Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

High-throughput ekspression og oprensning af humane opløste stofbærere til strukturelle og biokemiske undersøgelser

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturelle og biokemiske undersøgelser af humane membrantransportører kræver milligram mængder stabilt, intakt og homogent protein. Her beskriver vi skalerbare metoder til at screene, udtrykke og rense transportørtransportører af menneskeligt opløst stof ved hjælp af kodonoptimerede gener.

Abstract

Opløste bærere (SLC'er) er membrantransportører, der importerer og eksporterer en række endogene og eksogene substrater, herunder ioner, næringsstoffer, metabolitter, neurotransmittere og lægemidler. På trods af at den har vist sig at være attraktive terapeutiske mål og markører for sygdom, er denne gruppe proteiner stadig relativt underdrugged af nuværende lægemidler. Lægemiddelforskningsprojekter for disse transportører hæmmes af begrænset strukturel, funktionel og fysiologisk viden, i sidste ende på grund af vanskelighederne med ekspression og oprensning af denne klasse af membranindlejrede proteiner. Her demonstrerer vi metoder til at opnå milligram mængder af humane SLC-transportørproteiner med høj renhed ved hjælp af kodonoptimerede gensekvenser. I forbindelse med en systematisk udforskning af konstruktionsdesign og high-throughput ekspression sikrer disse protokoller bevarelsen af målproteinernes strukturelle integritet og biokemiske aktivitet. Vi fremhæver også kritiske trin i den eukaryote celleekspression, affinitetsoprensning og størrelsesudelukkelseskromatografi af disse proteiner. I sidste ende giver denne arbejdsgang rene, funktionelt aktive og stabile proteinpræparater, der er egnede til strukturbestemmelse med høj opløsning, transportundersøgelser, småmolekyleengagementsanalyser og in vitro-screening med høj kapacitet.

Introduction

Membranproteiner har længe været mål for både forskere og medicinalindustrien. Af disse er de opløste bærere (SLC'er) en familie af over 400 sekundære transportørgener kodet i det menneskelige genom1. Disse transportører er involveret i import og eksport af adskillige molekyler, herunder ioner2, neurotransmittere3, lipider 4,5,6,7, aminosyrer8, næringsstoffer 9,10,11 og lægemidler 12. Med en sådan bredde af substrater er disse proteiner også impliceret i en række patofysiologier gennem transport af toksiner13, transport af og hæmning af misbrugsstoffer 14,15 eller skadelige mutationer16. Bakterielle homologer har tjent som prototyper for den grundlæggende transportmekanisme i flere SLC-familier 17,18,19,20,21,22,23,24,25. I modsætning til humane proteiner udtrykkes prokaryote ortologer ofte bedre i det velforståede Escherichia coli-ekspressionssystem 26,27 og er mere stabile i de mindre vaskemidler, der giver velordnede krystaller til røntgenkrystallografi28. Imidlertid komplicerer sekvens- og funktionelle forskelle brugen af disse fjernt beslægtede proteiner til lægemiddelopdagelse29,30. Derfor er direkte undersøgelse af det humane protein ofte nødvendigt for at dechiffrere virkningsmekanismen for lægemidler rettet mod SLC'er 31,32,33,34,35. Mens de seneste fremskridt inden for kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM) har muliggjort strukturel karakterisering af SLC'er under mere native-lignende forhold36,37, er vanskeligheder med at udtrykke og rense disse proteiner fortsat en udfordring for at udvikle målrettet terapi og diagnostik.

For at afhjælpe denne udfordring har RESOLUTE-konsortiet (re-solute.eu) udviklet ressourcer og protokoller til storskala ekspression og oprensning af humane SLC-familieproteiner38. Med udgangspunkt i codonoptimerede gener har vi udviklet metoder til high-throughput kloning og screening af SLC-konstruktioner. Disse metoder blev systematisk anvendt på hele familien af SLC'er, generne blev klonet ind i BacMam virusekspressionssystemet, og proteinekspressionen blev testet i humane cellelinjer39 baseret på tidligere beskrevne metoder til kloning med høj kapacitet og ekspressionstest40. Sammenfattende klones SLC-genet fra pDONR221-plasmidet til en pHTBV1.1-vektor. Denne konstruktion bruges efterfølgende til at transponere genet af interesse til en bacmidvektor til transfektering af insektceller, som inkluderer en cytomegaloviruspromotor og forstærkerelementer til ekspression i pattedyrceller. Det resulterende baculovirus kan anvendes til at transducere pattedyrceller til ekspression af mål-SLC-proteinet.

Vi videreudviklede standardiserede metoder til storskala ekspression og stabil oprensning af udvalgte SLC'er (figur 1). Denne protokol indeholder flere kontrolpunkter for at lette effektiv fejlfinding og minimere variabilitet mellem eksperimenter. Især rutinemæssig overvågning af proteinekspression og lokalisering samt optimering i lille skala af oprensningsbetingelser for individuelle mål blev hjulpet af Strep og Green Fluorescent Protein (GFP) tags41,42.

I sidste ende kan disse kemisk rene og strukturelt homogene proteinprøver anvendes til strukturel bestemmelse ved røntgenkrystallografi eller kryo-elektronmikroskopi (Cryo-EM), biokemiske målengagementsassays, immunisering til bindemiddelgenerering og cellefrie funktionelle undersøgelser via rekonstitution i kemisk definerede liposomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

BEMÆRK: Alle codonoptimerede RESOLUTE SLC-gener er blevet deponeret i AddGene43, hvis links er tilgængelige på listen over RESOLUTE offentlige reagenser44. Disse gener er blevet klonet i pDONR221-plasmidet og tillader direkte kloning af generne i destinationsvektoren ved hjælp af rekombinationskloning45. For at maksimere parallelisme dyrkes bakterie-, insekt- og pattedyrceller i blokformat til henholdsvis bacmidproduktion (afsnit 3), baculovirusamplifikation (afsnit 5) og ekspressionstest (afsnit 6). Til disse trin kræves en mikroekspressionsryster for at sikre tilstrækkelig blanding og beluftning.

1. (High-throughput) kloning af SLC'er i pHTBV1.1 bacmid

BEMÆRK: Kloningstrinnet bruger en rekombinationskloningsprotokol til effektiv kloning og omdannelse til Escherichia coli (E. coli) ved hjælp af varmechokmetoden46. Protokollen er designet til high-throughput og parallel kloning af flere mål eller konstruktioner, men kan let tilpasses til mindre skalaer.

  1. I en plade med 96 brønde tilsættes 150 ng af pDONR221 SLC-klonen og 100 ng af pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-vektoren. Reaktionsvolumenet bringes til 8 μL med 10 mM Tris pH 8,0, og derefter tilsættes 2 μL af rekombinationsenzymblandingen.
  2. Der inkuberes ved stuetemperatur i 1 time, tilsættes 1 μL proteinase K, og der inkuberes i 30 minutter ved 37 °C.
  3. Brug 4 μL af reaktionsblandingen til at omdanne 50 μL kemisk kompetente E. coli MACH-1-celler ved hjælp af varmechokmetoden46 og SOC-medium til genvinding. Pladen på LB-agar indeholdende 5% saccharose eller SOC-agar, suppleret med 100 μg/ml ampicillin.
  4. Identificer kolonier, der huser pHTBV1.1-vektoren med SLC-genindsatsen ved hjælp af passende primere (se tabel 1) og standardprotokoller for koloni PCR47.
  5. Rens det rekombinante plasmid fra enkeltkolonier med genet af interesse ved hjælp af et plasmid miniprep kit.

2. Gennemførelse i national ret

BEMÆRK: Følgende trin bruges til at transponere SLC-generne fra pHTBV1.1-vektoren til et bacmid til BacMam-baculovirusgenerering i Sf9-celler. Ved hjælp af varmechokmetoden46 omdannes pHTBV1.1-vektoren til DH10Bac-kompetente E. coli-celler , som indeholder en overordnet bacmid med en lacZ-mini-attTn7-fusion. Transponering sker mellem elementerne i pHTBV1.1-vektoren og moderbacmidet i nærvær af transponeringsproteinerne tilvejebragt af et hjælperplasmid48. Se tabel 2 for sammensætningen af opløsninger, der anvendes i denne protokol.

  1. Brug 3 μL 100-200 ng/μL renset pHTBV1.1 vektor-DNA til at transformere DH10Bac ved hjælp af varmechokmetoden i en 96-brønds PCR-plade. Cellerne genvindes ved at inkubere dem i genvindingsmedium i 4-5 timer ved 37 °C, mens de rystes ved 700 o/min i en mikroekspressionsryster.
  2. Spred 50 μL transformerede celler på DH10Bac udvælgelsesplader. Pladerne inkuberes ved 37 °C i 48 timer dækket med folie.
  3. Vælg en enkelt hvid koloni (indeholdende det rekombinante DNA) og stribe til fortynding. Der inkuberes ved 37 °C natten over.

3. Bacmid-produktion med høj kapacitet

BEMÆRK: Protokollen beskriver trinene til ekstraktion af bacimider ved hjælp af et 96-brønds bacmid rensningssæt.

  1. Podes individuelle hvide kolonier (isoleret fra de stribede til fortyndingsplader) i brønde i en 96-dyb brøndblok, der indeholder 1 ml 2x LB-medium (tabel 2).
  2. Dækket med en porøs forsegling og inkuber ved 37 °C natten over ved 700 o/min i en mikroekspressionsryster.
  3. Der fremstilles en glycerolstamme af cellerne ved at blande 120 μL af kulturen med 30 μL 60% glycerol i en mikrotiterplade og opbevares ved -80 °C.
  4. Den dybe brøndblok centrifugeres ved 2.600 × g i 30 minutter. Supernatanten dekanteres i en egnet beholder til dekontaminering. Vend blokken om, og bank forsigtigt på et køkkenrulle. Der tilsættes 250 μL opløsning 1 til hvert hul i blokken ved hjælp af en flerkanalspipette.
  5. Resuspender pellets; Brug om nødvendigt en flerkanalspipette.
  6. Tilsæt 250 μL opløsning 2 til hvert hul og forsegl med en silikonemåtte. Vend forsigtigt 5x og inkuber ved stuetemperatur i 10 min. Spin meget kort.
  7. Tilsæt 300 μL opløsning 3 og forsegl med en silikonemåtte. Bland forsigtigt, men grundigt ved at vende 5x.
  8. Prøven lægges på is i 20 minutter, hvorefter den centrifugeres ved 2 600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  9. Den klare supernatant overføres til en frisk blok med 96 huller. Der centrifugeres igen ved 2.600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  10. I en frisk 96-dyb brøndblok dispenseres 0,8 ml 100% isopropanol pr. Brønd. Der tilsættes 0,8 ml supernatanter fra de tilsvarende huller.
  11. Pipetter forsigtigt op og ned med en pipette, og inkuber derefter på is i 30 minutter eller natten over ved 4 °C for at give mere bacmid.
  12. Der centrifugeres ved 2.600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  13. Sprøjt ydersiden af blokken med 70% ethanol i et biologisk sikkerhedsskab, åbn blokken, og supernatanten kasseres.
  14. Tilsæt 500 μL 70% ethanol (v / v) til hver brønd, og bank forsigtigt på blokken for at vaske pelleten. Dæk med en klæbende plastforsegling og centrifuger ved 2.600 × g i 30 minutter ved 4 °C.
  15. Åbn blokken inde i et biologisk sikkerhedsskab, og kassér supernatanten. Bank meget forsigtigt på blokken på et køkkenrulle for at fjerne ethanolen. Lad blokken tørre enten inde i emhætten i 1-2 timer eller i en 50 °C ovn.
  16. Tilsæt 50 μL steril TE-buffer for at resuspendere bacmid DNA'et og forsegle ved hjælp af en klæbende plastforsegling. Overfør indholdet til en V-bund mikrotiterplade. Bacmid DNA'et opbevares ved 4 °C, indtil testrensningen er afsluttet, og opbevares derefter ved -20 °C.
    BEMÆRK: Selvom det ikke måles rutinemæssigt, kan der generelt forventes et udbytte på 500 til 2.000 ng / μL bacmid DNA.
  17. Brug standard koloni PCR-metoder47 og følgende vektorprimere til at screene for bacimider, der med succes inkorporerer målgenet:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    BEMÆRK: Amplikon vil være ca. 700 bp større end målgenet.

4. Transfektion

BEMÆRK: Disse trin bruges til at transfektere Sf9 insektceller med bacmid produceret, hvilket får insektcellerne til at generere baculoviruspartikler (P0).

  1. Dyrk Sf9-celler i serumfrit insektmedium til en densitet på 2,0-2,4 × 106 celler / ml. Fortynd cellerne til 2 × 105 celler/ml i serumfrit insektmedium, og fordel 1 ml af de fortyndede celler i en 24-brønds vævskulturplade. Inkluder kun transfektionsreagens såvel som en kontrol, der kun indeholder celler . Pladen inkuberes i en befugtet inkubator ved 27 °C i 1 time for at muliggøre cellefastgørelse.
  2. 38 μL pr. hul serumfrit insektmedium blandes med 2 μL pr. hul transfektionsreagenset. Dispenser 40 μL af blandingen i en steril 96-brønds fladbundet mikrotiterplade. Der tilsættes 2 μL rekombinant bacmid-DNA ved 0,5-2,0 μg/μL, pladen dækkes og inkuberes inde i det mikrobiologiske sikkerhedsskab i 15 minutter.
  3. Der tilsættes 160 μL serumfrit insektmedium i hvert hul i mikrotiterpladen indeholdende DNA-transfektionsreagensblandingen.
  4. Aspirer substrat fra cellerne i trin 4.1. Der tilsættes forsigtigt 200 μL bacmidtransfektionsreagens-medium-blanding på cellerne, dækkes til og inkuberes i 4 timer i en befugtet inkubator ved 27 °C.
  5. Tilsæt 400 μL serumfrit insektmedium suppleret med 2% FBS til hvert hul. For at reducere fordampningen skal du overføre pladen til en ren plastpose, men forsegle den ikke. Pladen inkuberes ved 27 °C i 72 timer i en befugtet inkubator.
  6. Efter 3 dage overføres mediet fra pladen til en steril 96-dyb brøndblok og centrifugeres ved 1.500 × g i 20 minutter ved stuetemperatur. Den klarede supernatant, der indeholder P0-baculovirus, overføres til en steril 96-dyb brøndblok og opbevares 4 °C væk fra lys.

5. BacMam baculovirus forstærkning

BEMÆRK: Følgende trin bruges til at forstærke det oprindelige P0-baculovirus til viruslagre med højere titer; nemlig P1, P2 og P3. Den endelige P3-titer er egnet til transduktion og proteinekspression. For effektivitet og parallelisme bruger denne protokol faste volumetriske forhold til viral amplifikation, som er blevet empirisk optimeret. Hvis de efterfølgende transducerede celler imidlertid ikke viser GFP-fluorescens og øget cellediameter ved mikroskopi, eller hvis proteinekspression mislykkes (se pkt. 6 og 8), bør baculovirusamplifikation genoptimeres til en lav infektionsmultiplicitet ved hvert trin efter kvantificering af baculovirustiteren 49,50,51,52 og infektion overvåget ved GFP-fluorescensmikroskopi og øget cellediameter 53.

  1. Forbered P1-virusstammen ved at dyrke Sf9-celler i serumfrit insektmedium til en densitet på 2 × 106 celler / ml, tilsæt 2% FBS, og frø cellerne i en 24-dyb brøndblok i et slutvolumen på 3 ml pr. Brønd. Tilsæt 120 μL P0-viruslager til cellerne.
  2. Blokken inkuberes ved 27 °C, mens den rystes ved 450 o/min i en mikroekspressionsryster i 66-72 timer. Blokken centrifugeres ved 1 500 × g i 20 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten høstes i blokke med 96 dybe huller. Opbevares som P1-viruslager ved 4 °C væk fra lys.
  3. Forbered P2-virusstammen ved at inficere 50 ml Sf9-celler (2 × 106 celler/ml celletæthed), dyrket i serumfrit insektmedium suppleret med 2% FBS, med 250 μL P1-viruslager. Cellerne inkuberes ved 27 °C under omrystning ved 110 omdr./min.
  4. P2-virusstammen høstes efter 66-72 timer ved centrifugering ved 1 500 × g i 20 minutter og opbevares ved 4 °C væk fra lys.
  5. Forbered P3-viruslager ved at inficere det ønskede volumen af Sf9-celler (2 × 106 celler / ml celletæthed) med 1:200 (v / v) P2-virusstamme. Cellerne inkuberes ved 27 °C under omrystning ved 110 omdr./min.
  6. Efter 66-72 timer centrifugeres ved 1 500 × g i 20 minutter, og P3-virus høstes ved opsamling af supernatanten og opbevares ved 4 °C beskyttet mod lys.

6. Transduktion til ekspressionstest

BEMÆRK: Følgende afsnit beskriver ekspressionstest i lille skala og kan ændres til parallel test af flere konstruktioner ved hjælp af dybe brøndblokke.

  1. Der fremstilles en 20 % (w/v) polyethylenglycolopløsning ved opløsning af 200 g PEG 10.000 og 12 g NaCl i 600 ml dobbeltdestilleret H2O. Der omrøres og bringes til et slutvolumen på 1.000 ml. Autoklave løsningen.
  2. Der tilsættes 300 μL høstet P1-virus i hullerne i en 24-dyb brøndblok og 75 μL af PEG-opløsningen til hvert hul. Blokken inkuberes i en mikroekspressionsryster ved 18 °C, mens den rystes ved 300 o/min i 5 minutter, og blokken opbevares ved 4 °C natten over.
  3. Blokken rystes igen ved 300 o/min i 30 minutter ved 18 °C, og blokken centrifugeres ved 3.000 × g i 45 min. Supernatanten kasseres med en pipette i et mikrobiologisk sikkerhedsskab.
  4. Forbered suspensionstilpassede HEK293-celler i HEK293-medium til en densitet på 2 × 106 celler / ml, og frø 3 ml i hvert hul, der indeholder viruspelleten, suppleret med 5 mM natriumbutyrat.
  5. Blokken inkuberes ved 30 °C med 8% CO2 under omrystning ved 200-250 o/min i 72 timer.
    BEMÆRK: De leverandøranbefalede CO2 -koncentrationer under cellekultur er forskellige for suspensionstilpassede og forfædre HEK293 cellelinjer på henholdsvis 8% og 5%.
  6. Høst cellerne ved centrifugering ved 900 × g i 20 minutter og vask hvert hul med 1 ml PBS.
    BEMÆRK: Aspirer 10 μL resuspenderede celler og se cellerne under et fluorescensmikroskop med en GFP-kompatibel filterkube for at vurdere proteinekspression og lokalisering. Opsug 10-15 μL resuspenderede celler og kør en SDS-PAGE-gel med hele celler til GFP-fluorescensdetektioni gel 54.
  7. Der centrifugeres igen ved 900 × g i 20 min. Pellets fryses ved -80 °C.

7. Testrensning i lille skala med høj kapacitet

BEMÆRK: Følgende trin beskriver en arbejdsgang til hurtig testrensning i et blokformat med 24 brønde til screening af ekspressionsniveauerne for individuelle SLC'er. Se tabel 2 for sammensætningen af opløsninger, der anvendes i denne protokol.

  1. Tilsæt 1 ml HT-lysisbuffer til hver brønd af høstede celler og fortsæt med at sonikere på is i en samlet længde på 4 minutter (cykling ved 3 s on / 15 s off) i 24-brøndblokke ved hjælp af en 24-hovedsonde.
  2. Overfør indholdet til en 96 dyb brøndblok, tilsæt 125 μL vaskemiddel, og forsegl med en siliciumforsegling. Blokken drejes forsigtigt ved 4 °C i 1 time. Alternativt tilsættes dodecylmaltosid (DDM) og kolesterolhemisuccinat (CHS) direkte til blokkene med 24 brønde og anbringes på en vipperyster ved 4 °C.
  3. Blokken centrifugeres ved 2600 × g i 20 minutter ved 4 °C, og supernatanten overføres til en ny blok med 96 dybe huller.
  4. Forbered et 50% lager af Strep-Taktin-harpiks med høj kapacitet, der er præekvilibreret med lysisbuffer.
  5. Der tilsættes 100 μL opslæmmet harpiksbestand til hvert hul.
  6. Blokken dækkes med en siliciumforsegling og roteres ved 4 °C i 2 timer, og centrifugeres derefter meget kort (op til 200 × g) for at fjerne væske, der klæber til dækslet.
  7. En filterplade med 96 brønde anbringes oven på en tom blok, og harpiks/supernatantblandingen overføres til filterpladen. Skyl hullerne i den dybe brøndblok med 800 μL HT-vaskebuffer og overfør dem til filterblokken for at opsamle den maksimale mængde harpiks.
  8. Lad bufferen dryppe igennem eller centrifugere kortvarigt ved 200 × g , og opsaml gennemstrømningen. Placer filterpladen oven på en ny vaskeblok, og vask harpiksen med 800 μL HT-vaskebuffer, så bufferen drypper igennem (eller centrifugeres kortvarigt). Gentag vasketrinnet to gange mere, og centrifuger blokken ved 500 × g i 3 minutter for at fjerne den resterende HT-vaskebuffer.
  9. Placer filterpladen oven på en mikrotiterplade med 96 brønde. Der tilsættes 50 μL HT-elueringsbuffer og inkuberes med omrystning ved stuetemperatur i 10 min. Elueringsprøver ved centrifugering ved 500 × g i 3 min.
  10. Kør 15 μL af den eluerede prøve på en Coomassie-farvet SDS-PAGE gel for at kontrollere proteinekspressionen. Læg de resterende elueringsprøver på et SEC- (Size Exclusion Chromatography) eller Fluorescence-detection Size Exclusion Chromatography (FSEC)-system for at evaluere proteinmonodispersitet i DDM/CHS.

8. Transduktion til storstilet ekspression

BEMÆRK: Følgende trin er standard RESOLUTE-protokollen til SLC-udtryk. Individuelle mål vil kræve yderligere optimering af ekspressionstid, inkubationstemperatur og koncentration af natriumbutyrat. Desuden optimerer vi rutinemæssigt baculovirus-infektionsmangfoldigheden ved at teste forskellige volumetriske forhold mellem P3-viruset, der bruges til at inficere de suspensionstilpassede HEK293-celler i små eksperimenter. Dette er tidseffektivt, bruger teknikker og udstyr, der allerede er til rådighed, og evaluerer direkte det ønskede eksperimentelle output. Denne empiriske metode kræver imidlertid reoptimering med hver amplifikation af P3-virussen, og andre metoder er tilgængelige til kvantificering af baculoviruspartiklerne 49,50,51,52.

  1. Opskaler den nødvendige mængde suspensionstilpassede HEK293-celler i HEK293-medium.
  2. Fortynd suspensionstilpassede HEK293-celler til 1 × 106 celler/ml og voks i 24 timer (ved 170 omdr./min. for 2 L rulleflasker og 105 omdr./min. for 3 L rulleflasker).
  3. Tilsæt 30 ml P3-virus pr. Liter celler og tilsæt 5 mM natriumbutyrat. Cellerne inkuberes ved 37 °C i 48 timer eller ved 30 °C i 72 timer.
  4. Under og efter inkubationsperioden er et vigtigt trin at undersøge cellerne ved hjælp af brightfieldmikroskopi for at kontrollere mikrobiel kontaminering og cellelevedygtighed. Vurder proteinekspression og lokalisering ved hjælp af fluorescensmikroskopi med en GFP-kompatibel filterkube.
  5. Cellerne høstes ved centrifugering ved 900 × g i 20 min.
  6. Cellepillen vaskes ved at resuspendere den i 10-15 ml PBS pr. liter cellekultur og pellet igen ved 900 × g i 20 min.
  7. Snapfryse cellepillerne i flydende nitrogen og opbevar dem ved -80 °C.

9. Proteinrensning

BEMÆRK: Følgende er standard RESOLUTE metoden til SLC oprensning for 5 L cellekultur. For hvert SLC-mål skal det optimale vaskemiddel bestemmes empirisk. Forbered basebuffer, vaskemiddelopløsning, vaske-, eluerings- og SEC-buffere på forhånd (tabel 2). For en liste over de testede standardvaskemidler, se tabel 3. ATP ogMgCl2 i vaskebufferen reducerer kontaminering med varmechokproteiner.

  1. Dag 1
    1. Optø den frosne cellepille i et vandbad indstillet til stuetemperatur.
    2. Forbered opløselighedsbuffer med 135 ml basebuffer og tre proteasehæmmercocktailtabletter. Lad tabletterne opløses.
    3. Resuspender den optøede pellet med opløselighedsbuffer. Brug 27 ml opløselighedsbuffer pr. 10-15 g cellepellet, tilsæt DNase, og hæld i en iskold Dounce homogenisator. Opløsningen homogeniseres ved at bevæge stemplet op og ned ca. 20x, mens homogenisatoren holdes på is.
      BEMÆRK: Resuspensionsvolumenet skal optimeres baseret på målproteinet og cellepelletmassen, som vil variere på grund af celletætheden ved høst. Kommerciel DNase kan tilføjes i henhold til producentens anvisninger. DNase kan også udtrykkes og renses internt ved hjælp af etablerede protokoller55.
    4. Tilsæt vaskemiddelstamopløsning til 1% endelig koncentration.
      BEMÆRK: Et vigtigt skridt til optimering af proteinrensning er at identificere det optimale vaskemiddel til SLC-opløselighed og oprensning, som skal identificeres empirisk. Vi har regelmæssigt brugt forskellige rengøringsmidler; hver for sig og i kombination med cholesterylhemisuccinat, idet vaskemidlet i forhold til CHS-masseforholdet holdes på 10:1.
    5. Opløselighedsblandingen overføres til 50 ml koniske rør. Drej langsomt i 1 time ved 4 °C.
    6. Opløsningen centrifugeres ved 50.000 × g i 30 minutter ved 4 °C. Supernatanten hentes.
    7. Ligevægt 4-6 ml sengevolumen af Strep-Taktin-harpiks med basisbufferen.
    8. Der tilsættes ekvilibreret harpiks til den opløselige supernatant, og der roteres i 2 timer ved 4 °C.
    9. Hæld opløsningen i en tyngdekraftsstrømningskolonne, og lad opløsningen strømme igennem.
    10. Vask harpiksen med 30x sengens volumen af Strep vaskebuffer i 3 lige store volumentrin.
    11. Tilsæt 3-5 ml elueringsbuffer, inkuber i 15 min, og opsaml eluatet. Gentag dette trin fire gange mere, og saml hver elueringsfraktion separat.
      BEMÆRK: Et vigtigt trin er proteineluering fra Strep-Taktin-harpiksen, hvor det er vigtigt at inkubere i 15 minutter efter hver tilsætning af elueringsbufferen. Den første eluatfraktion indeholder typisk en lavere koncentration af protein på grund af fortyndingen af elueringsbufferen med restvaskebufferen. Derfor kan den første eluatfraktion kasseres, hvis der ønskes en højere endelig proteinkoncentration. Alternativt kan proteinkoncentrationen i alle serielle elutioner også analyseres ved hjælp af SDS-PAGE for at optimere protokollen.
    12. Mål proteinkoncentrationen ved UV-absorbansspektroskopi, kombiner de ønskede elueringsfraktioner, og tilsæt 3C-protease i forholdet 1:5 (w/w) til 1:10 (w/w).
    13. Drej langsomt natten over ved 4 °C.
      BEMÆRK: Trin 9.1.12 og 9.1.13 er kun nødvendige, hvis GFP-mærket skal fjernes. Hvis det ikke er nødvendigt at fjerne tagget, skal du fortsætte direkte til trin 9.2.4. Alternativt kan proteinet opbevares ved 4 °C natten over for at fortsætte den følgende dag. For SLC'er med nedsat stabilitet kan proteasekoncentrationen, inkubationsperioden og temperaturen desuden muligvis optimeres. 3C-proteasen er aktiv over en lang række temperaturer og giver mulighed for optimering, der er bedst egnet til forskellige SLC'er.
  2. Dag 2
    1. Ligevægt 2-4 ml sengevolumen af koboltmetalaffinitetsharpiks med SEC-buffer.
    2. Der tilsættes ekvilibreret koboltmetalaffinitetsharpiks til 3C-reaktionsblandingen natten over, og der roteres i 1 time ved 4 °C.
    3. Hæld opløsningen i en tyngdekraftsstrømningskolonne og saml gennemstrømningen.
    4. Koncentrer gennemstrømningen i et 100 kDa afskåret centrifugalfilter ved centrifugering ved 3.000 × g ved 4 °C, og bland forsigtigt prøven hvert 5. minut, indtil det ønskede SEC-injektionsvolumen er nået.
    5. Ligevægt i en dextran-agarose-baseret størrelsesekskluderingskromatografikolonne ved hjælp af SEC-buffer. SEC-proceduren skal udføres ved 4 °C (afkølet kammer eller kølerum).
      BEMÆRK: Nøgletrin: Afhængigt af SLC's oligomere tilstand kan en anden kolonne, såsom en agarosebaseret størrelsesekskluderingskromatografikolonne, bruges til at udføre SEC.
    6. Injicer prøven i prøvesløjfen, og kør SEC-programmet med en sådan strømningshastighed, at søjletrykket er under kolonneproducentens specifikationer. Brug en brøkopsamler til automatisk at indsamle 0,3 ml fraktioner over hele SEC-kørslen.
    7. Poolspidsfraktioner, mål UV-absorbans, og koncentrer dem i en 100 kDa afskåret centrifugalkoncentrator til det krævede volumen/koncentration ved centrifugering ved 3.000 × g ved 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SLC-gener kan klones fra RESOLUTE pDON-plasmider til BacMam-vektorer til pattedyrekspression
De beskrevne protokoller til kloning, ekspression og oprensning har vist sig at være vellykkede for mange SLC-transportører på tværs af flere proteinfolder. Ikke desto mindre omfatter procedurerne flere kontrolpunkter til overvågning af fremskridt, hvilket giver mulighed for optimering for at tage højde for forskelle i ekspression, proteinfoldning, lipid- og vaskemiddelafhængig stabilitet og følsomhed over for bufferforhold.

Kontrolpunkter under SLC-kloning og udtryk i lille skala
I kloningstrinnene bør agarosegelelektroforese anvendes for at sikre den korrekte størrelse af PCR og fordøjelsesprodukterne. På samme måde kan gateway- og transponeringsreaktionerne valideres med en koloni-PCR-reaktion (figur 2A, B). Baculovirusgenerering kan overvåges ved hjælp af standardteknikker efter behov 49,50,51,52. Den indledende ekspression skal udføres i lille skala og evaluere proteinudbyttet ved SDS-PAGE (figur 2B). Tilsvarende bør fraktionen af grønne fluorescerende celler, total proteinekspression og proteinlokalisering noteres ved hjælp af fluorescensmikroskopi (figur 2C, D). Proteinekspression bør optimeres til celletype, temperatur, tid og nødvendigheden af co-ekspression chaperoner eller komplekse partnere. Udtrykket kan optimeres yderligere ved at ændre konstruktionen til at afkorte uordnede N- og C-termini, baseret på sekundær strukturforudsigelse56,57,58 og teste typer og placering af affinitetsmærker. Proteinstabilitet bør evalueres i lille skala ved hjælp af FSEC (figur 2E), SEC-baseret termisk forskydningsassay (SEC-T) og DSF 41,42,59,60,61,62. Små molekyler, såsom substrater og hæmmere, vaskemidler, kolesterolhemisuccinat, lipider og pH bør testes for at forbedre proteinstabiliteten i betragtning af proteinets funktion og native subcellulære miljø og efterfølgende oprensningsbuffere modificeret i overensstemmelse hermed. I både små og store ekspressionsopsætninger skal celler overvåges ved hjælp af mikroskopi for levedygtighed og kontaminering.

Optimering af transportørrensning i stor skala
Hvert trin i proteinoprensning i stor skala bør evalueres af SDS-PAGE, herunder fluorescens i gel for specifikt at overvåge det GFP-mærkede protein og enzymatisk fjernelse af dette mærke. I praksis ser de GFP-mærkede SLC-ekspressive celler gulgrønne ud. Efter Twin-Strep-tag kromatografisk eluering vises elueringsmidlet indeholdende det rensede protein fluorescerende neongrønt under hvidt lys. Kemisk og strukturelt homogent protein skal give en enkelt monodispers A280-top under størrelseseksklusionskromatografi (figur 2F, G) og skal vise et enkelt bånd på SDS-PAGE. SDS-PAGE-båndet svarende til den forventede SLC og eventuelle uventede bånd skal analyseres ved hjælp af tryptisk fordøjelsesmassespektrometri. Flere bånd på SDS-PAGE-gelen indikerer enten proteolytisk nedbrydning, forurenende proteiner eller SDS-resistente oligomerer. Kontaminerende proteiner kan fjernes ved at øge NaCl-koncentrationen af opløselighedsbufferen eller ændre affinitetsmærket. Proteolyse kan begrænses ved at forbedre proteinets renhed, sikre, at alle trin udføres ved 4 °C eller på is, og optimere protokollen for at minimere tiden for hvert trin. Hvis SEC-profilen har en bred top, flere toppe eller en top med stort tomrum (f.eks. det lilla spor i figur 2F), skal konstruktions- og rensningsforholdene optimeres i lille skala ved hjælp af FSEC, SEC-Ts eller DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over RESOLUTE workflow for SLC-udtryk og oprensning. Trin-for-trin illustration af rekombinationskloning, BacMam baculoviruspræparation, proteinekspression og oprensning og downstream-applikationer. Forkortelser: SLC = fast bærer; Kryo-EM = kryo-elektronmikroskopi; SEC = størrelseseksklusionskromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Repræsentative resultater for SLC-ekspression og oprensning . (A) Koloni-PCR af SLC-kloning med høj kapacitet i pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) Coomassie-farvet SDS-PAGE af enkelt småskala, parallel ekspressionstest af 24 forskellige SLC'er i fuld længde. (C) In-cell fluorescens af en GFP-mærket SLC, der primært lokaliseres til plasmamembranen. (D) In-cell fluorescens af en GFP-mærket SLC med signifikant intracellulær lokalisering. E) Repræsentative FSEC-spor for fire SLC'er opløst på en hydrofil, neutral silicabaseret UHPLC-søjle. Repræsentative SEC-spor for seks SLC'er renset på enten en (F) dextran-agarose eller (G) agarosestørrelseseksklusionskromatografikolonner. Molekylvægten af SLC-komplekset og vaskemiddel anvendt til rensning er angivet, hvor oligomere tilstand er blevet eksperimentelt bestemt. Forkortelser: SLC = fast bærer; GFP = grønt fluorescerende protein; FSEC = fluorescensdetektionsstørrelse, eksklusionskromatografi. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Downstream-anvendelser af rensede SLC'er . (A) Mikrografi af SLC1A1 i vaske- og rengøringsmiddel. (B) 2D-klasse gennemsnit af SLC1A1 i vaskemiddel. C) Rå fluorescens af termisk denatureringsanalyse af CPM af SLC10A6 inkuberet med forskellige koncentrationer af Taurolithocholsyre-3-sulfat. (D) Første derivat af CPM termisk denaturering af SLC10A6. SLC10A6's smeltetemperatur steg med 10 °C ved tilstedeværelse af 120 μM Taurolithocholic acid 3-sulfat. Forkortelser: SLC = fast bærer; CPM = N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimid. Klik her for at se en større version af denne figur.

Vektor navn Antibiotiske markører Mærker til rensning Screening primere bp tilføjet under PCR
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW ForstærkerR C-terminal pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
3C proteasested GFP
Twin-Strep GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Hans10
pDONR221 KanR ingen M13 fremad ~190
M13 Baglæns

Tabel 1: Plasmider anvendt til RESOLUT kloning og BacMam-generation.

Opløsning Sammensætning
DH10Bac valgplader LB-agarplader indeholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin, 7μg/ml gentamycin, 40 μg/ml IPTG og 100 μg/ml bluo-gal
2x LB medium (med antibiotika) 2x LB bouillon indeholdende 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin og 7 μg/ml gentamycin
HT Lysis buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, EDTA-fri proteasehæmmer
HT Vask buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS
HT Elution buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 mM D-Biotin
Base buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl
Opløsning af vaskemiddel 10% (w/v) vaskemiddel, med eller uden 1% CHS, alt efter hvad der er relevant. Bland ved 4 °C natten over og opbevar ved -20 °C.
Strep vask buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, vaskemiddel ved 3 gange CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP
Strep elution buffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotin, vaskemiddel ved 3 gange CMC
SEC-buffer (størrelsesekskluderingskromatografi) 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, vaskemiddel ved 2 gange CMC. Filtrer gennem en 0,22 μM membran.
Natriumbutyrat 1 M opløsning i DPBS, opbevares ved -20 °C til langvarig brug.

Tabel 2: En liste over opløsninger, der anvendes i denne protokol, og deres sammensætning.

Vaskemiddel system Ekstraktionskoncentration Oprensningskoncentration (% w/v)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
DM 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
NG 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
CYMAL-5 1% 0.40%
LMNG 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
Digitonin 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos cholin-12 1% 0.14%

Tabel 3: Standardvaskemidler, der anvendes til test af membranopløselighed og SLC-monodispersitet og stabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Udviklingen af SLC-målrettede terapier er forblevet hæmmet på grund af fraværet af systematisk karakterisering af transportørfunktionen. Dette har ført til uforholdsmæssigt færre lægemidler rettet mod denne proteinklasse i forhold til GPCR'er og ionkanaler63, på trods af deres mange roller i normale og patofysiologiske processer. RESOLUTE er et internationalt konsortium, der har til formål at udvikle banebrydende forskningsteknikker og værktøjer til at fremskynde og forbedre den nuværende SLC-forskning. Som en del af RESOLUTE har vi udviklet disse protokoller til effektiv kloning, konstruktionsscreening og storskala ekspression og oprensning af humane SLC'er.

Her beskriver vi skalerbare SLC-klonings- og ekspressionsmetoder, der med succes blev brugt til systematisk at udforske de humane SLC-transportører, herunder formodede og forældreløse SLC'er. Især SLC'er oprenset på denne måde er blevet anvendt med succes i efterfølgende undersøgelser af transportørstruktur, biokemi, funktion, bindemiddelgenerering og binding af små molekyler. Vi anvender regelmæssigt denne metode til at rense milligrammængder af forskellige SLC'er, og under optimale forhold kan hele protokollen, inklusive klonings- og vævskulturtrinnene, afsluttes på 4-5 uger.

Vores metode er optimeret til økonomi og parallelitet til systematisk at evaluere flere mål. Denne high-throughput metode er imidlertid også let tilpasset den parallelle generering af konstruktioner til et enkelt mål med forskellige trunkeringer eller tags ved hjælp af forskellige kloningsprimere eller vektorer. Dette svarer til metoder, der også optimerer flere konstruktioner til et mål64, selvom vores protokol tilbyder yderligere effektivitet med parallel kloning, baculovirusgenerering og ekspressionstest. Transfektion giver en kortere tid mellem konstruktiv kloning og ekspression ved at give afkald på baculovirus generation65, men er betydeligt dyrere og besværligere for storstilet udtryk. I modsætning hertil er stabile cellelinjer sandsynligvis billigere for storskala ekspression66, men generering af højt udtrykte klonale cellelinjer kan kræve mere tid og specialiserede ressourcer. Endelig, mens denne protokol bruger humane cellelinjer til proteinproduktion, er insektcellelinjer som fra Spodoptera frugiperda og Trichoplusia ni også blevet anvendt med succes til storskala SLC-ekspression 5,31,64. Ekspression i humane cellelinjer øger medieomkostningerne, men tilbyder mere native-lignende ændringer efter oversættelse og lipidmiljø39,67.

Mens protokollen kan tilpasses forskellige membrantransportører og eksperimentelle behov, påvirker flere faktorer kvaliteten og udbyttet af de oprensede proteinprøver. Selvom det er ideelt at studere proteiner i fuld længde, kan det være nødvendigt med en vis grad af sekvensafkortning for at opnå bedre ekspression, oprensning og rekonstitutionsudbytter. Alle RESOLUTE SLC-konstruktioner er blevet mærket med en spaltbar GFP, hvilket er værdifuldt til overvågning af SLC-ekspression, cellulær lokalisering og oprensning. Det suspensionstilpassede HEK293-celleekspressionssystem, der anvendes i disse eksperimenter, har ført til overlegne udbytter og anbefales, selvom vi rutinemæssigt også producerer proteiner uden kompleks glykosylering via den suspensionstilpassede HEK293 GnTl-cellelinje. Inkubationstemperaturen og længden for proteinekspression af transducerede celler bør optimeres for hvert mål, selvom vi har fundet 72 timer ved 30 °C som en god standard.

Alle trin i proteinrensningen bør udføres på is eller ved 4 °C, og når det rensede protein er snapfrosset, bør fryse-optøningscyklusser undgås. Typen og mængden af rengøringsmidler, der anvendes i membranopløseligheds- og rensningsbuffere, er kritisk og bør bestemmes empirisk for hver SLC.

SLC'erne oprenset med denne metode giver homogene og strukturelt og funktionelt intakte prøver, som kan bruges til en række biokemiske og biofysiske undersøgelser. Observation af enkelte, diskrete partikler af det opløselige og oprensede SLC-protein ved negativ plet og Cryo-EM (figur 3A, B) kan være lovende for efterfølgende strukturbestemmelse37. Den rensede SLC i vaskemiddel kan bruges til biofysiske assays såsom termisk stabilitetsanalyse (figur 3C,D) for at undersøge proteininteraktionerne med små molekyler såsom substrater, inhibitorer eller lipider 59,62. Endelig kan SLC'erne, der er renset ved hjælp af denne protokol i biokemiske assays, rekonstitueres til liposomer eller nanodiske til funktionelle assays68 og anvendes til generering og udvælgelse af antistof og nanolegeme 69,70. Selv om det fortsat er en udfordring at tilpasse disse metoder til den gennemstrømning, der er nødvendig for opdagelsen af nye SLC-målrettede små molekyler 1, er der gjort lovende fremskridt inden for in vitro-screeningsteknologier med høj kapacitet71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev udført inden for RESOLUTE-projektet. RESOLUTE har modtaget støtte fra fællesforetagendet for initiativet om innovative lægemidler 2 i henhold til tilskudsaftale nr. 777372. Dette fællesforetagende modtager støtte fra EU's forsknings- og innovationsprogram Horisont 2020 og EFPIA. Denne artikel afspejler kun forfatternes synspunkter, og hverken IMI eller Den Europæiske Union og EFPIA er ansvarlige for enhver brug, der måtte blive gjort af oplysningerne deri. pHTBV-plasmidet blev venligst leveret af professor Frederick Boyce (Harvard).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

High-throughput ekspression oprensning humane opløste bærere strukturelle undersøgelser biokemiske undersøgelser membrantransportører endogene substrater eksogene substrater terapeutiske mål sygdomsmarkører lægemidler lægemiddelforskningsprojekter begrænset strukturel viden begrænset funktionel viden begrænset fysiologisk viden ekspressions- og oprensningsvanskeligheder milligrammængder kodonoptimerede gensekvenser konstruktionsdesign ekspression og high-throughput ekspression Bevarelse af strukturel integritet bevarelse af biokemisk aktivitet eukaryot celleekspression affinitetsoprensning størrelsesudelukkelseskromatografi strukturbestemmelse med høj opløsning transportundersøgelser, Analyser af engagement i små molekyler in vitro-screening med høj kapacitet
High-throughput ekspression og oprensning af humane opløste stofbærere til strukturelle og biokemiske undersøgelser
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter