Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Storskalig expression och rening av humana bärare av lösta ämnen för strukturella och biokemiska studier

Published: September 29, 2023 doi: 10.3791/65878
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 2, 3, 1
1Centre for Medicines Discovery, Nuffield Department of Medicine, University of Oxford, 2Nuvisan ICB GmbH, 3CeMM Research Center for Molecular Medicine of the Austrian Academy of Sciences

Summary

Strukturella och biokemiska studier av mänskliga membrantransportörer kräver milligram mängder av stabilt, intakt och homogent protein. Här beskriver vi skalbara metoder för att screena, uttrycka och rena mänskliga bärare av lösta ämnen med hjälp av kodonoptimerade gener.

Abstract

Solute bärare (SLC) är membrantransportörer som importerar och exporterar en rad endogena och exogena substrat, inklusive joner, näringsämnen, metaboliter, neurotransmittorer och läkemedel. Trots att denna grupp av proteiner har framstått som attraktiva terapeutiska mål och markörer för sjukdom är den fortfarande relativt underdrogad av dagens läkemedel. Läkemedelsutvecklingsprojekt för dessa transportörer hindras av begränsad strukturell, funktionell och fysiologisk kunskap, ytterst på grund av svårigheterna med att uttrycka och rena denna klass av membraninbäddade proteiner. Här demonstrerar vi metoder för att erhålla stora mängder av humana SLC-transportproteiner med hög renhet med hjälp av kodonoptimerade gensekvenser. I kombination med en systematisk utforskning av konstruktionsdesign och storskaligt uttryck säkerställer dessa protokoll bevarandet av målproteinernas strukturella integritet och biokemiska aktivitet. Vi belyser också kritiska steg i det eukaryota celluttrycket, affinitetsrening och storleksuteslutningskromatografi av dessa proteiner. I slutändan ger detta arbetsflöde rena, funktionellt aktiva och stabila proteinpreparat som är lämpliga för högupplöst strukturbestämning, transportstudier, analyser av småmolekylengagemang och in vitro-screening med hög genomströmning.

Introduction

Membranproteiner har länge varit måltavlor för både forskare och läkemedelsindustri. Av dessa är de lösta bärarna (SLC) en familj av över 400 sekundära transportgener som kodas i det mänskliga genomet1. Dessa transportörer är involverade i import och export av många molekyler, inklusive joner2, neurotransmittorer3, lipider 4,5,6,7, aminosyror 8, näringsämnen 9,10,11 och läkemedel 12. Med en sådan bredd av substrat är dessa proteiner också inblandade i en rad patofysiologier genom transport av toxiner13, transport av och hämning av missbruksdroger 14,15 eller skadliga mutationer16. Bakteriella homologer har fungerat som prototyper för den grundläggande transportmekanismen för flera SLC-familjer 17,18,19,20,21,22,23,24,25. Till skillnad från mänskliga proteiner uttrycks prokaryota ortologer ofta bättre i det välförstådda Escherichia coli-uttryckssystemet 26,27 och är mer stabila i de mindre tvättmedlen som ger välordnade kristaller för röntgenkristallografi 28. Sekvens- och funktionsskillnader komplicerar dock användningen av dessa avlägset besläktade proteiner för läkemedelsutveckling29,30. Följaktligen behövs ofta direkta studier av det mänskliga proteinet för att dechiffrera verkningsmekanismen för läkemedel som riktar sig mot SLC 31,32,33,34,35. Även om de senaste framstegen inom kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM) har möjliggjort strukturell karakterisering av SLC:er under mer nativa förhållanden36,37, är svårigheten att uttrycka och rena dessa proteiner fortfarande en utmaning för att utveckla riktade terapier och diagnostik.

För att mildra denna utmaning har Resolute-konsortiet (re-solute.eu) utvecklat resurser och protokoll för storskaligt uttryck och rening av humana proteiner i SLC-familjen38. Med utgångspunkt i kodonoptimerade gener har vi utvecklat metoder för storskalig kloning och screening av SLC-konstrukt. Dessa metoder tillämpades systematiskt på hela familjen av SLC, generna klonades in i BacMam-virusuttryckssystemet och proteinuttrycket testades i humana cellinjer39 baserat på tidigare beskrivna metoder för storskalig kloning och expressionstestning40. Sammanfattningsvis klonas SLC-genen från pDONR221-plasmiden till en pHTBV1.1-vektor. Denna konstruktion används sedan för att transponera genen av intresse till en bacmidvektor för transfektering av insektsceller, som inkluderar en cytomegaloviruspromotor och förstärkarelement för uttryck i däggdjursceller. Det resulterande baculoviruset kan användas för att transducera däggdjursceller för uttryck av målproteinet SLC.

Vi vidareutvecklade standardiserade metoder för storskalig expressionning och stabil rening av utvalda SLC:er (Figur 1). Det här protokollet innehåller flera kontrollpunkter för att underlätta effektiv felsökning och minimera variabiliteten mellan experiment. Rutinmässig övervakning av proteinuttryck och lokalisering, samt småskalig optimering av reningsförhållanden för enskilda mål, underlättades av Strep och Green Fluorescent Protein (GFP) taggar41,42.

I slutändan kan dessa kemiskt rena och strukturellt homogena proteinprover användas för strukturbestämning genom röntgenkristallografi eller kryoelektronmikroskopi (Cryo-EM), biokemiska målengagemangsanalyser, immunisering för bindemedelsgenerering och cellfria funktionella studier via rekonstituering till kemiskt definierade liposomer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

OBS: Alla kodonoptimerade RESOLUTE SLC-gener har deponerats i AddGene43, vars länkar finns tillgängliga på listan över RESOLUTE offentliga reagenser44. Dessa gener har klonats in i pDONR221-plasmiden och möjliggör direkt kloning av generna till destinationsvektorn med hjälp av rekombinationskloning45. För att maximera parallelliteten odlas bakterie-, insekts- och däggdjursceller i blockformat för bakterieproduktion (avsnitt 3), baculovirusamplifiering (avsnitt 5) respektive expressionstestning (avsnitt 6). För dessa steg krävs en skakapparat med mikrouttryck för att säkerställa tillräcklig blandning och luftning.

1. (High-throughput) kloning av SLC:er till pHTBV1.1 bacmid

OBS: Kloningssteget använder ett rekombinationskloningsprotokoll för effektiv kloning och omvandling till Escherichia coli (E. coli) med hjälp av värmechockmetoden46. Protokollet är utformat för hög genomströmning och parallell kloning av flera mål eller konstruktioner, men kan enkelt anpassas till mindre skalor.

  1. I en 96-hålars platta, tillsätt 150 ng av pDONR221 SLC-klonen och 100 ng av pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW-vektorn. Höj reaktionsvolymen till 8 μL med 10 mM Tris pH 8,0 och tillsätt sedan 2 μL av rekombinationsenzymblandningen.
  2. Inkubera i rumstemperatur i 1 timme, tillsätt 1 μl proteinas K och inkubera i 30 minuter vid 37 °C.
  3. Använd 4 μl av reaktionsblandningen för att omvandla 50 μl kemiskt kompetenta E. coli MACH-1-celler med hjälp av värmechockmetoden46 och SOC-medium för återvinning. Platta på LB-agar innehållande 5% sackaros, eller SOC-agar, kompletterat med 100 μg/ml ampicillin.
  4. Identifiera kolonier som hyser pHTBV1.1-vektorn med SLC-geninsatsen med hjälp av lämpliga primers (se tabell 1) och standardprotokoll för koloni-PCR 47.
  5. Rena den rekombinanta plasmiden från enstaka kolonier med genen av intresse med hjälp av ett plasmidminiprep-kit.

2. Införlivande

OBS: Följande steg används för att transponera SLC-generna från pHTBV1.1-vektorn till en bacmid för BacMam-baculovirusgenerering i Sf9-celler. Med hjälp av värmechockmetoden46 omvandlas pHTBV1.1-vektorn till DH10Bac-kompetenta E. coli-celler , som innehåller ett moderbacmid med en lacZ-mini-attTn7-fusion. Transponering sker mellan elementen i pHTBV1.1-vektorn och moderbacmidet i närvaro av transponeringsproteinerna som tillhandahålls av en hjälparplasmid48. Se tabell 2 för sammansättningen av de lösningar som används i detta protokoll.

  1. Använd 3 μL 100-200 ng/μL renat pHTBV1.1-vektor-DNA, transformera DH10Bac med hjälp av värmechockmetoden i en 96-håls PCR-platta. Återvinn cellerna genom att inkubera dem i ett återvinningsmedium i 4-5 timmar vid 37 °C medan de skakas vid 700 rpm i en mikroexpressionsshaker.
  2. Sprid ut 50 μL transformerade celler på DH10Bac-markeringsplattor. Inkubera plattorna vid 37 °C i 48 timmar täckta med folie.
  3. Välj en enda vit koloni (som innehåller det rekombinanta DNA:t) och stryk till utspädning. Inkubera vid 37 °C över natten.

3. Produktion av bacmid med hög genomströmning

OBS: Protokollet beskriver stegen för att extrahera bacmider med hjälp av en 96-brunnars bacmidreningssats.

  1. Inokulera enskilda vita kolonier (isolerade från de strimmiga plattorna till utspädningsplattorna) i brunnar med 96 djupa brunnar, innehållande 1 ml 2x LB-medium (tabell 2).
  2. Täck med en porös försegling och inkubera vid 37 °C över natten vid 700 varv per minut i en mikroexpressionsshaker.
  3. Bered en glycerolstam av cellerna genom att blanda 120 μl av kulturen med 30 μl 60 % glycerol i en mikrotiterplatta och förvara vid -80 °C.
  4. Centrifugera djupbrunnsblocket vid 2 600 × g i 30 minuter. Häll upp supernatanten i en lämplig behållare för dekontaminering. Vänd på blocket och knacka försiktigt på en pappershandduk. Tillsätt 250 μl lösning 1 till varje brunn i blocket med hjälp av en flerkanalspipett.
  5. Återsuspendera pelletsen; Använd vid behov en flerkanalspipett.
  6. Tillsätt 250 μl lösning 2 till varje brunn och förslut med en silikonmatta. Vänd försiktigt 5 gånger och inkubera i rumstemperatur i 10 min. Snurra mycket kort.
  7. Tillsätt 300 μl lösning 3 och förslut med en silikonmatta. Blanda försiktigt men grundligt genom att vända upp och ner 5x.
  8. Lägg provet på is i 20 minuter och centrifugera sedan vid 2 600 × g i 30 minuter vid 4 °C.
  9. Överför den klara supernatanten till ett nytt block med 96 brunnar. Centrifugera igen vid 2 600 × g i 30 minuter vid 4 °C.
  10. I ett nytt block med 96 djupa brunnar, dispensera 0,8 ml 100 % isopropanol per brunn. Tillsätt 0,8 ml supernatanter från motsvarande brunnar.
  11. Pipettera försiktigt upp och ner med en pipett och inkubera sedan på is i 30 minuter eller över natten vid 4 °C för att ge mer bakmid.
  12. Centrifugera vid 2 600 × g i 30 minuter vid 4 °C.
  13. Inuti ett biologiskt säkerhetsskåp, spraya utsidan av blocket med 70 % etanol, öppna blocket och kassera supernatanten.
  14. Tillsätt 500 μL 70 % etanol (v/v) till varje brunn och knacka försiktigt på blocket för att tvätta pelleten. Täck med en självhäftande plastförsegling och centrifugera vid 2 600 × g i 30 minuter vid 4 °C.
  15. Inuti ett biologiskt säkerhetsskåp öppnar du blocket och kasserar supernatanten. Knacka blocket mycket försiktigt på en pappershandduk för att ta bort etanolen. Låt blocket torka antingen inuti fläkten i 1-2 timmar eller i en 50 °C ugn.
  16. Tillsätt 50 μl steril TE-buffert för att återsuspendera bakmids-DNA och försegla med en självhäftande plastförsegling. Överför innehållet till en V-bottenmikrotiterplatta. Förvara bakmid-DNA vid 4 °C tills testreningen är klar och förvara det sedan vid -20 °C.
    OBS: Även om det inte mäts rutinmässigt, kan i allmänhet ett utbyte på 500 till 2 000 ng/μL bakmids-DNA förväntas.
  17. Använd standardmetoder för koloni-PCR47 och följande vektorprimrar för att screena för bacmider som framgångsrikt innehåller målgenen:
    pFBM-fwd caaaatgtcgtaacaactccgc
    pFBM-rev tagttaagaataccagtcaatctttcac
    OBS: Ampliconet kommer att vara ungefär 700 bp större än målgenen.

4. Transfektion

OBS: Dessa steg används för att transfektera Sf9-insektsceller med det producerade bacmidet, vilket får insektscellerna att generera baculoviruspartiklar (P0).

  1. Odla Sf9-celler i serumfritt insektsmedium till en densitet av 2,0-2,4 × 106 celler/ml. Späd cellerna till 2 × 105 celler/ml i serumfritt insektsmedium och fördela 1 ml av de utspädda cellerna i en brunn med 24 brunnars vävnadsodlingsplatta. Inkludera en kontroll med endast transfektion och endast celler . Inkubera plattan i en fuktad inkubator vid 27 °C i 1 timme så att cellen kan fästa.
  2. Blanda 38 μl serumfritt insektsmedium per brunn med 2 μl transfektionsreagens per brunn. Fördela 40 μl av blandningen i en 96-håls steril mikrotiterplatta med platt botten. Tillsätt 2 μL rekombinant bacmid-DNA vid 0,5-2,0 μg/μL, täck plattan och inkubera inuti det mikrobiologiska säkerhetsskåpet i 15 minuter.
  3. Tillsätt 160 μl serumfritt insektsmedium i varje brunn på mikrotiterplattan som innehåller blandningen av DNA-transfektionsreagens.
  4. Aspirera medium från cellerna i steg 4.1. Tillsätt försiktigt 200 μL bacmidtransfektionsreagens-mediumblandning till cellerna, täck plattan och inkubera i 4 timmar i en fuktad inkubator vid 27 °C.
  5. Tillsätt 400 μl serumfritt insektsmedium kompletterat med 2 % FBS till varje brunn. För att minska avdunstningen, överför plattan till en ren plastpåse men förslut den inte. Inkubera plattan vid 27 °C i 72 timmar i en fuktad inkubator.
  6. Efter 3 dagar överförs mediet från plattan till ett sterilt block med 96 brunnar och centrifugeras vid 1 500 × g i 20 minuter vid rumstemperatur. Överför den klarnade supernatanten som innehåller P0-baculovirus till ett sterilt block med 96 djupa brunnar och förvara vid 4 °C borta från ljus.

5. BacMam baculovirus amplifiering

OBS: Följande steg används för att amplifiera det initiala P0-baculoviruset till viruslager med högre titer; nämligen P1, P2 och P3. Den slutliga P3-titern är lämplig för transduktion och proteinuttryck. För effektivitet och parallellitet använder detta protokoll fasta volymetriska förhållanden för viral amplifiering, som har optimerats empiriskt. Om de därefter transducerade cellerna inte uppvisar GFP-fluorescens och ökad celldiameter genom mikroskopi eller om proteinuttrycket misslyckas (se avsnitt 6 och 8), bör baculovirusamplifieringen optimeras på nytt för en låg infektionsmultiplicitet i varje steg efter kvantifiering av baculovirustitern 49,50,51,52 och infektion övervakad med GFP-fluorescensmikroskopi och ökad celldiameter 53.

  1. Förbered P1-virusstammen genom att odla Sf9-celler i serumfritt insektsmedium till en densitet av 2 × 106 celler/ml, tillsätt 2 % FBS och så cellerna i ett block med 24 djupa brunnar i en slutlig volym på 3 ml per brunn. Tillsätt 120 μL P0-virusstam till cellerna.
  2. Inkubera blocket vid 27 °C under skakning vid 450 rpm i en mikroexpressionsshaker i 66-72 timmar. Centrifugera blocket vid 1 500 × g i 20 minuter vid rumstemperatur och skörda supernatanten i block med 96 djupa brunnar. Förvaras som P1-virusbuljong vid 4 °C borta från ljus.
  3. Bered P2-virusstammen genom att infektera 50 ml Sf9-celler (2 × 106 celler/ml celltäthet), odlade i serumfritt insektsmedium kompletterat med 2 % FBS, med 250 μl P1-virusstam. Inkubera cellerna vid 27 °C med skakning vid 110 varv per minut.
  4. Skörda P2-virusbuljongen efter 66–72 timmar genom centrifugering vid 1 500 × g i 20 minuter och förvara vid 4 °C i skydd mot ljus.
  5. Bered P3-virusstammen genom att infektera den önskade volymen av Sf9-celler (2 × 106 celler/ml celltäthet) med 1:200 (v/v) P2-virusstam. Inkubera cellerna vid 27 °C med skakning vid 110 varv per minut.
  6. Efter 66–72 timmar, centrifugera vid 1 500 × g i 20 minuter och skörda P3-viruset genom att samla upp supernatanten och förvara vid 4 °C, skyddad från ljus.

6. Transduktion för expressionstestning

I följande avsnitt beskrivs testning av småskaliga uttryck och kan modifieras för parallell testning av flera konstruktioner med hjälp av djupa brunnsblock.

  1. Bered en 20 % (w/v) polyetylenglykollösning genom att lösa 200 g PEG 10 000 och 12 g NaCl i 600 ml dubbeldestillerad H2O. Rör om och låt värma till en slutlig volym på 1 000 ml. Autoklavera lösningen.
  2. Tillsätt 300 μl skördat P1-virus i brunnarna i ett block med 24 djupa brunnar och 75 μl av PEG-lösningen i varje brunn. Inkubera blocket i en mikroexpressionsshaker vid 18 °C under skakning vid 300 rpm i 5 minuter och förvara blocket vid 4 °C över natten.
  3. Skaka blocket igen vid 300 varv per minut i 30 minuter vid 18 °C och centrifugera blocket vid 3 000 × g i 45 minuter. Kassera supernatanten med en pipett i ett mikrobiologiskt säkerhetsskåp.
  4. Bered suspensionsanpassade HEK293-celler i HEK293-medium till en densitet av 2 × 106 celler/ml, och frö 3 ml i varje brunn som innehåller viruspelleten, komplettera med 5 mM natriumbutyrat.
  5. Inkubera blocket vid 30 °C med 8 % CO2 under skakning vid 200-250 rpm i 72 timmar.
    OBS: De av leverantören rekommenderade CO2 -koncentrationerna under cellodling är olika för suspensionsanpassade och ursprungliga HEK293-cellinjer, vid 8 % respektive 5 %.
  6. Skörda cellerna genom centrifugering vid 900 × g i 20 minuter och tvätta varje väl med 1 ml PBS.
    OBS: Aspirera 10 μL resuspenderade celler och titta på cellerna i ett fluorescensmikroskop med en GFP-kompatibel filterkub för att bedöma proteinuttryck och lokalisering. Aspirera 10-15 μL resuspenderade celler och kör en helcells-SDS-PAGE-gel för GFP-fluorescensdetektioni gel 54.
  7. Centrifugera igen vid 900 × g i 20 min. Pelletsen fryses in vid -80 °C.

7. Småskalig testrening med hög genomströmning

OBS: Följande steg beskriver ett arbetsflöde för snabb testrening i ett blockformat med 24 brunnar för screening av uttrycksnivåerna för enskilda SLC:er. Se tabell 2 för sammansättningen av de lösningar som används i detta protokoll.

  1. Tillsätt 1 ml HT-lysbuffert till varje brunn med skördade celler och fortsätt att sonikera på is under en total längd av 4 minuter (cykling vid 3 s på/15 s av) i 24-brunnsblock med hjälp av en 24-huvudsond.
  2. Överför innehållet till ett 96-djupt brunnsblock, tillsätt 125 μL tvättmedelspapper och försegla med en silikontätning. Vrid blocket försiktigt vid 4 °C i 1 timme. Alternativt kan du tillsätta dodecylmaltosid (DDM) och kolesterolhemisuccinat (CHS) direkt till blocken med 24 brunnar och placera dem i en vippskakare vid 4 °C.
  3. Centrifugera blocket vid 2600 × g i 20 minuter vid 4 °C och överför supernatanten till ett nytt block med 96 djupa brunnar.
  4. Bered ett 50 % lager av Strep-Tactin-harts med hög kapacitet som är i balans med lyseringsbuffert.
  5. Tillsätt 100 μl återsuspenderat hartsmaterial till varje brunn.
  6. Täck blocket med en silikontätning och rotera vid 4 °C i 2 timmar och centrifugera sedan mycket kort (upp till 200 × g) för att avlägsna vätska som fastnat på locket.
  7. Placera en filterplatta med 96 brunnar ovanpå ett tomt block och överför blandningen av harts/supernatant till filterplattan. Skölj brunnarna i djupbrunnsblocket med 800 μL HT-tvättbuffert och överför till filterblocket för att samla upp maximal mängd harts.
  8. Låt bufferten droppa igenom eller centrifugera kort vid 200 × g och samla upp genomströmningen. Placera filterplattan ovanpå ett nytt tvättblock och tvätta hartset med 800 μL HT-tvättbuffert, låt bufferten droppa igenom (eller centrifugera kort). Upprepa tvättsteget två gånger till och centrifugera blocket vid 500 × g i 3 minuter för att ta bort den kvarvarande HT-tvättbufferten.
  9. Placera filterplattan ovanpå en 96-håls mikrotiterplatta. Tillsätt 50 μl HT-elueringsbuffert och inkubera under omskakning i rumstemperatur i 10 minuter. Eluera proverna genom centrifugering vid 500 × g i 3 minuter.
  10. Kör 15 μL av det eluerade provet på en Coomassie-färgad SDS-PAGE-gel för att kontrollera proteinuttrycket. Ladda de återstående proverna av elueringsmedel på ett system för storleksuteslutningskromatografi (SEC) eller fluorescensdetektion av storleksuteslutningskromatografi (FSEC) för att utvärdera proteinmonodispersitet i DDM/CHS.

8. Transduktion för storskaligt uttryck

OBS: Följande steg är RESOLUTE-standardprotokollet för SLC-uttryck. Individuella mål kommer att kräva ytterligare optimering för uttryckstid, inkubationstemperatur och koncentration av natriumbutyrat. Vidare optimerar vi rutinmässigt baculovirusets multiplicitet genom att testa olika volymetriska förhållanden av P3-viruset som används för att infektera de suspensionsanpassade HEK293-cellerna i småskaliga experiment. Detta är tidseffektivt, använder tekniker och utrustning som redan finns till hands och utvärderar direkt den önskade experimentella produktionen. Denna empiriska metod kräver dock omoptimering med varje amplifiering av P3-viruset, och andra metoder finns tillgängliga för att kvantifiera baculoviruspartiklarna 49,50,51,52.

  1. Skala upp erforderlig volym av suspensionsanpassade HEK293-celler i HEK293-medium.
  2. Späd suspensionsanpassade HEK293-celler till 1 × 106 celler/ml och odla i 24 timmar (vid 170 rpm för 2 L rullflaskor och 105 rpm för 3 L rullflaskor).
  3. Tillsätt 30 ml P3-virus per liter celler och tillsätt 5 mM natriumbutyrat. Inkubera cellerna vid 37 °C i 48 timmar eller vid 30 °C i 72 timmar.
  4. Under och efter inkubationstiden är ett viktigt steg att undersöka cellerna med hjälp av ljusfältsmikroskopi för att kontrollera mikrobiell kontaminering och cellviabilitet. Bedöma proteinuttryck och lokalisering med hjälp av fluorescensmikroskopi med en GFP-kompatibel filterkub.
  5. Skörda cellerna genom centrifugering vid 900 × g i 20 minuter.
  6. Tvätta cellpelleten genom att återsuspendera den i 10-15 ml PBS per liter cellkultur och pellet igen vid 900 × g i 20 min.
  7. Snap-frys cellpelletsen i flytande kväve och förvara dem vid -80 °C.

9. Rening av protein

OBS: Följande är standardmetoden RESOLUTE för SLC-rening för 5 L cellkultur. För varje SLC-mål måste det optimala tvättmedlet bestämmas empiriskt. Förbered basbuffert, tvättmedelslösning, tvätt, eluering och SEC-buffertar i förväg (tabell 2). För en lista över de testade standardtvättmedlen, se tabell 3. ATP och MgCl2 i tvättbufferten minskar kontaminering av värmechockproteiner.

  1. Dag 1
    1. Tina den frysta cellpelleten i ett vattenbad inställt på rumstemperatur.
    2. Bered solubiliseringsbuffert med 135 ml basbuffert och tre proteashämmande cocktailtabletter. Låt tabletterna lösas upp.
    3. Återsuspendera den tinade pelleten med solubiliseringsbuffert. Använd 27 ml solubiliseringsbuffert per 10-15 g cellpellet, tillsätt DNas och häll i en iskall Dounce homogenisator. Homogenisera lösningen genom att flytta kolven upp och ner cirka 20 gånger, håll homogenisatorn på is.
      OBS: Resuspensionsvolymen måste optimeras baserat på målproteinet och cellpelletsmassan, som kommer att variera på grund av celldensiteten vid skörd. Kommersiell DNase kan läggas till enligt tillverkarens instruktioner. DNase kan också uttryckas och renas internt med hjälp av etablerade protokoll55.
    4. Tillsätt medelslösning till 1 % slutkoncentration.
      OBS: Ett viktigt steg för att optimera proteinrening är att identifiera det optimala tvättmedlet för SLC-solubilisering och rening, vilket måste identifieras empiriskt. Vi har regelbundet använt olika tvättmedel; var och en för sig och i kombination med kolesterylhemisuccinat, vilket håller förhållandet mellan tvättmedlet och CHS-massan på 10:1.
    5. Överför solubiliseringsblandningen till 50 ml koniska rör. Rotera långsamt i 1 timme vid 4 °C.
    6. Centrifugera lösningen vid 50 000 × g i 30 minuter vid 4 °C. Samla supernatanten.
    7. Jämvikt 4-6 ml bäddvolym Strep-Tactin-harts med basbufferten.
    8. Tillsätt ekvilibrerad harts till den solubiliserade supernatanten och rotera i 2 timmar vid 4 °C.
    9. Häll lösningen i en gravitationskolonn och låt lösningen rinna igenom.
    10. Tvätta hartset med 30 gånger bäddvolymen av Strep tvättbuffert i 3 lika stora volymsteg.
    11. Tillsätt 3-5 ml elueringsbuffert, inkubera i 15 minuter och samla upp eluatet. Upprepa detta steg ytterligare fyra gånger och samla in varje elueringsfraktion separat.
      OBS: Ett viktigt steg är proteineluering från Strep-Tactin-hartset, där det är viktigt att inkubera i 15 minuter efter varje tillsats av elueringsbufferten. Vanligtvis innehåller den första eluatfraktionen en lägre koncentration av protein på grund av utspädningen av elueringsbufferten med den kvarvarande tvättbufferten. Därför kan den första eluatfraktionen kasseras om en högre slutlig proteinkoncentration önskas. Alternativt kan proteinkoncentrationen i alla serieelueringar också analyseras med hjälp av SDS-PAGE för att optimera protokollet.
    12. Mät proteinkoncentrationen med UV-absorbansspektroskopi, kombinera de önskade elueringsfraktionerna och tillsätt 3C-proteas i förhållandet 1:5 (vikt/vikt) till 1:10 (vikt/vikt).
    13. Rotera långsamt över natten vid 4 °C.
      OBS: Steg 9.1.12 och 9.1.13 är endast nödvändiga om GFP-taggen behöver tas bort. Om taggborttagning inte krävs, fortsätt direkt till steg 9.2.4. Alternativt kan proteinet förvaras vid 4 °C över natten för att fortsätta nästa dag. Dessutom, för SLC med minskad stabilitet, kan proteaskoncentrationen, inkubationstiden och temperaturen behöva optimeras. 3C-proteaset är aktivt över ett brett temperaturområde och möjliggör optimering som är bäst lämpad för olika SLC:er.
  2. Dag 2
    1. Jämvikt 2-4 ml bäddvolym koboltmetallaffinitetsharts med SEC-buffert.
    2. Tillsätt ekvilibrerad koboltmetallaffinitetsharts till 3C-reaktionsblandningen över natten och rotera i 1 timme vid 4 °C.
    3. Häll lösningen i en gravitationskolonn och samla upp genomströmningen.
    4. Koncentrera genomströmningen i ett centrifugalfilter med 100 kDa avstängning genom centrifugalcentrifugering vid 3 000 × g vid 4 °C och blanda försiktigt provet var 5:e minut tills önskad SEC-injektionsvolym uppnås.
    5. Jämvikt i en dextran-agaros-baserad storleksuteslutningskromatografikolonn med hjälp av SEC-buffert. SEC-proceduren bör utföras vid 4 °C (kylkammare eller kylrum).
      OBS: Nyckelsteg: Beroende på SLC:s oligomera tillstånd kan en annan kolonn, såsom en agarosbaserad storleksuteslutningskromatografikolonn, användas för att utföra SEC.
    6. Injicera sample i sample slinga och kör SEC-programmet, med en flödeshastighet sådan att kolonntrycket är under kolonntillverkarens specifikationer. Använd en fraktionsuppsamlare och samla automatiskt in 0.3 ml fraktioner under hela SEC-körningen.
    7. Poola toppfraktioner, mät UV-absorbansen och koncentrera i en 100 kDa centrifugalkoncentrator till erforderlig volym/koncentration genom centrifugering vid 3 000 × g vid 4 °C.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

SLC-gener kan klonas från RESOLUTE pDONR-plasmider till BacMam-vektorer för däggdjursuttryck
De beskrivna protokollen för kloning, uttryck och rening har visat sig vara framgångsrika för många SLC-transportörer över flera proteinveckningar. Icke desto mindre innehåller procedurerna flera kontrollpunkter för att övervaka framsteg, vilket möjliggör optimering för att ta hänsyn till skillnader i uttryck, proteinveckning, lipid- och detergentberoende stabilitet och känslighet för buffertförhållanden.

Kontrollpunkter under SLC-kloning och småskaligt uttryck
I kloningsstegen bör agarosgelelektrofores användas för att säkerställa rätt storlek på PCR och matsmältningsprodukter. På samma sätt kan gateway- och transponeringsreaktionerna valideras med en koloni-PCR-reaktion (figur 2A,B). Generering av baculovirus kan övervakas med hjälp av standardtekniker vid behov 49,50,51,52. Den initiala expressionen bör göras i liten skala, med utvärdering av proteinutbytet med SDS-PAGE (Figur 2B). På samma sätt bör fraktionen av gröna fluorescerande celler, det totala proteinuttrycket och proteinlokaliseringen noteras med hjälp av fluorescensmikroskopi (Figur 2C,D). Proteinuttrycket bör optimeras för celltyp, temperatur, tid och nödvändigheten av att samuttrycka chaperoner eller komplexa partners. Uttrycket kan optimeras ytterligare genom att modifiera konstruktionen för att trunkera oordnade N- och C-termini, baserat på förutsägelse av sekundär struktur56,57,58, och testa typerna och placeringen av tillhörighetstaggar. Proteinstabilitet bör utvärderas i liten skala med FSEC (figur 2E), SEC-baserad termisk skiftanalys (SEC-T) och DSF 41,42,59,60,61,62. Små molekyler, såsom substrat och hämmare, rengöringsmedel, kolesterolhemisuccinat, lipider och pH bör testas för att förbättra proteinstabiliteten med tanke på proteinets funktion och ursprungliga subcellulära miljö och efterföljande reningsbuffertar modifieras i enlighet med detta. I både små- och storskaliga expressionsuppställningar bör celler övervakas med mikroskopi med avseende på livskraft och kontaminering.

Optimering av transportrening i stor skala
Varje steg i storskalig proteinrening bör utvärderas av SDS-PAGE, inklusive in-gel-fluorescens för att specifikt övervaka det GFP-märkta proteinet och enzymatiskt avlägsnande av den taggen. I praktiken ser de GFP-märkta SLC-uttryckande cellerna gulgröna ut. Efter Twin-Strep-tag kromatografisk eluering ser elueringsmedlet som innehåller det renade proteinet fluorescerande neongrönt ut under vitt ljus. Kemiskt och strukturellt homogent protein bör ge en enda monodispersiv A280-topp under storleksuteslutningskromatografi (Figur 2F,G), och bör visa ett enda band på SDS-PAGE. SDS-PAGE-bandet som motsvarar den förväntade SLC, och eventuella oväntade band, bör analyseras med hjälp av tryptisk uppslutningsmasspektrometri. Flera band på SDS-PAGE-gelen indikerar antingen proteolytisk nedbrytning, kontaminerande proteiner eller SDS-resistenta oligomerer. Kontaminerande proteiner kan avlägsnas genom att öka NaCl-koncentrationen i solubiliseringsbufferten eller ändra affinitetstaggen. Proteolys kan begränsas genom att förbättra proteinets renhet, se till att alla steg görs vid 4 °C eller på is och optimera protokollet för att minimera tiden för varje steg. Om SEC-profilen har en bred topp, flera toppar eller en stor tomrumstopp (t.ex. det lila spåret i figur 2F) bör konstruktions- och reningsförhållandena optimeras i liten skala med hjälp av FSEC, SEC-Ts eller DSF 41,42,59,60,61,62.

Figure 1
Figur 1: Schematisk bild av RESOLUTE-arbetsflödet för SLC-uttryck och rening. Steg-för-steg-illustration av rekombinationskloning, BacMam baculovirusberedning, proteinuttryck och rening samt nedströmsapplikationer. Förkortningar: SLC = bärare av lösta ämnen; Kryo-EM = kryoelektronmikroskopi; SEC = storleksuteslutningskromatografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Representativa resultat för SLC-uttryck och rening . (A) Koloni-PCR av SLC-kloning med hög genomströmning till pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW. (B) Coomassie-färgad SDS-PAGE av ett enda småskaligt, parallellt uttryckstest av 24 olika fullängds-SLC:er. (C) Fluorescens i cellen av en GFP-märkt SLC lokaliserad främst till plasmamembranet. (D) Fluorescens i cellen av en GFP-märkt SLC med signifikant intracellulär lokalisering. E) Representativa FSEC-spår för fyra SLC:er upplösta på en hydrofil, neutral kiseldioxidbaserad UHPLC-kolonn. Representativa SEC-spår för sex SLC:er renade på antingen en (F) dextran-agaros- eller (G) agarosstorleksuteslutningskromatografikolonner. Molekylvikter för SLC-komplexet och tvätt- och rengöringsmedel som används för rening anges där det oligomera tillståndet har bestämts experimentellt. Förkortningar: SLC = bärare av lösta ämnen; GFP = grönt fluorescerande protein; FSEC = fluorescensdetektionsstorleksuteslutningskromatografi. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Nedströms användning av renade SLC:er . (A) Mikrobild av SLC1A1 i tvättmedel. (B) 2D-klassmedelvärden för SLC1A1 i tvättmedel. C) Rå fluorescens av CPM-termisk denatureringsanalys av SLC10A6 inkuberad med olika koncentrationer av Taurolithocholic acid 3-sulfate. D) Förstaderivatan av CPM termisk denaturering av SLC10A6. SLC10A6:s smälttemperatur ökade med 10 °C i närvaro av 120 μM Taurolithocholic acid 3-sulfate. Förkortningar: SLC = bärare av lösta ämnen; CPM = N-[4-(7-dietylamino-4-metyl-3-kumarinyl)fenyl]maleimid. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Vektor namn Markörer för antibiotika Taggar för Rening Screening Primers bp som läggs till under PCR
pHTBV1.1-C3CGFP-SIII-10H-GTW FörstärkareR C-terminalen pHTBV-F (CTATAGACTCTATAGGCACACC) ~350
GFP vid 3C-proteasstället
Dubbel-streptokocker GFP-R (CTGTCGTACAGATGAACTTCAAGGTC)
Hans10
pDONR221 KanR ingen M13 Framåt ~190
M13 Omvänd

Tabell 1: Plasmider som används för RESOLUTE-kloning och generering av BacMam.

Lösning Sammansättning
DH10Bac markeringsplattor LB-agarplattor innehållande 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin, 7 μg/ml gentamycin, 40 μg/ml IPTG och 100 μg/ml bluo-gal
2x LB medium (med antibiotika) 2x LB-buljong innehållande 50 μg/ml kanamycin, 10 μg/ml tetracyklin och 7 μg/ml gentamycin
HT Lysis buffert 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, EDTA-fri proteashämmare
HT Tvätt buffert 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS
HT Elueringsbuffert 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 250 mM NaCl, 5% glycerol, 0,03% DDM/0,003% CHS, 100 mM D-biotin
Bas buffert 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl
Stamlösning för tvättmedel 10 % (vikt/volym) tvättmedel, med eller utan 1 % CHS beroende på vad som är lämpligt. Blanda vid 4 °C över natten och förvara vid -20 °C.
Buffert för streptokocktvätt 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, tvättmedel vid 3-faldig CMC, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP
Buffert för eluering av streptokocker 50 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, 100 mM D-biotin, tvättmedel vid 3-faldig CMC
Buffert för storleksuteslutningskromatografi (SEC) 20 mM HEPES-NaOH, pH 7,5, 150 mM NaCl, tvättmedel vid 2-faldig CMC. Filtrera genom ett 0,22 μM membran.
Natriumbutyrat 1 M lösning i DPBS, förvaras vid -20 °C för långvarig användning.

Tabell 2: En lista över lösningar som används i detta protokoll och deras sammansättning.

System för rengöringsmedel Extraktionskoncentration Reningskoncentration (% vikt/volym)
DDM 1% 0.03%
DDM + CHS 1% + 0.1% 0.03% + 0.003%
DECIMETER 1% 0.25%
DM+CHS 1% + 0.1% 0.25% + 0.025%
NG 1% 0.60%
OG 1.5% 1.50%
LDAO (LDAO) 1% 0.07%
LDAO + CHS 1% + 0.1% 0.07% + 0.007%
C12E8 1% 0.015%
C12E8 + CHS 1% + 0.1% 0.015% + 0.0015%
C12E9 + CHS 1% + 0.1% 0.01 + 0.001%
CYMAL-5 1% 0.40%
LMNG (på engelska) 1% 0.005%
LMNG + CHS 1% + 0.1% 0.005% + 0.0005%
GDN 1% 0.02%
Digitonin (på engelska) 0.05%
OGNG + CHS 1% + 0.1% 0.18% + 0.018%
C12E10 + CHS 1% + 0.1% 0.04% + 0.004%
Fos Kolin-12 1% 0.14%

Tabell 3: Standardtvättmedel som används för att testa membransolubilisering och SLC-monodispersitet och stabilitet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Utvecklingen av SLC-riktade terapier har förblivit hämmad på grund av frånvaron av systematisk karakterisering av transportörens funktion. Detta har lett till oproportionerligt färre läkemedel som riktar sig mot denna proteinklass jämfört med GPCR och jonkanaler63, trots deras många roller i normala och patofysiologiska processer. RESOLUTE är ett internationellt konsortium som syftar till att utveckla banbrytande forskningstekniker och verktyg för att påskynda och förbättra nuvarande SLC-forskning. Som en del av RESOLUTE har vi utvecklat dessa protokoll för effektiv kloning, konstruktionsscreening och storskalig expression och rening av mänskliga SLC:er.

Här beskriver vi skalbara SLC-klonings- och expressionsmetoder som framgångsrikt användes för att systematiskt utforska de mänskliga SLC-transportörerna, inklusive förmodade och föräldralösa SLC:er. Framför allt har SLC:er renade på detta sätt framgångsrikt använts i efterföljande studier av transportörstruktur, biokemi, funktion, bindemedelsgenerering och bindning av små molekyler. Vi använder regelbundet denna metod för att rena milligrammängder av olika SLC:er och under optimala förhållanden kan hela protokollet, inklusive klonings- och vävnadsodlingsstegen, slutföras på 4-5 veckor.

Vår metod är optimerad för ekonomi och parallellitet för att systematiskt utvärdera flera mål. Denna metod med hög genomströmning är dock också lätt att anpassa till parallell generering av konstruktioner för ett enda mål med olika trunkeringar eller taggar med hjälp av distinkta kloningsprimers eller vektorer. Detta liknar metoder som också optimerar flera konstruktioner för ett mål64, även om vårt protokoll erbjuder ytterligare effektivitet med parallell kloning, baculovirusgenerering och uttryckstestning. Transfektion erbjuder en kortare tid mellan konstruktkloning och uttryck genom att avstå från baculovirusgeneration65 men är betydligt dyrare och mer mödosamt för storskaligt uttryck. Däremot är stabila cellinjer sannolikt billigare för storskaligt uttryck66, men att generera mycket uttryckande klonala cellinjer kan kräva mer tid och specialiserade resurser. Slutligen, medan detta protokoll använder humana cellinjer för proteinproduktion, har insektscellslinjer som från Spodoptera frugiperda och Trichoplusia ni också framgångsrikt använts för storskaligt SLC-uttryck 5,31,64. Uttryck i mänskliga cellinjer ökar mediekostnaderna men erbjuder mer nativt liknande modifieringar efter translation och lipidmiljö39,67.

Även om protokollet kan anpassas för olika membrantransportörer och experimentella behov, påverkar flera faktorer kvaliteten och utbytet av de renade proteinproverna. Även om det är idealiskt att studera fullängdsproteiner, kan en viss grad av sekvenstrunkering krävas för att uppnå bättre uttryck, rening och rekonstitution. Alla RESOLUTE SLC-konstruktioner har märkts med en klyvbar GFP, vilket är värdefullt för att övervaka SLC-uttryck, cellulär lokalisering och rening. Det suspensionsanpassade HEK293-cellexpressionssystemet som används i dessa experiment har lett till överlägsna utbyten och rekommenderas, även om vi rutinmässigt också producerar proteiner utan komplex glykosylering via den suspensionsanpassade HEK293 GnTl-cellinjen. Inkubationstemperaturen och längden för proteinuttryck av transducerade celler bör optimeras för varje mål, även om vi har funnit att 72 timmar vid 30 °C är en bra standard.

Alla proteinreningssteg bör utföras på is eller vid 4 °C och när det renade proteinet har snäppfrysts bör frys-upptiningscykler undvikas. Typen och mängden av de rengöringsmedel som används i membransolubiliserings- och reningsbuffertar är kritiska och bör bestämmas empiriskt för varje SLC.

De SLC:er som renas med denna metod ger homogena och strukturellt och funktionellt intakta prover, som kan användas för en mängd olika biokemiska och biofysikaliska studier. Att observera enstaka, diskreta partiklar av det solubiliserade och renade SLC-proteinet genom negativ färgning och Cryo-EM (Figur 3A,B) kan vara lovande för efterföljande strukturbestämning37. Den renade SLC i tvättmedel kan användas för biofysikaliska analyser såsom termisk stabilitetsanalys (Figur 3C,D) för att undersöka proteininteraktioner med små molekyler såsom substrat, hämmare eller lipider 59,62. Slutligen kan de SLC:er som renats med hjälp av detta protokoll i biokemiska analyser rekonstitueras till liposomer eller nanoskivor för funktionella analyser68 och användas för generering och selektion av antikroppar och nano69,70. Även om det fortfarande är en utmaning att anpassa dessa metoder till den genomströmning som krävs för upptäckten av nya SLC-riktade små molekyler 1, har lovande framsteg gjorts inom området in vitro screeningteknik med hög kapacitet71,72,73,74.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna deklarerar inga konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Detta arbete utfördes inom ramen för RESOLUTE-projektet. Resolute har fått finansiering från det gemensamma företaget för initiativet för innovativa läkemedel 2 enligt bidragsavtal nr 777372. Detta gemensamma företag får stöd från Europeiska unionens forsknings- och innovationsprogram Horisont 2020 och EFPIA. Denna artikel återspeglar endast författarnas åsikter och varken IMI eller Europeiska unionen och EFPIA är ansvariga för hur informationen i artikeln används. PHTBV-plasmiden tillhandahölls vänligen av professor Frederick Boyce (Harvard).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3C protease Produced in-house
50 or 100 kDa cut-off centrifugal concentrators Sartorius VS0242
5-Cyclohexyl-1-Pentyl-β-D-Maltoside Anatrace C325 CYMAL-5
96-well bacmid purification kit Millipore LSKP09604 Montage Plasmid Miniprep
96-well block (2 mL) Greiner Bio-One 780271
Adhesive plastic seals Qiagen 19570 Tape Pads
Agarose size exclusion chromatography column Cytiva 29091596 Superose 6 Increase 10/300 GL
Benzonase DNAse Produced in-house
BisTris Sigma Aldrich B9754
Cholesteryl Hemisuccinate Tris salt Anatrace CH210 CHS
Cobalt metal affinity resin Takara Bio 635653 TALON Metal Affinity Resin
D(+)-Biotin Sigma Aldrich 851209
Dextran-agarose size exclusion chromatography column Cytiva 28990944 Superdex 200 Increase 10/300 GL
Digitonin Apollo Scientific BID3301
Dounce tissue grinder (40 mL) DWK Life Sciences 357546
EDTA-free protease inhibitor cocktail Sigma Aldrich 4693132001 cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail
Fetal Bovine Serum Thermo Fisher 10500064
Fos-Choline-12 Anatrace F308S FS-12
Glycerol Sigma Aldrich G5516
Glyco-diosgenin Anatrace GDN101 GDN
Gravity flow columns Cole-Parmer WZ-06479-25
HEK293 medium Thermo Fisher 12338018 FreeStyle 293 medium
HEPES Apollo Scientific BI8181
Hydrophilic, neutral silica UHPLC column Sepax 231300-4615 Unix-C SEC-300 4.6 x 150
Imidazole Sigma Aldrich 56750
Insect transfection reagent Sigma Aldrich 71259 Reagent
Lauryl Maltose Neopentyl Glycol Anatrace NG310 LMNG
Magnesium Chloride Hexahydrate Sigma Aldrich M2670
Micro-expression shaker Glas-Col 107A DPMINC24CE
NaCl Sigma Aldrich S9888
n-Decyl-β-D-Maltoside Anatrace D322 DM
n-Dodecyl-b-D-Maltopyranoside Anatrace D310 DDM
n-Dodecyl-N,N-Dimethylamine-N-Oxide Anatrace D360 LDAO
n-Nonyl-β-D-Glucopyranoside Anatrace N324S NG
n-Octyl-d17-β-D-Glucopyranoside Anatrace O311D OGNG
Octaethylene Glycol Monododecyl
Ether		 Anatrace O330 C12E8
Octyl Glucose Neopentyl Glycol Anatrace NG311 OGNG
Phosphate Buffered Saline Sigma Aldrich D8537 DPBS
Polyoxyethylene(10)dodecyl Ether Anatrace AP1210 C12E10
Polyoxyethylene(9)dodecyl Ether Anatrace APO129 C12E9
Porous seal for tissue culture plates VWR 60941-084 Rayon Films for Biological Cultures
Proteinase K New England Biolabs P8107S
Recombination enzyme mix Thermo Fisher 11791020 Gateway LR Clonase II
Serum-free insect media Gibco 10902088 Sf-900 II serum-free media
Sodium Butyrate Sigma Aldrich 303410
Sonicator 24-head probe Sonics 630-0579
Sonicator power unit Sonics VCX 750
Strep-Tactin resin IBA Life Sciences 2-5030-025 Strep-TactinXT 4Flow high- capacity resin
Sucrose Sigma Aldrich S7903
Sucrose Monododecanoate Anatrace S350 DDS
Suspension-adapted HEK293 cells Thermo Fisher A14527 Expi293F
Transfection reagent Sigma Aldrich 70967 GeneJuice Transfection Reagent

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, W. W., Gallo, L., Jadhav, A., Hawkins, R., Parker, C. G. The druggability of solute carriers. Journal of Medicinal Chemistry. 63 (8), 3834-3867 (2020).
  2. Liao, J., et al. Structural insight into the ion-exchange mechanism of the sodium/calcium exchanger. Science. 335 (6069), 686-690 (2012).
  3. Bröer, S., Gether, U. The solute carrier 6 family of transporters: the solute carrier family 6. British Journal of Pharmacology. 167 (2), 256-278 (2012).
  4. Anderson, C. M., Stahl, A. SLC27 fatty acid transport proteins. Molecular Aspects of Medicine. 34 (2-3), 516-528 (2013).
  5. Nguyen, L. N., et al. Mfsd2a is a transporter for the essential omega-3 fatty acid docosahexaenoic acid. Nature. 509 (7501), 503-506 (2014).
  6. Kobayashi, N., et al. MFSD2B is a sphingosine 1-phosphate transporter in erythroid cells. Scientific Reports. 8 (1), 4969 (2018).
  7. Kawahara, A., et al. The sphingolipid transporter Spns2 functions in migration of zebrafish myocardial precursors. Science. 323 (5913), 524-527 (2009).
  8. Kandasamy, P., Gyimesi, G., Kanai, Y., Hediger, M. A. Amino acid transporters revisited: New views in health and disease. Trends in Biochemical Sciences. 43 (10), 752-789 (2018).
  9. Navale, A. M., Paranjape, A. N. Glucose transporters: physiological and pathological roles. Biophysical Reviews. 8 (1), 5-9 (2016).
  10. Pajor, A. M. Molecular properties of the SLC13 family of dicarboxylate and sulfate transporters. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 451 (5), 597-605 (2006).
  11. Nwosu, Z. C., Song, M. G., Di Magliano, M. P., Lyssiotis, C. A., Kim, S. E. Nutrient transporters: connecting cancer metabolism to therapeutic opportunities. Oncogene. 42 (10), 711-724 (2023).
  12. Girardi, E., et al. A widespread role for SLC transmembrane transporters in resistance to cytotoxic drugs. Nature Chemical Biology. 16 (4), 469-478 (2020).
  13. Nigam, S. K. The SLC22 transporter family: a paradigm for the impact of drug transporters on metabolic pathways, signaling, and disease. Annual Review of Pharmacology and Toxicology. 58 (1), 663-687 (2018).
  14. Cheng, M. H., et al. Insights into the modulation of dopamine transporter function by amphetamine, orphenadrine, and cocaine binding. Frontiers in Neurology. 6, 134 (2015).
  15. Sachkova, A., Doetsch, D. A., Jensen, O., Brockmöller, J., Ansari, S. How do psychostimulants enter the human brain? Analysis of the role of the proton-organic cation antiporter. Biochemical Pharmacology. 192, 114751 (2021).
  16. Lin, L., Yee, S. W., Kim, R. B., Giacomini, K. M. SLC transporters as therapeutic targets: emerging opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 14 (8), 543-560 (2015).
  17. Yernool, D., Boudker, O., Jin, Y., Gouaux, E. Structure of a glutamate transporter homologue from Pyrococcus horikoshii. Nature. 431 (7010), 811-818 (2004).
  18. Huang, Y., Lemieux, M. J., Song, J., Auer, M., Wang, D. -N. Structure and mechanism of the glycerol-3-phosphate transporter from Escherichia coli. Science. 301 (5633), 616-620 (2003).
  19. Yamashita, A., Singh, S. K., Kawate, T., Jin, Y., Gouaux, E. Crystal structure of a bacterial homologue of Na+/Cl--dependent neurotransmitter transporters. Nature. 437 (7056), 215-223 (2005).
  20. Sauer, D. B., et al. Structural basis for the reaction cycle of DASS dicarboxylate transporters. eLife. 9, 61350 (2020).
  21. Levin, E. J., Quick, M., Zhou, M. Crystal structure of a bacterial homologue of the kidney urea transporter. Nature. 462 (7274), 757-761 (2009).
  22. Abramson, J., et al. Structure and mechanism of the lactose permease of Escherichia coli. Science. 301 (5633), 610-615 (2003).
  23. Faham, S., et al. The crystal structure of a sodium galactose transporter reveals mechanistic insights into Na + /sugar symport. Science. 321 (5890), 810-814 (2008).
  24. Lopez-Redondo, M. L., Coudray, N., Zhang, Z., Alexopoulos, J., Stokes, D. L. Structural basis for the alternating access mechanism of the cation diffusion facilitator YiiP. Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (12), 3042-3047 (2018).
  25. Mulligan, C., et al. The bacterial dicarboxylate transporter VcINDY uses a two-domain elevator-type mechanism. Nature Structural & Molecular Biology. 23 (3), 256-263 (2016).
  26. Kermani, A. A. A guide to membrane protein X-ray crystallography. The FEBS Journal. 288 (20), 5788-5804 (2021).
  27. Carpenter, E. P., Beis, K., Cameron, A. D., Iwata, S. Overcoming the challenges of membrane protein crystallography. Current Opinion in Structural Biology. 18 (5), 581-586 (2008).
  28. Sonoda, Y., et al. Benchmarking membrane protein detergent stability for improving throughput of high-resolution X-ray structures. Structure. 19 (1), 17-25 (2011).
  29. Wang, H., et al. Structural basis for action by diverse antidepressants on biogenic amine transporters. Nature. 503 (7474), 141-145 (2013).
  30. Malinauskaite, L., et al. A mechanism for intracellular release of Na+ by neurotransmitter/sodium symporters. Nature Structural & Molecular Biology. 21 (11), 1006-1012 (2014).
  31. Sauer, D. B., et al. Structure and inhibition mechanism of the human citrate transporter NaCT. Nature. 591 (7848), 157-161 (2021).
  32. Qiu, B., Matthies, D., Fortea, E., Yu, Z., Boudker, O. Cryo-EM structures of excitatory amino acid transporter 3 visualize coupled substrate, sodium, and proton binding and transport. Science Advances. 7 (10), eabf5814 (2021).
  33. Canul-Tec, J. C., et al. Structure and allosteric inhibition of excitatory amino acid transporter 1. Nature. 544 (7651), 446-451 (2017).
  34. Coleman, J. A., Green, E. M., Gouaux, E. X-ray structures and mechanism of the human serotonin transporter. Nature. 532 (7599), 334-339 (2016).
  35. Han, L., et al. Structure and mechanism of the SGLT family of glucose transporters. Nature. 601 (7892), 274-279 (2022).
  36. Choy, B. C., Cater, R. J., Mancia, F., Pryor, E. E. A 10-year meta-analysis of membrane protein structural biology: Detergents, membrane mimetics, and structure determination techniques. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Biomembranes. 1863 (3), 183533 (2021).
  37. Piper, S. J., Johnson, R. M., Wootten, D., Sexton, P. M. Membranes under the magnetic lens: a dive into the diverse world of membrane protein structures using Cryo-EM. Chemical Reviews. 122 (17), 13989-14017 (2022).
  38. Superti-Furga, G., et al. The RESOLUTE consortium: unlocking SLC transporters for drug discovery. Nature Reviews Drug Discovery. 19 (7), 429-430 (2020).
  39. Fornwald, J. A., Lu, Q., Boyce, F. M., Ames, R. S. Gene expression in mammalian cells using BacMam, a modified baculovirus system. Baculovirus and Insect Cell Expression Protocols. 1350, 95-116 (2016).
  40. Mahajan, P., et al. Expression screening of human integral membrane proteins using BacMam. Structural Genomics. 2199, 95-115 (2021).
  41. Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14 (4), 673-681 (2006).
  42. Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20 (8), 1293-1299 (2012).
  43. Fan, M., Tsai, J., Chen, B., Fan, K., LaBaer, J. A central repository for published plasmids. Science. 307 (5717), 1877-1877 (2005).
  44. Resolute Public Reagents. , https://re-solute.eu/resources/reagents (2023).
  45. Hartley, J. L. DNA cloning using in vitro site-specific recombination. Genome Research. 10 (11), 1788-1795 (2000).
  46. Froger, A., Hall, J. E. Transformation of Plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. Journal of Visualized Experiments. (6), 253 (2007).
  47. Bergkessel, M., Guthrie, C. Colony PCR. Methods in Enzymology. 529, 299-309 (2013).
  48. Luckow, V. A., Lee, S. C., Barry, G. F., Olins, P. O. Efficient generation of infectious recombinant baculoviruses by site-specific transposon-mediated insertion of foreign genes into a baculovirus genome propagated in Escherichia coli. Journal of Virology. 67 (8), 4566-4579 (1993).
  49. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the Plaque Technique. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 18 (0), 273-279 (1953).
  50. Hitchman, R. B., Siaterli, E. A., Nixon, C. P., King, L. A. Quantitative real-time PCR for rapid and accurate titration of recombinant baculovirus particles. Biotechnology and Bioengineering. 96 (4), 810-814 (2007).
  51. Hopkins, R. F., Esposito, D. A rapid method for titrating baculovirus stocks using the Sf-9 Easy Titer cell line. BioTechniques. 47 (3), 785-788 (2009).
  52. Shen, C. F., Meghrous, J., Kamen, A. Quantitation of baculovirus particles by flow cytometry. Journal of Virological Methods. 105 (2), 321-330 (2002).
  53. Janakiraman, V., Forrest, W. F., Seshagiri, S. Estimation of baculovirus titer based on viable cell size. Nature Protocols. 1 (5), 2271-2276 (2006).
  54. Bird, L. E., et al. fluorescent protein-based expression screening of membrane proteins in Escherichia coli. Journal of Visualized Experiments. (95), 52357 (2015).
  55. Biedermann, K., Jepsen, P. K., Riise, E., Svendsen, I. Purification and characterization of a Serratia marcescens nuclease produced by Escherichia coli. Carlsberg Research Communications. 54 (1), 17-27 (1989).
  56. Cong, Q., Grishin, N. V. MESSA: MEta-Server for protein Sequence Analysis. BMC Biology. 10 (1), 82 (2012).
  57. Jumper, J., et al. Highly accurate protein structure prediction with AlphaFold. Nature. 596 (7873), 583-589 (2021).
  58. Baek, M., et al. Accurate prediction of protein structures and interactions using a three-track neural network. Science. 373 (6557), 871-876 (2021).
  59. Mancusso, R., Karpowich, N. K., Czyzewski, B. K., Wang, D. -N. Simple screening method for improving membrane protein thermostability. Methods. 55 (4), 324-329 (2011).
  60. Majd, H., et al. Screening of candidate substrates and coupling ions of transporters by thermostability shift assays. eLife. 7, e38821 (2018).
  61. Nji, E., Chatzikyriakidou, Y., Landreh, M., Drew, D. An engineered thermal-shift screen reveals specific lipid preferences of eukaryotic and prokaryotic membrane proteins. Nature Communications. 9 (1), 4253 (2018).
  62. Alexandrov, A. I., Mileni, M., Chien, E. Y. T., Hanson, M. A., Stevens, R. C. Microscale fluorescent thermal stability assay for membrane proteins. Structure. 16 (3), 351-359 (2008).
  63. Santos, R., et al. A comprehensive map of molecular drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 16 (1), 19-34 (2017).
  64. Goehring, A., et al. Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies. Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).
  65. Kaipa, J. M., Krasnoselska, G., Owens, R. J., Van Den Heuvel, J. Screening of membrane protein production by comparison of transient expression in insect and mammalian cells. Biomolecules. 13 (5), 817 (2023).
  66. Khanppnavar, B., et al. Structural basis of organic cation transporter-3 inhibition. Nature Communications. 13 (1), 6714 (2022).
  67. Marheineke, K., Grünewald, S., Christie, W., Reiländer, H. Lipid composition of Spodoptera frugiperda (Sf9) and Trichoplusia ni (Tn) insect cells used for baculovirus infection. FEBS Letters. 441 (1), 49-52 (1998).
  68. Majeed, S., Ahmad, A. B., Sehar, U., Georgieva, E. R. Lipid membrane mimetics in functional and structural studies of integral membrane proteins. Membranes. 11 (9), 685 (2021).
  69. Schenck, S., et al. Generation and characterization of anti-VGLUT nanobodies acting as inhibitors of transport. Biochemistry. 56 (30), 3962-3971 (2017).
  70. Zimmermann, I., et al. Synthetic single domain antibodies for the conformational trapping of membrane proteins. eLife. 7, e34317 (2018).
  71. Yandrapalli, N., Robinson, T. Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies. Lab on a Chip. 19 (4), 626-633 (2019).
  72. Bazzone, A., Barthmes, M., Fendler, K. SSM-based electrophysiology for transporter research. Methods in Enzymology. 594, 31-83 (2017).
  73. Maynard, J. A., et al. Surface plasmon resonance for high-throughput ligand screening of membrane-bound proteins. Biotechnology Journal. 4 (11), 1542-1558 (2009).
  74. Haffke, M., Duckely, M., Bergsdorf, C., Jaakola, V. -P., Shrestha, B. Development of a biochemical and biophysical suite for integral membrane protein targets: A review. Protein Expression and Purification. 167, 105545 (2020).

Tags

Storskaligt uttryck rening humana bärare av lösta ämnen strukturstudier biokemiska studier membrantransportörer endogena substrat exogena substrat terapeutiska mål sjukdomsmarkörer läkemedel läkemedelsutvecklingsprojekt begränsad strukturell kunskap begränsad funktionell kunskap begränsad fysiologisk kunskap uttrycks- och reningssvårigheter milligrammängder kodonoptimerade gensekvenser konstruktionsdesign högkapacitetsuttryck Bevarande av strukturell integritet biokemisk aktivitetsbevarande eukaryot celluttryck affinitetsrening storleksuteslutningskromatografi högupplöst strukturbestämning transportstudier, Analyser av engagemang för små molekyler in vitro-screening med hög genomströmning
Storskalig expression och rening av humana bärare av lösta ämnen för strukturella och biokemiska studier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N.,… More

Raturi, S., Li, H., Chang, Y. N., Scacioc, A., Bohstedt, T., Fernandez-Cid, A., Evans, A., Abrusci, P., Balakrishnan, A., Pascoa, T. C., He, D., Chi, G., Kaur Singh, N., Ye, M., Li, A., Shrestha, L., Wang, D., Williams, E. P., Burgess-Brown, N. A., Dürr, K. L., Puetter, V., Ingles-Prieto, A., Sauer, D. B. High-Throughput Expression and Purification of Human Solute Carriers for Structural and Biochemical Studies. J. Vis. Exp. (199), e65878, doi:10.3791/65878 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter