Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturelle und biochemische Untersuchungen menschlicher Membrantransporter erfordern Milligrammmengen an stabilem, intaktem und homogenem Protein. Hier beschreiben wir skalierbare Methoden zum Screening, zur Expression und zur Reinigung humaner Transporter gelöster Substanzen unter Verwendung von Codon-optimierten Genen.

Abstract

Solute Carrier (SLCs) sind Membrantransporter, die eine Reihe von endogenen und exogenen Substraten importieren und exportieren, darunter Ionen, Nährstoffe, Metaboliten, Neurotransmitter und Pharmazeutika. Obwohl sich diese Gruppe von Proteinen als attraktive therapeutische Ziele und Marker für Krankheiten erwiesen hat, wird sie von den derzeitigen Pharmazeutika immer noch relativ wenig unter Drogen gesetzt. Wirkstoffforschungsprojekte für diese Transporter werden durch begrenztes strukturelles, funktionelles und physiologisches Wissen behindert, was letztendlich auf die Schwierigkeiten bei der Expression und Reinigung dieser Klasse von membraneingebetteten Proteinen zurückzuführen ist. Hier demonstrieren wir Methoden, um hochreine Milligramm-Mengen von humanen SLC-Transporterproteinen unter Verwendung von Codon-optimierten Gensequenzen zu erhalten. In Verbindung mit einer systematischen Untersuchung des Konstruktdesigns und der Hochdurchsatzexpression stellen diese Protokolle die Erhaltung der strukturellen Integrität und biochemischen Aktivität der Zielproteine sicher. Wir beleuchten auch kritische Schritte in der eukaryotischen Zellexpression, der Affinitätsreinigung und der Größenausschlusschromatographie dieser Proteine. Letztendlich führt dieser Arbeitsablauf zu reinen, funktionell aktiven und stabilen Proteinpräparaten, die sich für hochauflösende Strukturbestimmungen, Transportstudien, niedermolekulare Engagement-Assays und In-vitro-Screenings mit hohem Durchsatz eignen.

Introduction

Membranproteine sind seit langem Ziele für Forscher und Pharmaindustrie gleichermaßen. Bei den Solute Carriers (SLCs) handelt es sich um eine Familie von über 400 sekundären Transportergenen, die im menschlichen Genom kodiert sind1. Diese Transporter sind am Import und Export zahlreicher Moleküle beteiligt, darunter Ionen2, Neurotransmitter3, Lipide 4,5,6,7, Aminosäuren8, Nährstoffe9,10,11 und Pharmazeutika 12. Mit einer solchen Breite von Substraten sind diese Proteine auch an einer Reihe von Pathophysiologien durch den Transport von Toxinen13, den Transport und die Hemmung durch Missbrauchsdrogen 14,15 oder schädliche Mutationen16 beteiligt. Bakterielle Homologe dienten als Prototypen für den grundlegenden Transportmechanismus mehrerer SLC-Familien 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Im Gegensatz zu humanen Proteinen werden prokaryotische Orthologe oft besser im gut verstandenen Escherichia coli-Expressionssystemexprimiert 26,27 und sind stabiler in den kleineren Detergenzien, die wohlgeordnete Kristalle für die Röntgenkristallographie liefern 28. Sequenzelle und funktionelle Unterschiede erschweren jedoch die Verwendung dieser entfernt verwandten Proteine für die Wirkstoffforschung29,30. Folglich ist oft eine direkte Untersuchung des menschlichen Proteins erforderlich, um den Wirkmechanismus von Medikamenten zu entschlüsseln, die auf SLCs abzielen 31,32,33,34,35. Während die jüngsten Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) die strukturelle Charakterisierung von SLCs unter nativeren Bedingungen ermöglicht haben36,37, bleibt die Schwierigkeit bei der Expression und Reinigung dieser Proteine eine Herausforderung für die Entwicklung zielgerichteter Therapeutika und Diagnostika.

Um diese Herausforderung zu bewältigen, hat das RESOLUTE-Konsortium (re-solute.eu) Ressourcen und Protokolle für die großflächige Expression und Reinigung von humanen Proteinen der SLC-Familie entwickelt38. Ausgehend von Codon-optimierten Genen haben wir Methoden für das Hochdurchsatz-Klonen und Screening von SLC-Konstrukten entwickelt. Diese Methoden wurden systematisch auf die gesamte Familie der SLCs angewendet, die Gene wurden in das virale Expressionssystem BacMam kloniert und die Proteinexpression wurde in humanen Zelllinien39 getestet, basierend auf zuvor beschriebenen Methoden für Hochdurchsatz-Klonierung und Expressionstests40. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das SLC-Gen aus dem pDONR221-Plasmid in einen pHTBV1.1-Vektor kloniert wird. Dieses Konstrukt wird anschließend verwendet, um das interessierende Gen in einen Bacmid-Vektor für die Transfektion von Insektenzellen zu transponieren, der einen Cytomegalievirus-Promotor und Enhancer-Elemente für die Expression in Säugetierzellen enthält. Das resultierende Baculovirus kann verwendet werden, um Säugetierzellen für die Expression des Ziel-SLC-Proteins zu transduzieren.

Wir haben standardisierte Methoden für die großtechnische Expression und stabile Aufreinigung ausgewählter SLCs weiterentwickelt (Abbildung 1). Dieses Protokoll enthält mehrere Prüfpunkte, um eine effektive Fehlerbehebung zu erleichtern und die Variabilität zwischen den Experimenten zu minimieren. Insbesondere die routinemäßige Überwachung der Proteinexpression und -lokalisierung sowie die Optimierung der Reinigungsbedingungen für einzelne Ziele in kleinem Maßstab wurden durch Streptokokken- und grün fluoreszierende Proteine (GFP)-Tags unterstützt41,42.

Letztendlich können diese chemisch reinen und strukturell homogenen Proteinproben für die Strukturbestimmung durch Röntgenkristallographie oder Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM), biochemische Target-Engagement-Assays, Immunisierung zur Bindergenerierung und zellfreie funktionelle Studien durch Rekonstitution in chemisch definierte Liposomen verwendet werden.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ANMERKUNG: Alle Codon-optimierten RESOLUTE SLC-Gene wurden in AddGene43 deponiert, dessen Links auf der Liste der öffentlichen RESOLUTE-Reagenzien44 verfügbar sind. Diese Gene wurden in das pDONR221-Plasmid kloniert und ermöglichen die direkte Klonierung der Gene in den Zielvektor mittels Rekombinationsklonierung45. Um die Parallelität zu maximieren, werden Bakterien-, Insekten- und Säugetierzellen im Blockformat für die Bacmid-Produktion (Abschnitt 3), die Baculovirus-Amplifikation (Abschnitt 5) und die Expressionstests (Abschnitt 6) gezüchtet. Für diese Schritte ist ein Mikroexpressionsschüttler erforderlich, um eine ausreichende Durchmischung und Belüftung zu gewährleisten.

1. (Hochdurchsatz-)Klonierung von SLCs in pHTBV1.1 bacmid

ANMERKUNG: Der Klonierungsschritt verwendet ein Rekombinationsklonprotokoll für effizientes Klonen und die Umwandlung in Escherichia coli (E. coli) unter Verwendung der Hitzeschockmethode46. Das Protokoll ist für das parallele Klonen mehrerer Ziele oder Konstrukte mit hohem Durchsatz ausgelegt, kann aber problemlos an kleinere Maßstäbe angepasst werden.

  1. In einer 96-Well-Platte werden 150 ng des pDONR221 SLC-Klons und 100 ng des pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-Vektors zugegeben. Das Reaktionsvolumen wird mit 10 mM Tris pH 8,0 auf 8 μl gebracht und dann 2 μl der Rekombinationsenzymmischung zugegeben.
  2. 1 h bei Raumtemperatur inkubieren, 1 μl Proteinase K zugeben und 30 min bei 37 °C inkubieren.
  3. Verwenden Sie 4 μl der Reaktionsmischung, um 50 μl chemisch kompetente E. coli MACH-1-Zellen unter Verwendung der Hitzeschockmethode46 und SOC-Medium zur Rückgewinnung umzuwandeln. Platte auf LB-Agar mit 5% Saccharose oder SOC-Agar, ergänzt mit 100 μg/ml Ampicillin.
  4. Identifizierung von Kolonien, die den pHTBV1.1-Vektor mit dem SLC-Geninsert beherbergen, unter Verwendung geeigneter Primer (siehe Tabelle 1) und Standardprotokollen für die Kolonie-PCR 47.
  5. Reinigen Sie das rekombinante Plasmid aus einzelnen Kolonien mit dem interessierenden Gen unter Verwendung eines Plasmid-Miniprep-Kits.

2. Umsetzung

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden verwendet, um die SLC-Gene aus dem pHTBV1.1-Vektor in ein Bacmid für die BacMam-Baculovirus-Generierung in Sf9-Zellen zu transponieren. Unter Verwendung des Hitzeschockverfahrens46 wird der pHTBV1.1-Vektor in DH10Bac-kompetente E. coli-Zellen transformiert, die ein Eltern-Bacmid mit einer lacZ-mini-attTn7-Fusion enthalten. Die Transposition erfolgt zwischen den Elementen des pHTBV1.1-Vektors und dem Mutter-Bacmid in Gegenwart der Transpositionsproteine, die von einem Helferplasmid48 bereitgestellt werden. Siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

  1. Unter Verwendung von 3 μl 100-200 ng/μl gereinigter pHTBV1.1-Vektor-DNA wird DH10Bac mit der Hitzeschockmethode in einer 96-Well-PCR-Platte transformiert. Die Zellen werden zurückgewonnen, indem sie 4-5 Stunden lang bei 37 °C in einem Rückgewinnungsmedium inkubiert werden, während sie bei 700 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler geschüttelt werden.
  2. Verteilen Sie 50 μl transformierte Zellen auf DH10Bac-Auswahlplatten. Die Platten bei 37 °C 48 h mit Folie abgedeckt inkubieren.
  3. Wählen Sie eine einzelne weiße Kolonie (die die rekombinante DNA enthält) und streifen Sie sie bis zur Verdünnung. Über Nacht bei 37 °C inkubieren.

3. Hochdurchsatz-Bacmid-Produktion

HINWEIS: Das Protokoll beschreibt die Schritte zur Extraktion von Bacmiden mit einem 96-Well-Bacmid-Reinigungskit.

  1. Einzelne weiße Kolonien (isoliert von den gestreiften bis verdünnten Platten) werden in Vertiefungen eines 96-Deep-Well-Blocks geimpft, der 1 ml 2x LB-Medium enthält (Tabelle 2).
  2. Mit einer porösen Dichtung abdecken und bei 37 °C über Nacht bei 700 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler inkubieren.
  3. Bereiten Sie einen Glycerinvorrat der Zellen vor, indem Sie 120 μl der Kultur mit 30 μl 60%igem Glycerin in einer Mikrotiterplatte mischen und bei -80 °C lagern.
  4. Zentrifugieren Sie den Deep-Well-Block bei 2.600 × g für 30 min. Dekantieren Sie den Überstand in einen geeigneten Behälter zur Dekontamination. Drehen Sie den Block um und klopfen Sie vorsichtig auf ein Papiertuch. Geben Sie 250 μl Lösung 1 mit einer Mehrkanalpipette in jede Vertiefung des Blocks.
  5. Resuspendieren Sie die Pellets; Verwenden Sie bei Bedarf eine Mehrkanalpipette.
  6. Geben Sie 250 μl Lösung 2 in jede Vertiefung und verschließen Sie sie mit einer Silikonmatte. 5x vorsichtig umdrehen und 10 min bei Raumtemperatur inkubieren. Ganz kurz drehen.
  7. Geben Sie 300 μl Lösung 3 hinzu und versiegeln Sie sie mit einer Silikonmatte. Vorsichtig aber gründlich mischen, indem man 5x umdreht.
  8. Die Probe wird 20 min lang auf Eis gelegt und dann bei 2.600 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert.
  9. Übertragen Sie den klaren Überstand in einen frischen 96-Well-Block. Bei 2.600 × g erneut 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  10. Geben Sie in einem frischen 96-Deep-Well-Block 0,8 ml 100%iges Isopropanol pro Well. Fügen Sie 0,8 ml Überstände aus den entsprechenden Vertiefungen hinzu.
  11. Mit einer Pipette vorsichtig auf und ab pipettieren und dann 30 Minuten oder über Nacht bei 4 °C auf Eis inkubieren, um mehr Bacmid zu erhalten.
  12. Bei 2.600 × g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  13. Besprühen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank die Außenseite des Blocks mit 70%igem Ethanol, öffnen Sie den Block und entsorgen Sie den Überstand.
  14. Geben Sie 500 μl 70%iges Ethanol (v/v) in jede Vertiefung und klopfen Sie vorsichtig auf den Block, um das Pellet zu waschen. Mit einer selbstklebenden Kunststoffdichtung abdecken und bei 2.600 × g 30 min bei 4 °C zentrifugieren.
  15. Öffnen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank den Block und entsorgen Sie den Überstand. Klopfen Sie den Block sehr vorsichtig auf ein Papiertuch, um das Ethanol zu entfernen. Lassen Sie den Block entweder in der Dunstabzugshaube oder bei 50 °C trocknen.
  16. Fügen Sie 50 μl sterilen TE-Puffer hinzu, um die Bacmid-DNA zu resuspendieren, und versiegeln Sie sie mit einer selbstklebenden Kunststoffdichtung. Übertragen Sie den Inhalt auf eine Mikrotiterplatte mit V-Boden. Lagern Sie die Bacmid-DNA bei 4 °C, bis die Testreinigung abgeschlossen ist, und lagern Sie sie dann bei -20 °C.
    HINWEIS: Obwohl nicht routinemäßig gemessen, kann im Allgemeinen eine Ausbeute von 500 bis 2.000 ng/μl Bacmid-DNA erwartet werden.
  17. Verwenden Sie die Standard-Kolonie-PCR-Methoden47 und die folgenden Vektorprimer, um nach Bacmiden zu suchen, die das Zielgen erfolgreich integrieren:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    HINWEIS: Das Amplikon wird etwa 700 bp größer sein als das Zielgen.

4. Transfektion

HINWEIS: Diese Schritte werden verwendet, um Sf9-Insektenzellen mit dem produzierten Bacmid zu transfizieren, was dazu führt, dass die Insektenzellen Baculoviruspartikel (P0) erzeugen.

  1. Züchten Sie Sf9-Zellen in serumfreiem Insektenmedium auf eine Dichte von 2,0-2,4 × 106 Zellen/ml. Verdünnen Sie die Zellen auf 2 × 105 Zellen/ml in serumfreiem Insektenmedium und geben Sie 1 ml der verdünnten Zellen in eine 24-Well-Gewebekulturplatte. Fügen Sie eine reine Transfektionsreagenz - als auch eine reine Zellkontrolle hinzu. Inkubieren Sie die Platte in einem befeuchteten Inkubator bei 27 °C für 1 h, um die Zellanhaftung zu ermöglichen.
  2. Mischen Sie 38 μl serumfreies Insektenmedium pro Vertiefung mit 2 μl pro Vertiefung des Transfektionsreagenzes. Geben Sie 40 μl der Mischung in eine sterile 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden. Fügen Sie 2 μl rekombinante Bacmid-DNA mit 0,5-2,0 μg/μl hinzu, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie sie 15 Minuten lang in der mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
  3. Geben Sie 160 μl serumfreies Insektenmedium in jede Vertiefung der Mikrotiterplatte, die die DNA-Transfektionsreagenzmischung enthält.
  4. Saugen Sie das Medium in Schritt 4.1 aus den Zellen ab. Geben Sie vorsichtig die 200 μl Bacmid-Transfektions-Reagenz-Medium-Mischung auf die Zellen, decken Sie die Platte ab und inkubieren Sie 4 Stunden lang in einem befeuchteten Inkubator bei 27 °C.
  5. Geben Sie 400 μl serumfreies Insektenmedium, ergänzt mit 2 % FBS, in jede Vertiefung. Um die Verdunstung zu reduzieren, geben Sie die Platte in einen sauberen Plastikbeutel, aber versiegeln Sie sie nicht. Die Platte wird bei 27 °C für 72 h in einem befeuchteten Inkubator inkubiert.
  6. Nach 3 Tagen wird das Medium von der Platte in einen sterilen 96-Deep-Well-Block überführt und bei 1.500 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugiert. Den geklärten Überstand, der das P0-Baculovirus enthält, in einen sterilen 96-Deep-Well-Block überführen und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

5. BacMam-Baculovirus-Amplifikation

HINWEIS: Die folgenden Schritte werden verwendet, um das anfängliche P0-Baculovirus auf Virusbestände mit höherem Titer zu amplifizieren. nämlich P1, P2 und P3. Der endgültige P3-Titer ist für die Transduktion und Proteinexpression geeignet. Aus Gründen der Effizienz und Parallelität verwendet dieses Protokoll feste volumetrische Verhältnisse für die virale Amplifikation, die empirisch optimiert wurden. Wenn die anschließend transduzierten Zellen jedoch keine GFP-Fluoreszenz und keinen vergrößerten Zelldurchmesser durch Mikroskopie aufweisen oder wenn die Proteinexpression versagt (siehe Abschnitte 6 und 8), sollte die Baculovirus-Amplifikation bei jedem Schritt nach der Quantifizierung des Baculovirus-Titers 49,50,51,52 und der durch GFP-Fluoreszenzmikroskopie überwachten Infektion und erhöhtem Zelldurchmesser 53 neu optimiert werden.

  1. Bereiten Sie den P1-Virusvorrat vor, indem Sie Sf9-Zellen in serumfreiem Insektenmedium auf eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml züchten, 2 % FBS hinzufügen und die Zellen in einem 24-Deep-Well-Block in einem Endvolumen von 3 ml pro Well aussäen. Geben Sie 120 μl P0-Virusbrühe in die Zellen.
  2. Der Block wird bei 27 °C inkubiert, während er bei 450 U/min in einem Mikroexpressionsschüttler 66-72 h lang geschüttelt wird. Zentrifugieren Sie den Block bei 1.500 × g für 20 Minuten bei Raumtemperatur und ernten Sie den Überstand in 96-Tiefbrunnen-Blöcke. Als P1-Virusbrühe bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
  3. Bereiten Sie den P2-Virusbestand vor, indem Sie 50 ml Sf9-Zellen (2 × 106 Zellen/ml Zelldichte), die in serumfreiem Insektenmedium gezüchtet wurden, das mit 2 % FBS angereichert ist, mit 250 μl P1-Virusmaterial infizieren. Die Zellen werden bei 27 °C unter Schütteln bei 110 U/min inkubiert.
  4. P2-Virusvorrat nach 66-72 h durch Zentrifugation bei 1.500 × g für 20 min ernten und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.
  5. Bereiten Sie den P3-Virusvorrat vor, indem Sie das gewünschte Volumen an Sf9-Zellen (2 × 106 Zellen/ml Zelldichte) mit einem P2-Virusstamm von 1:200 (v/v) infizieren. Die Zellen werden bei 27 °C unter Schütteln bei 110 U/min inkubiert.
  6. Nach 66-72 h bei 1.500 × g für 20 min zentrifugieren und das P3-Virus durch Auffangen des Überstandes ernten und bei 4 °C lichtgeschützt lagern.

6. Transduktion für Expressionstests

HINWEIS: Der folgende Abschnitt beschreibt Expressionstests in kleinem Maßstab und kann für parallele Tests mehrerer Konstrukte mit Deep-Well-Blöcken modifiziert werden.

  1. Bereiten Sie eine 20%ige (w/v) Polyethylenglykollösung vor, indem Sie 200 g PEG 10.000 und 12 g NaCl in 600 ml doppelt destilliertemH2Oauflösen. Autoklavieren Sie die Lösung.
  2. Geben Sie 300 μl geerntetes P1-Virus in die Vertiefungen eines 24-Tiefen-Well-Blocks und 75 μl der PEG-Lösung in jede Vertiefung. Inkubieren Sie den Block in einem Mikroexpressionsschüttler bei 18 °C und schütteln Sie ihn 5 Minuten lang bei 300 U/min und lagern Sie den Block über Nacht bei 4 °C.
  3. Schütteln Sie den Block erneut bei 300 U/min für 30 min bei 18 °C und zentrifugieren Sie den Block bei 3.000 × g für 45 min. Entsorgen Sie den Überstand mit einer Pipette in einer mikrobiologischen Sicherheitswerkbank.
  4. Bereiten Sie suspensionsangepasste HEK293-Zellen in HEK293-Medium auf eine Dichte von 2 × 106 Zellen/ml vor und säen Sie 3 ml in jede Vertiefung, die das Viruspellet enthält, und ergänzen Sie sie mit 5 mM Natriumbutyrat.
  5. Inkubieren Sie den Block bei 30 °C mit 8 % CO2 und schütteln Sie ihn 72 h lang bei 200-250 U/min.
    HINWEIS: Die vom Hersteller empfohlenen CO2 -Konzentrationen während der Zellkultur sind für suspensionsangepasste und angestammte HEK293-Zelllinien mit 8 % bzw. 5 % unterschiedlich.
  6. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 20 Minuten und waschen Sie jede Vertiefung mit 1 ml PBS.
    HINWEIS: Saugen Sie 10 μl resuspendierte Zellen ab und betrachten Sie die Zellen unter einem Fluoreszenzmikroskop mit einem GFP-kompatiblen Filterwürfel, um die Proteinexpression und -lokalisierung zu beurteilen. Aspirieren Sie 10-15 μl resuspendierte Zellen und verwenden Sie ein Ganzzell-SDS-PAGE-Gel für die In-Gel-GFP-Fluoreszenzdetektion54.
  7. Nochmals bei 900 × g für 20 min zentrifugieren. Die Pellets bei -80 °C einfrieren.

7. Testreinigung im kleinen Maßstab mit hohem Durchsatz

HINWEIS: Die folgenden Schritte beschreiben einen Schnelltest-Aufreinigungs-Workflow in einem 24-Well-Blockformat für das Screening der Expressionsniveaus einzelner SLCs. Siehe Tabelle 2 für die Zusammensetzung der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen.

  1. Geben Sie 1 ml HT-Lysepuffer in jede Vertiefung der geernteten Zellen und fahren Sie mit der Beschallung auf Eis für eine Gesamtlänge von 4 Minuten (Zyklus bei 3 s ein/15 s aus) in 24-Well-Blöcken mit einer 24-Kopf-Sonde fort.
  2. Den Inhalt in einen 96-tiefen Well-Block überführen, 125 μl Reinigungsmittelbrühe hinzufügen und mit einer Silikondichtung versiegeln. Drehen Sie den Block vorsichtig bei 4 °C für 1 Stunde. Alternativ können Sie Dodecylmaltosid (DDM) und Cholesterinhemisuccinat (CHS) direkt zu den 24-Well-Blöcken geben und bei 4 °C auf einen Rocker-Shaker stellen.
  3. Zentrifugieren Sie den Block bei 2600 × g für 20 min bei 4 °C und überführen Sie den Überstand in einen neuen 96-Deep-Well-Block.
  4. Bereiten Sie einen 50%igen Vorrat an Streptokokken-Taktinharz mit hoher Kapazität vor, das mit Lysepuffer voräquilibriert ist.
  5. Geben Sie 100 μl resuspendiertes Harz in jede Vertiefung.
  6. Den Block mit einer Silikondichtung abdecken und 2 h bei 4 °C drehen und dann sehr kurz zentrifugieren (bis zu 200 × g), um die am Deckel haftende Flüssigkeit zu entfernen.
  7. Platzieren Sie eine 96-Well-Filterplatte auf einem leeren Block und geben Sie das Harz/Überstands-Gemisch in die Filterplatte. Spülen Sie die Vertiefungen des Deep-Well-Blocks mit 800 μl HT-Waschpuffer und geben Sie sie in den Filterblock, um die maximale Menge an Harz aufzufangen.
  8. Den Puffer durchtropfen lassen oder kurz bei 200 × g zentrifugieren und den Durchfluss auffangen. Legen Sie die Filterplatte auf einen neuen Waschblock und waschen Sie das Harz mit 800 μl HT-Waschpuffer, so dass der Puffer durchtropfen (oder kurz zentrifugieren) kann. Wiederholen Sie den Waschschritt noch zweimal und zentrifugieren Sie den Block bei 500 × g für 3 Minuten, um den restlichen HT-Waschpuffer zu entfernen.
  9. Platzieren Sie die Filterplatte auf einer 96-Well-Mikrotiterplatte. 50 μl HT-Elutionspuffer zugeben und 10 Minuten lang unter Schütteln bei Raumtemperatur inkubieren. Eluieren Sie die Proben durch Zentrifugieren bei 500 × g für 3 Minuten.
  10. 15 μl der eluierten Probe auf ein Coomassie-gefärbtes SDS-PAGE-Gel geben, um die Proteinexpression zu überprüfen. Laden Sie die restlichen Eluentenproben auf ein Größenausschlusschromatographie- (SEC) oder Fluoreszenzdetektions-Größenausschlusschromatographie-System (FSEC), um die Proteinmonodispersität in DDM/CHS zu bewerten.

8. Transduktion für die großflächige Expression

HINWEIS: Die folgenden Schritte sind das Standardprotokoll RESOLUTE für die SLC-Expression. Einzelne Ziele erfordern weitere Optimierungen hinsichtlich der Expressionszeit, der Inkubationstemperatur und der Konzentration von Natriumbutyrat. Darüber hinaus optimieren wir routinemäßig die Baculovirus-Infektionsvielfalt, indem wir verschiedene volumetrische Verhältnisse des P3-Virus testen, mit dem die suspensionsangepassten HEK293-Zellen in kleinen Experimenten infiziert werden. Dies ist zeiteffizient, nutzt bereits vorhandene Techniken und Geräte und wertet den gewünschten experimentellen Output direkt aus. Diese empirische Methode muss jedoch mit jeder Amplifikation des P3-Virus neu optimiert werden, und es stehen andere Methoden zur Verfügung, um die Baculovirus-Partikel zu quantifizieren 49,50,51,52.

  1. Skalieren Sie das erforderliche Volumen von suspensionsangepassten HEK293-Zellen in HEK293-Medium.
  2. An die Suspension angepasste HEK293-Zellen auf 1 × 106 Zellen/ml verdünnen und 24 Stunden lang wachsen lassen (bei 170 U/min für 2-Liter-Rollerflaschen und 105 U/min für 3-L-Rollerflaschen).
  3. Fügen Sie 30 ml P3-Virus pro Liter Zellen hinzu und fügen Sie 5 mM Natriumbutyrat hinzu. Die Zellen werden 48 h lang bei 37 °C oder 72 h bei 30 °C inkubiert.
  4. Während und nach der Inkubationszeit besteht ein wichtiger Schritt darin, die Zellen mit Hilfe der Hellfeldmikroskopie auf mikrobielle Kontamination und Zelllebensfähigkeit zu untersuchen. Beurteilung der Proteinexpression und -lokalisierung mittels Fluoreszenzmikroskopie mit einem GFP-kompatiblen Filterwürfel.
  5. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 900 × g für 20 min.
  6. Waschen Sie das Zellpellet, indem Sie es in 10-15 ml PBS pro Liter Zellkultur resuspendieren und erneut 20 Minuten lang bei 900 × g pelletieren.
  7. Die Zellpellets werden in flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C gelagert.

9. Reinigung von Proteinen

HINWEIS: Im Folgenden finden Sie die Standardmethode RESOLUTE für die SLC-Aufreinigung für 5 l Zellkultur. Für jedes SLC-Target muss das optimale Waschmittel empirisch ermittelt werden. Bereiten Sie Basispuffer, Waschmittellösung, Wasch-, Elutions- und SEC-Puffer im Voraus vor (Tabelle 2). Eine Liste der getesteten Standardwaschmittel finden Sie in Tabelle 3. ATP und MgCl2im Waschpuffer reduzieren die Kontamination durch Hitzeschockproteine.

  1. Tag 1
    1. Tauen Sie das gefrorene Zellpellet in einem auf Raumtemperatur eingestellten Wasserbad auf.
    2. Bereiten Sie den Solubilisierungspuffer mit 135 ml Basenpuffer und drei Protease-Inhibitor-Cocktail-Tabletten vor. Lassen Sie die Tabletten sich auflösen.
    3. Resuspendieren Sie das aufgetaute Pellet mit Solubilisierungspuffer. Verwenden Sie 27 ml Solubilisierungspuffer pro 10-15 g Zellpellet, fügen Sie DNase hinzu und gießen Sie sie in einen eiskalten Dounce-Homogenisator. Homogenisieren Sie die Lösung, indem Sie den Kolben etwa 20x auf und ab bewegen, wobei der Homogenisator auf Eis bleibt.
      HINWEIS: Das Resuspensionsvolumen muss auf der Grundlage des Zielproteins und der Zellpelletmasse optimiert werden, die aufgrund der Zelldichte bei der Ernte variiert. Handelsübliche DNase kann gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzugefügt werden. DNase kann auch intern unter Verwendung etablierter Protokolle55 exprimiert und gereinigt werden.
    4. Waschmittelstammlösung auf 1 %ige Endkonzentration geben.
      HINWEIS: Ein wichtiger Schritt zur Optimierung der Proteinaufreinigung ist die Identifizierung des optimalen Detergens für die SLC-Solubilisierung und -Aufreinigung, das empirisch identifiziert werden muss. Wir haben regelmäßig verschiedene Reinigungsmittel verwendet; jeweils allein und in Kombination mit Cholesterylhemisuccinat, wobei das Verhältnis von Detergens zu CHS-Masse bei 10:1 gehalten wird.
    5. Die Solubilisierungsmischung wird in konische 50-ml-Röhrchen überführt. 1 h bei 4 °C langsam drehen.
    6. Die Lösung wird bei 50.000 × g für 30 min bei 4 °C zentrifugiert. Sammle den Überstand ein.
    7. 4-6 ml Bettvolumen Streptokokken-Taktharz mit dem Basispuffer ausgleichen.
    8. Äquilibriertes Harz in den gelösten Überstand geben und 2 h bei 4 °C drehen.
    9. Gießen Sie die Lösung in eine Schwerkraft-Durchflusssäule und lassen Sie die Lösung durchfließen.
    10. Waschen Sie das Harz mit dem 30-fachen Bettvolumen des Streptokokken-Waschpuffers in 3 Schritten mit gleichem Volumen.
    11. Fügen Sie 3-5 ml Elutionspuffer hinzu, inkubieren Sie 15 Minuten lang und sammeln Sie das Eluat. Wiederholen Sie diesen Schritt vier weitere Male und sammeln Sie jede Elutionsfraktion separat.
      HINWEIS: Ein wichtiger Schritt ist die Proteinelution aus dem Streptokokken-Taktinharz, bei der es wichtig ist, nach jeder Zugabe des Elutionspuffers 15 Minuten lang zu inkubieren. Typischerweise enthält die erste Eluatfraktion aufgrund der Verdünnung des Elutionspuffers durch den Restwaschpuffer eine geringere Proteinkonzentration. Daher kann die erste Eluatfraktion verworfen werden, wenn eine höhere Endproteinkonzentration gewünscht wird. Alternativ kann die Proteinkonzentration in allen seriellen Elutionen auch mit SDS-PAGE analysiert werden, um das Protokoll zu optimieren.
    12. Messen Sie die Proteinkonzentration mittels UV-Absorptionsspektroskopie, kombinieren Sie die gewünschten Elutionsfraktionen und fügen Sie 3C-Protease im Verhältnis 1:5 (w/w) bis 1:10 (w/w) hinzu.
    13. Über Nacht bei 4 °C langsam drehen.
      HINWEIS: Die Schritte 9.1.12 und 9.1.13 sind nur erforderlich, wenn das GFP-Tag entfernt werden muss. Wenn das Entfernen des Tags nicht erforderlich ist, fahren Sie direkt mit Schritt 9.2.4 fort. Alternativ kann das Protein über Nacht bei 4 °C aufbewahrt werden, um am nächsten Tag fortzufahren. Darüber hinaus müssen bei SLCs mit verminderter Stabilität die Proteasekonzentration, die Inkubationszeit und die Temperatur möglicherweise optimiert werden. Die 3C-Protease ist über einen weiten Temperaturbereich aktiv und ermöglicht eine Optimierung, die am besten für verschiedene SLCs geeignet ist.
  2. Tag 2
    1. 2-4 ml Bettvolumen des Kobaltmetallaffinitätsharzes mit SEC-Puffer ausgleichen.
    2. Äquilibriertes Kobaltmetall-Affinitätsharz in die 3C-Reaktionsmischung über Nacht geben und 1 h bei 4 °C drehen.
    3. Gießen Sie die Lösung in eine Schwerkraft-Durchflusssäule und fangen Sie den Durchfluss auf.
    4. Konzentrieren Sie den Durchfluss in einem 100-kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter durch Schleudern bei 3.000 × g bei 4 °C und mischen Sie die Probe vorsichtig alle 5 Minuten, bis das gewünschte SEC-Injektionsvolumen erreicht ist.
    5. Äquilibrieren Sie eine Dextran-Agarose-basierte Größenausschlusschromatographiesäule mit SEC-Puffer. Das SEC-Verfahren sollte bei 4 °C (Kühlkammer oder Kühlraum) durchgeführt werden.
      HINWEIS: Wichtiger Schritt: Abhängig vom oligomeren Zustand des SLC kann eine andere Säule, wie z. B. eine Größenausschlusschromatographiesäule auf Agarosebasis, zur Durchführung der SEC verwendet werden.
    6. Injizieren Sie die Probe in die Probenschleife und führen Sie das SEC-Programm mit einer Durchflussrate aus, bei der der Säulendruck unter den Spezifikationen des Säulenherstellers liegt. Sammeln Sie mit einem Fraktionssammler automatisch 0,3-ml-Fraktionen über den gesamten SEC-Lauf.
    7. Poolen Sie Peak-Fraktionen, messen Sie die UV-Absorption und konzentrieren Sie sie in einem 100-kDa-Cut-off-Zentrifugalkonzentrator auf das erforderliche Volumen/die erforderliche Konzentration durch Schleudern bei 3.000 × g bei 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SLC-Gene können aus RESOLUTE pDONR-Plasmiden in BacMam-Vektoren für die Säugetierexpression kloniert werden
Die beschriebenen Protokolle für Klonierung, Expression und Aufreinigung haben sich für viele SLC-Transporter über mehrere Proteinfaltungen hinweg bewährt. Nichtsdestotrotz enthalten die Verfahren mehrere Kontrollpunkte zur Überwachung des Fortschritts, die eine Optimierung ermöglichen, um Unterschiede in der Expression, der Proteinfaltung, der lipid- und detergenzienabhängigen Stabilität und der Empfindlichkeit gegenüber Pufferbedingungen zu berücksichtigen.

Checkpoints während des Klonens von SLCs und der Expression in kleinem Maßstab
In den Klonierungsschritten sollte die Agarose-Gelelektrophorese verwendet werden, um die richtige Größe der PCR- und Verdauungsprodukte sicherzustellen. In ähnlicher Weise können die Gateway- und Transpositionsreaktionen mit einer Kolonie-PCR-Reaktion validiert werden (Abbildung 2A,B). Die Baculovirus-Generierung kann bei Bedarf mit Standardtechniken überwacht werden 49,50,51,52. Die anfängliche Expression sollte in kleinem Maßstab erfolgen, wobei die Proteinausbeute mittels SDS-PAGE bewertet wird (Abbildung 2B). In ähnlicher Weise sollten der Anteil an grün fluoreszierenden Zellen, die Gesamtproteinexpression und die Proteinlokalisierung mit Hilfe der Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden (Abbildung 2C,D). Die Proteinexpression sollte für den Zelltyp, die Temperatur, die Zeit und die Notwendigkeit der Co-Expression von Chaperonen oder komplexen Partnern optimiert werden. Die Expression kann weiter optimiert werden, indem das Konstrukt so modifiziert wird, dass ungeordnete N- und C-Termini abgeschnitten werden, basierend auf der Sekundärstrukturvorhersage56,57,58, und die Typen und die Platzierung von Affinitätsmarkierungen getestet werden. Die Proteinstabilität sollte in kleinem Maßstab mit FSEC (Abbildung 2E), SEC-basiertem Thermal Shift Assay (SEC-Ts) und DSF 41,42,59,60,61,62 bewertet werden. Kleine Moleküle wie Substrate und Inhibitoren, Detergenzien, Cholesterinhemisuccinat, Lipide und pH-Wert sollten unter Berücksichtigung der Funktion des Proteins und der nativen subzellulären Umgebung auf Verbesserung der Proteinstabilität getestet werden, und die anschließenden Reinigungspuffer sollten entsprechend modifiziert werden. Sowohl in kleinen als auch in großen Expressionsaufbauten sollten die Zellen mikroskopisch auf Lebensfähigkeit und Kontamination überwacht werden.

Optimierung der Transporterreinigung im großen Maßstab
Jeder Schritt der groß angelegten Proteinreinigung sollte von SDS-PAGE bewertet werden, einschließlich der In-Gel-Fluoreszenz, um das GFP-markierte Protein und die enzymatische Entfernung dieses Tags spezifisch zu überwachen. In der Praxis erscheinen die GFP-markierten SLC-exprimierenden Zellen gelblich-grün. Nach der chromatographischen Elution mit Twin-Streptokokken erscheint der Eluent, der das gereinigte Protein enthält, unter weißem Licht fluoreszierend neongrün. Chemisch und strukturell homogenes Protein sollte während der Größenausschlusschromatographie einen einzelnen monodispersen A280-Peak ergeben (Abbildung 2F,G) und eine einzelne Bande auf SDS-PAGE zeigen. Die SDS-PAGE-Bande, die dem erwarteten SLC entspricht, und alle unerwarteten Banden sollten mit Hilfe der tryptischen Aufschluss-Massenspektrometrie analysiert werden. Mehrere Banden auf dem SDS-PAGE-Gel weisen entweder auf proteolytischen Abbau, kontaminierende Proteine oder SDS-resistente Oligomere hin. Kontaminierende Proteine können entfernt werden, indem die NaCl-Konzentration des Solubilisierungspuffers erhöht oder die Affinitätsmarkierung geändert wird. Die Proteolyse kann eingeschränkt werden, indem die Reinheit des Proteins verbessert wird, sichergestellt wird, dass alle Schritte bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt werden, und das Protokoll optimiert wird, um die Zeit für jeden Schritt zu minimieren. Wenn das SEC-Profil einen breiten Peak, mehrere Peaks oder einen großen Void-Peak aufweist (z. B. die violette Spur in Abbildung 2F), sollten das Konstrukt und die Reinigungsbedingungen in kleinem Maßstab mit FSEC, SEC-Ts oder DSF 41,42,59,60,61,62 optimiert werden.

Figure 1
Abbildung 1: Schematische Darstellung des RESOLUTE-Arbeitsablaufs für die SLC-Expression und -Aufreinigung. Schritt-für-Schritt-Illustration der Rekombinationsklonierung, der BacMam-Baculovirus-Vorbereitung, der Proteinexpression und -reinigung sowie der nachgeschalteten Anwendungen. Abkürzungen: SLC = Solute Carrier; Kryo-EM = Kryo-Elektronenmikroskopie; SEC = Größenausschlusschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Repräsentative Ergebnisse für die SLC-Expression und -Aufreinigung . (A) Kolonie-PCR der Hochdurchsatz-SLC-Klonierung in pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) Coomassie-gefärbte SDS-PAGE eines einzelnen kleinskaligen, parallelen Expressionstests von 24 verschiedenen SLCs in voller Länge. (C) In-Cell-Fluoreszenz eines GFP-markierten SLC, der primär an der Plasmamembran lokalisiert ist. (D) In-Zell-Fluoreszenz eines GFP-markierten SLC mit signifikanter intrazellulärer Lokalisation. (E) Repräsentative FSEC-Spuren für vier SLCs, die auf einer hydrophilen, neutralen UHPLC-Säule auf Kieselsäurebasis aufgelöst wurden. Repräsentative SEC-Spuren für sechs SLCs, die entweder auf einer (F)-Dextran-Agarose- oder (G)-Agarose-Größenausschlusschromatographiesäule gereinigt wurden. Die Molekulargewichte des SLC-Komplexes und des zur Reinigung verwendeten Detergenziums werden angegeben, wenn der oligomere Zustand experimentell bestimmt wurde. Abkürzungen: SLC = Solute Carrier; GFP = grün fluoreszierendes Protein; FSEC = Fluoreszenz-Detektionsgrößen-Ausschlusschromatographie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Downstream-Anwendungen von gereinigten SLCs . (A) Mikroskopische Aufnahme von SLC1A1 in Waschmitteln. (B) Durchschnittswerte der 2D-Klasse von SLC1A1 in Detergenzien. (C) Rohfluoreszenz des CPM-Thermodenaturierungstests von SLC10A6, die mit verschiedenen Konzentrationen von Taurolithocholsäure-3-sulfat inkubiert wurden. (D) Erste Ableitung der thermischen CPM-Denaturierung von SLC10A6. Die Schmelztemperatur des SLC10A6 erhöhte sich in Gegenwart von 120 μM Taurolithocholsäure-3-sulfat um 10 °C. Abkürzungen: SLC = Solute Carrier; CPM = N-[4-(7-diethylamino-4-methyl-3-coumarinyl)phenyl]maleimid. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Name des Vektors Antibiotika-Marker Tags für die Reinigung Screening-Primer bp während der PCR zugegeben
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW AmpereR C-Klemme PHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
3C-Protease-Stelle GFP
Zwillings-Streptokokken GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Seine10
pDONR221-KARTON KanR nichts M13 Vorwärts ~190
M13 Rückwärtsgang

Tabelle 1: Plasmide, die für die RESOLUTE-Klonierung und die BacMam-Generierung verwendet werden.

Lösung Zusammensetzung
DH10Bac Auswahlplatten LB-Agarplatten mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin, 7 μg/ml Gentamycin, 40 μg/ml IPTG und 100 μg/ml Bluo-Gal
2x LB Medium (mit Antibiotika) 2x LB Bouillon mit 50 μg/ml Kanamycin, 10 μg/ml Tetracyclin und 7 μg/ml Gentamycin
HT-Lyse-Puffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% Glycerin, EDTA-freier Protease-Inhibitor
HT Wasch-Puffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % Glycerin, 0,03 % DDM/0,003 % CHS
HT-Elutionspuffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5 % Glycerin, 0,03 % DDM/0,003 % CHS, 100 mM D-Biotin
Basis-Puffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl
Waschmittel-Stammlösung 10 % (w/v) Waschmittel, je nach Bedarf mit oder ohne 1 % CHS. Über Nacht bei 4 °C mischen und bei -20 °C lagern.
Streptokokken-Waschpuffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, Detergens bei 3-fach CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP
Strep tokokken-Elutionspuffer 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-Biotin, Detergens bei 3-fach CMC
Größenausschlusschromatographie-Puffer (SEC) 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, Reinigungsmittel bei 2-fach CMC. Filtern Sie durch eine 0,22 μM-Membran.
Natriumbutyrat 1 M Lösung in DPBS, für den Langzeitgebrauch bei -20 °C lagern.

Tabelle 2: Eine Liste der in diesem Protokoll verwendeten Lösungen und deren Zusammensetzung.

Reinigungsmittel-System Extraktionskonzentration Reinigungskonzentration (% w/v)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
DEZIMETER 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
NG 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8-KARTON 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
CYMAL-5-KARTON 1% 0.40%
LMNG 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
Digitonin 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos Cholin-12 1% 0.14%

Tabelle 3: Standard-Detergenzien zur Prüfung der Membransolubilisierung und der SLC-Monodispersität und -Stabilität.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Die Entwicklung von SLC-gerichteten Therapien wurde durch das Fehlen einer systematischen Charakterisierung der Transporterfunktion behindert. Dies hat dazu geführt, dass im Vergleich zu GPCRs und Ionenkanälen63 unverhältnismäßig weniger Medikamente auf diese Proteinklasse abzielen, obwohl sie zahlreiche Rollen in normalen und pathophysiologischen Prozessen spielen. RESOLUTE ist ein internationales Konsortium, das sich zum Ziel gesetzt hat, modernste Forschungstechniken und -werkzeuge zu entwickeln, um die aktuelle SLC-Forschung zu beschleunigen und zu verbessern. Als Teil von RESOLUTE haben wir diese Protokolle für effizientes Klonen, Konstrukt-Screening und großflächige Expression und Reinigung von humanen SLCs entwickelt.

Hier beschreiben wir skalierbare Klonierungs- und Expressionsmethoden von SLCs, die erfolgreich eingesetzt wurden, um die humanen SLC-Transporter, einschließlich putativer und verwaister SLCs, systematisch zu untersuchen. Insbesondere wurden auf diese Weise gereinigte SLCs erfolgreich in nachfolgenden Studien zur Transporterstruktur, Biochemie, Funktion, Binderbildung und Bindung kleiner Moleküle eingesetzt. Wir wenden diese Methode regelmäßig an, um Milligramm-Mengen verschiedener SLCs zu reinigen, und unter optimalen Bedingungen kann das gesamte Protokoll, einschließlich der Klonierungs- und Gewebekulturschritte, in 4-5 Wochen abgeschlossen werden.

Unsere Methode ist auf Wirtschaftlichkeit und Parallelität optimiert, um mehrere Ziele systematisch zu bewerten. Diese Hochdurchsatzmethode lässt sich jedoch auch leicht an die parallele Generierung von Konstrukten für ein einzelnes Target mit verschiedenen Trunkierungen oder Tags anpassen, indem unterschiedliche Klonprimer oder Vektoren verwendet werden. Dies ähnelt Methoden, die auch mehrere Konstrukte für ein Ziel64 optimieren, obwohl unser Protokoll weitere Effizienzsteigerungen durch paralleles Klonen, Baculovirus-Generierung und Expressionstests bietet. Die Transfektion bietet eine kürzere Zeit zwischen der Klonierung des Konstrukts und der Expression durch den Verzicht auf die Baculovirus-Generation65, ist aber für die großflächige Expression deutlich teurer und aufwändiger. Im Gegensatz dazu sind stabile Zelllinien für die Expression in großem Maßstab wahrscheinlich kostengünstiger66, aber die Generierung hochexprimierender klonaler Zelllinien kann mehr Zeit und spezialisierte Ressourcen erfordern. Während dieses Protokoll menschliche Zelllinien für die Proteinproduktion verwendet, wurden auch Insektenzelllinien wie Spodoptera frugiperda und Trichoplusia ni erfolgreich für die groß angelegte SLC-Expression verwendet 5,31,64. Die Expression in humanen Zelllinien erhöht die Medienkosten, bietet aber mehr native Modifikationen nach der Translation und eine Lipidumgebung39,67.

Während das Protokoll an verschiedene Membrantransporter und experimentelle Anforderungen angepasst werden kann, beeinflussen mehrere Faktoren die Qualität und Ausbeute der gereinigten Proteinproben. Obwohl es ideal ist, Proteine in voller Länge zu untersuchen, kann ein gewisses Maß an Sequenzkürzung erforderlich sein, um eine bessere Expressions-, Reinigungs- und Rekonstitutionsausbeute zu erzielen. Alle RESOLUTE SLC-Konstrukte wurden mit einem spaltbaren GFP versehen, das für die Überwachung der SLC-Expression, der zellulären Lokalisierung und der Reinigung wertvoll ist. Das suspensionsangepasste HEK293-Zellexpressionssystem, das in diesen Experimenten verwendet wurde, hat zu überlegenen Ausbeuten geführt und wird empfohlen, obwohl wir routinemäßig auch Proteine ohne komplexe Glykosylierung über die suspensionsangepasste HEK293 GnTl-Zelllinie herstellen. Die Inkubationstemperatur und -länge für die Proteinexpression durch transduzierte Zellen sollte für jedes Ziel optimiert werden, obwohl wir festgestellt haben, dass 72 h bei 30 °C ein guter Standard sind.

Alle Schritte der Proteinreinigung sollten auf Eis oder bei 4 °C durchgeführt werden, und sobald das gereinigte Protein schockgefroren wurde, sollten Gefrier-Auftau-Zyklen vermieden werden. Die Art und Menge der Detergenzien, die in Membransolubilisierungs- und Reinigungspuffern verwendet werden, sind kritisch und sollten für jeden SLC empirisch bestimmt werden.

Die mit dieser Methode gereinigten SLCs liefern homogene und strukturell und funktionell intakte Proben, die für eine Vielzahl von biochemischen und biophysikalischen Untersuchungen verwendet werden können. Die Beobachtung einzelner, diskreter Partikel des solubilisierten und gereinigten SLC-Proteins durch negative Färbung und Kryo-EM (Abbildung 3A,B) kann vielversprechend für die anschließende Strukturbestimmungsein 37. Das gereinigte SLC in Detergenzien kann für biophysikalische Assays wie den thermischen Stabilitätsassay (Abbildung 3C, D) verwendet werden, um die Proteinwechselwirkungen mit kleinen Molekülen wie Substraten, Inhibitoren oder Lipiden zu untersuchen59,62. Schließlich können die mit diesem Protokoll in biochemischen Assays gereinigten SLCs für funktionelle Assays68 in Liposomen oder Nanodiscs rekonstituiert und für die Generierung und Selektion von Antikörpern und Nanobodysverwendet werden 69,70. Während es nach wie vor eine Herausforderung ist, diese Methoden an den Durchsatz anzupassen, der für die Entdeckung neuer SLC-gerichteter kleiner Moleküle erforderlich ist 1, wurden vielversprechende Fortschritte auf dem Gebiet der In-vitro-Hochdurchsatz-Screening-Technologien erzielt71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen Interessen gibt.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde im Rahmen des RESOLUTE-Projekts durchgeführt. RESOLUTE wurde vom Gemeinsamen Unternehmen Innovative Medicines Initiative 2 im Rahmen der Finanzhilfevereinbarung Nr. 777372 gefördert. Dieses gemeinsame Unternehmen wird durch das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union und EFPIA unterstützt. Dieser Artikel gibt nur die Ansichten der Autoren wieder, und weder das IMI noch die Europäische Union und die EFPIA sind für die Verwendung der darin enthaltenen Informationen verantwortlich. Das pHTBV-Plasmid wurde freundlicherweise von Prof. Frederick Boyce (Harvard) zur Verfügung gestellt.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Hochdurchsatzexpression Reinigung humane Träger gelöster Stoffe Strukturstudien biochemische Studien Membrantransporter endogene Substrate exogene Substrate therapeutische Ziele Marker für Krankheiten Pharmazeutika Arzneimittelforschungsprojekte begrenztes strukturelles Wissen begrenztes funktionelles Wissen begrenztes physiologisches Wissen Expressions- und Reinigungsschwierigkeiten Milligrammmengen Codon-optimierte Gensequenzen Konstruktdesign Hochdurchsatzexpression Erhaltung der strukturellen Integrität Erhaltung der biochemischen Aktivität eukaryotische Zellexpression Affinitätsreinigung Größenausschlusschromatographie hochauflösende Strukturbestimmung Transportstudien, Niedermolekulare Engagement-Assays In-vitro-Screening mit hohem Durchsatz
Hochdurchsatzexpression und Aufreinigung humaner gelöster Träger für strukturelle und biochemische Untersuchungen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter