootschalige eiwitzuivering moet worden geëvalueerd door SDS-PAGE, inclusief fluorescentie in de gel om specifiek het GFP-gelabelde eiwit en de enzymatische verwijdering van dat label te controleren. In de praktijk zien de GFP-gelabelde SLC-expressiecellen er geelachtig groen uit. Na chromatografische elutie met dubbele streptokokken ziet het eluens met het gezuiverde eiwit er fluorescerend neongroen uit onder wit licht. Chemisch en structureel homogeen eiwit moet een enkele monodisperse A280-piek opleveren tijdens grootte-uitsluitingschromatografie (Figuur 2F,G), en moet een enkele band vertonen op SDS-PAGE. De SDS-PAGE-band die overeenkomt met de verwachte SLC, en eventuele onverwachte banden, moeten worden geanalyseerd met behulp van tryptische spijsverteringsmassaspectrometrie. Meerdere banden op de SDS-PAGE-gel duiden op proteolytische afbraak, verontreinigende eiwitten of SDS-resistente oligomeren. Verontreinigende eiwitten kunnen worden verwijderd door de NaCl-concentratie van de oplosbaarheidsbuffer te verhogen of de affiniteitstag te veranderen. Proteolyse kan worden beperkt door de zuiverheid van het eiwit te verbeteren, ervoor te zorgen dat alle stappen worden uitgevoerd bij 4 °C of op ijs, en het protocol te optimaliseren om de tijd van elke stap te minimaliseren. Als het SEC-profiel een brede piek, meerdere pieken of een grote leegtepiek heeft (zoals het paarse spoor van figuur 2F), moeten de constructie- en zuiveringsomstandigheden op kleine schaal worden geoptimaliseerd met behulp van FSEC, SEC-Ts of DSF 41,42,59,60,61,62.
Figuur 1: Schema van de RESOLUTE workflow voor SLC-expressie en -zuivering. Stap-voor-stap illustratie van recombinatie klonen, BacMam baculovirus bereiding, eiwitexpressie en -zuivering, en stroomafwaartse toepassingen. Afkortingen: SLC = opgeloste stofdrager; Cryo-EM = cryo-elektronenmicroscopie; SEC = grootte-uitsluitingschromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Representatieve resultaten voor SLC-expressie en -zuivering . (A) Kolonie-PCR van high-throughput SLC-klonering in pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) Coomassie-gekleurde SDS-PAGE van enkele kleinschalige, parallelle expressietest van 24 verschillende SLC's van volledige lengte. (C) Fluorescentie in de cel van een GFP-gelabelde SLC die voornamelijk op het plasmamembraan is gelokaliseerd. (D) In-cel fluorescentie van een GFP-gelabelde SLC met significante intracellulaire lokalisatie. (E) Representatieve FSEC-sporen voor vier SLC's opgelost op een hydrofiele, neutrale UHPLC-kolom op basis van silica. Representatieve SEC-sporen voor zes SLC's gezuiverd op een (F) dextran-agarose of (G) agarose-grootte-uitsluitingschromatografiekolommen. Molecuulgewichten van het SLC-complex en het wasmiddel dat voor de zuivering wordt gebruikt, worden aangegeven wanneer de oligomere toestand experimenteel is bepaald. Afkortingen: SLC = opgeloste stofdrager; GFP = groen fluorescerend eiwit; FSEC = fluorescentie-detectie grootte uitsluitingschromatografie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Stroomafwaartse toepassingen van gezuiverde SLC's . (A) Microfoto van SLC1A1 in wasmiddel. (B) 2D-klassegemiddelden van SLC1A1 in wasmiddel. (C) Ruwe fluorescentie van CPM thermische denaturatietest van SLC10A6 geïncubeerd met verschillende concentraties taurolithocholzuur 3-sulfaat. (D) Eerste derivaat van CPM thermische denaturatie van SLC10A6. De smelttemperatuur van de SLC10A6 steeg met 10 °C in aanwezigheid van 120 μM Taurolithocholzuur 3-sulfaat. Afkortingen: SLC = opgeloste stofdrager; CPM = N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)fenyl]maleimide. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Vector Naam | Antibiotische markers | Tags voor zuivering | Screening Primers | bp toegevoegd tijdens PCR | ||
| pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW | VersterkerR | C-klem | pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) | ~350 | ||
| 3C-proteaseplaats GFP | ||||||
| Dubbele streptokokken | GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC) | |||||
| Zijn10 | ||||||
| pDONR221 zei: | KanR | geen | M13 Vooruit | ~190 | ||
| M13 Achteruit | ||||||
Tabel 1: Plasmiden die worden gebruikt voor het klonen van RESOLUTE en het genereren van BacMam.
| Oplossing | Compositie |
| DH10Bac selectieplaten | LB-agarplaten met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline, 7 μg/ml gentamycine, 40 μg/ml IPTG en 100 μg/ml bluo-gal |
| 2x LB medium (met antibiotica) | 2x LB bouillon met 50 μg/ml kanamycine, 10 μg/ml tetracycline en 7 μg/ml gentamycine |
| HT Lysis buffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, EDTA-vrije proteaseremmer |
| HT Was buffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS |
| HT Elution buffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 mM D-biotine |
| Basis buffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl |
| Wasmiddel voorraad oplossing | 10% (w/v) wasmiddel, met of zonder 1% CHS, al naar gelang het geval. Meng een nacht bij 4 °C en bewaar bij -20 °C. |
| Streptokokken wasbuffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, wasmiddel op 3-voudige CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP |
| Streptokokken elutie buffer | 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotine, wasmiddel met 3-voudige CMC |
| Buffer voor grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) | 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, wasmiddel op 2-voudige CMC. Filtreer door een membraan van 0,22 μM. |
| Natrium butyraat | 1 M oplossing in DPBS, bewaren bij -20 °C voor langdurig gebruik. |
Tabel 2: Een lijst van oplossingen die in dit protocol worden gebruikt en hun samenstelling.
| Wasmiddel systeem | Extractie concentratie | Zuiveringsconcentratie (% m/v) |
| DDM | 1% | 0.03% |
| DDM + CHS | 1% + 0.1% | 0.03% + 0.003% |
| DM | 1% | 0.25% |
| DM+CHS | 1% + 0.1% | 0.25% + 0.025% |
| NG | 1% | 0.60% |
| OG | 1.5% | 1.50% |
| LDAO | 1% | 0.07% |
| LDAO + CHS | 1% + 0.1% | 0.07% + 0.007% |
| C12E8 | 1% | 0.015% |
| C12E8 + CHS | 1% + 0.1% | 0.015% + 0.0015% |
| C12E9 + CHS | 1% + 0.1% | 0.01 + 0.001% |
| CYMAL-5 | 1% | 0.40% |
| LMNG | 1% | 0.005% |
| LMNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.005% + 0.0005% |
| GDN | 1% | 0.02% |
| Digitonine | 0.05% | |
| OGNG + CHS | 1% + 0.1% | 0.18% + 0.018% |
| C12E10 + CHS | 1% + 0.1% | 0.04% + 0.004% |
| Fos Choline-12 | 1% | 0.14% |
Tabel 3: Standaarddetergentia die worden gebruikt om de oplosbaarheid van het membraan en de monodispersiteit en stabiliteit van SLC te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De ontwikkeling van SLC-gerichte therapieën is belemmerd gebleven door het ontbreken van systematische karakterisering van de transporterfunctie. Dit heeft geleid tot onevenredig minder geneesmiddelen die zich op deze eiwitklasse richten in vergelijking met GPCR's en ionkanalen63, ondanks hun talrijke rollen in normale en pathofysiologische processen. RESOLUTE is een internationaal consortium dat zich richt op het ontwikkelen van geavanceerde onderzoekstechnieken en -instrumenten om het huidige SLC-onderzoek te versnellen en te verbeteren. Als onderdeel van RESOLUTE hebben we deze protocollen ontwikkeld voor efficiënt klonen, constructscreening en grootschalige expressie en zuivering van menselijke SLC's.
Hier beschrijven we schaalbare SLC-kloon- en expressiemethoden die met succes werden gebruikt om systematisch de menselijke SLC-transporters te onderzoeken, inclusief vermeende en wees-SLC's. Met name SLC's die op deze manier zijn gezuiverd, zijn met succes gebruikt in latere studies van transporterstructuur, biochemie, functie, bindmiddelgeneratie en binding van kleine moleculen. We gebruiken deze methode regelmatig om milligramhoeveelheden van verschillende SLC's te zuiveren en onder optimale omstandigheden kan het hele protocol, inclusief de kloon- en weefselkweekstappen, in 4-5 weken worden voltooid.
Onze methode is geoptimaliseerd voor zuinigheid en parallellisme om systematisch meerdere doelen te evalueren. Deze high-throughput-methode kan echter ook gemakkelijk worden aangepast aan het parallel genereren van constructies voor een enkel doel met verschillende afkappingen of tags door gebruik te maken van verschillende kloonprimers of vectoren. Dit is vergelijkbaar met methoden die ook meerdere constructen optimaliseren voor een target64, hoewel ons protocol verdere efficiëntie biedt met parallel klonen, baculovirusgeneratie en expressietesten. Transfectie biedt een kortere tijd tussen het klonen van constructen en expressie door af te zien van het baculovirusgeneratie65, maar is aanzienlijk duurder en arbeidsintensiever voor expressie op grote schaal. Daarentegen zijn stabiele cellijnen waarschijnlijk minder duur voor grootschalige expressie66, maar het genereren van klonale cellijnen met een hoge expressie kan meer tijd en gespecialiseerde middelen vergen. Ten slotte, terwijl dit protocol menselijke cellijnen gebruikt voor eiwitproductie, zijn insectencellijnen zoals van Spodoptera frugiperda en Trichoplusia ni ook met succes gebruikt voor grootschalige SLC-expressie 5,31,64. Expressie in menselijke cellijnen verhoogt de mediakosten, maar biedt meer native-achtige modificaties na translatie en lipidenomgeving39,67.
Hoewel het protocol kan worden aangepast voor verschillende membraantransporters en experimentele behoeften, zijn verschillende factoren van invloed op de kwaliteit en opbrengst van de gezuiverde eiwitmonsters. Hoewel het ideaal is om eiwitten van volledige lengte te bestuderen, kan een zekere mate van sequentie-afkapping nodig zijn om betere expressie-, zuiverings- en reconstitutieopbrengsten te bereiken. Alle RESOLUTE SLC-constructen zijn gelabeld met een splitsbare GFP, die waardevol is bij het bewaken van SLC-expressie, cellulaire lokalisatie en zuivering. Het aan suspensie aangepaste HEK293-celexpressiesysteem dat in deze experimenten wordt gebruikt, heeft geleid tot superieure opbrengsten en wordt aanbevolen, hoewel we routinematig ook eiwitten produceren zonder complexe glycosylering via de aan suspensie aangepaste HEK293 GnTl-cellijn. De incubatietemperatuur en -lengte voor eiwitexpressie door getransduceerde cellen moeten voor elk doel worden geoptimaliseerd, hoewel we hebben vastgesteld dat 72 uur bij 30 °C een goede standaard is.
Alle stappen van de eiwitzuivering moeten worden uitgevoerd op ijs of bij 4 °C en zodra het gezuiverde eiwit snel is ingevroren, moeten vries-dooicycli worden vermeden. Het type en de hoeveelheid detergentia die worden gebruikt in membraanoplosbaarheids- en zuiveringsbuffers zijn van cruciaal belang en moeten voor elke SLC empirisch worden bepaald.
De SLC's die met deze methode worden gezuiverd, leveren homogene en structureel en functioneel intacte monsters op, die kunnen worden gebruikt voor een verscheidenheid aan biochemische en biofysische studies. Het observeren van enkelvoudige, discrete deeltjes van het opgeloste en gezuiverde SLC-eiwit door negatieve kleuring en Cryo-EM (Figuur 3A,B) kan veelbelovend zijn voor latere structuurbepaling37. De gezuiverde SLC in wasmiddel kan worden gebruikt voor biofysische tests zoals thermische stabiliteitstest (Figuur 3C,D) om de eiwitinteracties met kleine moleculen zoals substraten, remmers of lipiden te onderzoeken 59,62. Ten slotte kunnen de SLC's die met behulp van dit protocol in biochemische assays zijn gezuiverd, worden gereconstitueerd tot liposomen of nanodiscs voor functionele assays68 en worden gebruikt voor het genereren en selecteren van antilichamen en nanobody 69,70. Hoewel het een uitdaging blijft om deze methoden aan te passen aan de doorvoer die nodig is voor de ontdekking van nieuwe SLC-gerichte kleine moleculen 1, is er veelbelovende vooruitgang geboekt op het gebied van in vitro high-throughput screeningtechnologieën71,72,73,74.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat er geen tegenstrijdige financiële belangen zijn.
Acknowledgments
Dit werk werd uitgevoerd binnen het RESOLUTE-project. RESOLUTE heeft financiering ontvangen van de Gemeenschappelijke Onderneming voor het initiatief innovatieve geneesmiddelen 2 in het kader van subsidieovereenkomst nr. 777372. Deze gemeenschappelijke onderneming wordt ondersteund door het onderzoeks- en innovatieprogramma Horizon 2020 van de Europese Unie en EFPIA. Dit artikel geeft alleen de mening van de auteurs weer en noch IMI, noch de Europese Unie en EFPIA zijn verantwoordelijk voor enig gebruik dat kan worden gemaakt van de informatie in het artikel. Het pHTBV-plasmide werd vriendelijk ter beschikking gesteld door Prof. Frederick Boyce (Harvard).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 3C protease | Produced in-house | ||
| 50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators | Sartorius | VS0242 | |
| 5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside | Anatrace | C325 | CYMAL-5 |
| 96-well bacmid purification kit | Millipore | LSKP09604 | Montage Plasmid Miniprep |
| 96-well block (2 mL) | Greiner Bio-One | 780271 | |
| Adhesive plastic seals | Qiagen | 19570 | Tape Pads |
| Agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 29091596 | Superose 6 Increase 10/300 GL |
| Benzonase DNAse | Produced in-house | ||
| BisTris | Sigma Aldrich | B9754 | |
| Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt | Anatrace | CH210 | CHS |
| Cobalt metal affinity resin | Takara Bio | 635653 | TALON Metal Affinity Resin |
| D(+)-Biotin | Sigma Aldrich | 851209 | |
| Dextran-agarose size exclusion chromatography column | Cytiva | 28990944 | Superdex 200 Increase 10/300 GL |
| Digitonin | Apollo Scientific | BID3301 | |
| Dounce tissue grinder (40 mL) | DWK Life Sciences | 357546 | |
| EDTA-free protease inhibitor cocktail | Sigma Aldrich | 4693132001 | cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10500064 | |
| Fos-Choline-12 | Anatrace | F308S | FS-12 |
| Glycerol | Sigma Aldrich | G5516 | |
| Glyco-diosgenin | Anatrace | GDN101 | GDN |
| Gravity flow columns | Cole-Parmer | WZ-06479-25 | |
| HEK293 medium | Thermo Fisher | 12338018 | FreeStyle 293 medium |
| HEPES | Apollo Scientific | BI8181 | |
| Hydrophilic, neutral silica UHPLC column | Sepax | 231300-4615 | Unix-C SEC-300 4.6 x 150 |
| Imidazole | Sigma Aldrich | 56750 | |
| Insect transfection reagent | Sigma Aldrich | 71259 | Reagent |
| Lauryl Maltose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG310 | LMNG |
| Magnesium Chloride Hexahydrate | Sigma Aldrich | M2670 | |
| Micro-expression shaker | Glas-Col | 107A DPMINC24CE | |
| NaCl | Sigma Aldrich | S9888 | |
| n-Decyl-β-D-Maltoside | Anatrace | D322 | DM |
| n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside | Anatrace | D310 | DDM |
| n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide | Anatrace | D360 | LDAO |
| n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | N324S | NG |
| n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside | Anatrace | O311D | OGNG |
| Octaethylene Glycol Monododecyl Ether |
Anatrace | O330 | C12E8 |
| Octyl Glucose Neopentyl Glycol | Anatrace | NG311 | OGNG |
| Phosphate Buffered Saline | Sigma Aldrich | D8537 | DPBS |
| Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether | Anatrace | AP1210 | C12E10 |
| Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether | Anatrace | APO129 | C12E9 |
| Porous seal for tissue culture plates | VWR | 60941-084 | Rayon Films for Biological Cultures |
| Proteinase K | New England Biolabs | P8107S | |
| Recombination enzyme mix | Thermo Fisher | 11791020 | Gateway LR Clonase II |
| Serum-free insect media | Gibco | 10902088 | Sf-900 II serum-free media |
| Sodium Butyrate | Sigma Aldrich | 303410 | |
| Sonicator 24-head probe | Sonics | 630-0579 | |
| Sonicator power unit | Sonics | VCX 750 | |
| Strep-Tactin resin | IBA Life Sciences | 2-5030-025 | Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S7903 | |
| Sucrose Monododecanoate | Anatrace | S350 | DDS |
| Suspension-adapted HEK293 cells | Thermo Fisher | A14527 | Expi293F |
| Transfection reagent | Sigma Aldrich | 70967 | GeneJuice Transfection Reagent |
References
- Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G.
- Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
- Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
- Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
- Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
- Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
- Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
- Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
- Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
- Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
- Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
- Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
- Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
- Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
- Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
- Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
- Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
- Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
- Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
- Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
- Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
- Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
- Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
- Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
- Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
- Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
- Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S.
- Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
- Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
- Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
- Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
- Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
- Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
- Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
- Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
- Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
- Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
- Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
- Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
- Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
- Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
- Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
- Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
- Bergkessel, M., Guthrie, C.
- Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
- Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
- Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
- Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
- Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
- Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
- Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
- Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
- Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
- Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
- Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
- Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
- Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
- Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
- Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
- Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
- Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
- Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
- Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
- Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
- Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
- Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
- Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
- Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
- Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
- Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
- Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).
